一種檢測人HEV IgM及IgG的免疫層析試紙及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于體外診斷技術領域，尤其是涉及一種一種檢測人HEV IgM及IgG的免疫層析試紙及其制備方法。
【背景技術】
[0002]目前，臨床上對戊型肝炎病毒IgM抗體的診斷主要采用酶聯免疫法(ELISA)、放免法(RIA)和化學發光法等。最普及的方法仍是酶聯免疫法(ELISA)。放免法(RIA)因其標記物有效期短和有放射性污染物而被市場逐步淘汰。化學發光法(CLIA)，它是在化學發光反應的基礎上與免疫反應相結合建立的新技術，它不僅具有免疫反應的特異性，而且具有化學發光反應的高靈敏性。采用化學發光測量儀，具有靈敏度高、穩定性好、快速、準確和簡便等優點，無放射性污染，但所用試劑和自動化分析儀均為國外產品，價格昂貴尚難全面普及；EIA法，須經孵育、洗滌、顯色、判讀等步驟，過程較為繁瑣，檢測時間長。
[0003]戊型肝炎病毒(HEV)感染的診斷主要依賴于抗HEV IgG及IgM的檢測，單獨檢測一項指標用于戊肝診斷均存在一定的局限性，易發生漏檢現象。

【發明內容】

[0004]為了克服現有技術的不足，本發明提供一種漏檢率低的檢測人HEV IgM及IgG的免疫層析試紙及其制備方法。
[0005]本發明的目的之一是提供一種檢測人HEV IgM及IgG的免疫層析試紙，所述試紙包括樣品墊、金標抗原結合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊和底板；
所述硝酸纖維素膜在所述底板的中部，在所述硝酸纖維素膜沿底板的一端依次為金標抗原結合墊、樣品墊，在所述硝酸纖維素膜沿底板的另一端為吸水墊，且每相鄰兩者之間部分疊合；
所述硝酸纖維素膜包含包被有抗人IgM抗體及包被有抗人IgG抗體的檢測區和包被有抗兔IgG抗體的質控區；所述硝酸纖維素膜靠近吸水墊一端為質控區，另一端為檢測區；所述檢測區設有檢測線(T1、T2線)，所述質控區設有質控線(C線)；
所述的金標抗原結合墊2上包被有膠體金標記的HEV抗原及膠體金標記的兔IgG抗體或乳膠標記的HEV抗原及乳膠標記的兔IgG抗體或膠體硒標記的HEV抗原及膠體硒標記的兔IgG抗體。
[0006]優選，樣品墊為親水性微孔結構材料。
[0007]優選，所述親水性微孔結構材料為無紡布或玻璃纖維。
[0008]優選，質控區設有一個質控線(C線)。
[0009]優選，所述抗人IgM的宿主為:鼠、羊、兔、雞、馬等；抗人IgG的宿主為:鼠、羊、兔、
雞、馬等；抗兔IgG抗體的宿主為:鼠、羊、兔、雞、馬等；HEV抗原為:基因工程重組抗原或天然培養抗原。
[0010]優選，所述硝酸纖維素膜上包被有抗人IgM抗體及包被有抗人IgG抗體的檢測區的檢測區在包被有抗IgG抗體的質控區的下方。
[0011]優選,所述試紙寬度為2mm-6mm。
[0012]本發明的另一發明目的是提供一種檢測人HEV IgM及IgG的免疫層析試紙的制備方法，包括以下步驟:
a)準備樣品墊、吸水墊；
b)準備金標抗原結合墊
1)HEV金標抗原:用堿性溶液將膠體金溶液pH調至至7.0-10.0,混合HEV抗原與膠體金溶液，然后加入蛋白保護劑，再采用高速冷凍離心的方法對所得金標抗原進行純化，并用膠體金懸浮液進行復溶得到HEV金標抗原；
2)兔IgG金標抗體:用堿性溶液將膠體金溶液pH調至至7.0-10.0,混合兔IgG與膠體金溶液，然后加入蛋白保護劑，再采用高速冷凍離心的方法對所得金標抗原進行純化，并用膠體金懸浮液進行復溶得到兔IgG金標抗體；
3)將所得HEV金標抗原及兔IgG金標抗體按一定比例混合后噴點到金標抗原結合墊上，干燥后即為金標抗原結合墊；
c)準備硝酸纖維素膜
在硝酸纖維素膜輔料的一側噴點抗人IgM抗體作為Tl檢測線，中間噴點抗人IgG抗體作為T2檢測線，另一側噴點抗IgG抗體作為質控線(C線)；
d)順次將所述樣品墊、金標抗原結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊相互搭接在底板上，并用切刀機切割成所需寬度的試紙條。
[0013]優選，所述膠體金溶液的制備方法為:將10ml 0.01%的HAuClyK溶液加熱至沸騰，在劇烈攪拌下迅速加入0.5-10ml的檸檬酸三納溶液，保持沸騰狀態反應3-30min后停止加熱，然后冷卻。
[0014]抗人IgM抗體及抗人IgG抗體分別包被于硝酸纖維素膜的檢測區的檢測線(Tl線和T2線)，抗IgG抗體包被于質控區的質控線(C線)，當樣本中含有抗HEV IgM時，抗HEVIgM能與膠體金標記HEV抗原結合形成復合物，該復合物在層析過程中又與Tl線區的抗人IgM抗體結合形成紫紅色沉淀條帶，當樣本中不含抗HEV IgM時,膠體金標記的HEV抗原無法與Tl線區的抗人IgM抗體結合。當樣本中含有抗HEV IgG時，抗HEV IgG能與膠體金標記HEV抗原結合形成復合物，該復合物在層析過程中又與T2線區的抗人IgM抗體結合形成紫紅色沉淀條帶，否則不顯色，無論樣本中是否含有抗HEV IgM，C線區的抗IgG抗體都會與膠體金標記的HEV抗原結合形成一條紫紅色對照C線。C線的顯色是判定是否有足夠樣本，層析過程是否正常的標準，同時也作為該試劑的內控標準。
[0015]本發明的有益技術效果:
利用免疫層析法原理，采用膠體金標記技術，本申請人研制出HEV IgM及IgG抗體檢測試紙，它采用高度特異性的抗原抗體反應、免疫層析技術及膠體金標記技術，可快速檢測人血液樣本中的HEV IgM及IgG抗體，適合于戊型肝炎的早期特異性診斷。HEV感染人體后，人的免疫系統會產生針對該病毒的特異性抗體，主要為IgM及IgG抗體，經研究發現這兩種抗體的產生及存在有如下幾個特點:(I)在非肝炎患者或健康人群中可以出現抗HEV IgG和IgM陽性，前者為既往HEV隱性感染，后者為新近隱性感染；(2)急性戊肝早期抗-HEV IgG和IgM均可陽性，抗-HEV IgG的活性和陽性率均高于IgM,而IgM的A值比IgG下降快，故抗-HEV IgM可作為急性戊肝的確診依據。但若IgM陰性時，結合臨床表現、肝功能檢查等，抗HEV IgG陽性同樣具有急性戊肝的確診價值。本發明所提供的HEV IgM及IgG抗體檢測試紙，可同時檢測HEV IgM及IgG抗體，相比較單一檢測HEV IgM抗體的產品臨床陽性檢出率更高，可避免因為HEV IgM陰性或滴度較低而造成漏檢的情況發生，為戊型肝炎的確診提供更好的依據。
【附圖說明】
[0016]圖1為本發明的結構示意圖；
圖2為本發明硝酸纖維膜的結構示意圖；
圖3為本發明的檢測結果判斷示意圖。
[0017]附圖標記:
1-樣品墊；2_金標抗原結合墊；3_硝酸纖維素膜；4_吸水墊；5_底板。
【具體實施方式】
[0018]下面結合具體實施為例，進一步闡述本發明，應注意，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。
[0019]實施例1
結合附圖1、2:檢測人HEV IgM及IgG的免疫層析試紙，所述試紙包括樣品墊1、金標抗原結合墊2、硝酸纖維素膜3、吸水墊4和底板5 ;所述硝酸纖維素膜3在所述底板5的中部，在所述硝酸纖維素膜3沿底板的一端依次為金標抗原結合墊2、樣品墊I，在所述硝酸纖維素膜3沿底板的另一端為吸水墊4，且每相鄰兩者之間部分疊合；所述硝酸纖維素膜3靠近吸水墊4 一端為質控區，另一端為檢測區；硝酸纖維素膜3包含包被有抗人IgM抗體(設為Tl線)及包被有抗人IgG抗體(設為T2線)的檢測區和包被有抗IgG抗體的質控區；硝酸纖維素膜3靠近吸水墊4 一端為質控區，另一端為檢測區；所述檢測區設有檢測線(Tl、T2線)，所述質控區設有質控線(C線);金標抗原結合墊2上包被有膠體金標記的HEV抗原及膠體金標記的兔IgG抗體。
[0020]實施例2
與實施例1的不同之處在于，金標抗原結合墊2上包被有乳膠標記的HEV抗原及乳膠標記的兔IgG抗體。
[0021]實施例3
與實施例1的不同之處在于，金標抗原結合墊2上包被有膠體硒標記的HEV抗原及膠體硒標記的兔IgG抗體。
[0022]以下實施例4-5為檢測人HEV IgM及IgG的免疫層析試紙的制備方法實施例4
a)準備樣品墊、吸水