包含禽戊型肝炎病毒orf3蛋白抗原區的重組蛋白及其制備和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于禽戊型肝炎病毒抗體檢測領域，具體涉及一種禽戊型肝炎病毒ORF3 蛋白一個抗原區的氨基酸序列，及包含該抗原區的原核表達的兩段重組截短禽ORF3蛋 白，還涉及上述兩段重組蛋白在體外血清學檢測禽HEV抗體的應用。
【背景技術】
[0002] 禽戊型肝炎病毒（HepatitisEvirus,HEV)是雞大肝大脾病（Bigliverand spleendisease，BLS)和肝炎脾大（Hepatitis-Splenomegaly，HS)綜合癥的主要病原。雞 BLS主要導致30?72周齡的蛋雞和肉種雞死淘率升高1?4%、產蛋率下降20?40%以 及種蛋孵化率降低10?30%。此外，禽HEV感染會使雞群處于亞健康狀態，當氣候和飼料 等外界環境改變或與其它病原混合感染時，極有可能導致雞群爆發HS綜合癥或BLS。禽HEV 感染在許多國家或地區雞群中的感染率達到30%以上，而且曾給澳大利亞的養禽業造成了 嚴重的經濟損失。因此，禽HEV是危害養禽業，尤其是蛋雞和種禽養殖業的重要疾病之一。 在我國，由于禽的分離報道較晚，所以該病毒感染對我國養禽業造成的危害還沒有系 統的評價。
[0003] 禽HEV的基因組全長約為6. 6kb，比哺乳動物HEV基因組少600bp左右，除包含5' 帽子和3'PolyA結構，還含有3個開放閱讀框（Openreadingframe，0RF)，分別為0RF1、 0RF2和0RF3,并且0RF3與0RF2部分重疊。其中ORFl最大，編碼病毒的非結構蛋白，包括甲 基化轉移酶、解螺旋酶和RNA依賴的RNA聚合酶等幾個功能區域；0RF2編碼病毒的主要結 構蛋白--衣殼蛋白，含有病毒主要的抗原表位；最小的0RF3編碼一個小的磷酸化蛋白， 禽HEV感染雞只后能夠產生針對0RF3蛋白強烈的免疫應答反應，此外0RF3蛋白在病毒的 復制與感染過程中可能起著非常關鍵的作用。
[0004] 目前，禽HEV仍沒有合適高效的體外培養系統，對禽HEV感染的診斷更多的是通 過病毒核酸和抗體的檢測。迄今，已利用禽0RF2蛋白C端268個氨基酸建立了禽HEV 的抗體檢測的ELISA實驗室診斷方法。但是目前仍沒有一個其它的方法去佐證該方法的正 確性。此外，對人HEV不同的血清學診斷方法比較發現，人HEV不同抗原（0RF2和0RF3蛋 白）對HEV抗體的檢測存在較大的偏差，結果一致性差。因此，分析禽HEV0RF3蛋白的抗 原性以及利用該蛋白建立禽抗體檢測的方法就顯得非常必要，但是目前仍沒有關于禽 HEV0RF3蛋白抗原區的分析以及利用該抗原區檢測血清中禽HEV抗體的報道。

【發明內容】

[0005] 本發明所要解決的技術問題是提供包含禽戊型肝炎病毒0RF3蛋白抗原區的重組 蛋白及其制備和應用，提示重組蛋白可以用于禽抗體的檢測，佐證以禽HEV0RF2蛋白為 包被抗原血清檢測結果，在禽戊型肝炎病毒的血清學診斷方面具有良好的應用前景。
[0006] 本發明所需要解決的技術問題，可以通過以下技術方案來實現：
[0007] 本發明的一種包含禽戊型肝炎病毒ORF3蛋白抗原區的重組蛋白ORF3-2,其為禽 戊型肝炎病毒ORF3蛋白的28-87個氨基酸，其氨基酸序列如SEQIDNo: 2所示，具體為LL CAAGCQGAPKRSQPEAGAVNAAVITQPSGALNNAPKEPSAPPLLPTLSPRQVLARYQM;所述的含禽戊型肝炎 病毒0RF3蛋白抗原區，其位于0RF3蛋白C端區域74-87個氨基酸之間，氨基酸序列如SEQ IDNo: 1 所示，具體為PTLSPRQVLARYQM。
[0008] 本發明的一種包含禽戊型肝炎病毒0RF3蛋白抗原區的重組蛋白0RF3-3,其為 禽戊型肝炎病毒0RF3蛋白55-87個氨基酸，其氨基酸序列如SEQIDNo:3所示，具體為 QPSGALNNAPKEPSAPPLLPTLSPRQVLARYQM;所述的含禽戊型肝炎病毒0RF3蛋白抗原區，其 位于0RF3蛋白C端區域74-87個氨基酸之間，氨基酸序列如SEQIDNo: 1所示，具體為 PTLSPRQVLARYQM。
[0009] 本發明的上述重組蛋白的制備方法，包括：
[0010] (1)重組表達質粒的構建：
[0011] 依據0RF3-2或0RF3-3蛋白氨基酸區域對應的0RF3基因的核苷酸序列分別設計 引物，并在上下游引物的5'端引入BamHI和EcoRI酶切位點；
[0012] 采用Trizol法從CaHEV懸液中提取RNA，然后以RNA為模板，傳統的RT-PCR 方法得到基因目的序列，然后將擴增目的基因的PCR產物與pGEX-6p-l載體，同時用 BamHI和EcoRI進行雙酶切，T4連接酶連接，構建重組表達質粒pGEX-6p-0RF3-2或 pGEX-6p-0RF3-3；
[0013] (2)重組蛋白的原核表達與純化
[0014] 將重組表達質粒pGEX-6p-0RF3-2或pGEX-6p-0RF3-3轉化到大腸桿菌表達宿主菌 BL21 (DE3)中，加入IPTG(異丙基-0-D-硫代吡喃半乳糖苷）誘導表達，最后收集菌液，超 聲裂解離心后，SDS-PAGE鑒定蛋白的表達。
[0015] 步驟⑴中所述的pGEX-6p-l載體中包含GST標簽，目的蛋白與GST蛋白融合表 達。
[0016] 步驟（1)中所述的引物為：
[0017] 0RF3-2-F CG GGATCC TTGCTATGTGCTGCGG，
[0018] 0RF3-2-R CG GAATTC CTACATCTGGTACCGTGCGA ；
[0019]或0RF3-3-F CG GGATCC CAGCCCAGTGGAGCG，
[0020] 0RF3-3-RCGGAATTCCTACATCTGGTACCGTGCGA。
[0021] 步驟⑵中所述的IPTG的用量為ImM。
[0022] 本發明的重組蛋白0RF3-2或0RF3-3應用于檢測臨床雞血清中是否含有禽HEV 抗體，其具體操作采用Westernblot方法，包括：將表達純化的0RF3-2或0RF3-3蛋白，經 SDS-PAGE(12%聚丙烯酰胺凝膠）后，利用半干轉膜法將抗原轉至PVDF膜上，封閉過夜后洗 膜，然后SPF雞陰性血清與臨床雞血清（血清稀釋度為1:100)與膜室溫孵育lh，洗膜后，將 膜與HRP標記的兔抗雞二抗（1:5000)室溫孵育lh，最后用DAB顯色液避光顯色10min。
[0023] 本發明的重組蛋白0RF3-2或0RF3-3應用于制備檢測臨床雞血清中是否含有禽 HEV抗體的試劑或試劑盒。
[0024] 本發明提供一個禽HEV 0RF3蛋白抗原區的氨基酸序列，提供兩段包含上述抗原 區的重組截短禽HEV 0RF3蛋白的原核表達方法，以上述包含抗原區的兩段蛋白為抗原， Westernblot方法檢測臨床雞血清中的禽HEV抗體。
[0025] (1)-個禽戊型肝炎病毒0RF3蛋白的抗原區，其位于蛋白的C端區域74-87個氨 基酸之間，氨基酸序列為PTLSPRQVLARYQM(SEQ IDNo:l)。
[0026] (2)兩段重組截短的包含上述抗原區的重組0RF3蛋白，分別命名為0RF3-2和 0RF3-3。其中0RF3-2包含的區域為0RF3蛋白的28-87個氨基酸之間，其氨基酸序列為LLC AAGCQGAPKRSQPEAGAVNAAVTTQPSGALNNAPKEPSAPPLLPTLSPRQVLARYQM(SEQIDNo:2) ；0RF3-3 蛋白包含的區域為0RF3蛋白55-87個氨基酸之間，其氨基酸序列為QPSGALNNAPKEPSAPPLL PTLSPRQVLARYQM(SEQIDNo:3)〇
[0027] (3)利用上述表達純化的兩種重組蛋白為抗原，Western blot檢測發現，上述兩 種蛋白可以與臨床上禽戊型肝炎病毒抗體陽性雞血清發生強烈反應，而與陰性雞血清不反 應。
[0028] 本發明技術方案的詳細描述：
[0029] 利用DNAStar軟件程序包（Lasergene7. 0)的Protean程序分析禽戊型肝炎病毒 中國分離株（HepatitisEvirus,HEV,CaHEV,GenBanknumberGU954430)0RF3 蛋白氨基酸 序列（SEQIDN〇:4)的抗原性和親疏水性（圖1)。依據其分析結果，將0RF3蛋白設計成5 段相互重疊包含預測的不同抗原區或不同抗原區組合的蛋白，分別命名為0RF3-l，0RF3-2， 0RF3-3, 0RF3-4和0RF3-5,其所包含的0RF3蛋白的氨基酸區域見圖1。
[0030] 依據5段蛋白氨基酸區域對應的0RF3基因的核苷酸序列（SEQIDN〇:5)分別設 計引物，引物序列見表1(SEQIDNo:6-15)，同時在上下游引物的5'端引入BamHI和EcoRI 酶切位點。RT-PCR擴增得到目的基因后，將其與原核表達載體pGEX-6p-l(GEHealthcare) 同時進行BamHI和EcoRI雙酶切，然后T4連接酶連接，構建重組原核表達質粒。酶切鑒定的 陽性重組質粒PGEX-0RF3-1，-2, -3, -4, -5 (圖2)轉化大腸桿菌表達宿主菌BL21 (DE3)。挑 取單個菌落接種5mlLB培養基，OD6tltlmi達到0.4-0. 6時，加入ImMIPTG誘導表達，225rpm， 25°C，誘導6小時，收集菌液，超聲裂解離心后，沉淀和上清分別進行SDS-PAGE鑒定蛋白的 表達。大量表達后利用GST填料純化表達的蛋白（圖3)。利用抗GST單抗為一抗，Western blot鑒定重組融合蛋白的正確表達（圖4)。
[0031] 利用禽HEV抗體陽性雞血清，間接ELISA和Western blot檢測陽性雞血清與 5段蛋白的反應，發現禽HEV陽性雞血清與0RF3-2, -3蛋白發生強烈的免疫反應