專利名稱：一種豬戊型肝炎病毒抗原表位及它的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種肝炎病毒抗原表位，尤其涉及一種豬戊型肝炎病毒抗原表位及其在體外檢測和疫苗中的應用。
背景技術：
戊型肝炎病毒Ofepatitis E virus, HEV)是一種經糞、口途徑傳播的非甲-非乙型肝炎病毒。該病毒會在人群引起暴發流行，主要侵害青壯年，對孕婦可造成20%的病死率。1986-1988年我國新疆南部地區因飲水污染導致戊型肝炎流行，共計發病119280例，死亡707例，是迄今世界上最大的一次戊型肝炎流行。近年來戊型肝炎發病率有逐年增加的趨勢，據我國衛生部統計，戊肝發病率2003年比2002年上升40. 4%。因此，戊肝防控已列入各級公共衛生機構的工作日程。近年來研究發現，HEV可以感染豬、牛、羊、鼠和雞等動物。其中，病毒在豬和鼠的抗體陽性率高于50%，由此推測動物是HEV傳播的重要中間宿主。基因序列分析表明，從動物體內分離的戊型肝炎病毒與人的HEV有極高的基因同源性，并且已有人食用野豬肉和鹿肉而感染戊肝的報道，證明戊肝是一種可以通過食物傳播的人畜共患疫病。葛勝祥等(中國人獸共患病雜志，2003，19 ), 108-109)對我國20個省、市和自治區的120個養豬場的 8626只成年豬進行了 HEV血清學調查，結果表明平均感染陽性率為83. 4%，其中最高省份為內蒙古(100%)，最低為湖北(68%)。鑒于我國HEV居高不下的感染率，對豬戊肝病毒的表位進行研究，建立特異、有效的豬戊肝檢測方法，研制安全、有效的豬戊肝疫苗，了解的流行發病規律，阻斷該病由豬向人的傳播，對于保證人民的健康安全意義重大。國內第二軍醫大學的學者 Qi (Journal of Virological Methods 1995，5，55-66) 分析了人HEV假定的開放閱讀框0RF1、0RF2、0RF3的蛋白順序，合成了 7個肽，發現其中3 個肽具有免疫原性，可用作HEV的診斷。美國學者Meng(Virology 2001,288,203-211)從人HEV 0RF2中擴增出不同大小的交互重疊的重組肽段，發現其中的片段之一——pB166 為中和表位，可用作HEV的疫苗開發及診斷。日本學者Niikura(Virology 2002,293, 273-280)報道了人HEV-VLP的C末端11個氨基酸肽段具有免疫原性，能夠誘導產生抗體。廈門大學的學者^iang(Vaccine 2005,23,2881-2892)發現人HEV外殼蛋白394-606 位肽段以二聚體的形式可與HEV人血清強烈反應，用作疫苗可抗獼猴的實驗感染。印度學者 Deshmukh (Vaccine 2007，25，4350-4360)報道表達的完整人 HEV 0RF2 蛋白和 0RF2 內部 458-607位肽段具有免疫原性，起到中和作用。可用作疫苗的開發。但是，到目前為止，還沒有豬HEV開放閱讀框0RF1、0RF2和0RF3相關的蛋白表位的系統篩選報道。雖然豬戊肝研究越來越得到全世界的重視，但目前國內外對豬戊肝的研究多限于局部區域的流行病學調查和一些簡單的動物感染試驗。在豬戊肝防控研究方面尚有以下有待回答問題和技術瓶頸。目前還沒有豬戊肝病毒的表位研究報道，市場上用于豬戊肝檢測的試劑盒是用于人戊肝檢測的試劑盒。雖然豬戊肝病毒與人戊肝病毒序列同源性很高，但是他們之間畢竟還是有些差別，用人的戊肝病毒表位來檢測豬戊肝病毒導致檢測的特異性 (Speciality)不強，不能特異反映出豬戊肝流行規律。

發明內容
本發明的一個目的在于提供一種豬戊型肝炎病毒抗原表位。本發明的另一個目的在于提供一種用于豬戊型肝炎體外檢測的多肽。本發明的又一個目的在于提供一種用于制備豬戊型肝疫苗的多肽。本發明利用計算機軟件從豬戊型肝炎病毒全基因組開放閱讀框0RF1、0RF2和 0RF3的對應蛋白中篩選識別表位。表位識別的主要依據是蛋白質或多肽氨基酸序列的親水性、表面度、柔韌度、Chou-Fasman的螺旋、片狀和轉角、Robson-Garnier的二級結構及C-和 N-末端來預測抗原綜合數據(Antigenic Index, Al) 0利用現有的軟件，如GCG (Madison， Wisconsin, USA)及 DNAStar (Madison, Wisconsin, USA)從豬 HEV 的 0RF1、0RF2 和 0RF3 的蛋白中計算AI和輔助識別抗原區。根據豬HEV的0RF1、0RF2和0RF3的已知蛋白質取得的氨基酸序列，再用計算機程序來估計它們的抗原區(Al)( 一般10到15個氨基酸)。一種豬戊型肝炎病毒抗原表位，其氨基酸序列如下Val-Glu-His-Asn-Pro-Lys-Arg-Leu-Glu-Ala-Ala-Tyr-Arg-Glu-Thr-Cys-Ser-A rg-Arg-Gly-Thr-Ala-Ala-Tyr-Pro-Leu-Leu-Gly-Ala-Gly-IIe-Tyr-Lys-Val-Pro-Val-Gl y-Leu-Ser-Phe-Asp-Ala-Trp-Glu-Arg-Asn-His-Arg-Pro—Gly-Asp-GlUo另一種豬戊型肝炎病毒抗原表位，其氨基酸序列如下Ser-Asp-Ser-Val-Leu-Thr-Phe-Glu-Leu-Thr-Asp-Ile-Val-His-Cys-Arg-Met-A Ia-Ala-Pro-Ser-Gln-Arg-Lys-Ala-Val-Leu-Ser-Thr-Leu-Val-Gly-Arg-Tyr-Gly-Arg-Ar g-Thr-Lys-Leu-Tyr-Glu-Ala-Ala-His-Ala-Asp-Val-Arg-Gly-Ser。另一種豬戊型肝炎病毒抗原表位，其氨基酸序列如下Pro-Arg-Gln-Pro-Ala-Arg-Pro-Leu-Gly-Ser-Ala-Trp-Arg-Asp-Gln-Ser-Gln-A rg-Pro-Ala-Ala-Ser-Thr-Arg-Arg-Arg-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Pro-Leu-Thr-Al a-Val-Ala-Pro-Ala-Pro-Asp-Thr-Ala-Pro-Val-Pro-Asp-Val-Asp-Ser-Arg-Gly-Ala-Ile -Leu-Arg-Arg-Gln-Tyr-Asn-Leu-Ser0另一種豬戊型肝炎病毒抗原表位，其氨基酸序列如下Pro-Val-Ser-Ile-Ser-Ala-Val-Gly-Val-Leu-Ala-Pro-His-Ser-Ala-Leu-Ala-I Ie-Leu-Glu-Asp-Thr-Ala-Asp-Tyr-Pro-Ala-Arg-Ala-His-Thr-Phe-Asp-Asp-Phe-Cys-Pr O-Glu-Cys-Arg-Ser-Leu-Gly-Leu-Gln-Gly-Cys ο通過分析，多月太 Leu-Gly-Ala-Thr-Ser-Pro-Ser-Ala-Pro-Pro-Leu-Pro-Pro-Val-Val-Asp-Leu、、多月太 Pro-Pro-Val-Val-Asp-Leu-Pro-Gln-Leu-Gly、多月太 Leu-Ala-Leu-Gly -Ser-Gln-Pro-Val-His-Ser-Ala-Pro-Leu-Gly-Ala-Thr-Ser-Pro-Ser-Ala-Pro-Pro-Leuλ 多肽 Pro-Gln-Leu-Gly-Leu-Arg-Arg 禾口多肽 Leu-Ala-Leu-Gly-Ser-Gln-Pro-Val-His-Se r-Ala-Pro-Leu-Gly-Ala-Thr-Ser-Pro-Ser-Ala-Pro-Pro-Leu-Pro-Pro-Val-Val-Asp-Leu 是豬戊型肝炎病毒抗原表位的重要組成部分，是抗體結合抗原識別表位不可或缺的重要組成部分，這些多肽可以單獨、一種多肽的N端與另一種多肽C端的連接或連接于其它多肽的 N端或C端，所述的這些多肽單獨或共同對豬戊型肝炎的體外檢測及免疫抗體的制備起到
重要作用。另一種豬戊型肝炎病毒抗原表位，其氨基酸序列如下Ser-Pro-Ser-Pro-Ser-Pro-IIe-Phe-IIe-Gln-Pro-Thr-Pro-Ser-His-Leu-Thr-P he-Gln-Pro-Gln-Pro-Gly-Leu-Glu-Leu-Ala-Leu-Gly-Ser-Gln-Pro-Val-His-Ser-Ala-Pr o-Leu-Gly-Ala-Thr-Ser-Pro-Ser-Ala-Pro-Pro-Leu-Pro-Pro-Val-Val-Asp-Leu-Pro-Gln -Leu-Gly0另一種豬戊型肝炎病毒抗原表位，其氨基酸序列如下Leu-Ala-Leu-Gly-Ser-Gln-Pro-Val-His-Ser-Ala-Pro-Leu-Gly-Ala-Thr-Ser-P ro_Ser_Ala_Pro_Pro_Leu_Pro_Pro_Val_Val_Asp_Leu_Pro_Gln_Leu_Gly_Leu_Arg_Arg0另一種豬戊型肝炎病毒抗原表位，其氨基酸序列如下Leu-Gly-Ala-Thr-Ser-Pro-Ser-Ala-Pro-Pro-Leu-Pro-Pro-Val-Val-Asp-Leu-P ro-Gln-Leu-Gly-Leu-Arg-Arg0另一種豬戊型肝炎病毒抗原表位，其氨基酸序列如下Leu-Ala-Leu-Gly-Ser-Gln-Pro-Val-His-Ser-Ala-Pro-Leu-Gly-Ala-Thr-Ser-P ro-Ser-Ala-Pro-Pro-LeUc上述多肽可以通過化學合成的方式完成。化學合成采用Fmoc方法，通過固相合成技術合成。該方法的具體步驟參見Eur. J. Immunol. 1994，24，3188-3193 J. Org. Chem. 1972，37，3404-3409 ；黃惟德，陳常慶多肽合成，北京科學出版社，1985。上述多肽還可以通過與其它多肽或蛋白形成融合蛋白抗原，融合蛋白抗原可以通過基因工程方式制得，即通過目標融合蛋白的DNA轉導/轉化至基因工程菌株，如大腸桿菌(E. coli)、酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)中表達并純化，或在中國倉鼠卵巢 (CHO)細胞、COS細胞、小倉鼠腎(BHK)細胞、小鼠骨髓瘤SP2/0細胞、小鼠NSO胸腺瘤細胞等哺乳動物細胞中表達并純化后，得到將其中一種抗原C末端，經由酰胺鍵(amide bond)和另一種抗原N末端首尾相連的融合蛋白產物(Protein Expr. Purif.，2008，59，189-196)。基因工程方法制備蛋白質抗原的克隆、表達以及純化可通過多種方法進行。具體方法參見《分子克隆實驗指南》(第三版)，科學出版社，2002，第1217-1270頁。適宜的原核表達載體如PEGX系列原核表達載體(Amersham Pharmacia)、pET系列原核表達載體 (Novagen)等。特別優選pGEX_4T_2載體。對于不同肽段融合的抗原，本領域眾所周知其構建原則和方法。具體而言，為了不影響待融合肽段的各自的功能需要在不同肽段之間添加一個接頭。關于接頭的選擇具體可參見 Protein Eng.，2001，14，529-532。由上述多肽單獨或組合或融合而形成的抗原用于檢測應答豬戊型肝炎病毒而產生的抗體。具體而言，這些多肽在豬戊型肝炎體外檢測中的應用。檢測方法可以有多種，例如間接酶聯免疫測定技術、雙抗原夾心酶免疫測定技術、 金標快速檢測技術、免疫滲濾檢測技術和蛋白芯片檢測技術等。間接酶聯免疫測定，即間接 ELISA是最常用的檢測方法。間接ELISA方法基本原理是多肽(抗原)包被在酶標板表面，將稀釋后的待檢
5血清/血漿和對照物加入反應板孔中，如果被檢血清/血漿中存在抗體，經溫育后，則血清 /血漿中特異性抗體與反應板孔中的抗原多肽結合，形成固相抗原-抗體復合物，洗去未結合的血清/血漿中其它成分，加入酶標記的抗人IgG抗體，溫育，固相抗原(多肽)結合的抗體再與酶標記的抗人IgG抗體結合，洗去未結合的酶標記抗體成分，加入酶底物，并被催化成為有色產物，最后加入終止液終止反應。根據對照物，可對抗體進行定量或定性測定。上述多肽單獨或組合或融合而形成的抗原用于制備抗豬戊型肝炎病毒抗體。本發明技術方案實現的有益效果本發明通過計算機軟件篩選和實驗驗證得到了豬戊肝病毒的抗原表位。一方面可以將其單獨或組合應用于快速特異豬戊肝診斷試劑盒，用于豬戊肝的快速診斷，特別是研制疫苗免疫抗體和自然隱性感染抗體的鑒別診斷技術用于豬戊肝流行的監控；另一方面也可以設計特異、安全和高效的豬戊肝疫苗用于豬戊肝的預防、控制豬戊肝的流行和阻斷戊肝由豬向人傳播。
具體實施例方式以下詳細描述本發明的技術方案，本發明實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解， 可以對發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的精神和范圍， 其均應涵蓋在本發明的權利要求范圍中。本發明所用的試劑若未明確指明，則均購自西格瑪-奧德里奇(Sigma-Aldrich)。實施例1豬戊肝病毒表面抗原利用計算機軟件從豬戊型肝炎病毒全基因組開放閱讀框0RF1、0RF2和0RF3的對應蛋白中篩選識別表位。表位識別的主要依據是蛋白質或多肽氨基酸序列的親水性、 表面度、柔韌度、Chou-Fasman的螺旋、片狀和轉角、Robson-Garnier的二級結構及C-和 N-末端來預測抗原綜合數據(Antigenic Index, Al) 0利用現有的軟件，如GCG (Madison， Wisconsin, USA)及 DNAStar (Madison, Wisconsin, USA)從豬 HEV 的 0RF1、0RF2 和 0RF3 的蛋白中計算AI和輔助識別抗原區。根據豬HEV的0RF1、0RF2和0RF3的已知蛋白質取得的氨基酸序列，再用計算機程序來估計它們的抗原區(Al)( 一般10到15個氨基酸)。進過分析，分別從ORFl、0RF2和0RF3選定如下多肽ORFl swHEV-1:83-140Ala-Gly-Arg-Cys-Leu-Glu-Val-Gly-Ala-His-Pro-Arg-Ser-Ile-Asn-Asp-Asn-P ro-Asn-Val-Leu-His-Arg-Cys-Phe-Leu-Lys-Pro-Val-Gly-Arg-Asp-Val-Gln-Arg-Trp-Ty r-Thr-Ala-Pro-Thr-Arg-Gly-Pro-Ala-Ala-Asn-Cys-Arg-Arg-Ser-Ala-Leu-Arg-Gly-Leu -Pro-Pro,其相應的DNA序列為swHEVn-1 :281-454ccgggcgctg tcttgaggtg ggtgcccacc cacgttctat taatgacaac cctaacgtcctgcatcgctg ctttcttaaa cctgttggcc gcgacgttca gcggtggtat accgctccta cccgtggccctgcagcaaat tgccggcggt ccgctctccg cgggcttcca cctg。
swHEV-2 :874-925Val-Glu-His-Asn-Pro-Lys-Arg-Leu-Glu-Ala-Ala-Tyr-Arg-Glu-Thr-Cys-Ser-A rg-Arg-Gly-Thr-Ala-Ala-Tyr-Pro-Leu-Leu-Gly-Ala-Gly-IIe-Tyr-Lys-Val-Pro-Val-Gl y-Leu-Ser-Phe-Asp-Ala-Trp-Glu-Arg-Asn-His-Arg-Pro-Gly-Asp-Glu,其相應的DNA序列為swHEVn-2 :2654-2809t c g aa c a taaccccaaa cggctcgagg ccgcctatcg ggagacctgc tcccgacgggggacggctgc ttaccccctg ctcggtgccg gcatatataa ggtccctgtt gggttgagct ttgatgcctgggagcgtaac caccgacccg gggatgaat0swHEV-3 :1295-1346Ser-Asp-Ser-Val-Leu-Thr-Phe-Glu-Leu-Thr-Asp-Ile-Val-His-Cys-Arg-Met-A Ia-Ala-Pro-Ser-Gln-Arg-Lys-Ala-Val-Leu-Ser-Thr-Leu-Val-Gly-Arg-Tyr-Gly-Arg-Ar g-Thr-Lys-Leu-Tyr-Glu-Ala-Ala-His-Ala-Asp-Val-Arg-Gly-Ser,其相應的DNA序列為swhevn-3 3917-4072atag tgtgctcact tttgagetea cggacatagt gcactgccgt atggcagcgc ccagccagcgcaaggcggtc ctgtcaactc ttgtcggcag gtacggccga cgtactaaat tgtacgaggc cgcacacgcagatgtccgcg gatctctgaa tc0swHEV-4 :1521-1582Glu-Ser-Leu-Arg-Gly-Phe-Trp-Lys-Lys-His-Ser-Gly-Glu-Pro-Gly-Thr-Leu-L eu-Trp-Asn-Thr-Val-Trp-Asn-Met-Ala-Val-IIe-Ala-His-Cys-Tyr-Glu-Phe-Arg-Asp-Le u-Lys-Val-Ala-Ala-Phe-Lys-Gly-Asp-Asp-Ser-Val-Val-Leu-Cys-Ser-Asp-Tyr-Arg-Gln -Ser-Arg-Asp-Ala-Ala-Ala,其相應的DNA序列為swhevn-4 :4561-4746gttcgctctg cttgggttct acaggcaccg aaggagt c tc t gcgaggc tt ctggaagaaacactctggtg agcctggcac cctattatgg aataccgttt ggaacatggc tgtcatagca cactgttatgaattccgcga ccttaaggtt gcagcattca agggggacga ttctgttgtg etttge。0rf2 swHEV-5 :90-153Pro-Arg-Gln-Pro-Ala-Arg-Pro-Leu-Gly-Ser-Ala-Trp-Arg-Asp-Gln-Ser-Gln-A rg-Pro-Ala-Ala-Ser-Thr-Arg-Arg-Arg-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Pro-Leu-Thr-Al a-Val-Ala-Pro-Ala-Pro-Asp-Thr-Ala-Pro-Val-Pro-Asp-Val-Asp-Ser-Arg-Gly-Ala-Ile -Leu—Arg-Arg-Gln-Tyr-Asn-Leu—Ser，其相應的DNA序列為swhevn-5 :5422-5607ctcggcagc cagcccgt cc act cggctcc gctt ggcgcg accagtccca gcgccccgccgcttccaccc gtcgtcgacc tgccccagct ggggcttcgc cgttgacggc tgtggctccg gctcctgacactgcacccgt ccctgatgtt gattcccgtg gcgctatctt gcgccgccag tataatt
swHEV-6 :433-476Ala-Gln-Gln-Asp-Lys-Gly-Ile-Ala-Ile-Pro-His-Asp-Ile-Asp-Leu-Gly-Glu-Ser-Arg-Val-Val-Ile-Gln-Asp-Tyr-Asp-Asn-Gln-His-Glu-Gln-Asp-Arg-Pro-Thr-Pro-Ser-Pro-Ala-Pro-Ser-Arg-Pro-Phe,其相應的DNA序列為swhevn-6 :6451-6582ct cagcagga caagggt ata gctatt ccac atgatat t ga t ct cggt gag tcccgtgtggtcattcagga ttatgataat caacatgagc aagaccgccc caccccctct cctgctccct ctcgcccttt ttοswHEV-7 :606-653Pro-Val-Ser-Ile-Ser-Ala-Val-Gly-Val-Leu-Ala-Pro-His-Ser-Ala-Leu-Ala-I Ie-Leu-Glu-Asp-Thr-Ala-Asp-Tyr-Pro-Ala-Arg-Ala-His-Thr-Phe-Asp-Asp-Phe-Cys-Pr O-Glu-Cys-Arg-Ser-Leu-Gly-Leu-Gln-Gly-Cys,其相應的DNA序列為swHEVn-7 :6970-7113c cgtgt ctatt tctgctgttg gtgtccttgc ccctcattct gcgct ggcta ttctggaggacaccgctgat taccctgctc gcgcccatac ttttgatgat ttctgccctg agtgccgttc actcggccttcagggttgtg ctt00RF3 swHEV-8 :22-58Cys-Pro-Arg-His-Arg-Pro-Val-Ser-Pro-Leu-Ala-Val-Ala-Ala-Gly-Gly-Ala-Ala-Ala-Val-Pro-Ala-Val-Val-Ser-Gly-Val-Thr-Gly-Leu-IIe-Leu-Ser-Pro-Ser-Pro-Ser，其相應的DNA序列為swHEVn-8 :5246-5356gcccg cgccaccggc cggtcagccc tctggccgtc gccgcgggcg gcgcagcggcggtgccggca gtggtttctg gggtgaccgg gttgattctc agcccttcgc cctccc。swHEV-9 :55-112Ser-Pro-Ser-Pro-Ser-Pro-Ile-Phe-Ile-Gln-Pro-Thr-Pro-Ser-His-Leu-Thr-P he-Gln-Pro-Gln-Pro-Gly-Leu-Glu-Leu-Ala-Leu-Gly-Ser-Gln-Pro-Val-His-Ser-Ala-Pr o-Leu-Gly-Ala-Thr-Ser-Pro-Ser-Ala-Pro-Pro-Leu-Pro-Pro-Val-Val-Asp-Leu-Pro-Gln -Leu-Gly，其相應的DNA序列為swHEVn-9 :5345-5518cttcgc cctcccctat attcatccaa ccaacccctt cgcatctgac attccagccg cagccggggctggagctcgc cctcggcagc cagcccgtcc actcggctcc gcttggcgcg accagtcccagcgccccgcc gcttccaccc gtcgtcgacc tgccccagct ggggcttc。swHEV-10 :79-114Leu-Ala-Leu-Gly-Ser-Gln-Pro-Val-His-Ser-Ala-Pro-Leu-Gly-Ala-Thr-Ser-Pro-Ser-Ala-Pro-Pro-Leu-Pro-Pro-Val-Val-Asp-Leu-Pro-Gln-Leu-Gly-Leu-Arg-Arg,其相應的DNA序列為SwHEVn-IO :5417-5524tcgc cctcggcagc cagcccgtcc actcggctcc gcttggcgcg accagtccca gcgccccgccgcttccaccc gtcgtcgacc tgccccagct ggggcttcgc cgtt。swHEV-11 :91-114Leu-Gly-Ala-Thr-Ser-Pro-Ser-Ala-Pro-Pro-Leu-Pro-Pro-Val-Val-Asp-Leu-P ro-Gln-Leu-Gly-Leu-Arg-Arg,其相應的DNA序列為Swhevn-ii :5453-5524ttggcgcg accagtccca gcgccccgcc gcttccaccc gtcgtcgacc tgccccagctggggcttcgc cgtt。SwHEV-I2 :79-101Leu-Ala-Leu-Gly-Ser-Gln-Pro-Val-His-Ser-Ala-Pro-Leu-Gly-Ala-Thr-Ser-P ro-Ser-Ala-Pro-Pro-Leu,其相應的DNA序列為Swhevn-12 :5417-5485tcgc cctcggcagc cagcccgtcc actcggctcc gcttggcgcg accagtccca gcgccccgccgcttc。上述序列由GL-Biochem (shanghai) Ltd通過多肽合成儀合成后，再由HPLC純化得到純度大于95%的多肽。實施例2豬戊型肝炎病毒表位的篩選先用北京萬泰實業生物醫藥有限公司生產的豬HEV總抗體ELISA試劑盒對采集到的豬血清進行進行鑒定，篩選出豬HEV陽性血清和陰性血清。再用豬HEV陽性血清和陰性血清對實施例1得到的豬HEV多肽進行ELISA鑒定， 篩選出豬HEV表位抗原。其具體步驟如下1.抗原稀釋取10 μ 1濃度為10mg/ml的多肽(將5mg合成的多肽溶解在0. 5ml 二甲基亞砜 (DMSO)而得)與90ul PBS液混勻，得到的抗原稀釋液溶度為1 μ g/ μ 1。再取15 μ 1抗原稀釋液與5ml包被液混勻，得到的抗原稀釋溶度為3 μ g/ml。在酶標板上加入抗原稀釋溶度 100 μ 1/孔，4°C包被 12h。2.封閉吸去包被夜，每孔加入200μ 1封閉液于37°C封閉2h。封閉液是3%牛血清白蛋白 (BSA) /TBS 液。3.加一抗用PBST液洗板3次，每孔加100 μ 1 1% BSA/TBST液和10 μ 1血清，震蕩混勻，置 37°C溫育 Ih。4.加二抗用PBST液洗板5次，每孔加100 μ 1辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗豬IgG或IgM(均購自于 Immunology Consultants Laboratory, Inc. ,USA)稀釋液，置 37°C溫育 lh。 二抗用BSA/TBST液稀釋。5.顯色用PBST液洗板5次，每孔加底物液100ul，37度顯色lOmin。底物液是由IOml檸檬酸緩沖液，0. 4mlTMB和33 μ 1 3% H2O2配置而成的。6.終止每孔加50 μ 1 lmol/1 HCl的終止液來終止反應，用酶標儀測OD值。當(樣品OD 值/陰性對照OD值)> 2. 1為陽性，當(樣品OD值/陰性對照OD值)< 2. 1為陰性。實驗結果見表一、表二和表三。所述試劑如下PBS 液(500ml, ρΗ7· 4) :0. 575g Na2HPO4 和 0. 114g NaH2PO4 加蒸餾水溶解，定容至 Λ 500ml ο包被液(1000ml,ρΗ9· 6) () :1. 59g Na2CO3 和 2. 93g NaHCO3 加蒸餾水溶解，定容至 Λ 1000ml。TBS 液(2000ml, ρΗ8· 6) :16g NaCl、0· 4g KCl 和 2. 42g Trizma-Base 加蒸溜水溶解，定容至入2000ml。TBST 液(1000ml，Tween-20 的濃度為 0· 1 % ) :1000ml TBS 液力Π 入 1. Oml Tween_20o檸檬酸緩沖液(100ml，pH3. 5-4. 0) :0. 84g檸檬酸和0. 294g檸檬酸鈉加蒸餾水溶解，定容至入100ml。 終止液(500ml, IM HCl) :40. 88ml濃鹽酸溶解于459. 12ml蒸餾水。
表一合成豬HEV多肽與豬HEV陽性血清盤的免疫反應(對于IgG)
陽性參照數量
權利要求
1.一種豬戊型肝炎病毒抗原表位，其序列如SEQ ID No 8所示。
2.權利要求1所述的豬戊型肝炎病毒抗原表位在豬戊型肝炎體外診斷中的應用。
3.權利要求1所述的豬戊型肝炎病毒抗原表位在豬戊型肝炎疫苗制備中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種豬戊型肝炎病毒抗原表位及它的應用，所述豬戊型肝炎病毒抗原表位序列如SEQ ID No8所示。通過計算機軟件篩選和實驗驗證得到的豬戊肝病毒的抗原表位，一方面可以將其應用于快速特異豬戊肝診斷試劑盒，用于豬戊肝的快速診斷，特別是研制疫苗免疫抗體和自然隱性感染抗體的鑒別診斷技術用于豬戊肝流行的監控；另一方面也可以設計特異、安全和高效的豬戊肝疫苗用于豬戊肝的預防、控制豬戊肝的流行和阻斷戊肝由豬向人傳播。
文檔編號G01N33/576GK102276700SQ20111020835
公開日2011年12月14日 申請日期2009年4月1日 優先權日2009年4月1日
發明者于瑞嵩, 劉啟文, 吳蕭, 唐雪明, 朱宏, 李震, 王金斌, 譚芙蓉, 趙凱 申請人:上海市農業科學院