專利名稱：一種新的多肽——人f1f0 atp合成酶亞基15和編碼這種多肽的多核苷酸的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體地說，本發明描述了一種新的多肽——人F1F0ATP合成酶亞基15，以及編碼此多肽的多核苷酸序列。本發明還涉及此多核苷酸和多肽的制備方法和應用。
依賴真核細胞的呼吸作用，線粒體ATP合成酶可作為驅動力，它可被質子泵ATP合成酶所水解。線粒體ATP合成酶是多亞基復合物，容易分裂為兩個亞復合物，一個稱為F0，它跨越線粒體膜，一個稱為F1，它通過線粒體膜內側的細柄與F0相連接。F1是催化位點，而F0通過細柄構型變化負責轉換膜電化學質子梯度的能量給F1。ATP的合成底物包括磷酸、ADP、膜電化學質子梯度，ATP的合成有一個平衡，腺嘌呤核苷酸移位酶是ATP合成的重要調控成分(Tager etal.,1983)，它可成為速率限制因素。ATP合成的逆向反應可被ADP敏感地抑制；當ATP過量時電子傳遞鏈被阻遏，ATP合成的正向逆向反應減慢。ATP合成酶的運動學特性和最大活性對應于ATP合成的最大速率(Kathryn F et al.,1992)。
ATP合成酶的疏水催化區域即F1有三個大的β亞基、三個大的α亞基及三個簡單重復的亞基γ、δ與ε亞基。ATP合成酶F1催化區域象一個“質子洞”，氫離子在此處被作用，其能量并不直接用于形成P-O鍵，而用于改變ATP的結合構型。F1上結合腺嘌呤核苷酸的位點可與ADP和磷酸結合線粒體亞單位顆粒以在緊密的催化區域形成ATP。催化區域上ATP的釋放可使ATP或PI發生交換。F1的β亞基或一個α亞基β亞基的界面跨越了催化區域，這樣一個ATP合成酶F1就有三個特異的催化位點，在這樣的催化位點上發生著ATP的合成與水解。
ATP合成酶F1的細柄包含亞基γ、δ、ε、OSCP、F-6及b、d亞基，它的長度約為40-50埃(Haiming Chen et al.,1995).
ATP合成酶F0區域涉及質子移位的催化與抑制(Kathryn F et al.,1992)線粒體呼吸鏈復合物Ⅴ即F1F0 ATP合成酶在鼠心肌細胞、犬心肌細胞、小兒骨胳肌、成人心肌細胞、人胎盤已被研究。ATP合成酶是一種至少由16種不同多肽組成的多聚復合物，其中兩種在線粒體上編碼，其余的由核基因編碼。它可被氰化物所阻遏，它可被鈣離子所調控(Das AM et al.,1998)。
研究發現，F1F0 ATP合成酶表達及參與代謝的異常可引起各種疾病。ATP合成酶F1的細柄OSCP亞基的突變與人的DOWN綜合癥關系密切(Haiming Chen etal.,1995)。胎鼠與幼鼠子宮內的生長遲緩(IUGR)與F1F0 ATP合成酶C亞基(SUC)的低表達有關(Lane RH,et al.,1998)。幼兒遲發性纖維原細胞臘樣脂褐素病變(NCL)、BATTEN病癥與F1F0 ATP合成酶第9亞基的代謝異常有關(Majander A,et al.1997)。利伯氏病(球后視神經炎，LHON)與NARP(神經發生不全、共濟失調、色素性視神經炎)綜合癥是由于F1F0 ATP合成酶第6亞基的突變引起(Majander A,et al.1997)。F1F0 ATP合成酶不足可引起Alzheimer氏病(Schagger H,et al.1995)由于F1F0 ATP合成酶基因家族具有以下的特征性結構域---疏水催化區域即F1有三個大的β亞基、三個大的α亞基及三個簡單重復的亞基γ、δ與ε亞基，催化區域位于β亞基中或一個α亞基β亞基的界面，一個ATP合成酶F1就有三個特異的催化位點；ATP合成酶F1的細柄包含亞基γ、δ、ε、OSCP、F-6及b、d亞基；ATP合成酶F0區域涉及質子移位的催化與抑制。本發明的人多肽具有F1F0ATP合成酶亞基d的特征性結構，故認為本發明的新基因為一編碼F1F0 ATP合成酶基因家族的基因，命名為人F1F0-ATP合成酶亞基15。并以此推斷其具有F1F0ATP合成酶基因家族相似的生物學功能。
本發明的一個目的是提供分離的新的多肽——人F1F0 ATP合成酶亞基15以及其片段、類似物和衍生物。
本發明的另一個目的是提供編碼該多肽的多核苷酸。
本發明的另一個目的是提供含有編碼人F1F0 ATP合成酶亞基15的多核苷酸的重組載體。
本發明的另一個目的是提供含有編碼人F1F0 ATP合成酶亞基15的多核苷酸的基因工程化宿主細胞。
本發明的另一個目的是提供生產人F1F0 ATP合成酶亞基15的方法。
本發明的另一個目的是提供針對本發明的多肽——人F1F0 ATP合成酶亞基15的抗體。
本發明的另一個目的是提供了針對本發明多肽——人F1F0 ATP合成酶亞基15的模擬化合物、拮抗劑、激動劑、抑制劑。
本發明的另一個目的是提供診斷治療與人F1F0 ATP合成酶亞基15異常相關的疾病的方法。
在本發明的第一方面，提供新穎的分離出的人F1F0 ATP合成酶亞基15，該多肽是人源的，它包含具有SEQ ID NO:2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物、類似物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO:2氨基酸序列的多肽。
在本發明的第二方面，提供編碼分離的這些多肽的多核苷酸，該多核苷酸包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少70％相同性(a)編碼上述人F1F0 ATP合成酶亞基15的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。較佳地，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，該多核苷酸的序列是選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO:1中47-460位的序列；和(b)具有SEQ ID NO:1中1-531位的序列。
在本發明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的載體，以及被該載體轉化或轉導的宿主細胞或者被上述多核苷酸直接轉化或轉導的宿主細胞。
本發明的其它方面由于本文的技術的公開，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。
如本發明所用，“分離的”是指物質從其原始環境中分離出來(如果是天然的物質，原始環境即是天然環境)。如活體細胞內的天然狀態下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態中同存在的其他物質中分開，則為分離純化的。
如本文所用，“分離的人F1F0 ATP合成酶亞基15”是指人F1F0 ATP合成酶亞基15基本上不含天然與其相關的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質。本領域的技術人員能用標準的蛋白質純化技術純化人F1F0 ATP合成酶亞基15。基本上純的多肽在非還原聚丙烯酰胺凝膠上能產生單一的主帶。人F1F0 ATP合成酶亞基15多肽的純度能用氨基酸序列分析。
本發明提供了一種新的多肽——人F1F0 ATP合成酶亞基15，其基本上是由SEQID NO:2所示的氨基酸序列組成的。本發明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優選重組多肽。本發明的多肽可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。根據重組生產方案所用的宿主，本發明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發明還包括人F1F0 ATP合成酶亞基15的片段、衍生物和類似物。如本發明所用，術語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發明的人F1F0 ATP合成酶亞基15相同的生物學功能或活性的多肽。本發明多肽的片段、衍生物或類似物可以是(Ⅰ)這樣一種，其中一個或多個氨基酸殘基被保守或非保守氨基酸殘基(優選的是保守氨基酸殘基)取代，并且取代的氨基酸可以是也可以不是由遺傳密碼子編碼的；或者(Ⅱ)這樣一種，其中一個或多個氨基酸殘基上的某個基團被其它基團取代包含取代基；或者(Ⅲ)這樣一種，其中成熟多肽與另一種化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合；或者(Ⅳ)這樣一種，其中附加的氨基酸序列融合進成熟多肽而形成的多肽序列(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列)通過本文的闡述，這樣的片段、衍生物和類似物被認為在本領域技術人員的知識范圍之內。
本發明提供了分離的核酸(多核苷酸)，基本由編碼具有SEQ ID NO:2氨基酸序列的多肽的多核苷酸組成。本發明的多核苷酸序列包括SEQ ID NO:1的核苷酸序列。本發明的多核苷酸是從人胎腦組織的cDNA文庫中發現的。它包含的多核苷酸序列全長為531個堿基，其開放讀框(47-460)編碼了137氨基酸。根據氨基酸序列同源比較發現，此多肽與同源蛋白人F1F0 ATP合成酶亞基d有62％的同源性，可推斷出該人F1F0 ATP合成酶亞基15具有同源蛋白人F1F0 ATP合成酶亞基d相似的結構和功能。
本發明的多核苷酸可以是DNA形式或是RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區序列可以與SEQ ID NO:1所示的編碼區序列相同或者是簡并的變異體。如本發明所用，“簡并的變異體”在本發明中是指編碼具有SEQ ID NO:2的蛋白質或多肽，但與SEQ ID NO:1所示的編碼區序列有差別的核酸序列。
編碼SEQ ID NO:2的成熟多肽的多核苷酸包括只有成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術語“編碼多肽的多核苷酸”是指包括編碼此多肽的多核苷酸和包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發明還涉及上述描述多核苷酸的變異體，其編碼與本發明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片斷、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發生的等位變異體或非天然發生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質上改變其編碼的多肽的功能。
本發明還涉及與以上所描述的序列雜交的多核苷酸(兩個序列之間具有至少50％，優選具有70％的相同性)。本發明特別涉及在嚴格條件下與本發明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發明中，“嚴格條件”是指(1)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)雜交時加用變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll,42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在95％以上，更好是97％以上時才發生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO:2所示的成熟多肽有相同的生物學功能和活性。
本發明還涉及與以上所描述的序列雜交的核酸片段。如本發明所用，”核酸片段”的長度至少含10個核苷酸，較好是至少20-30個核苷酸，更好是至少50-60個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段也可用于核酸的擴增技術(如PCR)以確定和/或分離編碼人F1F0 ATP合成酶亞基15的多核苷酸。
本發明中的多肽和多核苷酸優選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質。
本發明的編碼人F1F0 ATP合成酶亞基15的特異的多核苷酸序列能用多種方法獲得。例如，用本領域熟知的雜交技術分離多核苷酸。這些技術包括但不局限于1)用探針與基因組或cDNA文庫雜交以檢出同源的多核苷酸序列，和2)表達文庫的抗體篩選以檢出具有共同結構特征的克隆的多核苷酸片段。
本發明的DNA片段序列也能用下列方法獲得1)從基因組DNA分離雙鏈DNA序列；2)化學合成DNA序列以獲得所述多肽的雙鏈DNA。
上述提到的方法中，分離基因組DNA最不常用。DNA序列的直接化學合成是經常選用的方法。更經常選用的方法是cDNA序列的分離。分離感興趣的cDNA的標準方法是從高表達該基因的供體細胞分離mRNA并進行逆轉錄，形成質粒或噬菌體cDNA文庫。提取mRNA的方法已有多種成熟的技術，試劑盒也可從商業途徑獲得(Qiagene)。而構建cDNA文庫也是通常的方法(Sambrook,et al.,MolecularCloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory.New York,1989)。還可得到商業供應的cDNA文庫，如Clontech公司的不同cDNA文庫。當結合使用聚合酶反應技術時，即使極少的表達產物也能克隆。
可用常規方法從這些cDNA文庫中篩選本發明的基因。這些方法包括(但不限于)(1)DNA-DNA或DNA-RNA雜交；(2)標志基因功能的出現或喪失；(3)測定人F1F0 ATP合成酶亞基15的轉錄本的水平；(4)通過免疫學技術或測定生物學活性，來檢測基因表達的蛋白產物。上述方法可單用，也可多種方法聯合應用。
在第(1)種方法中，雜交所用的探針是與本發明的多核苷酸的任何一部分同源，其長度至少10個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸。此外，探針的長度通常在2000個核苷酸之內，較佳的為1000個核苷酸之內。此處所用的探針通常是在本發明的基因序列信息的基礎上化學合成的DNA序列。本發明的基因本身或者片段當然可以用作探針。DNA探針的標記可用放射性同位素，熒光素或酶(如堿性磷酸酶)等。
在第(4)種方法中，檢測人F1F0 ATP合成酶亞基15基因表達的蛋白產物可用免疫學技術如Western印跡法，放射免疫沉淀法，酶聯免疫吸附法(ELISA)等。
應用PCR技術擴增DNA/RNA的方法(Saiki,et al.Science1985；230:1350-1354)被優選用于獲得本發明的基因。特別是很難從文庫中得到全長的cDNA時，可優選使用RACE法(RACE-cDNA末端快速擴增法)，用于PCR的引物可根據本文所公開的本發明的多核苷酸序列信息適當地選擇，并可用常規方法合成。可用常規方法如通過凝膠電泳分離和純化擴增的DNA/RNA片段。
如上所述得到的本發明的基因，或者各種DNA片段等的多核苷酸序列可用常規方法如雙脫氧鏈終止法(Sanger et al.PNAS,1977,74:5463-5467)測定。這類多核苷酸序列測定也可用商業測序試劑盒等。為了獲得全長的cDNA序列，測序需反復進行。有時需要測定多個克隆的cDNA序列，才能拼接成全長的cDNA序列。
本發明也涉及包含本發明的多核苷酸的載體，以及用本發明的載體或直接用人F1F0 ATP合成酶亞基15編碼序列經基因工程產生的宿主細胞，以及經重組技術產生本發明所述多肽的方法。
本發明中，編碼人F1F0 ATP合成酶亞基15的多核苷酸序列可插入到載體中，以構成含有本發明所述多核苷酸的重組載體。術語“載體”指本領域熟知的細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒如腺病毒、逆轉錄病毒或其它載體。在本發明中適用的載體包括但不限于在細菌中表達的基于T7啟動子的表達載體(Rosenberg,et al.Gene,1987,56:125)；在哺乳動物細胞中表達的pMSXND表達載體(Lee and Nathans,J Bio Chem.263:3521,1988)和在昆蟲細胞中表達的來源于桿狀病毒的載體。總之，只要能在宿主體內復制和穩定，任何質粒和載體都可以用于構建重組表達載體。表達載體的一個重要特征是通常含有復制起始點、啟動子、標記基因和翻譯調控元件。
本領域的技術人員熟知的方法能用于構建含編碼人F1F0 ATP合成酶亞基15的DNA序列和合適的轉錄/翻譯調控元件的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等(Sambroook,et al.Molecular Cloning,aLaboratory Manual,cold Spring Harbor Laboratory.New York,1989)。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。這些啟動子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動子；λ噬菌體的PL啟動子；真核啟動子包括CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、反轉錄病毒的LTRs和其它一些已知的可控制基因在原核細胞或真核細胞或其病毒中表達的啟動子。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子等。在載體中插入增強子序列將會使其在高等真核細胞中的轉錄得到增強。增強子是DNA表達的順式作用因子，通常大約有10到300個堿基對，作用于啟動子以增強基因的轉錄。可舉的例子包括在復制起始點晚期一側的100到270個堿基對的SV40增強子、在復制起始點晚期一側的多瘤增強子以及腺病毒增強子等。
此外，表達載體優選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環素或氨芐青霉素抗性等。
本領域一般技術人員都清楚如何選擇適當的載體/轉錄調控元件(如啟動子、增強子等)和選擇性標記基因。
本發明中，編碼人F1F0 ATP合成酶亞基15的多核苷酸或含有該多核苷酸的重組載體可轉化或轉導入宿主細胞，以構成含有該多核苷酸或重組載體的基因工程化宿主細胞。術語“宿主細胞”指原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；細菌細胞如鼠傷寒沙門氏菌；真菌細胞如酵母；植物細胞；昆蟲細胞如果蠅S2或Sf9；動物細胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤細胞等。
用本發明所述的DNA序列或含有所述DNA序列的重組載體轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態細胞可在指數生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。可供選擇的是用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法磷酸鈣共沉淀法，或者常規機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。
通過常規的重組DNA技術，利用本發明的多核苷酸序列可用來表達或生產重組的人F1F0 ATP合成酶亞基15(Science,1984；224:1431)。一般來說有以下步驟(1)．用本發明的編碼人人F1F0 ATP合成酶亞基15的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；(2)．在合適的培養基中培養宿主細胞；(3)．從培養基或細胞中分離、純化蛋白質。
在步驟(2)中，根據所用的宿主細胞，培養中所用的培養基可選自各種常規培養基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養。當宿主細胞生長到適當的細胞密度后，用合適的方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養一段時間。
在步驟(3)中，重組多肽可包被于細胞內、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法包括但并不限于常規的復性處理、蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超聲波處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。
應用領域線粒體呼吸鏈復合物V即F1F0 ATP合成酶在能量與物質代謝中具有重要作用。
研究發現，F1F0 ATP合成酶表達及參與代謝的異常可引起各種疾病。ATP合成酶F1的細柄OSCP亞基的突變與人的DOWN綜合癥關系密切。胎鼠與幼鼠子宮內的生長遲緩(IUGR)與F1F0 ATP合成酶C亞基(SUC)的低表達有關。幼兒遲發性纖維原細胞臘樣脂褐素病變(NCL)、BATTEN病癥與F1F0 ATP合成酶第9亞基的代謝異常有關。利伯氏病(球后視神經炎，LHON)與NARP(神經發生不全、共濟失調、色素性視神經炎)綜合癥是由于F1F0 ATP合成酶第6亞基的突變引起。F1F0 ATP合成酶不足可引起Alzheimer氏病。
故本發明的人F1F0-ATP合成酶亞基15的表達異常將產生各種疾病，如DOWN綜合癥、子宮內的生長遲緩、幼兒遲發性纖維原細胞臘樣脂褐素病變、BATTEN病癥、利伯氏病、Alzheimer氏病等，并與能量代謝及物質代謝障礙性疾病密切有關。這些疾病包括但不限于碳水化合物代謝病糖原儲積病、半乳糖血癥、遺傳性果糖不耐受、原發性乳酸酸中毒脂質代謝異常病脂舫酸氧化障礙、低β脂蛋白血癥氨基酸代謝病苯丙酮尿癥，酪氨酸代謝缺陷性癥如新生兒一過性高酪基酸血癥、急性酪氨酸亞急性和慢性酪氨酸血癥、白化病，含硫氨基酸代謝缺陷病，色氨基酸代謝缺陷病，甘氨酸代謝缺陷病，谷氨酸代謝缺陷病，尿素循環的代謝缺陷病，組氨酸代謝缺陷病，賴氨酸代謝缺陷病，及其它氨基酸代謝缺陷病。
發育紊亂癥先天性流產、脊柱裂、顱腦裂、腦膨出、孔腦畸形、先天性腦積水、導水管畸形、軟骨發育不全性侏儒病、脊柱骨骺發育不良癥、假軟骨發育不全癥、生殖腺發育不全、先天性腎上腺增生、尿道上裂、隱、先天性青光眼或白內障、先天性小瞼裂、視網膜發育異常、先天性視神經萎縮、先天性感覺神經性聽覺損失、裂手裂腳癥、畸胎、Williams綜合癥、貝魏二氏綜合癥本發明的多肽以及該多肽的拮抗劑、激動劑和抑制劑可直接用于疾病治療，例如，可治療多種疾病，尤其是能量代謝與物質代謝障礙性疾病如DOWN綜合癥、子宮內的生長遲緩、幼兒遲發性纖維原細胞臘樣脂褐素病變、BATTEN病癥、利伯氏病、Alzheimer氏病及其它碳水化合物代謝病、脂質代謝異常病、氨基酸代謝病、發育紊亂癥，某些腫瘤，某些遺傳性疾病、神經系統疾病、血液病及免疫系統疾病等。本發明還公開了抗此多肽的拮抗劑及其治療作用。本發明還公開了編碼這種新的人F1F0 ATP合成酶亞基15的多核苷酸的用途。
本發明也提供了篩選化合物以鑒定提高(激動劑)或阻遏(拮抗劑)人F1F0 ATP合成酶亞基15的藥劑的方法。激動劑提高人F1F0 ATP合成酶亞基15刺激細胞增殖等生物功能，而拮抗劑阻止和治療與細胞過度增殖有關的紊亂如各種癌癥。例如，能在藥物的存在下，將哺乳動物細胞或表達人F1F0 ATP合成酶亞基15的膜制劑與標記的人F1F0 ATP合成酶亞基15一起培養。然后測定藥物提高或阻遏此相互作用的能力。
人F1F0 ATP合成酶亞基15的拮抗劑包括篩選出的抗體、化合物、受體缺失物和類似物等。人F1F0 ATP合成酶亞基15的拮抗劑可以與人F1F0 ATP合成酶亞基15結合并消除其功能，或是抑制該多肽的產生，或是與該多肽的活性位點結合使該多肽不能發揮生物學功能。
在篩選作為拮抗劑的化合物時，可以將人F1F0 ATP合成酶亞基15加入生物分析測定中，通過測定化合物對人F1F0 ATP合成酶亞基15和其受體之間相互作用的影響來確定化合物是否是拮抗劑。用上述篩選化合物的同樣方法，可以篩選出起拮抗劑作用的受體缺失物和類似物。能與人F1F0 ATP合成酶亞基15結合的多肽分子可通過篩選由各種可能組合的氨基酸結合于固相物組成的隨機多肽庫而獲得。篩選時，一般應對人F1F0 ATP合成酶亞基15分子進行標記。
本發明提供了用多肽，及其片段、衍生物、類似物或它們的細胞作為抗原以生產抗體的方法。這些抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體。本發明還提供了針對人F1F0 ATP合成酶亞基15抗原決定簇的抗體。這些抗體包括(但不限于)多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段和Fab表達文庫產生的片段。
多克隆抗體的生產可用人F1F0 ATP合成酶亞基15直接注射免疫動物(如家兔，小鼠，大鼠等)的方法得到，多種佐劑可用于增強免疫反應，包括但不限于弗氏佐劑等。制備人F1F0 ATP合成酶亞基15的單克隆抗體的技術包括但不限于雜交瘤技術(Kohler and Milstein.Nature,1975,256:495-497)，三瘤技術，人B-細胞雜交瘤技術，EBV-雜交瘤技術等。將人恒定區和非人源的可變區結合的嵌合抗體可用已有的技術生產(Morrison et al,PNAS,1985,81:6851)。而已有的生產單鏈抗體的技術(U.S.Pat No.4946778)也可用于生產抗人F1F0 ATP合成酶亞基15的單鏈抗體。
抗人F1F0 ATP合成酶亞基15的抗體可用于免疫組織化學技術中，檢測活檢標本中的人F1F0 ATP合成酶亞基15。
與人F1F0 ATP合成酶亞基15結合的單克隆抗體也可用放射性同位素標記，注入體內可跟蹤其位置和分布。這種放射性標記的抗體可作為一種非創傷性診斷方法用于腫瘤細胞的定位和判斷是否有轉移。
抗體還可用于設計針對體內某一特殊部位的免疫毒素。如人F1F0 ATP合成酶亞基15高親和性的單克隆抗體可與細菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，紅豆堿等)共價結合。一種通常的方法是用巰基交聯劑如SPDP，攻擊抗體的氨基，通過二硫鍵的交換，將毒素結合于抗體上，這種雜交抗體可用于殺滅人F1F0 ATP合成酶亞基15陽性的細胞。
本發明中的抗體可用于治療或預防與人F1F0 ATP合成酶亞基15相關的疾病。給予適當劑量的抗體可以刺激或阻斷人F1F0 ATP合成酶亞基15的產生或活性。
本發明還涉及定量和定位檢測人F1F0 ATP合成酶亞基15水平的診斷試驗方法。這些試驗是本領域所熟知的，且包括FISH測定和放射免疫測定。試驗中所檢測的人F1F0 ATP合成酶亞基15水平，可以用作解釋人F1F0 ATP合成酶亞基15在各種疾病中的重要性和用于診斷人F1F0 ATP合成酶亞基15起作用的疾病。
本發明的多肽還可用作肽譜分析，例如，多肽可用物理的、化學或酶進行特異性切割，并進行一維或二維或三維的凝膠電泳分析，更好的是進行質譜分析。
編碼人F1F0 ATP合成酶亞基15的多核苷酸也可用于多種治療目的。基因治療技術可用于治療由于人F1F0 ATP合成酶亞基15的無表達或異常/無活性表達所致的細胞增殖、發育或代謝異常。重組的基因治療載體(如病毒載體)可設計用于表達變異的人F1F0 ATP合成酶亞基15，以抑制內源性的人F1F0 ATP合成酶亞基15活性。例如，一種變異的人F1F0 ATP合成酶亞基15可以是縮短的、缺失了信號傳導功能域的人F1F0 ATP合成酶亞基15，雖可與下游的底物結合，但缺乏信號傳導活性。因此重組的基因治療載體可用于治療人F1F0 ATP合成酶亞基15表達或活性異常所致的疾病。來源于病毒的表達載體如逆轉錄病毒、腺病毒、腺病毒相關病毒、單純皰疹病毒、細小病毒等可用于將編碼人F1F0 ATP合成酶亞基15的多核苷酸轉移至細胞內。構建攜帶編碼人F1F0 ATP合成酶亞基15的多核苷酸的重組病毒載體的方法可見于已有文獻(Sambrook,et a1.)。另外重組編碼人F1F0 ATP合成酶亞基15的多核苷酸可包裝到脂質體中轉移至細胞內。
多核苷酸導入組織或細胞內的方法包括將多核苷酸直接注入到體內組織中；或在體外通過載體(如病毒、噬菌體或質粒等)先將多核苷酸導入細胞中，再將細胞移植到體內等。
抑制{多肽名稱}mRNA的寡核苷酸(包括反義RNA和DNA)以及核酶也在本發明的范圍之內。核酶是一種能特異性分解特定RNA的酶樣RNA分子，其作用機制是核酶分子與互補的靶RNA特異性雜交后進行核酸內切作用。反義的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技術獲得，如固相磷酸酰胺化學合成法合成寡核苷酸的技術已廣泛應用。反義RNA分子可通過編碼該RNA的DNA序列在體外或體內轉錄獲得。這種DNA序列已整合到載體的RNA聚合酶啟動子的下游。為了增加核酸分子的穩定性，可用多種方法對其進行修飾，如增加兩側的序列長度，核糖核苷之間的連接應用磷酸硫酯鍵或肽鍵而非磷酸二酯鍵。
編碼人F1F0 ATP合成酶亞基15的多核苷酸可用于與人F1F0 ATP合成酶亞基15的相關疾病的診斷。編碼人F1F0 ATP合成酶亞基15的多核苷酸可用于檢測人F1F0 ATP合成酶亞基15的表達與否或在疾病狀態下人F1F0 ATP合成酶亞基15的異常表達。如編碼人F1F0 ATP合成酶亞基15的DNA序列可用于對活檢標本進行雜交以判斷人F1F0 ATP合成酶亞基15的表達狀況。雜交技術包括Southern印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術方法都是公開的成熟技術，相關的試劑盒都可從商業途徑得到。本發明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(Microarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達分析和基因診斷。用人F1F0 ATP合成酶亞基15特異的引物進行RNA-聚合酶鏈反應(RT-PCR)體外擴增也可檢測人F1F0 ATP合成酶亞基15的轉錄產物。
檢測人F1F0 ATP合成酶亞基15基因的突變也可用于診斷人F1F0 ATP合成酶亞基15相關的疾病。人F1F0 ATP合成酶亞基15突變的形式包括與正常野生型人F1F0 ATP合成酶亞基15 DNA序列相比的點突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等。可用已有的技術如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無突變。
本發明的序列對染色體鑒定也是有價值的。該序列會特異性地針對某條人染色體具體位置且并可以與其雜交。目前，需要鑒定染色體上的各基因的具體位點。現在，只有很少的基于實際序列數據(重復多態性)的染色體標記物可用于標記染色體位置。根據本發明，為了將這些序列與疾病相關基因相關聯，其重要的第一步就是將這些DNA序列定位于染色體上。
簡而言之，根據cDNA制備PCR引物(優選15-35bp)，可以將序列定位于染色體上。然后，將這些引物用于PCR篩選含各條人染色體的體細胞雜合細胞。只有那些含有相應于引物的人基因的雜合細胞會產生擴增的片段。
體細胞雜合細胞的PCR定位法，是將DNA定位到具體染色體的快捷方法。使用本發明的寡核苷酸引物，通過類似方法，可利用一組來自特定染色體的片段或大量基因組克隆而實現亞定位。可用于染色體定位的其它類似策略包括原位雜交、用標記的流式分選的染色體預篩選和雜交預選，從而構建染色體特異的cDNA庫。
將cDNA克隆與中期染色體進行熒光原位雜交(FISH)，可以在一個步驟中精確地進行染色體定位。此技術的綜述，參見Verma等，Human Chromosomes:a Manualof Basic Techniques,Pergamon Press,New York(1988)。
一旦序列被定位到準確的染色體位置，此序列在染色體上的物理位置就可以與基因圖數據相關聯。這些數據可見于例如，V.Mckusick,MendelianInheritance in Man(可通過與Johns Hopkins University Welch Medical Library聯機獲得)。然后可通過連鎖分析，確定基因與業已定位到染色體區域上的疾病之間的關系。
接著，需要測定患病和未患病個體間的cDNA或基因組序列差異。如果在一些或所有的患病個體中觀察到某突變，而該突變在任何正常個體中未觀察到，則該突變可能是疾病的病因。比較患病和未患病個體，通常涉及首先尋找染色體中結構的變化，如從染色體水平可見的或用基于cDNA序列的PCR可檢測的缺失或易位。根據目前的物理作圖和基因定位技術的分辨能力，被精確定位至與疾病有關的染色體區域的cDNA，可以是50至500個潛在致病基因間之一種(假定1兆堿基作圖分辨能力和每20kb對應于一個基因)。
可以將本發明的多肽、多核苷酸及其模擬物、激動劑、拮抗劑和抑制劑與合適的藥物載體組合后使用。這些載體可以是水、葡萄糖、乙醇、鹽類、緩沖液、甘油以及它們的組合。組合物包含安全有效量的多肽或拮抗劑以及不影響藥物效果的載體和賦形劑。這些組合物可以作為藥物用于疾病治療。
本發明還提供含有一種或多種容器的藥盒或試劑盒，容器中裝有一種或多種本發明的藥用組合物成分。與這些容器一起，可以有由制造、使用或銷售藥品或生物制品的政府管理機構所給出的指示性提示，該提示反映出生產、使用或銷售的政府管理機構許可其在人體上施用。此外，本發明的多肽可以與其它的治療化合物結合使用。
藥物組合物可以以方便的方式給藥，如通過局部、靜脈內、腹膜內、肌內、皮下、鼻內或皮內的給藥途徑。人F1F0 ATP合成酶亞基15以有效地治療和/或預防具體的適應癥的量來給藥。施用于患者的人F1F0 ATP合成酶亞基15的量和劑量范圍將取決于許多因素，如給藥方式、待治療者的健康條件和診斷醫生的判斷。
下列附圖用于說明本發明的具體實施方案，而不用于限定由權利要求書所界定的本發明范圍。


圖1是本發明人F1F0 ATP合成酶亞基15和同源蛋白人F1F0 ATP合成酶亞基d的氨基酸序列同源性比較圖。上方序列是人F1F0 ATP合成酶亞基15，下方序列是同源蛋白人F1F0 ATP合成酶亞基d。相同氨基酸在兩個序列間用單字符氨基酸表示，相似氨基酸用“+”表示。
圖2為分離的人F1F0 ATP合成酶亞基15的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖(SDS-PAGE)。15kDa為蛋白質的分子量。箭頭所指為分離出的蛋白條帶。
{實施例}下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例1人F1F0 ATP合成酶亞基15的克隆用異硫氰酸胍/酚/氯仿一步法提取人胎腦總RNA。用Quik mRNA Isolation Kit(Qiegene公司產品)從總RNA中分離poly(A)mRNA。2ug poly(A)mRNA經逆轉錄形成cDNA。用Smart cDNA克隆試劑盒(購自Clontech)將cDNA片段定向插入到pBSK(+)載體(Clontech公司產品)的多克隆位點上，轉化DH5α，細菌形成cDNA文庫。用Dyeterminate cycle reaction sequencing kit(Perkin-Elmer公司產品)和ABI 377自動測序儀(Perkin-Elmer公司)測定所有克隆的5′和3′末端的序列。將測定的cDNA序列與已有的公共DNA序列數據庫(Genebank)進行比較，結果發現其中一個克隆0023的cDNA序列為新的DNA。通過合成一系列引物對該克隆所含的插入cDNA片段進行雙向測定。結果表明，0023克隆所含的全長cDNA為531bp(如Seq ID NO:1所示)，從第47bp至460bp有一個423bp的開放閱讀框架(ORF)，編碼一個新的蛋白質(如Seq ID NO:2所示)。我們將此克隆命名為pBS-0023，編碼的蛋白質命名為人F1F0 ATP合成酶亞基15。實施例2cDNA克隆的同源檢索將本發明的人F1F0 ATP合成酶亞基15的序列及其編碼的蛋白序列，用Blast程序(Basiclocal Alignment search tool)[Altschul,SF et al.J.Mol.Biol.1990；215:403-10],在Genbank、Swissport等數據庫進行同源檢索。與本發明的人F1F0 ATP合成酶亞基15同源性最高的基因是一種已知的人F1F0 ATP合成酶亞基d，其編碼的蛋白在Genbank的準入號為AF070650。蛋白質同源結果示于圖1，兩者高度同源，其相同性為62％；相似性為70％。實施例3用RT-PCR方法克隆編碼人F1F0 ATP合成酶亞基15的基因用胎腦細胞總RNA為模板，以oligo-dT為引物進行逆轉錄反應合成cDNA，用Qiagene的試劑盒純化后，用下列引物進行PCR擴增Primer1: 5’-GGCTGCGGAGGACCGTGGGCAGC-3’(SEQ ID NO:3)
Primer2:5’-ACCGTATAATTATTATTTTTAAT-3’(SEQ ID NO:4)Primer1為位于SEQ ID NO:1的5’端的第1bp開始的正向序列；Primer2為SEQ ID NO:1的中的3’端反向序列。
擴增反應的條件在50μl的反應體積中含有50mmol/L KCl,10mmol/L Tris-Cl,(pH8.5),1.5mmol/L MgCl2,200μmol/L dNTP,10pmol引物，1U的Taq DNA聚合酶(Clontech公司產品)。在PE9600型DNA熱循環儀(Perkin-Elmer公司)上按下列條件反應25個周期94℃ 30sec；55℃ 30sec；72C 2min。在RT-PCR時同時設β-actin為陽性對照和模板空白為陰性對照。擴增產物用QIAGEN公司的試劑盒純化，用TA克隆試劑盒連接到pCR載體上(Invitrogen公司產品)。DNA序列分析結果表明PCR產物的DNA序列與SEQ ID NO:1所示的1-531bp完全相同。實施例4Northern印跡法分析人FIF0 ATP合成酶亞基15基因的表達用一步法提取總RNA[Anal.Biochem 1987,162,156-159]。該法包括酸性硫氰酸胍苯酚-氯仿抽提。即用4M異硫氰酸胍-25mM檸檬酸鈉，0.2M乙酸鈉(pH4.0)對組織進行勻漿，加入1倍體積的苯酚和1/5體積的氯仿-異戊醇(49∶1)，混合后離心。吸出水相層，加入異丙醇(0.8體積)并將混合物離心得到RNA沉淀。將得到的RNA沉淀用70％乙醇洗滌，干燥并溶于水中。用20μg RNA，在含20mM 3-(N-嗎啉代)丙磺酸(pH7.0)-5mM乙酸鈉-1mM EDTA-2.2M甲醛的1.2％瓊脂糖凝膠上進行電泳。然后轉移至硝酸纖維素膜上。用α-32p dATP通過隨機引物法制備32p-標記的DNA探針。所用的DNA探針為圖1所示的PCR擴增的人F1F0 ATP合成酶亞基15編碼區序列(47bp至460bp)。將32P-標記的探針(約2×106cpm/ml)與轉移了RNA的硝酸纖維素膜在一溶液中于42℃雜交過夜，該溶液包含50％甲酰胺-25mM KH2PO4(pH7.4)-5×SSC-5×Denhardt’s溶液和200μg/ml鮭精DNA。雜交之后，將濾膜在1×SSC-0.1％SDS中于55℃洗30min。然后，用Phosphor Imager進行分析和定量。實施例5重組人F1F0 ATP合成酶亞基15的體外表達、分離和純化根據SEQ ID NO:1和圖1所示的編碼區序列，設計出一對特異性擴增引物，序列如下Primer3:5’-CCCCATATGATGGCTGGGCGAAAACTTGCTCTA-3’(Seq ID No:5)Primer4:5’-CCCCTCGAGTTTATAAATTCTCAATTGGTTGGT-3’(Seq ID No:6)此兩段引物的5’端分別含有NdeⅠ和XhoⅠ酶切位點，其后分別為目的基因5’端和3’端的編碼序列，NdeⅠ和XhoⅠ酶切位點相應于表達載體質粒pET-28b(+)(Novagen公司產品，Cat.No.69865.3)上的選擇性內切酶位點。以含有全長目的基因的pBS-0023質粒為模板，進行PCR反應。PCR反應條件為總體積50μ1中含pBS-0023質粒10pg、引物Primer-3和Primer-4分別為10pmol、Advantage polymerase Mix(Clontech公司產品)1μl。循環參數94℃ 20s,60℃ 30s,68℃ 2min，共25個循環。用NdeⅠ和XhoⅠ分別對擴增產物和質粒pET-28(+)進行雙酶切，分別回收大片段，并用T4連接酶連接。連接產物轉化用氯化鈣法大腸桿細菌DH5α，在含卡那霉素(終濃度30μg/ml)的LB平板培養過夜后，用菌落PCR方法篩選陽性克隆，并進行測序。挑選序列正確的陽性克隆(pET-0023)用氯化鈣法將重組質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)plySs(Novagen公司產品)。在含卡那霉素(終濃度30μg/ml)的LB液體培養基中，宿主菌BL21(pET-0023)在37℃培養至對數生長期，加入IPTG至終濃度1mmol/L，繼續培養5小時。離心收集菌體，經超聲波破菌，離心收集上清，用能與6個組氨酸(6His-Tag)結合的親和層析柱His.Bind Quick Cartridge(Novagen公司產品)進行層析，得到了純化的目的蛋白人F1F0 ATP合成酶亞基15。經SDS-PAGE電泳，在15kDa處得到一單一的條帶(圖2)。將該條帶轉移至PVDF膜上用Edams水解法進行N-端氨基酸序列分析，結果N-端15個氨基酸與SEQ ID NO:2所示的N-端15個氨基酸殘基完全相同。實施例6抗人F1F0 ATP合成酶亞基15抗體的產生用多肽合成儀(PE公司產品)合成下述人F1F0 ATP合成酶亞基15特異性的多肽NH2-Met-Ala-Gly-Arg-Lys-Leu-Ala-Leu-Lys-Thr-Ile-Asp-Trp-Val-Ala-COOH(SEQ ID NO:7)。將該多肽分別與血藍蛋白和牛血清白蛋白耦合形成復合，方法參見Avrameas,et al.Immunochemistry,1969；6:43。用4mg上述血藍蛋白多肽復合物加上完全弗氏佐劑免疫家兔，15天后再用血藍蛋白多肽復合物加不完全弗氏佐劑加強免疫一次。采用經15μg/ml牛血清白蛋白多肽復合物包被的滴定板做ELISA測定兔血清中抗體的滴度。用蛋白A-Sepharose從抗體陽性的家兔血清中分離總IgG。將多肽結合于溴化氰活化的Sepharose4B柱上，用親和層析法從總IgG中分離抗多肽抗體。免疫沉淀法證明純化的抗體可特異性地與人F1F0 ATP合成酶亞基15結合。
序列表(1)一般信息(ⅱ)發明名稱人F1F0 ATP合成酶亞基15及其編碼序列(ⅲ)序列數目7(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度531bp(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:1 GGCTGCGGAGGACCGTGGGCAGCCAGGGTCGGTGAAGGATCCCAAAATGGCTGGGCGAAA61 ACTTGCTCTAAAAACCATTGACTGGGTAGCTTTTGCAGAGATCATACCCCAGAACCAAAA121 GGCCATTGCTAGTTCCCTGAAATCCTGGAATGAGACCCTCACCTCCAGGTTGGCTGCTTT181 ACCTGAGAATCCACCAGCTATCGACTGGGCTTACTACAAGGCCAATGTGGCCAAGGCTGG241 CTTGGTGGATGACTTTGAGAAGAAGGTGAAATCTTGTGCTGAGTGGGTGTCTCTCTCAAA301 GGCCAGGATTGTAGAATATGAGAAAGAGATGGAGAAGATGAAGAACTTAATTCCATTTGA361 TCAGATGACCATTGAGGACTTGAATGAAGCTTTCCCAGAAACCAAATTAGACAAGAAAAA421 GTATCCCTATTGGCCTCACCAACCAATTGAGAATTTATAAAATTGAGTCCAGGAGGAAGC481 TCTGGCCCTTGTATTACACATTCTGGACATTAAAAATAATAATTATACGGT(3)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度137個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型多肽
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:1 Met Ala Gly Arg Lys Leu Ala Leu Lys Thr Ile Asp Trp Val Ala16 Phe Ala Glu Ile Ile Pro Gln Asn Gln Lys Ala Ile Ala Ser Ser31 Leu Lys Ser Trp Asn Glu Thr Leu Thr Ser Arg Leu Ala Ala Leu46 Pro Glu Asn Pro Pro Ala Ile Asp Trp Ala Tyr Tyr Lys Ala Asn61 Val Ala Lys Ala Gly Leu Val Asp Asp Phe Glu Lys Lys Val Lys76 Ser Cys Ala Glu Trp Val Ser Leu Ser Lys Ala Arg Ile Val Glu91 Tyr Glu Lys Glu Met Glu Lys Met Lys Asn Leu Ile Pro Phe Asp106 Gln Met Thr Ile Glu Asp Leu Asn Glu Ala Phe Pro Glu Thr Lys121 Leu Asp Lys Lys Lys Tyr Pro Tyr Trp Pro His Gln Pro Ile Glu136 Asn Leu(4)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征(A)長度23堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:GGCTGCGGAGGACCGTGGGCAGC 23(5)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)長度23堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:ACCGTATAATTATTATTTTTAAT 23(6)SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)序列特征(A)長度33堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5:CCCCATATGATGGCTGGGCGAAAACTTGCTCTA33(7)SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)序列特征(A)長度33堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6:CCCCTCGAGTTTATAAATTCTCAATTGGTTGGT33(8)SEQ ID NO:7的信息(ⅰ)序列特征(A)長度15個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型多肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7:Met-Ala-Gly-Arg-Lys-Leu-Ala-Leu-Lys-Thr-Ile-Asp-Trp-Val-Ala1權利要求
1.一種分離的多肽-人F1F0 ATP合成酶亞基15，其特征在于它包含有SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列的多肽、或其多肽的活性片段、類似物或衍生物。
2.如權利要求1所述的多肽，其特征在于所述多肽、類似物或衍生物的氨基酸序列具有與SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列至少95％的相同性。
3.如權利要求2所述的多肽，其特征在于它包含具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的多肽。
4.一種分離的多核苷酸，其特征在于所述多核苷酸包含選自下組中的一種(a)編碼具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽或其片段、類似物、衍生物的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸；或(c)與(a)或(b)有至少65％相同性的多核苷酸。
5. 如權利要求4所述的多核苷酸，其特征在于所述多核苷酸包含編碼具有SEQID NO:2所示氨基酸序列的多核苷酸。
6.如權利要求4所述的多核苷酸，其特征在于所述多核苷酸的序列包含有SEQ IDNO:1中47-460位的序列或SEQ ID NO:1中1-531位的序列。
7.一種含有外源多核苷酸的重組載體，其特征在于它是由權利要求4-6中的任一權利要求所述多核苷酸與質粒、病毒或運載體表達載體構建而成的重組載體。
8.一種含有外源多核苷酸的遺傳工程化宿主細胞，其特征在于它是選自于下列一種宿主細胞(a)用權利要求7所述的重組載體轉化或轉導的宿主細胞；或(b)用權利要求4-6中的任一權利要求所述多核苷酸轉化或轉導的宿主細胞。
9.一種具有人F1F0 ATP合成酶亞基15活性的多肽的制備方法，其特征在于所述方法包括(a)在表達人F1F0 ATP合成酶亞基15條件下，培養權利要求8所述的工程化宿主細胞；(b)從培養物中分離出具有人F1F0 ATP合成酶亞基15活性的多肽。
10.一種能與多肽結合的抗體，其特征在于所述抗體是能與人F1F0 ATP合成酶亞基15特異性結合的抗體。
11.一類模擬或調節多肽活性或表達的化合物，其特征在于它們是模擬、促進、拮抗或抑制人F1F0 ATP合成酶亞基15的活性的化合物。
12.如權利要求11所述的化合物，其特征在于它是SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列或其片段的反義序列。
13.一種權利要求11所述化合物的應用，其特征在于所述化合物用于調節人F1F0ATP合成酶亞基15在體內、體外活性的方法。
14.一種檢測與權利要求1-3中的任一權利要求所述多肽相關的疾病或疾病易感性的方法，其特征在于其包括檢測所述多肽的表達量，或者檢測所述多肽的活性，或者檢測多核苷酸中引起所述多肽表達量或活性異常的核苷酸變異。
15.如權利要求1-3中的任一權利要求所述多肽的應用，其特征在于它應用于篩選人F1F0 ATP合成酶亞基15的模擬物、激動劑，拮抗劑或抑制劑；或者用于肽指紋圖譜鑒定。
16.如權利要求4-6中的任一權利要求所述的核酸分子的應用，其特征在于它作為引物用于核酸擴增反應，或者作為探針用于雜交反應，或者用于制造基因芯片或微陣列。
17.如權利要求1-6及11中的任一權利要求所述的多肽、多核苷酸或化合物的應用，其特征在于用所述多肽、多核苷酸或其模擬物、激動劑、拮抗劑或抑制劑以安全有效劑量與藥學上可接受的載體組成作為診斷或治療與人F1F0 ATP合成酶亞基15異常相關的疾病的藥物組合物。
18.權利要求1-6及11中的任一權利要求所述的多肽、多核苷酸或化合物的應用，其特征在于用所述多肽、多核苷酸或化合物制備用于治療各種疾病尤其是能量代謝與物質代謝障礙性疾病如DOWN綜合癥、子宮內的生長遲緩、幼兒遲發性纖維原細胞臘樣脂褐素病變、BATTEN病癥、利伯氏病、Alzheimer氏病及其它碳水化合物代謝病、脂質代謝異常病、氨基酸代謝病、發育紊亂癥，某些腫瘤，某些遺傳性疾病、神經系統疾病、血液病及免疫系統疾病等的藥物。
全文摘要
本發明公開了一種新的多肽——人F1FOATP合成酶亞基15,編碼此多肽的多核苷酸和經DNA重組技術產生這種多肽的方法。本發明還公開了此多肽用于治療多種疾病的方法,尤其是能量代謝與物質代謝障礙性疾病如DOWN綜合癥、子宮內的生長遲緩、幼兒遲發性纖維原細胞臘樣脂褐素病變、BATTEN病癥、利伯氏病、Alzheimer氏病及其它碳水化合物代謝病、脂質代謝異常病、氨基酸代謝病、發育紊亂癥,某些腫瘤,某些遺傳性疾病、神經系統疾病、血液病及免疫系統疾病等。本發明還公開了抗此多肽的拮抗劑及其治療作用。本發明還公開了編碼這種新的人F1FOATP合成酶亞基15的多核苷酸的用途。
文檔編號C12N9/14GK1302868SQ99119920
公開日2001年7月11日 申請日期1999年10月29日 優先權日1999年10月29日
發明者毛裕民, 謝毅 申請人:上海博道基因技術有限公司