腦信號蛋白-4d結合分子治療動脈粥樣硬化的用圖
【專利摘要】本發明提供了用于在患有動脈粥樣硬化的對象中減少、抑制、阻止和/或延遲動脈粥樣硬化斑塊生長或新血管形成的方法，包括向該對象給予有效量的特異性結合腦信號蛋白?4D(SEMA4D)或其高親和性叢蛋白?B1受體的分離的結合分子。
【專利說明】腦信號蛋白-4D結合分子治療動脈粥樣硬化的用途
[000?]對提交的序列表的引用
[0002] 用本申請提交的電子提交ASCII文本文件序列表（名稱："Sequence_Listing_ 58008_136615. txt" ；大小:36，964字節;和創建日期：2014年10月9日）的內容通過引用全文 納入本文。
[0003] 發明背景
[0004]腦信號蛋白4D(SEMA4D)，也稱作⑶100,是一種屬于IV型腦信號蛋白基因家族的跨 膜蛋白（例如，SEQ ID N0:1(人）；SEQ ID N0:2(鼠））<^ΕΜΑ4?在細胞表面上表達為同二聚 體，但在細胞激活之后，SEMA4D可通過蛋白水解切割從細胞表面上釋放以生成該蛋白質的 溶解形式sSEMA4D，這也是有生物活性的。參見Suzuki等，Nature Rev. Immunol · 3:159-167 (2003);Kikutani等，Nature Immunol.9:17-23(2008)。
[0005] SEMA4D在包括脾臟、胸腺和淋巴結的淋巴器官中以及如腦、心臟和腎臟的非淋巴 器官中以高水平表達。在淋巴器官中，SEMA4D在靜息T細胞上大量表達，但是僅在靜息B細胞 和抗原呈遞細胞(APC)如樹突細胞(DC)上弱表達。然而，在用各種免疫刺激激活之后，其表 達在這些細胞中上調。細胞激活也增加了可溶性SEMA4D從免疫細胞的釋放。
[0006] 動脈粥樣硬化已經被認為是一種炎性疾病，其中免疫細胞在疾病發展期間起到關 鍵作用（Hansson GK等，Nat Rev Immunol 6:508-519，2006)。巨噬細胞表達CD40分子并且T 細胞在其細胞表面上具有CD40配體(CD40L或CD154)(Mach F等，Circulation 96:396-399， 1997;和Mach F等，Proc Natl Acad Sci USA 94:1931-36，1997) XD40與斑塊內免疫細胞 上的CD40L的連接誘導蛋白酶和促炎性介體的分泌，其擴大炎性活化（Mach F等， Circulation 96:396-399，1997)。〇)40連接的阻斷或CD40L基因敲除可在有動脈粥樣硬化 傾向的小鼠中減少動脈粥樣硬化斑塊發展（Mach F等，Nature 394: 200-203,1998;和 Lutgens E等，Nat Med 11:1313-1316，1999)。已經報道免疫細胞上的CD40與刺激抗-CD40 抗體的連接誘導Sema4D(Q)100)的表達(Kumanogoh A等，Immunity 13:621-31，2000) 〇
[0007] SEMA4D涉及各種過程，如增強免疫應答、血管生成、上皮形態發生和骨重塑 (Kruger RP等，Nat Rev Mol Cell Biol 6:789-800,2005;Pasterkamp R.J.，Nat Rev Neurosci 13:605-618,2012;和Kang S等，Seminars in Cell&Dev Biol 24:163-171， 2013)。動脈粥樣硬化斑塊中的淋巴細胞、巨噬細胞、內皮細胞和血小板在其膜表面上表達 叢蛋白（Plexin)-Bl，一種Sema4D的高親和性受體（Basile JR等，Moll Cell Biol 25: 6889_6898,2005;Delaire S等，J Immunol 166:4348-4354,2001;和Chabbert-de Ponnat I等，Int Immunol 17:439-447，2005)。因此，由T細胞表達或從T細胞膜釋放的Sema4D可對 位于動脈粥樣硬化斑塊中的細胞具有某些作用（Basile JR等，Mol.Cell Biol 25:6889-6898,2005;Delaire S等，J Immunol 166:4348-4354，2001;和Chabbert-de Ponnat I等， Int Immunol 17:439-447，2005)。之前的研究揭示了Sema4D在體外和體內對內皮細胞的促 血管生成活性（Conrotto P等，Blood 105:4321_4329,2005;和Basil JR等，Cancer Res 64:5212-5224，2004)。此外，在幾種鱗狀細胞癌癥中觀察到高水平的Sema4D表達，表明 Sema4D在體內腫瘤誘導的血管生成中起關鍵作用(Basile JR等，Proc Natl Acad Sci USA 103:9017-9022,2006)。因此，Sema4D可通過例如促進粥樣斑中發成的新血管形成過程來影 響斑塊生長。事實上，一項研究揭示在有動脈粥樣硬化傾向的ApoE缺陷型(ApoE-/-)小鼠中 刪除Sema4D基因延遲斑塊區域中動脈粥樣硬化斑塊的生長和新血管形成，表明在動脈粥樣 硬化的發展期間阻斷Sema4D信號可防止斑塊生長和新血管形成（Yukawa K等，Int.J Mol.Med.26:39-44,2010)。

【發明內容】

[0008] 本發明公開了使用腦信號蛋白4D結合分子治療動脈粥樣硬化的方法。按照本文所 示的本發明的方面，提供了在患有動脈粥樣硬化的對象中減少、抑制、阻止和/或延遲動脈 粥樣硬化斑塊形成的方法，包括向對象給予有效量的分離的結合分子，所述結合分子特異 性結合并阻斷腦信號蛋白4D(SEMA4D)的活性。在某些實施方式中，提供了用于在患有動脈 粥樣硬化的對象中抑制、阻止、減少或延遲動脈粥樣硬化斑塊生長的方法，包括向該對象給 予有效量的分離的結合分子，所述結合分子特異性結合腦信號蛋白_4D(SEMA4D)。在某些實 施方式中，結合分子抑制SEMA4D與其受體的相互作用。在某些實施方式中，受體是叢蛋白-B1或叢蛋白-B2。在某些實施方式中，結合分子抑制SEMA4D-介導的叢蛋白-B1信號轉導。在 任意前述方法的某些實施方式中，對象患有心血管疾病。在某些實施方式中，心血管疾病選 自下組:冠心病(也稱為缺血性心臟病或冠狀動脈疾病）、心肌病、高血壓心臟病、心力衰竭、 肺源性心臟病、心臟節律障礙、炎性心臟病心內膜炎、炎性心臟肥大、心肌炎、心臟瓣膜病、 腦血管病、外周動脈疾病、先天性心臟病、風濕性心臟病、及其組合。在任意前述方法的某些 實施方式中，分離的結合分子與參照單克隆抗體VX15/2503或67特異性結合相同的SEMA4D 表位。在任意前述方法的某些實施方式中，分離的結合分子競爭性抑制參照單克隆抗體 VX15/2503或67與SEMA4D的特異性結合。在任意前述方法的某些實施方式中，分離的結合分 子包括抗體或其抗原結合片段。在任意前述方法的某些實施方式中，抗體或其抗原結合片 段的可變重鏈(VH)含有VHCDR 1-3且可變輕鏈(VL)含有VIXDR 1-3，VHCDR 1-3分別包含SEQ ID N0:6、7和8，VLCDR 1-3分別包含SEQ ID N0:14、15和16。如任意前述方法的某些實施方 式中，VH和VL分別包含SEQIDN0:9和SEQIDN0 :17或SEQIDN0:10和SEQIDN0:18。在任 意前述方法的某些實施方式中，該方法還包括抑制、延遲、減少或延緩動脈粥樣硬化斑塊周 圍的新血管形成。
[0009] 還提供了方法，用于在患有動脈粥樣硬化的對象中抑制、延緩、減少或延遲新血管 形成的方法，包括向該對象給予有效量的分離的結合分子，所述結合分子特異性結合腦信 號蛋白_4D(SEMA4D)。在某些實施方式中，結合分子抑制SEMA4D與其受體的相互作用。在某 些實施方式中，受體是叢蛋白-B1。在某些實施方式中，結合分子抑制SEMA4D-介導的叢蛋 白-B1信號轉導。在任意前述方法的某些實施方式中，對象患有心血管疾病。在某些實施方 式中，心血管疾病選自下組:冠心病(也稱為缺血性心臟病或冠狀動脈疾病）、心肌病、高血 壓心臟病、心力衰竭、肺源性心臟病、心臟節律障礙、炎性心臟病心內膜炎、炎性心臟肥大、 心肌炎、心臟瓣膜病、腦血管病、外周動脈疾病、先天性心臟病、風濕性心臟病、及其組合。在 任意前述方法的某些實施方式中，分離的結合分子與參照單克隆抗體VX15/2503或67特異 性結合相同的SEMA4D表位。在任意前述方法的某些實施方式中，分離的結合分子競爭性抑 制參照單克隆抗體VX15/2503或67與SEMA4D的特異性結合。在任意前述方法的某些實施方 式中，分離的結合分子包括抗體或其抗原結合片段。在任意前述方法的某些實施方式中，抗 體或其抗原結合片段的可變重鏈(VH)含有VH⑶R 1-3且可變輕鏈（VL)含有VIXDR 1-3， VHCDR 1-3分別包含SEQ ID N0:6、7和8，VLCDR 1-3分別包含SEQ ID N0:14、15和 16。在任意 前述方法的某些實施方式中，VH和VL分別包含SEQIDN0:9和SEQIDN0:17或SEQIDN0 : 10和SEQ ID NO:18。
[0010] 還提供了治療患有動脈粥樣硬化的對象的方法，所述方法包括：向確定有動脈粥 樣硬化斑塊的對象給予有效量的分離的結合分子，所述結合分子特異性結合腦信號蛋白-4D(SEMA4D)，從而抑制、延緩、減少或延遲動脈粥樣硬化斑塊的生長。在某些實施方式中，通 過分析來自患者的圖像或樣品來提供確定。在任意前述方法的某些實施方式中，如果患者 中的動脈粥樣硬化斑塊的數量、尺寸或特征超過預定閾值數量、尺寸或特征則確定患者有 動脈粥樣硬化斑塊并且接受治療。在任意前述方法的某些實施方式中，如果當與一個或多 個對照樣品比較時，患者中的動脈粥樣硬化斑塊的數量、尺寸或特征指示動脈粥樣硬化則 確定患者有動脈粥樣硬化斑塊并且接受治療。在任意前述方法的某些實施方式中，如果樣 品中CRP和/或LDL的水平超過預定閾值水平，相對于對照樣品升高，或者指示動脈粥樣硬化 斑塊則確定患者有動脈粥樣硬化并且接受治療。在任意前述方法的某些實施方式中，如果 成像確定動脈粥樣硬化斑塊的數量、尺寸或特征超過預定閾值水平，相對于對照樣品升高， 或者指示動脈粥樣硬化斑塊，則確定患者有動脈粥樣硬化并且接受治療。在該方法的某些 實施方式中，成像可包括冠狀血管造影、血管內超聲（IVUS)、頸動脈超聲、冠狀動脈計算機 斷層掃描(CT)、核磁共振成像(MRI)、正電子發射斷層成像(PET)光學相干斷層成像(0CT)、 近紅外光譜(NIRS)、和NIR熒光。在任意前述方法的某些實施方式中，如果患者確定具有一 個或多個易感的動脈粥樣硬化斑塊，則確定患者有動脈粥樣硬化斑塊并接受治療。在任意 前述方法的某些實施方式中，分離的結合分子與參照單克隆抗體VX15/2503或67特異性結 合相同的SEMA4D表位。在任意前述方法的某些實施方式中，分離的結合分子競爭性抑制參 照單克隆抗體VX15/2503或67與SEMA4D的特異性結合。在任意前述方法的某些實施方式中， 分離的結合分子包括抗體或其抗原結合片段。在任意前述方法的某些實施方式中，抗體或 其抗原結合片段的可變重鏈(VH)含有VHCDR 1-3且可變輕鏈(VL)含有VIXDR 1-3，VH⑶R 1-3分別包含SEQ ID N0:6、7和8，VLCDR 1-3分別包含SEQ ID N0:14、15和16。在任意前述方法 的某些實施方式中，VH和VL分別包含SEQIDN0:9和SEQIDN0 :17或SEQIDN0:10和SEQ ID N0：18〇
[0011] 根據本文所示的方面，提供了一種減少患有動脈粥樣硬化的對象中新血管形成的 方法，包括向該對象給予有效量的特異性結合腦信號蛋白4D(SEMA4D)的分離的結合分子。
[0012] 附圖簡述
[0013]圖1A:在用抗-Sema4D抗體治療的ApoE-缺陷型自發性高脂血癥（SHL)小鼠中受到 抑制的動脈粥樣硬化斑塊發展。圖1A顯示對在從14周齡開始持續12周用抗-SEMA4D抗體或 同種型對照治療的SHL小鼠中動脈粥樣硬化斑塊的脂質沉積物中嗜蘇丹面積的定量測量。 [0014]圖1B和1C:抗-Sema4D抗體治療的SHL小鼠中斑塊的減少的新血管形成。圖1B顯示 通過對抗-Sema4D抗體治療的SHL小鼠和對照抗體治療的SHL小鼠中的內皮細胞的凝集素 B4 染色定量測量可視化的新血管形成。圖1C顯示使用CD31抗體免疫組化可視化的抗-Sema4D 抗體治療的SHL小鼠和對照抗體治療的SHL小鼠的斑塊中的內皮細胞。
[0015] 發明詳述
[0016] I.定義
[0017]需要注意，術語"一個"或"一種"實體指一種或多種該實體;例如，"一種抗-SEMA4D 抗體"應理解為代表一種或多種抗-SEMA4D抗體。如此，術語"一個"（或"一種""一個或多 個"和"至少一個"在本文中可互換使用。
[0018] 本文所用術語"動脈粥樣硬化"是指大多數冠狀動脈疾病、主動脈瘤和下肢動脈疾 病之下的較大動脈的疾病，并且也在腦血管疾病中起主要作用。在美國對于65歲以上和以 下的男女，動脈粥樣硬化是主要死亡原因，E.L.Bierman，〃動脈粥樣硬化和動脈粥樣硬化的 其它形式（Atherosclerosis and Other Forms of Arteriosclerosis)〃第208章，第1106 頁，Harrisor/s Principles of Internal Medicine(《哈里森內科學原理》），第13版， KJ. Isselbacher等編(麥格勞-希爾公司(McGraw-Hill，Inc ·)，紐約，1994)。動脈粥樣硬化 可影響體內的任何動脈，包括心臟、腦、手臂、腿、骨盆和腎臟中的動脈。動脈粥樣硬化的特 征在于膽固醇滲透并且在動脈壁的傷口處出現泡沫細胞。這之后是復雜的系列變化，涉及 血小板、巨噬細胞、平滑肌細胞和產生增殖性傷口的生長因子。這些扭曲了血管并使其變得 剛性。在血漿膽固醇水平升高的個體中，動脈粥樣硬化及其并發癥的發病率增加。 W.F.Ganong，《醫學生理學》（Review of Medical Physiology)，第17版，第281 頁 (Appleton&Lange Norwalk,CT 1995)〇
[0019] 本文所用術語"新血管形成"或"血管發生"是指從現有血管形成新血管。例如，在 黃斑變性、腫瘤、癌癥和動脈粥樣硬化的發展中存在新血管形成。
[0020] 本文所用術語"炎性疾病"或"炎性病癥"是指特征為炎癥并且通常伴隨發紅、腫脹 和疼痛的疾病。炎癥可導致宿主其它疾病，包括但不限于，心血管疾病、類風濕性關節炎、胃 腸道疾病、神經炎性疾病(例如，多發性硬化)甚至癌癥(例如，膽囊癌）。
[0021] 本文所用術語"心血管疾病"是指涉及心臟、血管（動脈、毛細血管和靜脈)或同時 涉及兩者的疾病。心血管疾病的示例包括但不限于，冠心病(也稱為缺血性心臟病或冠狀動 脈疾病）、心肌病、高血壓心臟病、心力衰竭、肺源性心臟病、心臟節律障礙、炎性心臟病心內 膜炎、炎性心臟肥大、心肌炎、心臟瓣膜病、腦血管病、外周動脈疾病、先天性心臟病、和風濕 性心臟病。
[0022]術語"治療有效量"是指對"治療"對象或哺乳動物中的疾病或病癥而言有效的抗 體、多肽、多核苷酸、小有機分子或其他藥物的量。在動脈粥樣硬化的情況中，治療有效量的 藥物可延遲動脈粥樣硬化斑塊的形成;減少、阻滯或停止新動脈粥樣硬化斑塊形成的增加； 在動脈粥樣硬化斑塊中或在動脈粥樣硬化斑塊周圍減少、阻止或停止炎癥;抑制，例如，阻 止、阻滯、防止、停止或逆轉新血管形成;動脈粥樣硬化斑塊的形態或功能變化;或在一定程 度上緩解與動脈粥樣硬化相關的一種或多種癥狀;降低發病率和死亡率;改善生活質量;或 這些效果的任意組合。
[0023]術語，如"治療"或"緩解"同時指1)治愈、減緩、減少診斷的病理病癥或疾病的癥 狀、逆轉和/或終止診斷的病理病癥或疾病的進展和2)預防和/或減緩靶向的病理病癥或疾 病的發展的預防性措施。因此，需要治療的那些人包括已經患有疾病的那些人;易于患有疾 病的那些人；和需要預防疾病的那些人。有益或所需的臨床結果包括但不限于可檢測或不 可檢測的緩解癥狀、減輕疾病程度、疾病狀態穩定（即不惡化）、延遲或減緩疾病進展、改善 或減輕疾病狀態、緩解(部分或完全）、或其任意組合。"治療"也可以指與不接受治療的期望 存活相比延長生存期。需要治療的人包括已經患有病癥或疾病的人，以及傾向于患有病癥 或疾病的人或需預防病癥或疾病的人。
[0024] "對象"或"個體"或"動物"或"患者"或"哺乳動物"指需要診斷、預防或治療的任何 對象，特別是哺乳動物對象。哺乳動物對象包括人、家養動物、家畜和動物園動物、競技動物 或寵物，如犬、貓、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、馬、牛、奶牛、熊等。
[0025] 本文所用的術語"給予抗-SEMA4D抗體時能夠獲益的對象"和"需要治療的動物"包 括能夠從給予抗-SEMA4D抗體或其它SEMA4D結合分子和/或從用抗-SEMA4D抗體或其它 SEMA4D結合分子治療（即減輕或預防疾病）中獲益的對象(如哺乳動物對象），該抗體或結合 分子可用于(例如)檢測抗-SEMA4D多肽(如用于診斷方法）。
[0026] 廣義來說，本發明的〃結合分子〃或〃抗原結合分子〃指特異性結合抗原決定簇的分 子。在一個實施方式中，結合分子特異性結合SEMA4D，例如，約150kDa的跨膜SEMA4D多肽或 約120kDa的可溶性SEMA4D多肽(通常稱為SSEMA4D)。在另一個實施方式中，本發明的結合分 子是抗體或其抗原結合片段。在另一個實施方式中，本發明的結合分子包括抗體分子的至 少一個重鏈或輕鏈CDR。在另一個實施方式中，本發明的結合分子包括來自一種或多種抗體 分子的至少2個CDR。在另一個實施方式中，本發明的結合分子包括來自一種或多種抗體分 子的至少3個CDR。在另一個實施方式中，本發明的結合分子包括來自一種或多種抗體分子 的至少4個CDR。在另一個實施方式中，本發明的結合分子包括來自一種或多種抗體分子的 至少5個CDR。在另一個實施方式中，本發明的結合分子包括來自一種或多種抗體分子的至 少6個CDR。
[0027] 本發明涉及治療動脈粥樣硬化的方法，包括向對象給予抗-SEMA4D結合分子，例如 抗體，或其抗原結合片段、變體或衍生物。除非特別提到完整大小的抗體如天然產生的抗 體，術語"抗-SEMA4D抗體"包括完整大小的抗體以及這種抗體的抗原結合片段、變體、類似 物或衍生物，例如天然產生的抗體或免疫球蛋白分子，或以類似于抗體分子的方式結合抗 原的經工程改造抗體分子或片段。
[0028] 本文所用的"人"或"全人"抗體包括具有人免疫球蛋白氨基酸序列的抗體并包括 分離自人免疫球蛋白文庫或一種或多種人免疫球蛋白轉基因動物的抗體，如上文所述，例 如，Kucherlapati等的美國專利號5,939,598。"人"或"全人"抗體也包括至少含重鏈可變區 或至少重鏈和輕鏈可變區的抗體，其中所述可變區具有人免疫球蛋白可變區的氨基酸序列 或是人源化抗體。
[0029] "人"或"全人"抗體還包括如上所述包含本文所述抗體分子(如VH區和/或VL區）的 變體(包括衍生物)或基本由其組成或由其組成的"人"或"全人"抗體，所述抗體或其片段免 疫學特異性結合于SEMA4D多肽或其片段或變體。可利用本領域技術人員已知的標準技術在 編碼人抗-SEMA4D抗體的核苷酸序列中引入突變，包括但不限于，引起氨基酸取代的定點誘 變和PCR介導的誘變。在一些方面中，相對于參照VH區、VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLg、 VLCDR1、VIXDR2或VIXDR3，該變體(包括衍生物)編碼少于50個氨基酸取代、少于40個氨基酸 取代、少于30個氨基酸取代、少于25個氨基酸取代、少于20個氨基酸取代、少于15個氨基酸 取代、少于10個氨基酸取代、少于5個氨基酸取代、少于4個氨基酸取代、少于3個氨基酸取代 或少于2個氨基酸取代。
[0030] 在某些實施方式中，氨基酸取代是保守性氨基酸取代，如下所詳述。或者，也可沿 所有或一部分編碼序列隨機引入突變，例如通過飽和誘變引入，可篩選所得突變體的生物 學活性以鑒定保持活性(例如，結合SEMA4D多肽，如結合人SEMA4D、鼠 SEMA4D或同時結合人 和鼠 SEMA4D的能力）的突變體。"人"或"全人"抗體的這類變體（或其衍生物）也可稱為"優 化"或"就抗原結合優化"的人或全人抗體，包括對抗原親和性提高的抗體。
[0031] 術語"抗體"和"免疫球蛋白"在本文中可互換使用。抗體或免疫球蛋白至少包括重 鏈可變區，通常至少包括重鏈和輕鏈的可變區。較好地理解了脊椎動物系統中的基本免疫 球蛋白結構。參見例如，Harlow等（1988)《抗體：實驗室手冊》(Antibodies : A Laboratory Manual)(第2版;冷泉港實驗室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press))。
[0032] 本文所用術語"免疫球蛋白"包括可在生物化學上區分的各種類型多肽。本領域技 術人員應理解，重鏈分為伽馬、繆、阿爾法、德爾塔或伊普西龍（γ，μ，α，δ， ε)，其中還有一些 亞類(如γ1-γ4)。該鏈的特性決定抗體"類別"分別為IgG、IgM、IgA、IgG或IgE。免疫球蛋白 亞類（同種型）如IgGl、]^62、]^63、]^64、]^41等已被良好表征，且已知賦予功能特化。根據 本文公開內容，本領域技術人員不難區分這些類別和同種型的修飾形式，因此，它們涵蓋在 本發明范圍內。所有免疫球蛋白類別明顯屬于本發明范圍，以下討論通常針對免疫球蛋白 分子的IgG類。在IgG中，標準的免疫球蛋白分子包括分子量約為23,000道爾頓的兩條相同 輕鏈多肽和分子量為53,000-70，000的兩條相同重鏈多肽。這四條鏈通常在?'構型中由二 硫鍵連接起來，其中輕鏈從Y的口部開始托起重鏈，并延續通過可變區。
[0033] 輕鏈分類為κ或λ。各重鏈類可與κ或λ輕鏈結合。通常，輕鏈和重鏈互相共價結合， 并且當由雜交瘤、Β細胞或遺傳工程改造的宿主細胞生成免疫球蛋白時，兩條重鏈的"尾"部 分通過共價二硫鍵或非共價連接結合在一起。在重鏈中，氨基酸從Υ構型的分叉末端處的Ν-端到各條鏈的底部處的C-端。
[0034] 輕鏈和重鏈都劃分成結構和功能同源性的區域。從功能角度使用術語"恒定"和 "可變"。在這方面，應理解輕鏈(VL或VK)和重鏈(VH)部分的可變區決定抗原識別和特異性。 相反，輕鏈(CL)和重鏈(CH1、CH2或CH3)的恒定區產生重要的生物學特性，例如分泌、跨胎盤 移動、Fc受體結合、補體結合等。按照習慣，恒定區結構域的編號隨著遠離抗原結合位點或 抗體的氨基端而增加。N-端區是可變區并且C-端區是恒定區；CH3和CL結構域實際上分別包 括重鏈和輕鏈的羧基端。
[0035] 如上所述，可變區允許抗體選擇性識別并特異性結合抗原上的表位。也就是說，抗 體的VL和VH結構域、或這些可變區內的互補決定區（CDR)亞組組合形成確定三維抗原結合 位點的可變區。這種四聯抗體結構形成在Y的每條臂末端存在的抗原結合位點。更具體地， 所述抗原結合位點由各VH和VL鏈上的三個CDR確定。在一些情況下，例如在衍生自羊駝種類 或根據羊駝免疫球蛋白工程改造的某些免疫球蛋白分子中，完整的免疫球蛋白分子可僅由 重鏈構成而不含輕鏈。參見例如，Hamers-Casterman等，Nature 363:446-448( 1993)。
[0036]在天然產生的抗體中，每個抗原結合結構域上出現的六個"互補決定區"或"CDR" 是短的非毗連氨基酸序列，隨著抗體在水性環境中確定其三維構型時，它們特別定位以形 成抗原結合結構域。抗原結合結構域中的其余氨基酸稱為"構架"區，顯示較小的分子間差 異。構架區主要采用β-片層構象，CDR形成連接β-片層結構和某些情況下形成部分β-片層結 構的環。因此，構架區用于通過鏈間非共價相互作用形成為CDR提供正確方向位置的支架。 定位的CDR形成的抗原結合結構域確定了與免疫反應性抗原上的表位互補的表面。這種互 補表面促進了抗體與其互補表位的非共價結合。對于任何給定的重鏈或輕鏈可變區，本領 域普通技術人員能容易地鑒定分別包含CDR和構架區的氨基酸，因為它們已被精確定義(見 下文）。
[0037] 除非明確表述為相反的含義，否則在本領域內所使用和/或接受的某一術語有兩 種或多種定義的情況下，本文所用的術語定義應包括所有這些含義。具體示例是使用術語 "互補決定區"（"CDR"）描述在重鏈和輕鏈多肽的可變區內發現的非毗連抗原結合位點。這 一特定區域的描述可參見Kabat等（1983)美國健康和公共服務部(U.S.Dept.of Health and Human Services)，"Sequences of Proteins of Immunological Interest(具有免疫 學重要性的蛋白質序列)"以及Chothia和Lesk，J.Mol .Biol. 196:901-917(1987)(上述文獻 通過引用全文納入本文），互相比較時所述定義包括重疊的氨基酸殘基或氨基酸殘基亞組。 盡管如此，應用任一定義指抗體或其變體的CDR均應落入本文所定義和使用的術語范圍。合 適氨基酸殘基包括上文引用的各參考文獻中定義的CDR，所述氨基酸殘基列于下表1以作比 較。包括特定CDR的準確殘基編號根據CDR的序列和大小而變化。在抗體的可變區氨基酸序 列給定的情況下，本領域技術人員可常規確定哪些殘基包含具體CDR。
[0038] 表1.CDR 定義1
[0040] 1表1中所有⑶R定義的編號均按照Kabat等所述的編號規則(見下文）。
[0041] Kabat等還定義了適用于任何抗體的可變區序列的編號系統。本領域普通技術人 員能明確地將所述"Kabat編號"系統應用于任何可變區序列，而不依賴序列本身外的任何 實驗數據。本文所用的"Kabat編號"指Kabat等（1983)美國衛生與公眾服務部，"Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫學上感興趣的蛋白質序列)"中所述的編 號系統。除非另有說明，提到本發明的抗-SEMA4D抗體或其抗原結合片段、變體或衍生物中 具體氨基酸殘基位置的編號時，均按照Kabat編號系統。
[0042] 本發明的抗體或抗原結合片段、變體、或其衍生物包括但不限于:多克隆、單克隆、 多特異性和雙特異性(其中至少一個臂對SEMA4D有特異性）、人、人源化、靈長類化或嵌合抗 體，單鏈抗體，表位結合片段如Fab、Fat/和F(at/ )2、Fd、Fv、單鏈Fv(scFv)、二硫鍵連接的Fv (sdFv)、包含VL或VH結構域的片段、Fab表達文庫產生的片段和抗獨特型(抗-Id)抗體(包括 例如，本文所述抗-SEMA4D抗體的抗-Id抗體）dcFv分子為本領域已知，描述于例如美國專 利號5,892,019。本發明的免疫球蛋白或抗體分子可以是任何類型（如IgG、IgE、IgM、IgD、 IgA和IgY)、類(如1861、1862、1863、1864、1841和以42等)或小類的免疫球蛋白分子。
[0043] 本文所用的術語"重鏈部分"包括衍生自免疫球蛋白重鏈的氨基酸序列。在某些實 施方式中，多肽包含包括以下至少一種的重鏈部分:VH結構域、CH1結構域、鉸鏈(例如，上、 中、和/或下鉸鏈區）結構域、CH2結構域、CH3結構域或其變體或片段。例如，本發明所用的結 合多肽可包括含有CH1結構域的多肽鏈;含有CH1結構域、至少一部分絞鏈區和CH2結構域的 多肽鏈;含有CH1結構域和CH3結構域的多肽鏈;含有CH1結構域、至少一部分絞鏈區和CH3結 構域的多肽鏈，或者含有CH1結構域、至少一部分絞鏈區、CH2結構域和CH3結構域的多肽鏈。 在另一實施方式中，本發明的多肽包括含有CH3結構域的多肽鏈。另外，本發明所用的結合 多肽可能缺少CH2結構域的至少一部分(例如，所有或部分CH2結構域）。如上所述，本領域普 通技術人員應理解，可修飾這些結構域(例如重鏈部分），從而其氨基酸序列不同于天然產 生的免疫球蛋白分子。
[0044] 在本文公開的某些抗-SEMA4D抗體，或其抗原結合片段、變體或衍生物中，多聚體 的一條多肽鏈的重鏈部分與該多聚體的第二條多肽鏈相同。或者，本發明的含有重鏈部分 的單體是不同的。例如，各單體可包含不同的靶結合位點，形成例如雙特異性抗體。
[0045] 用于本文所述方法的結合分子的重鏈部分可衍生自不同的免疫球蛋白分子。例 如，多肽的重鏈部分可包含衍生自IgGl分子的CH1結構域和衍生自IgG3分子的鉸鏈區。在另 一個示例中，重鏈部分可包含部分衍生自IgGl分子、部分衍生自IgG3分子的絞鏈區。在另一 個示例中，重鏈部分可包含部分衍生自IgGl分子、部分衍生自IgG4分子的嵌合鉸鏈。
[0046] 本文所用的術語"輕鏈部分"包括衍生自免疫球蛋白輕鏈，如κ或λ輕鏈的氨基酸序 列。在一個方面中，輕鏈部分包含VL或CL結構域中的至少一種。
[0047] 本文所述的抗-SEMA4D抗體，或其抗原結合片段、變體或衍生物可根據它們識別或 特異性結合的抗原如本文所述靶標多肽(如SEMA4D)的表位或部分進行描述或說明。靶多肽 與抗體的抗原結合結構域特異性相互作用的部分是"表位"或"抗原決定簇"。靶多肽可包含 單個表位，但通常包含至少兩個表位，并可包括任意數量的表位，這取決于抗原的大小、構 象和類型。而且，應該注意到，靶標多肽上的"表位"可以是或可包括非多肽元件，例如表位 可包括糖側鏈。
[0048] 認為抗體的肽或多肽表位的最小尺寸是約4至5個氨基酸。肽或多肽表位可含有至 少7個，至少9個，或至少約15至約30個氨基酸。由于⑶R能以三聯形式識別抗原性肽或多肽， 所以包含表位的氨基酸不必定是毗連的，可在2條或更多條不同肽鏈上。本發明的抗-SEMA4D抗體識別的肽或多肽表位可含有SEMA4D中至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至 少8個、至少9個、至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、或約15-約30個毗連或非毗連的 氨基酸。
[0049] "特異性結合"通常指該抗體通過其抗原結合結構域結合于表位，并且該結合需要 抗原結合結構域和表位之間某種程度的互補。按照這一定義，當抗體通過其抗原結合結構 域與表位結合比與隨機無關的表位結合更容易時，稱該抗體"特異性結合"該表位。本文中 使用術語"特異性"定性分析某一抗體與某一表位結合的相對親和性。例如，抗體"Α"可被認 為比抗體"Β"對給定表位具有更高特異性，或者抗體"Α"據說可以比對相關表位"D"的特異 性更高的特異性或親和性結合表位Τ'。
[0050] "優選結合"指與結合相關、相似、同源或類似的表位相比，該抗體更容易特異性結 合某表位。因此，與相關表位相比，"優選結合"給定表位的抗體更可能結合該表位，即便這 種抗體可能與相關表位發生交叉反應。
[0051]作為非限制性示例，如果抗體與第一表位結合的解離常數(KD)低于抗體與第二表 位的KD，則可認為抗體優選結合第一表位。在另一個非限制性示例中，如果抗體與第一表位 結合的親和性比抗體與第二表位的K D低至少一個數量級，則可認為抗體優選結合第一抗 原。在另一個非限制性示例中，如果抗體與第一表位結合的親和性比抗體與第二表位的Kd 低至少2個數量級，則可認為抗體優選結合第一表位。
[0052]在另一個非限制性示例中，如果抗體與第一表位結合的解離速率(k(off))比抗體 與第二表位的k(〇ff)低，則可認為抗體優選結合第一表位。在另一個非限制性示例中，如果 抗體與第一表位結合的親和性比抗體與第二表位的k(off)低至少1個數量級，則可認為抗 體優選結合第一表位。在另一個非限制性示例中，如果抗體與第一表位結合的親和性比抗 體與第二表位的k(off)低至少2個數量級，則可認為抗體優選結合第一表位。可以說，本文 所述的抗體或其抗原結合片段、變體或衍生物結合本文公開的靶多肽(例如，SEMA4D，例如， 人、鼠或者人和鼠 SEMA4D)或其片段或變體，其解離速率(k(off))低于或等于5X 10^^、10 ΑΛ5Χ ΠΓΥ1或ΙΟΛ'在某些方面中，可以說，本發明的抗體結合本文公開的靶多肽(例 如，SEMA4D，例如，人、鼠、或者人和鼠 SEMA4D)或其片段或變體，其解離速率(k(of f))低于或 等于 5X 10-4s-\10-4s-\5X 10-5s-\或 10-5s-\5X 10-6s-\10-6s-\5X 10-7s-1 或 10-7s-、
[0053] 可以說，本文所述的抗體或其抗原結合片段、變體或衍生物結合本文公開的靶多 肽(例如，SEMA4D，例如，人、鼠或者人和鼠 SEMA4D)或其片段或變體，其結合速率(k(on))大 于或等于1〇3Μ?，5Χ lOtVSlOtV1或5X lOtV1。在某些方面中，可以說本發明的抗 體結合本文公開的靶多肽(如SEMA4D，如人、鼠或者人和鼠的SEMA4D)或其片段或變體，其結 合速率(k(on))大于或等于 105M-\5X 105M-^106]^1 或 5X 106M-1 或 107M-、
[0054] 如果抗體優先結合給定表位以至于在某種程度上阻斷參照抗體與該表位的結合， 則稱該抗體能競爭性抑制參照抗體與該表位的結合。可通過本領域已知的任意方法確定競 爭性抑制，例如，競爭ELISA試驗。可以說，抗體將參照抗體與給定表位的結合競爭性抑制至 少90%、至少80%、至少70%、至少60%或至少50%。
[0055] 本文所用的術語"親和性"指單獨表位與免疫球蛋白分子的CDR結合的強度量度。 參見例如，Harlow等（1988)《抗體:實驗室手冊》(Antibodies:A Laboratory Manual)(冷泉 港實驗室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，第2版），第27-28頁。本文所用 的術語"親合力"指免疫球蛋白群體和抗原間復合物的總體穩定性，即免疫球蛋白混合物與 抗原的功能性結合強度。參見，例如，Harlow，第29-34頁。親合力既與群體中單獨免疫球蛋 白分子與特定表位的親和性相關，也與免疫球蛋白分子和抗原的價態相關。例如，二價單克 隆抗體和具有高度重復表位結構的抗原例如多聚體之間的相互作用是具有高親合力的一 個例子。
[0056] 本發明的抗-SEMA4D抗體或其抗原結合片段、變體或其衍生物也可就其交叉反應 性方面進行描述或說明。本文所用的術語"交叉反應性"指抗體對某一種抗原具有特異性、 與第二種抗原發生反應的能力；它是兩種不同抗原性物質之間關聯性的量度。因此，如果抗 體與誘導其形成的表位以外的其他表位結合，則具有交叉反應性。交叉反應性表位通常含 有許多與誘導表位相同的互補結構特征，在某些情況下甚至比原始表位更匹配。
[0057] 例如，某些抗體具有一定程度的交叉反應性，因為它們結合相關但不相同的表位， 例如，與參照表位至少95 %、至少90 %、至少85 %、至少80 %、至少75 %、至少70 %、至少 65%、至少60%、至少55%和至少50%相同（按照本領域已知方法和本文所述方法計算）的 表位。如果抗體不結合與參照表位少于95%、少于90%、少于85%、少于80%、少于75%、少 于70%、少于65%、少于60%、少于55%和少于50%相同性(按照本領域已知方法和本文所 述方法計算)的表位，則可以說該抗體的交叉反應性很低或沒有交叉反應性。如果某抗體不 結合某表位的任何其它類似物、直系同源物或同源物，則可認為該抗體對該表位"高度特 異"。
[0058]本發明的抗-SEMA4D結合分子如抗體或其抗原結合片段、變體或衍生物可根據與 本發明多肽的結合親和性進行描述或說明，所述多肽例如SEMA4D，如人、鼠或者人和鼠的 SEMA4D。結合親和性可包括解離常數或 Kd 低于 5x 10-2M、10-2M、5x 10-3M、10-3M、5x 10-4M、10 、、5x 10-5M、10-5M、5x 10-6M、10-6M、5x 10-7M、10-7M、5x 10-8M、10-8M、5x 10-9M、10-9M、5x 10 -10M、10-10M、5x 10-nM、10-nM、5x 10-12M、10-12M、5x 10-13M、10-13M、5x 10-14M、10-14M、5x 10- 15M或1(T15M的那些。在某些實施方式中，抗-SEMA4D結合分子，例如，本發明的抗體或其抗原 結合片段以約5χ 10_9至約6χ 10_9的Kd結合人SEMA4D。在另一個實施方式中，抗-SEMA4D結 合分子，例如，本發明的抗體或其抗原結合片段以約lx ΗΓ9至約2χ 10-9的Kd結合鼠 SEMA4D。
[0059] 本文所用的術語"嵌合抗體"指其中免疫反應性區域或位點獲自或衍生自第一物 種，而恒定區（根據本發明，可能是完整、一部分或修飾的）獲自第二物種的任何抗體。在一 些實施方式中，靶標結合區或位點將來自非人來源(例如，小鼠或靈長類)并且恒定區是人 的。
[0060] 本文所用的術語"工程改造的抗體"指通過從具有已知特異性的抗體至少部分置 換一個或多個CDR和必要時通過部分構架區置換和序列變化，來改變重鏈或輕鏈或二者中 可變區的抗體。雖然CDR可衍生自與產生構架區的抗體屬于同一類或甚至亞類的抗體，但設 想CDR衍生自不同類別的抗體，例如，不同物種的抗體。將來自具有已知特異性的非人抗體 的一個或多個"供體" CDR移植到人重鏈或輕鏈構架區內形成的工程改造的抗體在本文中稱 為"人源化抗體"。在某些實施方式中，可能不必定用來自供體可變區的完整CDR代替所有 CDR以將一種可變區的抗原結合能力轉移至另一可變區。相反，可僅僅轉移維持靶結合位點 的活性所需的那些殘基。
[0061 ]進一步認識到，人源化抗體的重鏈或輕鏈或二者中可變結構域內的構架區可僅包 含人來源的殘基，在這種情況下人源化抗體的這些構架區稱為"全人構架區"（例如，MAb VX15/2503,在美國專利申請公開號US 2010/0285036 A1中為MAb 2503,其全文通過引用納 入本文）。或者，如果需要維持與SEMA4D抗原的適當結合或提高結合，可以在人源化抗體的 重鏈或輕鏈或二者可變區中人框架區的相應位置內工程改造供體可變區中框架區的一個 或多個殘基。因此，以此方式工程改造的人構架區包含人和供體構架區殘基的混合物，在本 文中稱為"部分人構架區"。
[0062] 例如，抗-SEMA4D抗體的人源化過程可基本按照Win ter和同事所述方法進行 (Jones等，Nature 321:522-525(1986);Riechmann等，Nature 332:323-327(1988); Verhoeyen等，Science 239:1534-1536(1988))，即用嚙齒動物或突變型嚙齒動物CDR或CDR 序列取代人抗-SEMA4D抗體的相應序列。也參見美國專利號5，225，539; 5，585，089; 5，693， 761; 5，693，762; 5，859，205;其通過引用納入本文。所得的人源化抗-SEMA4D抗體將在人源 化抗體的重鏈和/或輕鏈可變區的全人框架區內包含至少一個嚙齒動物或突變型嚙齒動物 CDR。在一些情況下，人源化抗-SEMA4D抗體的一個或多個可變區的構架區內殘基被相應非 人(例如，嚙齒動物)殘基代替（參見例如，美國專利號5,585,089;5,693,761;5,693,762;和 6,180,370)，在這種情況下所得的人源化抗-SEMA4D抗體將在重鏈和/或輕鏈的可變區內包 含部分人框架區。
[0063]而且，人源化抗體可包含在受體抗體或供體抗體中未發現的殘基。進行這些修飾 以進一步改善抗體性能(例如，獲得所需親和性）。通常，人源化抗體將包含幾乎所有的至少 一個、通常兩個可變區，其中全部或基本上全部的CDR對應于非人免疫球蛋白的CDR，全部或 基本上全部的構架區是人免疫球蛋白序列的構架區。人源化抗體還任選包含至少一部分免 疫球蛋白恒定區（Fc )，一般是人免疫球蛋白的Fc。更多的細節參見Jones等，Nature，331: 522-525(1986) ;Riechmann等，Nature，332:323-329(1988);和Presta， Curr · Op · Struct · Biol ·，2:593-596(1992);其通過引用全文納入本文。因此，所述"人源化" 抗體可包括其中明顯小于完整的人可變區被來自非人物種的相應序列所取代的抗體。在實 踐中，人源化抗體一般是一些CDR殘基，可能是一些框架殘基被嚙齒動物抗體中相似位點的 殘基所取代的人抗體。參見，例如，美國專利號5，225，539; 5，585，089; 5，693，761; 5，693， 762;5,859,205。也參見美國專利號6，180,370和國際公開號冊01/27160，其中公開了人源 化抗體和用于產生對預定抗原的親和性提高的人源化抗體的技術。
[0064] II.靶標多肽描述
[0065]本文所用術語"腦信號蛋白_4D"、"SEMA4D"和"SEMA4D多肽"可互換使用，如 "SEMA4D"和"Sema4D"。在某些實施方式中，SEMA4D表達在細胞表面上或由細胞分泌。在另一 個實施方式中，SEMA4D是膜結合的。在另一個實施方式中，SEMA4D是可溶的，例如SSEMA4D。 在其他實施方式中，SEMA4D可包括完整大小的SEMA4D或其片段，或SEMA4D變體多肽，其中 SEMA4D或SEMA4D變體多肽的片段保留完整大小的SEMA4D的一些或全部功能性質。
[0066]完整大小的人SEMA4D蛋白質是由2條150kDa的多肽鏈組成的同二聚體跨膜蛋白。 SEMA4D屬于腦信號蛋白家族細胞表面受體并且也稱為CD100。人和小鼠 SEMA4D/Sema4D從其 跨膜形式經蛋白水解切割以形成120-kDa可溶性形式，表明存在2種Sema4D同種型 (Kumanogoh等，J.Cell Science 116(7): 3464(2003))。腦信號蛋白由可溶性和膜結合蛋白 組成，其原始定義為發育期間的軸突引導因子，其在建立神經元與其合適靶標的精確連接 中起到重要作用。從結構上考慮，IV類腦信號蛋白，SEMA4D由氨基末端信號序列接著特征性 "Sema"結構域組成，其含有17個保守的半胱氨酸殘基、Ig-樣結構域、富賴氨酸伸長段、疏水 性跨膜結構域和胞質尾。
[0067] SEMA4D的各多肽包含約13個氨基酸的信號序列，之后是約512個氨基酸的腦信號 蛋白結構域，約65個氨基酸的免疫球蛋白樣（Ig-樣)結構域，104個氨基酸的富賴氨酸伸長 段，約19個氨基酸的疏水性跨膜區，和110個氨基酸的胞質尾。胞質尾中酪氨酸磷酸化的共 有位點支持SEMA4D與酪氨酸激酶的預測結合(Schlossman等編，（1995)Leucocyte Typing V(《白細胞分型V》）（牛津，牛津大學出版社(Oxford University Press，0xford)))。
[0068] SEMA4D已知具有至少3個功能性受體，叢蛋白-B1、叢蛋白-B2和⑶72。受體之一，叢 蛋白-B1在非淋巴組織中表達并且已經顯示為SEMA4D的高親和性（InM)受體(Tamagnone等， Cell 99:71-80(1999))。叢蛋白-B1信號轉導的SEMA4D刺激已經顯示出誘導神經元的生長 錐塌陷，并且誘導少突細胞的過程延伸塌陷（process extension collapse)和凋亡 (Giraudon等，J.Immunol·172:1246-1255(2004);Giraudon等，NeuroMolecular Med·7: 207-216(2005))。在與SEMA4D結合之后，叢蛋白-B1信號轉導介導R-Ras的失活，導致整聯蛋 白介導的胞外基質粘附減少，以及RhoA的激活，導致通過重組細胞骨架和細胞迀移。參見 Kruger等，Nature Rev.Mol.Cell Biol.6:789-800(2005);Pasterkamp，TRENDS in Cell Biology 15:61-64(2005)。在另一方面，叢蛋白-B2對SEMA4D有中等親和性，并且最近的報 道表明叢蛋白-B2在角質形成細胞上表達并且激活SEMA4D-陽性γ δΤ細胞以促進上皮修復 (Witherden等，Immunity · 2012年8月24 日；37(2): 314-25)。
[0069] 在淋巴組織中，CD72用作低親和性（300nM)SEMA4D受體（Kumanogoh等，Immunity 13:621-631 (2000)) 3細胞和APC表達CD72，并且抗-CD72抗體具有許多與sSEMA4D相同的作 用，如增強CD40-誘導的B細胞應答和CD23的B細胞脫落。CD72被認為通過招募酪蛋白磷酸酶 SHP-1發揮B細胞應答的負調節物的作用，其可與許多抑制性受體聯合。SEMA4D與CD72的相 互作用導致SHP-1的解離，以及這種負激活信號的失去。SEMA4D已經顯示促進T細胞刺激和B 細胞聚集以及體外存活。加入SEMA4D-表達細胞或SSEMA4D在體外增強⑶40-誘導的B細胞增 殖和免疫球蛋白產生，并且在體內加快抗體應答(Ishida等，Inter. Immunol. 15:1027-1034 (2003);Kumanogoh和H.Kukutani，Trends in Immunol · 22:670-676(2001)) QSSEMA4D增強 ⑶40誘導的DC成熟，包括共刺激分子上調和增加的IL-12分泌。另外，sSEMA4D可抑制免疫細 胞迀移，其可能加入阻斷抗-SEMA4D抗體來逆轉（Elhabazi等，J. Immunol · 166:4341-4347 (2001);Delaire等，J·Immunol·166:4348-4354(2001))〇
[0070] Sema4D在包括脾臟、胸腺和淋巴結的淋巴器官中以及如腦、心臟和腎臟的非淋巴 器官中以高水平表達。在淋巴器官中，Sema4D在靜息T細胞上大量表達，但是僅在靜息B細胞 和抗原呈遞細胞(APC)如樹突細胞(DC)上弱表達。細胞激活增加了SEMA4D的表面表達以及 可溶性SEMA4D (SSEMA4D)的生成。
[0071] SEMA4D的表達特性表明其在免疫系統中起到重要的生理和病理作用。SEMA4D已經 顯示促進B細胞激活、聚集和存活;增強CD40-誘導的增殖和抗體產生;增強對T細胞以來抗 原的抗體響應;增加 T細胞增殖;增強樹突細胞成熟和刺激T細胞的能力;和直接涉及脫髓鞘 和軸突變性（Shi等，Immunity 13 :633-642(2000) ;Kumanogoh等，J Immunol 169:1175-1181(2002);和Watanabe等，J Immunol 167:4321-4328(2001))。
[0072] SEMA4D敲除（SEMA4D-/-)小鼠已經提供其他證據顯示SEMA4D在體液和細胞免疫應 答中起到重要作用。在SEMA4D-/-小鼠中沒有已知的非淋巴組織主要異常。來自SEMA4D-/-小鼠的樹突細胞(DC)具有弱刺激能力并且在共刺激分子的表達中顯示出缺陷，其可通過加 入SSEMA4D來拯救。SEMA4D缺陷（SEMA4D-/-)的小鼠無法發生由髓鞘少突細胞糖蛋白肽誘導 的實驗性自身免疫脊髓炎，因為在缺少SEMA4D的情況下，髓鞘少突細胞糖蛋白特異性T細胞 生成微弱(Kumanogoh等，J Immuno 1 169:1175-1181( 2002))。也在自身免疫傾向型MRL/lpr 小鼠（全身性自身免疫疾病如SLE的模型)而不是正常小鼠的血清中檢測到顯著量的可溶性 SEMA4D。此外，SSEMA4D的水平與自身抗體的水平相關并且隨著年齡增加(Wang等，Blood 97:3498-3504(2001))。可溶性SEMA4D也已經顯示在患有脫髓鞘性疾病的患者的腦脊液和 血清中累積，并且SSEMA4D誘導人多潛能神經前體(Dev細胞）的凋亡，并且在體外抑制過程 擴展并誘導大鼠少突細胞的凋亡(Giraudon等，J Immunol 172(2): 1246-1255(2004))。由 抗-SEMA4D MAb封閉這種凋亡。
[0073] III ·抗-SEMA4D抗體
[0074] 已經在本領域中描述了結合SEMA4D的抗體。參見，例如，美國公開號2008/ 0219971A1、US 2010/0285036A1 和US 2006/0233793A1、國際專利申請WO 93/14125、W0 2008/100995和W0 2010/129917,以及Herold等，Int. Immunol .7(1): 1-8(1995)，其各自通 過引用全文納入本文。
[0075]本發明一般涉及在患有炎性病癥的對象，例如人患者中治療動脈粥樣硬化的方 法，包括給予特異性結合SEMA4D的抗體、或其抗原結合片段、變體或衍生物。在某些實施方 式中，該抗體阻斷SEMA4D與其受體中的一種或多種，例如叢蛋白-B1的相互作用。具有這些 性質的抗-SEMA4D抗體可用于本文提供的方法。可使用的抗體包括，但不限于MAbs VX15/ 2503,67和76及其抗原結合片段、變體或衍生物，其全部描述于1^ 2010/028503641。可用于 本文提供的方法的其他抗體包括US 2006/0233793A1中所述的BD16和BB18抗體及其抗原結 合片段、變體或衍生物；或MAb 301、MAb 1893、MAb 657、MAb 1807、MAb 1656、MAb 1808、Mab 59、MAb 2191、MAb 2274、MAb 2275、MAb 2276、MAb 2277、MAb 2278、MAb 2279、MAb 2280、 MAb 2281、MAb 2282、MAb 2283、MAb 2284和MAb 2285中的任意種，及其任意片段、變體或衍 生物，如US 2008/0219971A1所述。在某些實施方式中，用于本文提供的方法的抗-SEMA4D抗 體結合人、鼠或人和鼠 SEMA4D。還可使用與任意前述抗體結合相同表位的抗體和/或競爭性 抑制任意前述抗體的抗體。
[0076]在某些實施方式中，可用于本文提供的方法的抗-SEMA4D抗體或其抗原結合片段、 變體或衍生物具有與參照抗-SEMA4D抗體分子的氨基酸序列具有至少約80 %、約85 %、約 88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%或約95%序列相同性的氨基酸序列， 例如，上述的那些。在另一個實施方式中，所述結合分子與參照抗體共有至少約96%、約 97%、約98%、約99%或100%的序列相同性。
[0077]在另一個實施方式中，可用于本發明提供的方法的抗-SEMA4D抗體或其抗原結合 片段、變體或衍生物，包含免疫球蛋白重鏈可變區（VH結構域）、基本由其組成或由其組成， 其中所述VH結構域的至少一個CDR具有與SEQ ID N0:9或10的CDRUCDR2或CDR3至少約 80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99 %相同或完全相同的氨基酸序 列。
[0078]在另一個實施方式中，可用于本發明提供的方法的抗-SEMA4D抗體或其抗原結合 片段、變體或衍生物，包含免疫球蛋白重鏈可變區（VH結構域）、基本由其組成或由其組成， 其中所述VH結構域的至少一個CDR具有與SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7或SEQ ID N0:8至少約 80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%相同或完全相同的氨基酸序 列。
[0079]在另一個實施方式中，可用于本發明提供的方法的抗-SEMA4D抗體或其抗原結合 片段、變體或衍生物，包含免疫球蛋白重鏈可變區（VH結構域）、基本由其組成或由其組成， 其中除了 1、2、3、4或5個保守氨基酸取代以外，所述VH結構域的至少一個CDR具有與SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8完全相同的氨基酸序列。
[0080]在另一個實施方式中，可用于本文提供的方法的抗-SEMA4D抗體或其抗原結合片 段、變體或衍生物的包含VH結構域、基本由其組成或由其組成，該VH結構域具有與SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10至少約80%、約85%、約90%、約91 %、約92%、約93%、約94%、約 95 %、約96 %、約97 %、約98%、約99%或100 %相同的氨基酸序列，其中抗-SEMA4D抗體包含 特異性或優先結合SEMA4D的編碼VH結構域。
[0081]在另一個實施方式中，可用于本發明提供的方法的抗-SEMA4D抗體或其抗原結合 片段、變體或衍生物，包含免疫球蛋白輕鏈可變區（VL結構域）、基本由其組成或由其組成， 其中所述VL結構域的至少一個CDR具有與SEQ ID如：17或18的〇?1工01?2或〇)1?3至少約 80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99 %相同或完全相同的氨基酸序 列。
[0082]在另一個實施方式中，可用于本發明提供的方法的抗-SEMA4D抗體或其抗原結合 片段、變體或衍生物，包含免疫球蛋白輕鏈可變區（VL結構域）、基本由其組成或由其組成， 其中所述VL結構域的至少一個CDR具有與SEQIDN0 :14、SEQIDN0:15或SEQIDN0:16至 少約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%相同或完全相同的氨基 酸序列。
[0083]在另一個實施方式中，可用于本發明提供的方法的抗-SEMA4D抗體或其抗原結合 片段、變體或衍生物，包含免疫球蛋白輕鏈可變區（VL結構域）、基本由其組成或由其組成， 其中除了 1、2、3、4或5個保守氨基酸取代以外，所述VL結構域的至少一個⑶R具有與SEQ ID N0:14、SEQ ID N0:15或SEQ ID N0:16完全相同的氨基酸序列。
[0084]在另一個實施方式中，可用于本文提供的方法的抗-SEMA4D抗體或其抗原結合片 段、變體或衍生物的包含VL結構域、基本由其組成或由其組成，該VL結構域具有與SEQ ID NO: 17或SEQ ID NO: 18至少約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約 95 %、約96 %、約97 %、約98%、約99%或100 %相同的氨基酸序列，其中抗-SEMA4D抗體包含 特異性或優先結合SEMA4D的編碼VL結構域。
[0085]本文提供的方法中使用的還包括編碼本文所述的抗-SEMA4D抗體，或其抗原結合 片段、變體或衍生物的多肽，編碼這類多肽的多核苷酸，包含這類多核苷酸的載體，和包含 這類載體或多核苷酸的宿主細胞，全部用于產生用于本文所述方法的抗-SEMA4D抗體，或其 抗原結合片段、變體或衍生物。
[0086]本發明抗-SEMA4D抗體的合適生物活性變體可用于本發明方法。這種變體將保持 母體抗-SEMA4D抗體的所需結合性質。本領域中制備抗體變體的方法通常是可得的。
[0087]誘變和改變核苷酸序列的方法為是本領域中熟知的。參見例如，Walker和Gaastra 編（1983)，Techniques in Molecular Biology(《分子生物學技術》）（紐約麥克米蘭出版公 司（MacMillan Publishing Company));Kunkel，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:488-492 (1985) ;Kunkel等，Methods Enzymol · 154:367-382( 1987);Sambrook等（1989)《分子克隆： 實驗室手冊》（Molecular Cloning:A Laboratory Manual)(紐約州冷泉港（Cold Spring Harbor，N.Y.));美國專利號4,873，192;以及其中引用的參考文獻;其通過引用納入本文。 有關不影響感興趣多肽生物學活性的合適氨基酸取代的指南可參見下述文獻中的模型： Dayhoff等（1978)，Atlas of Protein Sequence and Structure(《蛋白質序列和結構圖 冊》）（華盛頓特區的國家生物醫學研究基金會(Natl .Biomed.Res .Found.，Washington， D.C.))，第345-352頁，通過引用全文納入本文。Dayhoff等的模型利用單點可接受突變 (Point Accepted Mutation，PAM)氨基酸相似矩陣(PAM 250矩陣）來確定合適的保守性氨 基酸取代。在一些方面中，氨基酸取代可以是保守性取代，如用一個氨基酸交換具有類似性 質的另一個氨基酸。Dayhoff等模型的PAM 250矩陣中教導的保守性氨基酸取代的示例包括 但不限于：Oly^Ala '、ValoIle'^Leu、AspeGlu .、Lys^Arg、和 PheOT.rpHTyr 〇
[0088] 構建所述抗-SEMA4D結合分子的變體如抗體或其抗原結合片段、感興趣多肽時，生 成修飾，從而變體持續擁有所需屬性，如能特異性結合SEMA4D，如人、靈長動物、鼠、或者人 和鼠的SEMA4D，例如在表面上表達或由細胞分泌，并具有SEMA4D阻斷活性，如本文所述。編 碼變體多肽的DNA中產生的突變不應該將序列置于閱讀框外，并且在某些方面中將不產生 可生成二級mRNA結構的互補區。參見歐洲專利申請公開號75,444。
[0089] 測定抗-SEMA4D結合分子如抗體或其抗原結合片段、變體或衍生物的結合特異性 的方法包括但不限于:標準競爭結合實驗、T細胞或B細胞的免疫球蛋白分泌的監測試驗、T 細胞增殖實驗、凋亡實驗、ELISA實驗等。參見例如，W0 93/14125;Shi等，1臟1111^7 13:633-642(2000);Kumanogoh等，J Immunol 169:1175-1181(2002);Watanabe等，J Immunol 167： 4321-4328(2001);Wang等，Blood 97:3498-3504(2001);和Giraudon等，J Immunol 172 (2): 1246-1255(2004)公開的實驗，其都通過引用納入本文。
[0090] 本文在討論本文公開的任何具體多肽(包括恒定區、CDR、VH結構域或VL結構域)是 否與另一多肽至少約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約 93%、約94%、約95%、約96%、約97 %、約98%、約99%或者甚至約100%相同時，相同性％ 可采用本領域已知的方法和計算機程序/軟件測定，例如但不限于BESTFIT程序(威斯康星 序列分析軟件包，用于Unix系統的第8版，遺傳學計算機團隊(Genetics Computer Group)， 威斯康星州麥迪遜科學大道575大學研究園（University Research Park)，53711)。 BESTFIT利用Smith和Waterman( 1981 )Adv · Appl .Math · 2:482-489的局部同源性算法，以找 到兩條序列之間的最佳同源性區段。使用BESTFIT或任何其它序列比對程序來確定某具體 序列是否與本發明所述參考序列(例如)95%相同時，當然要設定參數從而在參考多肽序列 的全長上計算相同性百分數，并且在參考序列的氨基酸總數中允許多至5%的同源性缺口。
[0091] 出于本發明的目的，可采用史密斯-沃特曼(Smith-Waterman)同源性搜索算法測 定序列相同性百分數，該算法使用仿射缺口搜索，其中缺口開放罰12分，缺口延伸罰2分， BL0SUM矩陣計62分。Smith和Waterman( 1981 )Adv. Appl .Math.2:482-489中公開了史密斯-沃特曼同源性搜索算法。變體與參照抗CXCL13抗體(例如，MAb VX15/2503、67或76)可以差 異例如，少至1-15個氨基酸殘基，少至1-10個氨基酸殘基，如6-10個，少至5個，少至4、3、2、 或者甚至1個氨基酸殘基。
[0092] "序列相同性"百分比也可通過比較對比窗中兩種最優比對序列來測定。為了最優 比對用于比較的序列，對比窗中多核苷酸或多肽序列的部分可包含稱為缺口的添加或缺 失，而參考序列保持不變。最優比對是即使有缺口仍在參考和比較序列之間產生最大可能 數目的"相同"位置的比對。兩種序列之間的"序列相同性"百分比可用程序"BLAST 2序列" 版本測定，所述程序2004年9月1日起可獲自國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information)，包括程序BLASTN(用于核苷酸序列比較)和BLASTP(用于多 肽序列比較），基于Karl in和Alt schul 的算法（Proc · Natl .Acad .Sci.USA 90(12):5873-5877，1993)。使用"BLAST 2序列"時，2004年9月1日起的標準參數可用于字長(3)、缺口開放 罰分(11)、延伸缺口罰分(1)、缺口降低(50)、期望值(10)和任何其他需要的參數，包括但不 限于基質選擇。
[0093]可以多種方式使抗-SEMA4D抗體的恒定區突變從而改變效應物功能。例如，參見美 國專利號6,737,056B1和美國專利申請公開號2004/0132101A1，其公開了優化抗體與Fc受 體結合的Fc突變。
[0094]在可用于本文提供的方法的抗-SEMA4D抗體或其片段、變體或衍生物中，可使用本 領域已知的技術突變Fc部分以降低效應物功能。例如，恒定區結構域的缺失或失活(通過點 突變或其它方式)可降低循環的修飾抗體與Fc受體的結合，從而提高腫瘤定位。在其他情況 中，與本發明一致的恒定區修飾調節互補結合并因此縮短血清半衰期。可利用恒定區的其 它修飾來改變二硫鍵連接或寡糖部分，能因抗原特異性或抗體靈活性提高而加強定位。無 需過多實驗，即可容易地利用熟知的免疫學技術測定或定量分析修飾所產生的生理學概 況、生物利用度和其它生化作用，如腫瘤定位、生物分布和血清半衰期。用于本文提供的方 法的抗-SEMA4D抗體包括修飾的衍生物，例如通過將任何類型的分子共價連接到抗體上，從 而該共價連接不會防止抗體特異性結合其關聯表位。例如但不限于，抗體衍生物包括通過， 例如糖基化、乙酰化、PEG化、磷酸化、酰胺化、由已知保護/阻斷基團衍生、蛋白水解切割、連 接于細胞配體或其它蛋白質等方法修飾的抗體。通過已知技術可進行任意多種化學修飾， 包括但不限于:特異性化學切割、乙酰化、甲酰化等。此外，衍生物可包含一種或多種非經典 氨基酸。
[0095] "保守性氨基酸取代"是氨基酸殘基被具有帶相似電荷的側鏈的氨基酸殘基取代。 本領域已定義具有帶相似電荷的側鏈的氨基酸殘基家族。這些家族包括:具有堿性側鏈的 氨基酸(如賴氨酸、精氨酸、組氨酸）、具有酸性側鏈的氨基酸(如天冬氨酸、谷氨酸）、具有不 帶電極性側鏈的氨基酸（如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨 酸）、具有非極性側鏈的氨基酸(如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲 硫氨酸、色氨酸）、具有分支側鏈的氨基酸(如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和具有芳族側鏈 的氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸）。或者，突變可沿著編碼序列的全部或部分 隨機導入，如通過飽和突變，并且可篩選所得的突變體的生物活性以鑒定保持活性(例如， 在對象，例如癌癥患者中結合抗-SEMA4D多肽，以阻斷SEMA4D與其受體的相互作用，或減少、 抑制、阻止或延遲對象，例如患有炎性病癥或動脈粥樣硬化的患者中斑塊形成的能力）的突 變體。
[0096] 例如，可能僅在抗體分子的構架區內或僅在CDR區內引入突變。導入的突變可以是 沉默或天然錯義突變，即對抗體結合抗原的能力沒有或有很少的影響。可使用這些突變類 型來優化密碼子使用，或提高雜交瘤的抗體生成。或者，非天然錯義突變可改變抗體結合抗 原的能力。本領域技術人員將能夠設計并測試具有所需性質的突變體分子，如沒有抗原結 合活性或結合活性的變化(例如，改善抗原結合活性或改變抗體特異性）。誘變之后，編碼的 蛋白質可經常規表達并且能使用本文所述的技術或者通過本領域已知的常規修飾技術來 確定編碼的蛋白質的功能和/或生物活性(例如，免疫特異性結合SEMA4D多肽的至少一個表 位的能力）。
[0097]在某些實施方式中，用于本文提供的方法的抗-SEMA4D抗體包含至少一個優化的 互補決定區（CDR)。"優化的⑶R"指該⑶R已經修飾并且經優化以提高包含優化的⑶R的抗- SEMA4D抗體的結合親和性和/或抗-SEMA4D活性。"抗-SEMA4D活性"或"SEMA4D阻斷活性"可 包括調節下列一種或多種SEMA4D相關活性的活性:B細胞活性、聚集和存活;CD40-誘導的增 殖和抗體產生;對T細胞依賴抗原的抗體應答;T細胞或其他免疫細胞增殖;樹突細胞成熟； 脫髓鞘和軸突變性;多潛能神經前體和/或少突細胞的凋亡;誘導內皮細胞迀移;抑制自發 性單核細胞迀移;與細胞表面叢蛋白B1或其他受體結合，或者與可溶性SEMA4D或SEMA4D+細 胞表面上表達的SEMA4D相關的任意其他活性。抗-SEMA4D活性也可導致與SEMA4D表達相關 的疾病的發病或嚴重性降低，包括但不限于某些類型的癌癥包括淋巴瘤，自身免疫疾病，炎 性疾病包括中樞神經系統(CNS)和外周神經系統(PNS)炎性疾病，移植排斥和侵入性血管生 成。基于鼠抗-SEMA4D MAb BD16和BB18的優化的抗體的示例描述于美國專利公開號2008/ 0219971A1、國際專利申請號WO 93/14125和Herold等，Int. Immunol .7(1): 1-8(1995)，其各 自通過引用全文納入本文。修飾可包括取代CDR內的氨基酸殘基，使得抗-SEMA4D抗體保留 對SEMA4D抗原的特異性并且具有改善的結合親和性和/或改善的抗-SEMA4D活性。
[0098] IV.使用治療性抗-SEMA4D抗體的治療方法
[0099]本發明的方法涉及抗-SEMA4D結合分子，例如抗體，包括其抗原結合片段、變體和 衍生物治療患有動脈粥樣硬化的對象中的動脈粥樣硬化的用途。在某些實施方式中，內皮 細胞表達SEMA4D受體，在某些實施方式中，該受體是叢蛋白-B1。雖然以下說明涉及給予抗-SEMA4D抗體，本文所述的方法也適用于保留本發明抗-SEMA4D抗體的所需性質的這些抗體 的抗原結合片段、變體和衍生物，所述性質例如，能夠特異性結合SEMA4D，例如，人、小鼠、或 人和小鼠 SEMA4D，具有SEMA4D中和活性，和/或阻斷SEMA4D與其受體，例如叢蛋白-B1的相互 作用。本文所述的方法也適用于保留本發明抗體的所需性質的其他生物產品或小分子藥 物，例如，能夠特異性結合SEMA4D，例如，人、小鼠、或人和小鼠 SEMA4D，具有SEMA4D中和活 性，和/或阻斷SEMA4D與其受體的相互作用。
[0100]在一個實施方式中，治療包括向患者施加或給予本文所述的抗-SEMA4D結合分子， 例如抗體或抗原結合片段，其中該患者患有，或處于發展冠狀動脈疾病的風險中。在另一個 實施方式中，治療也包括向患者施加或給予包含抗-SEMA4D結合分子，例如抗體或其抗原結 合片段的組合物，其中該患者患有，或處于發展冠狀動脈疾病的風險中。
[0101] 本文所述的抗-SEMA4D結合分子，例如抗體或其抗原結合片段可用于治療炎性疾 病，包括動脈粥樣硬化。在一些實施方式中，動脈粥樣硬化的治療可減少、抑制、阻止和/或 延遲動脈粥樣硬化斑塊的形成和/或減少、抑制、阻止和/或延遲動脈粥樣硬化斑塊的生長。 動脈粥樣硬化斑塊由脂肪、膽固醇、鈣和其他血液中發現物質構成，其隨著時間使動脈硬化 并變窄，從而顯示富氧血液流向器官和身體的其他部分。
[0102] 在其他實施方式中，動脈粥樣硬化的治療可減少或降低在動脈粥樣硬化斑塊中或 周圍出現的新血管形成。人主動脈和冠狀動脈的動脈粥樣硬化斑塊中出現新血管形成 (Carmeliet P，Nature Med 9:653-660,2003;和Zhang Y等，Am J Pathol 143:164-172， 1993)。這些心血管源自外膜滋養血管并且用于滋養增厚的動脈粥樣硬化內膜生長 (Kumamoto Μ等，Hum Pathol 26:450_456，1995)。因此，新血管形成是動脈粥樣硬化斑塊生 長和不穩定的主要原因 （Barger AC等，N Engl J Med 310:175-177,1984)。幾項研究探索 了新血管形成促進粥樣斑形成的機制(Moreno PR等，Circulation 113:2245-2252,2006; 和Cheng XW等，Hypertension 57:981-989，2011)。由于滋養血管的密度與滲透進入斑塊的 炎性單核細胞的數量高度相關，認為斑塊中新血管的形成提供了白細胞迀移進入動脈粥樣 硬化斑塊的關鍵進入位點（O'Brien ER等，Am J Pathol 145:883-894,1994;和Moulton KS 等，Proc Natl Acad Sci USA 100:4736-4741,2003)。來自斑塊新血管的出血還通過幫助 血液脂質沉積在粥樣斑的脂質核心上來擴大斑塊尺寸（Kolodgie FD等，N Engl J Med 349:2316-25，2003)。包括血管抑制素或TNP-4570的動脈粥樣硬化抑制劑已經在有動脈粥 樣硬化傾向的載脂蛋白E-缺陷型(ApoE-/-)小鼠中顯示通過減少新血管形成來抑制斑塊生 長，這表明新血管形成在動脈粥樣硬化進展中的功能重要性(Moulton KS等，Proc Natl Acad Sci USA 100:4736-4741，2003;和Moulton KS等，Circulation 99:1726-32，1999)〇 此外，在動脈粥樣硬化斑塊中形成的新血管可通過增加從血液中分泌到斑塊的金屬蛋白酶 的量來加劇動脈粥樣硬化，并最終誘導斑塊破裂和血栓形成（Jonsson-Rylander AC等， Arterioscler Thromb Vase Biol 25:180-185,2005)。
[0103]在其他實施方式中，本文所述的抗-SEMA4D結合分子，例如抗體或其抗原結合片段 可用于治療其他炎性疾病。這類疾病的示例可包括，但不限于，心血管疾病、類風濕性關節 炎、胃腸道疾病、神經炎性疾病(例如，多發性硬化)甚至某些類型的癌癥(例如，膽囊癌）。 [0 104]在一個實施方式中，本發明涉及抗-SEMA4D結合分子，例如抗體或其抗原結合片 段、變體或衍生物作為藥物具體用于治療或預防動脈粥樣硬化以抑制、減少、防止、最小化 和/或延遲動脈粥樣硬化斑塊的形成和/或抑制、減少、防止、最小化和/或延遲動脈粥樣硬 化斑塊中的新血管形成的用途。
[0105] 按照本發明的方法，對于動脈粥樣硬化，利用至少一種抗-SEMA4D結合分子，例如 本文另述的抗體或其抗原結合片段、變體或衍生物提高積極治療響應。動脈粥樣硬化的"積 極治療響應"包括與斑塊形成、斑塊新血管形成、斑塊生長和/或與疾病相關的癥狀的改善 相關的疾病改善。即，可觀察到延遲的動脈粥樣硬化斑塊形成、減少的斑塊的新血管形成、 減少的炎癥、降低的斑塊生長、其組合等。這種積極治療響應不僅限于給藥途徑，可包括給 予供體、供體組織(如器官灌注）、宿主、其任何組合等。具體地，本文提供的方法涉及抑制、 防止、減少、緩解或減弱患者中動脈粥樣硬化的發展。因此，例如，疾病的改善的特征是沒有 臨床上可觀察到的癥狀，斑塊形成或斑塊生長的減少、抑制、阻止和/或延遲，新血管形成的 減少、抑制、阻止和/或延遲，炎癥減少，或斑塊功能或形態變化。
[0106] 抗-SEMA4D結合分子，例如，抗體或其抗原結合片段、變體或衍生物可與至少一種 或多種其他動脈粥樣硬化的治療聯用；其中其他療法在抗-SEMA4D結合分子，例如，抗體或 其抗原結合片段、變體或衍生物療法之前、期間或之后給予。因此，在組合療法包括給予抗-SEMA4D結合分子，例如，抗體或其抗原結合片段、變體或衍生物與給予另一種治療的情況 中，本發明的方法包括共同給予、使用單獨制劑或單一藥物制劑，同時或以任意順序連續給 予。
[0107] 在某些實施方式中，為了應用本發明的方法和系統，可在向患有動脈粥樣硬化或 炎性疾病的對象給予包括以下的治療之前、之后、或之前和之后同時從對象獲得樣品或圖 像：（1)有效量的特異性結合腦信號蛋白_4D(SEMA4D)的分離的結合分子;或(2)有效量的特 異性結合腦信號蛋白-4D(SEMA4D)的分離的結合分子。在一些情況中，可在已經開始治療之 后或已經停止治療之后，或在治療之前和之后從患者獲得連續樣品或圖像。樣品或圖像可 以是，例如，由醫療提供者（例如，醫生）或醫療益處提供者所需要，由相同或不同醫療提供 者(例如，護士，醫院）或臨床實驗室獲得和/或處理，并且在處理之后，可將結果轉送至另一 個提供者、醫療益處提供者或患者。類似地，可由一個或多個醫療提供者、醫療益處提供者 和/或臨床實驗室進行一個或多個分數的測量/確定、分數之間的比較、分數的評價和治療 決定。
[0108] 本文所用術語"醫療提供者"是指直接接觸或向活的對象(例如人類患者)給藥的 個人或機構。醫療提供者的非限制性示例包括醫生、護士、技師、治療師、藥師、顧問、替代醫 學從業者、醫學設備、醫生辦公室、醫院、急救室、診所、急救中心、替代醫學診所/設備、和提 供關于患者健康狀態的全部或任意部分的一般和/或特殊治療、評價、維持、療法、醫藥和/ 或建議的任意其他實體，包括但不限于一般醫學、特殊醫學、手術、和/或任何其他類型治 療、評價、維持、療法、醫藥和/或建議。
[0109] 在一些方面中，醫療提供者可給予或指示其他醫療提供者給予治療，包括：（1)有 效量的特異性結合腦信號蛋白_4D(SEMA4D)的分離的結合分子;或(2)有效量的特異性結合 腦信號蛋白_4D(SEMA4D)的分離的結合分子，其中該對象患有或疑似患有動脈粥樣硬化或 炎性疾病。醫療提供者可執行或指示其他醫療提供者或患者進行以下動作:獲取樣品或圖 像、處理樣品或圖像、提交樣品或圖像、接收樣品或圖像、轉移樣品或圖像、分析或測量樣品 或圖像、定量樣品或圖像、提供在分析/測量/定量樣品或圖像之后得到的結果、接收在分 析/測量/定量樣品或圖像之后得到的結果、比較/評分在分析/測量/定量一個或多個樣品 或圖像之后得到的結果、提供來自一個或多個樣品的比較/分數、獲取來自一個或多個樣品 或圖像的比較/分數、給予治療(例如，（1)有效量的特異性結合腦信號蛋白_4D(SEMA4D)的 分離的結合分子;或(2)給予對象有效量的特異性結合腦信號蛋白_4D(SEMA4D)的分離的結 合分子，其中該對象患有，或疑似患有動脈粥樣硬化或炎性疾病），開始給予治療、停止給予 治療、繼續給予治療、暫時中斷給予治療、增加給予的治療劑的量、減少給予的治療劑的量、 繼續給予一定量的治療劑、增加給予治療劑的頻率、降低給予治療劑的頻率、保持治療劑的 相同給藥頻率、由至少一種其他治療或治療劑取代治療或治療劑、將治療或治療劑與至少 一種其他治療或治療劑組合。
[0110] 在一些方面中，醫療提供者可授權或拒絕例如，收集樣品或圖像、處理樣品或圖 像、提交樣品或圖像、接收樣品或圖像、轉移樣品或圖像、分析或測量樣品或圖像、定量樣品 或圖像、提供在分析/測量/定量樣品或圖像之后得到的結果、轉移在分析/測量/定量樣品 或圖像之后得到的結果、比較/評分在分析/測量/定量一個或多個樣品或圖像之后得到的 結果、轉移來自一個或多個樣品或圖像的比較/分數、給予治療或治療劑、開始給予治療或 治療劑、停止給予治療或治療劑、持續給予治療或治療劑、暫時中斷給予治療或治療劑、增 加給予的治療劑的量、減少給予的治療劑的量、繼續給予一定量的治療劑、增加給予治療劑 的頻率、降低給予治療劑的頻率、維持治療劑的相同給藥頻率、由至少一種其他治療或治療 劑取代治療或治療劑、或將治療或治療劑與至少一種其他治療或治療劑組合。
[0111] 另外，醫療益處提供者可以，例如授權或拒絕治療處方，授權或拒絕治療覆蓋范 圍，授權或拒絕治療成本的退還，確定或拒絕治療合格性等。
[0112] 在一些方面中，臨床實驗室可以，例如，收集或獲取樣品、處理樣品、提交樣品、接 收樣品、轉移樣品、分析或測量樣品、定量樣品、提供在分析/測量/定量樣品之后得到的結 果、接收在分析/測量/定量樣品之后得到的結果、比較/評分在分析/測量/定量一個或多個 樣品之后得到的結果、提供來自一個或多個樣品的比較/分數、獲取來自一個或多個樣品的 比較/分數、或其他相關活動。
[0113] 在一些方面中，醫療提供者、臨床實驗室、或其他實體可以，例如，收集或獲取圖 像、處理圖像、提交圖像、接收圖像、轉移圖像、分析或測量圖像、定量圖像、提供在分析/測 量/定量圖像之后得到的結果、接收在分析/測量/定量圖像之后得到的結果、比較/評分在 分析/測量/定量一個或多個圖像之后得到的結果、提供來自一個或多個圖像的比較/分數、 獲取來自一個或多個圖像的比較/分數、或其他相關活動。可用于這些方面的成像包括但不 限于通過冠狀血管造影、血管內超聲（IVUS)、頸動脈超聲、冠狀動脈計算機斷層掃描(CT)、 核磁共振成像(MRI)、正電子發射斷層成像(PET)光學相干斷層成像（0CT)、近紅外光譜 (NIRS)、和NIR熒光獲得的圖像。在某些實施方式中，可使用已經在文獻中描述的成像技術 (Tardif等，Circ Cardiovasc Imaging 4:319-333(2011))。
[0114] VII.診斷和治療方法
[0115] 在某些實施方式中，本發明提供了治療對象，例如動脈粥樣硬化患者的方法，其中 該對象具有升高水平的B細胞、T細胞或B細胞和T細胞，該方法包括如果該對象的B細胞、T細 胞或B細胞和T細胞水平超過B細胞、T細胞或B細胞和T細胞的預定閾值水平，或者相對于一 個或多個對照樣品中的B細胞、T細胞或B細胞和T細胞水平升高，則給予有效量的特異性結 合腦信號蛋白_4D(SEMA4D)的分離的結合分子，對照樣品可包括但不限于來自其他動脈粥 樣硬化患者或來自健康非動脈粥樣硬化患者的樣品。可由醫療提供者或臨床實驗室測量B 細胞、T細胞或B細胞和T細胞水平，其中由醫療提供者或臨床實驗室從患者獲取樣品，例如， 血液樣品。在一個方面中，可在基于流式細胞術的免疫表型試驗中測量患者的B細胞、T細胞 或B細胞和T細胞的水平。
[0116] 在某些實施方式中，本發明也提供了治療對象，例如動脈粥樣硬化患者的方法，該 方法包括:如果取自該對象的樣品中的C-反應蛋白（CRP)和/或低密度脂蛋白（LDL)水平高 于上述預定閾值水平，或者相對于一個或多個對照樣品中的CRP和/或LDL水平升高，則向該 對象給予有效量的特異性結合腦信號蛋白_4D(SEMA4D)的分離的結合分子。可由醫療提供 者或由臨床實驗室測量對象中的CRP和/或LDL水平表達。在某些方面中，可通過例如成像技 術在原位測量CRP和/或LDL水平。在某些方面中，可在獲自對象的樣品中測量CRP和/或LDL 水平表達。在一個方面中，可在采用識別CRP和/或LDL的抗體或其抗原結合片段的免疫試驗 中測量CRP和/或LDL水平。在另一個方面中，可通過定量基因表達試驗，例如RT-PCR試驗來 測量CRP和/或LDL水平。
[0117] 本發明還提供了方法、試驗和試劑盒來促進由醫療提供者、醫療益處提供者或臨 床實驗室確定對象，例如患有動脈粥樣硬化或炎性疾病的患者是否將受益于用以下治療： (1)有效量的特異性結合腦信號蛋白_4D(SEMA4D)的分離的結合分子;或（2)有效量的特異 性結合腦信號蛋白-4D(SEMA4D)的分離的結合分子，其中該對象患有或疑似患有動脈粥樣 硬化或炎性疾病。本發明提供的方法、試驗和試劑盒還將促進由醫療提供者、醫療益處提供 者或臨床實驗室確定對象，例如患有動脈粥樣硬化或炎性疾病的患者是否將受益于以下治 療：（1)有效量的特異性結合腦信號蛋白_4D(SEMA4D)的分離的結合分子和有效量的至少一 種其他免疫調節治療劑;或(2)有效量的特異性結合腦信號蛋白-4D(SEMA4D)的分離的結合 分子。
[0118] 本發明提供了治療對象，例如動脈粥樣硬化患者的方法，該方法包括如果取自該 患者的樣品中的B細胞、T細胞、或B細胞和T細胞的水平高于預定閾值水平，或者高于一個或 多個對照樣品中的B細胞、T細胞、或B細胞和T細胞的水平，則給予有效量的特異性結合腦信 號蛋白_4D(SEMA4D)的分離的結合分子。在一些方面中，從患者獲取樣品并且提交至例如臨 床實驗室來測量樣品中B細胞、T細胞、或B細胞和T細胞的水平。
[0119] 本發明還提供了一種治療確定患有動脈粥樣硬化斑塊的對象，例如患有動脈粥樣 硬化的患者的方法，包括給予有效量的特異性結合腦信號蛋白_4D(SEMA4D)的分離的結合 分子。在某些實施方式中，如果患者中動脈粥樣硬化斑塊的數量、尺寸或特征大于預定閾值 數量、尺寸或特征，或如果對象中動脈粥樣硬化斑塊的數量、尺寸或特征與一個或多個對照 樣品相比時指示動脈粥樣硬化，則確定對象有動脈粥樣硬化斑塊并接受治療。在一些方面 中，從患者獲取樣品并且提交至例如臨床實驗室來測量樣品中CRP和/或LDL的水平。在其他 方面中，患者經過成像技術以確定動脈粥樣硬化斑塊的數量、尺寸或特征。可用于這些方法 的成像包括但不限于通過冠狀血管造影、血管內超聲（IVUS)、頸動脈超聲、冠狀動脈計算機 斷層掃描(CT)、核磁共振成像(MRI)、正電子發射斷層成像(PET)光學相干斷層成像(0CT)、 近紅外光譜(NIRS)、和NIR熒光獲得的圖像。在某些實施方式中，可使用已經在文獻中描述 的成像技術（Tardif等，Circ Cardiovasc Imaging. 2011 ;4:319-333)。在某些實施方式中， 如果動脈粥樣硬化斑塊是具有特征的"易感的動脈粥樣硬化斑塊"，則給予治療，該特征包 括但不限于大脂質核、低SMC含量、高巨噬細胞含量、和薄纖維帽。可通過評分系統(Virmani 等，Arterioscler Thromb Vase Biol 20(5): 1262-75(2000))或其他技術（van Lammeren 等，Current Cardiology Reviews 7:22-27(2011))來確定對象中存在"易感的動脈粥樣硬 化斑塊"。在某些實施方式中，按照本文提供的方法治療確定具有這類"易感的動脈粥樣硬 化斑塊"的對象。
[0120] 還提供了一種治療對象，例如動脈粥樣硬化患者的方法，該方法包括：（a)提交取 自該對象的樣品來測量樣品中B細胞、T細胞、或B細胞和T細胞的水平，或測量CRP和/或LDL; 和(b)如果該對象的B細胞、T細胞、或B細胞和T細胞的水平、或該對象的CRP和/或LDL水平高 于預定閾值水平，或者高于一個或多個對照樣品中的B細胞、T細胞、或B細胞和T細胞的水 平、或CRP和/或LDL的水平，則給予該對象有效量的特異性結合腦信號蛋白-4D( SEMA4D)的 分離的結合分子。
[0121] 本發明還提供了治療對象，例如動脈粥樣硬化患者的方法，該方法包括(a)測量取 自對象，例如動脈粥樣硬化患者的樣品中B細胞、T細胞、或B細胞和T細胞的水平，其中在基 于流式細胞術的免疫表型試驗中測量樣品中的B細胞、T細胞、或B細胞和T細胞的水平；（b) 確定樣品中B細胞、T細胞、或B細胞和T細胞的水平是否高于預定閾值水平，或者高于一個或 多個對照樣品中的B細胞、T細胞、或B細胞和T細胞的水平；和（c)如果該對象的B細胞、T細 胞、或B細胞和T細胞的水平高于預定閾值水平，或者高于一個或多個對照樣品中的B細胞、T 細胞、或B細胞和T細胞的水平，則建議、指示或授權醫療提供者向該對象給予有效量的特異 性結合腦信號蛋白-4D (SEMA4D)的分離的結合分子。
[0122] 在一些方面中，可在基于流式細胞術的免疫表型試驗中測量對象的B細胞、T細胞、 或B細胞和T細胞的水平。在某些方面中，可通過醫療專業人員用例如本文所述的試驗配制 成"醫療點"診斷試劑盒對取自對象的樣品進行試驗。在一些方面中，可從對象獲取樣品并 且可提交至例如臨床實驗室來按照醫療專業人員的說明測量樣品中B細胞、T細胞、或T細胞 和Β細胞的水平，包括但不限于使用本文所述的基于流式細胞術的免疫表型試驗。在某些方 面中，臨床實驗室所進行的試驗可建議醫療提供者或醫療益處提供者如果取自該患者的樣 品中的Β細胞、Τ細胞、或Β細胞和Τ細胞的水平高于預定閾值水平，或者高于一個或多個對照 樣品中的Β細胞、Τ細胞、或Τ細胞和Β細胞的水平，對象是否受益于用有效量的特異性結合腦 信號蛋白-4D (SEMA4D)的分離的結合分子。
[0123] 在某些方面中，免疫試驗、其他診斷試驗和/或成像的結果可提交至醫療益處提供 者來確定患者的保險是否覆蓋用特異性結合腦信號蛋白_4D(SEMA4D)的分離的結合分子的 治療。
[0124] VIII.藥物組合物和給藥方法
[0125] 本領域技術人員熟知或不難確定制備和給予抗-SEMA4D結合分子，如抗體或其抗 原結合片段、變體或衍生物的方法。抗-SEMA4D結合分子，如抗體或其抗原結合片段、變體或 衍生物的給藥途徑可以是，例如，口服、胃腸道外、吸入或外用。本文所用的術語"胃腸道外" 包括例如，靜脈內、動脈內、腹膜內、肌肉內、皮下、直腸或陰道給藥。雖然所有這些給藥形式 均明確認為在本發明范圍內，但給藥形式的例子是注射液，特別是用于靜脈內或動脈內注 射或滴注。合適的注射用藥物組合物可包含緩沖劑(如乙酸鹽、磷酸鹽或檸檬酸鹽緩沖劑）、 表面活性劑(如聚山梨酯），以及任選的穩定劑(如人白蛋白）等。然而，在與本文所教授內容 相符的其它方法中，抗-SEMA4D結合分子，如抗體或其抗原結合片段、變體或衍生物可直接 遞送到不良細胞群的位點，從而提高患病組織與治療劑的接觸。
[0126] 如本文所述，可以藥學有效量給予抗-SEMA4D結合分子，例如，抗體或其抗原結合 片段、變體或衍生物用于體內治療炎性病癥。在這方面，應理解，將配制本發明公開的結合 分子以利于給藥并提高活性物質的穩定性。在某些實施方式中，本發明的藥物組合物包含 藥學上可接受的無毒無菌運載體，如生理鹽水、無毒緩沖液、防腐劑等。出于本申請目的， 抗-SEMA4D結合分子如抗體或其抗原結合片段、變體或衍生物的藥學有效量應認為指足以 實現有效結合靶標和足以實現某一益處例如減少、抑制、阻止和/或延遲動脈粥樣硬化患者 中斑塊形成或生長的量。
[0127] 本發明所用的藥物組合物包含藥學上可接受的運載體，包括例如，離子交換劑、氧 化鋁、硬脂酸鋁、卵磷脂，血清蛋白質如人血清白蛋白，緩沖物質如磷酸鹽、甘氨酸、山梨酸、 山梨酸鉀、飽和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、鹽或電解質，如硫酸魚精蛋白、磷酸氫 二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽、膠體二氧化硅、三硅酸鎂、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素基物質、 聚乙二醇、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸酯、蠟、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊 毛脂。
[0128] 胃腸道外給藥制劑包括無菌的水性或非水性溶液、懸液和乳液。非水性溶劑的示 例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油，和可注射有機酯如油酸乙酯。水性運載體包括例 如，水、醇/水溶液、乳液或懸液，包括鹽水和緩沖介質。在本發明中，藥學上可接受的運載體 包括但不限于:〇. 01-0.1M，例如0.05M的磷酸鹽緩沖液或0.8 %鹽水。其它常見的胃腸道外 載劑包括磷酸鈉溶液、林格右旋糖、右旋糖和氯化鈉、乳酸林格溶液或固定油。靜脈內載劑 包括液體和營養補充劑、電解質補充劑，例如基于林格右旋糖的那些物質等。也可存在防腐 劑和其它添加劑，例如，抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體等。
[0129] 更具體地，適于注射應用的藥物組合物包括無菌水溶液(水溶性時）或分散液，以 及用于臨時制備無菌注射液或分散液的無菌粉末。在這種情況下，該組合物必須無菌，并應 該是達到存在注射容易性(easy 871*;[1^313；[1;^7)程度的流體。它應該在制造和儲存條件下 穩定，并且在一些方面中應該在保存過程中能夠抵抗微生物如細菌和真菌的污染作用。運 載體可以是包含如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)及其合適混合物 的溶劑或分散介質。可維持合適的流動性，例如通過使用諸如卵磷脂的涂料、分散液情況下 通過保持所需粒度以及通過使用表面活性劑。適用于本文所述治療方法的制劑可參見《雷 明頓藥物科學》（Remingtor/s Pharmaceutical Sciences)(馬克出版公司（Mack Publishing Co·))第16版（1980)。
[0130] 也可通過各種抗菌劑和抗真菌劑(如對羥基苯甲酸酯類、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、 硫柳汞等)實現防止微生物的作用。在某些方面中，藥物組合物可包含等滲劑，例如，糖、多 元醇，如甘露醇、山梨醇或氯化鈉。可在組合物中包含延遲吸收的試劑(如單硬脂酸鋁和明 膠）以延長可注射組合物的吸收。
[0131] 在任何情況下，制備無菌注射溶液可通過將所需量的活性化合物(如抗-SEMA4D抗 體或其抗原結合片段、變體或衍生物，本身或與其它活性劑聯合)摻入含有本文所列一種成 分或多種成分組合的合適溶劑，然后如需要進行過濾除菌。通常，將活性活化物摻入含有堿 性分散介質和上述其它所需成分的無菌載劑中制備分散液。在制備無菌注射液所需的無菌 粉末時，在一些方面中，制備方法包括真空干燥和冷凍干燥，由之前無菌過濾的溶液得到活 性組分和任何其它所需組分的粉末。注射制劑在無菌條件下按照本領域已知方法加工，裝 入容器(如安瓿、袋、瓶、注射器或小管）中，并密封。此外，可以試劑盒的形式包裝并銷售制 劑。這類制品可具有標簽或藥品說明書，表明相關組合物可用于治療患有或傾向于患有疾 病或病癥的對象。
[0132] 胃腸道外制劑可以是單次推注劑量，輸注或負荷推注劑量，隨后是維持劑量。可在 具體固定或可變的間隔處給予這些組合物，例如，每天一次或者"按需"基礎。
[0133] 本發明所用的某些藥物組合物可以可接受的劑型口服給予，包括例如，膠囊、片 劑、水性懸液或溶液。也可通過鼻氣溶膠或吸入來給予某些藥物組合物。這類組合物可采用 苯甲醇或其他合適的防腐劑，吸收促經濟以增強生物可及性，和/或其他常規增溶劑或分散 劑制備成鹽水溶液。
[0134] 與載體材料組合產生單一劑型的抗-SEMA4D結合分子，如抗體或其片段、變體或衍 生物的量可以根據治療宿主以及具體的給藥模式而變化。可以單劑型、多劑型或在確立的 時間段內的輸注中給予組合物。也可調整給藥方案，以提供最優所需響應(例如，治療或預 防性響應)。
[0135] 在本發明范圍內，抗-SEMA4D抗體或其抗原結合片段、變體或衍生物可按照上述治 療方法給予人或其它動物，其給予量足以產生療效。本發明抗-SEMA4D抗體，或其抗原結合 片段、變體或衍生物可以常規劑型給予所述人或其它動物，該劑型根據已知技術將本發明 抗體與常規的藥學上可接受運載體或稀釋劑混合來制備。本領域技術人員應認識到，藥學 上可接受運載體或稀釋劑的形式和特點由混合的活性成分含量、給藥途徑和其它熟知變量 決定。本領域技術人員還將理解，可使用包含一種或多種抗-SEMA4D結合分子，如本發明的 抗體或其抗原結合片段、變體或衍生物的混合物。
[0136] "治療有效劑量或量"或"有效量"是指抗-SEMA4D結合分子，例如抗體或其抗原結 合片段、變體或衍生物的量，其在給予時帶來對于患有待治療疾病的患者的治療的積極治 療響應，例如，動脈粥樣硬化斑塊形成的延遲;新動脈粥樣硬化斑塊形成增加的減少、延遲 或停止;抑制，例如，阻止、延遲、防止、停止或逆轉動脈粥樣硬化斑塊中的新血管形成;動脈 粥樣硬化斑塊形態或功能變化;或一定程度上釋放與動脈粥樣硬化相關的癥狀中的一種或 多種;降低發病率和死亡率;改善生活質量;或這類效果的組合。
[0137] 用于減少、抑制、阻止和/或延遲動脈粥樣硬化斑塊的本發明的組合物的治療有效 劑量可根據許多不同的因素變化，包括給藥方式、目標位點、患者的生理狀態、患者是人還 是動物、給予的其他藥物和治療是預防性還是治療性。在某些實施方式中，患者是人，但也 可治療非人哺乳動物，包括轉基因哺乳動物。可使用本領域技術人員已知的常規方法對治 療劑量進行滴定以優化安全性和功效。
[0138] 鑒于本發明的公開內容，本領域普通技術人員無需過多實驗即可確定至少一種 抗-SEMA4D結合分子如抗體或其結合片段、變體或衍生物的給予量。影響給藥方式以及至少 一種抗-SEMA4D結合分子，如抗體或其抗原結合片段、變體或衍生物各自用量的因素包括但 不限于:接受治療的個體的疾病嚴重程度、病史、年齡、身高、重量、健康和身體狀況。類似 地，抗-SEMA4D結合分子，如抗體或其片段、變體或衍生物的給予量取決于給藥方式、對象是 否接受單一劑量或多劑量的此種藥劑。
[0139] 本發明還提供抗-SEMA4D結合分子，例如本發明的抗體，或其抗原結合片段、變體 或衍生物在制備用于治療患有炎性病癥的對象的藥物中的用途，其中該藥物用于已經用至 少一種其他治療預治療的對象。"預治療"或"預處理"是指對象在接受包含抗-SEMA4D結合 分子，如抗體或其抗原結合片段、變體或衍生物的藥物之前已經接受了一種或多種其他治 療（例如，已經用至少一種其他炎癥治療進行治療）。"預治療"或"預處理"包括在開始用包 含抗-SEMA4D結合分子，例如本文公開的單克隆抗體VX15/2503或其抗原結合片段、變體或 衍生物的藥物治療開始2年內、18個月內、1年內、6個月內、2個月內、6周內、1個月內、4周內、 3周內、2周內、1周內、6天內、5天內、4天內、3天內、2天內、或者甚至1天內已經用至少一種其 他治療進行治療的對象。對象不必對用之前的一種或多種治療進行的預治療有響應。因此， 接受包含抗-SEMA4D結合分子，例如抗體或其抗原結合片段、變體或衍生物的藥物的對象可 能已經響應或可能沒有響應用先前治療的預治療，或先前治療中的一種或多種，其中預治 療包括多種治療。
[0140] 除非另有說明，本發明的實施將采用細胞生物學、細胞培養、分子生物學、轉基因 生物學、微生物學、重組DNA和免疫學的常規技術，它們均在本領域技術范圍內。這些技術在 文獻中已有充分描述。參見例如，Sambrook等編（1989)Molecular Cloning A Laboratory Manual (《分子克隆：實驗室手冊》）（第2版；冷泉港實驗室出版社（Cold Spring Harbor Laboratory Press)); Sambrook等編（1992)Molecular Cloning： A Laboratory Manual (《分子克隆：實驗室手冊》），（紐約州的冷泉港實驗室出版社（Cold Springs Harbor 1^13〇1&1:〇巧，階））；0.1^.61〇￥61'編，（1985)0嫩（]1〇11；[叫（《0財克隆》），第1和11卷；6&;[1:編 (1984)01丨801111(31601:丨(16 37111:1168丨8(《寡核苷酸合成》）；11111丨8等，美國專利號4,683，195; Hames和Higgins編（1984)Nucleic Acid Hybridization(《核酸雜交》）；Hames和Higgins編 (1984)Transcription And Translation(《轉錄和翻譯》）；Freshney(1987)Culture Of Animal Cells(《動物細胞培養》）（ARL公司（Alan R.Liss，Inc.));Immobilized Cells And Enzymes(《固定的細胞和酶》）（IRL出版社）（1986) ;Perbal(1984)A Practical Guide To Molecular Cloning(《分子克隆實踐指南》論文，Methods In Enzymology(《酶學方法》） (學術出版社公司（Academic Press，Inc.)，紐約州）；Miller和Calos編（1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(《哺乳動物細胞的轉基因載體》）（冷泉港實驗室 出版社（Cold Spring Harbor Laboratory) );Wu等編，Methods In Enzymology(《酶學方 法》），第154和155卷；Mayer和Walker編（1987)Immunochemical Methods In Cell And Molecular Bio logy (《細胞和分子生物學中的免疫化學方法》）（學術出版社(Academic Press)，倫敦）；Weir和Blackwell編（1986)Handbook Of Experimental Immunology(《實驗 免疫學手冊》），第I-IV卷;Manipulating the Mouse Embryo(《小鼠胚胎操作》），紐約州冷 泉港的冷泉港實驗室出版社（Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor， N.Y·)，（1986);和Ausubel等（1989)Current Protocols in Molecular Biology(《新編分 子生物學實驗指南》）（馬里蘭州巴爾的摩的約翰韋利父子公司（John Wiley&Sons， Baltimore?Md.))0
[0141 ] 抗體工程的一般原理可參見Borrebaeck編（1995) Anti body Engineering (《抗體 工程》）（第2版；牛津大學出版社（Oxford Univ.Press))。蛋白質工程的一般原理可參見 Rickwood等編（1995)Protein Engineering，A Practical Approach(《蛋白質工程，實踐方 法》），（英國牛津的牛津大學出版社的IRL出版公司（IRL Press at Oxford Univ.Press， 0xford，Eng.)) 抗體和抗體-半抗原結合的一般原理可參見:Nisonoff (1984)Molecular Immunology (《分子免疫學》）（第2版；馬薩諸塞州桑德蘭的辛奧爾聯合公司（Sinauer Associates，Sunderland，Mass·));和Steward(1984)Antibodies，Their Structure and Function(《抗體的結構和功能》）（Chapman和Hall，紐約州紐約市）D此外，本領域已知且沒 有具體描述的免疫學標準方法通常按照下述文獻所述進行：Current Protocols in Immunology(《新編免疫學實驗指南》），紐約州的約翰韋利父子公司（John Wiley&Sons); Stites等編（1994)Basic and Clinical Immunology(《基礎和臨床免疫學》）（第8版； Apple ton 和 Lange，康捏狄格州的諾沃克(Norwalk，Conn.))和Mishe 11 和Shi igi (編）（1980) Selected Methods in Cellular Immunology(《細胞免疫學的選用方法》）(W.Η.弗里曼公 司(W.H.Freeman and Co)，紐約州）。
[0142] 列出免疫學通用原理的標準參考文獻包括:Current Protocols in Immunology (《新編免疫學實驗指南》），約翰韋利父子公司（John Wiley&Sons)，紐約州;Klein(1982) J. ?Immunology：The Science of Self-Nonself Discrimination^〈免疫學：自身-非自身 區別的科學》）（約翰韋利父子公司，紐約州）；Kennett等編（1980)Monoclonal Antibodies， Hybridoma:A New Dimension in Biological Analyses(《單克隆抗體，雜交瘤：生物學分 析的新領域》）（普萊努公司（Plenum Press)，紐約州）；Campbell (1984)〃Monoclonal Antibody Technology"in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology"(《生化和分子生物學實驗室技術》中的"單克隆抗體技術"），Burden等編（的埃爾 斯威爾公司(Elsevere)，阿姆斯特丹）；Goldsby等編（2000)Kuby Immunnology(《庫比免疫 學》）（第4版;H.弗里曼公司（H.Freemand&Co.)) ;Roitt等（2001)Immunology(《免疫學》）（第 6版；倫敦：摩茲比公司（Mosby));Abbas等（2005)Cellular and Molecular Immunology (《細胞和分子免疫學》）（第5版;埃爾斯威爾健康科學分公司(Elsevier Health Sciences Division)) ;Kontermann和Dubel(2001 )Antibody Engineering(《抗體工程》）（施普林格公 司（Springer Verlan));Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual (《分子克隆：實驗室手冊》）（冷泉港出版社（Cold Spring Harbor Press) );Lewin (2003)Gene VIII(《基因普倫蒂斯霍爾出版社(Prentice Hall)2003);Harlow和 Lane( 1988)Antibodies :A Laboratory Manual (《抗體：實驗室手冊》）（冷泉港出版社）； Dieffenbach和Dveksler(2003)PCR Primer(《PCR引物》）（冷泉港出版社）。
[0143] 將上文中引用的所有參考文獻以及其中引用的所有參考文獻通過引用全文納入 本文。
[0144] 通過說明的方式，而非限制性方式提供以下實施例。 實施例
[0145] 實施例1:測試抗-SEMA4D結合分子，例如抗體或其抗原結合片段、變體或衍生物， 例如VX15/2503在ApoE-缺陷型自發性高脂血癥(SHL)小鼠中抑制動脈粥樣硬化形成并減少 新血管形成的能力
[0146] 實驗設計。以下實驗檢驗用抗-Sema4D阻斷抗體治療ApoE-缺陷型自發性高脂血癥 (SHL)小鼠是否降低斑塊生長和新血管形成。
[0147] 小鼠。遺傳背景為0578176,0578176.1(01?/5加 51(3-4口〇641的雄性4口(^-缺陷型自 發性高脂血癥（SHL)小鼠獲自日本靜岡縣的日本SLC公司（Japan SLC，Inc ·( Shizuoka， Japan))。用正常飲食飼喂SHL小鼠并飼養在名城大學藥學系的動物中心。所有的實驗方案 得到機構動物倫理審查委員會的批準。
[0148] 小鼠的抗體治療。雄性14周齡的SHL小鼠被隨機分配到2個組中并且各組通過腹膜 內注射以〇. 6mg/小鼠每周一次給予小鼠對照單克隆抗體(n= 10)(對照抗體2B8.1E7，紐約 州羅徹斯特的瓦西尼斯公司（Vaccinex，Inc .，Rochester，NY))或小鼠抗-SEMA4D中和單克 隆抗體(n = 9)(VX15/67-2,瓦西尼斯公司）。在12周的治療之后，處死小鼠。
[0149] 組織處理。通過插入左心室尖部的21號針頭使用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)灌注小鼠 主動脈持續3分鐘，然后用4%緩沖的多聚甲醛(pH 7.4)另外灌注3分鐘。帶有其主要分支點 (頭臂動脈干、左頸總動脈和左鎖骨下動脈）的主動脈弓以及胸主動脈和腹主動脈被切下并 在4%緩沖的多聚甲醛(pH 7.4)中固定。然后用蘇丹IV(美國密蘇里州圣路易斯的西格瑪-奧德里奇公司（Sigma-Aldrich，St .Louis，M0))對主動脈染色以揭示嗜蘇丹脂質沉積并且 使用Image J軟件(Wayne Rasband，馬里蘭州貝塞斯達的國立衛生研究院（NIH，Bethesda， MD))來對脂質斑塊面積占總主動脈面積的百分比進行定量(Dougherty A等，Methods in Molecular Biology，卷209:Transgenic Mouse Methods and Protocols(《轉基因小鼠方 法和方案》），新澤西州托托瓦的胡馬納出版公司(Humana Press Inc.，Totowa，NJ)，第293-309 頁，2002)。
[0150] 免疫組化和形態計量學。從麻醉的小鼠中切下的主動脈弓在4%緩沖的多聚甲醛 (pH 7.4)中固定。所有血管縱向包埋于石蠟中并切成1-μπι連續切片。用抗-小鼠⑶31抗體 (美國新澤西州富蘭克林湖市的BD公司（BD，Franklin Lakes，NJ))對切片進行免疫標記以 對內皮細胞進行染色。隨后用偶聯二抗的葡聚糖聚合物和過氧化物酶（日本京都的DC公司 (DakoCytomation，Kyoto，Japan))孵育它們。為了檢測新血管形成，在室溫下用10μg/ml蛋 白酶K(日本京都的日本生命技術公司（Life technologies Japan，Tokyo，Japan))預處理 切片15分鐘并且在室溫下與7.5mg/ml的偶聯焚光素酶的來自西非單葉豆（Bandeiraea simpilicifolia)的凝集素 Μ(西格瑪-奧德里奇公司)孵育1小時。凝集素 M(IB4)結合至有 內皮細胞表達的末端半乳糖殘基。新血管形成的程度確定為通過使用Image-J形態計量 學系統(Wayne Rasband)將凝集素 Μ或CD31-陽性面積除以相應的斑塊面積計算的百分比。 [0151 ]統計學分析。數據表示為平均值土 s. Ε。使用斯氏t檢驗比較抗-Sema4D抗體治療的 SHL小鼠與對照抗體治療的SHL小鼠。在*p<0.05，#p<0.01下，數據是統計學顯著的。 [0152]抗-Sema4D抗體治療抑制動脈粥樣硬化斑塊的發展。為了分析ApoE缺陷型SHL小鼠 中抗-Sema4D抗體治療對動脈粥樣硬化發展的影響，對來自對照抗體治療和抗-Sema4D抗體 治療的SHL小鼠的解剖主動脈進行脂質沉積的嗜蘇丹染色。圖1A顯示當與對照抗體治療的 組比較時，抗-Sema4D抗體治療的SHL小鼠的主動脈區域中動脈粥樣硬化斑塊發展受到顯著 抑制。如圖1A所示，對動脈粥樣硬化斑塊面積的定量測量顯示抗-Sema4D抗體治療的SHL小 鼠中嗜蘇丹面積相對于總主動脈區域的平均百分比明顯小于對照抗體治療的組中的平均 百分比（抗-361^40抗體治療的小鼠 ：4.89±1.11%對比對照抗體治療的小鼠：17.64± 3.41%;p = 0.002)。這些發現證明在動脈粥樣硬化發展階段使用抗-SEMA4D抗體阻斷 Sema4D活性減少了斑塊生長。
[0153]抗-Sema4D抗體治療的SHL小鼠的動脈粥樣硬化斑塊中更少的新血管形成。為了研 究動脈粥樣硬化斑塊中新血管形成，采用凝集素 Μ染色來檢測對照抗體治療的SHL斑塊和 抗-Sema4D抗體治療的SHL斑塊中的新血管形成。結果顯示，在抗-Sema4D抗體治療的斑塊中 凝集素 Μ陽性染色的百分比明顯低于在對照抗體治療的SHL斑塊中的百分比(抗-Sema4D抗 體治療的SHL小鼠：0.35 ±0.04%對比對照抗體治療的SHL小鼠：1.70 ±0.24% ;P<0.001， 圖 1B)。
[0154] 使用針對⑶31，一種內皮細胞的標記物的抗體的免疫組化也顯示與對照抗體治療 的SHL斑塊相比，在抗-Sema4D抗體治療的SHL斑塊中CD31陽性面積明顯減少(抗-Sema4D抗 體治療的SHL小鼠：12.62 ± 1.34 %對比對照抗體治療的SHL小鼠：19.30 ± 1.22 % ; P = 0.012，圖1C)，這強調了在抗-Sema4D抗體治療的SHL小鼠斑塊中弱的新血管形成。
[0155] 這些發現證明在動脈粥樣硬化的進展階段阻斷Sema4D活性使新血管形成減少。此 外，它們證明抗-SEMA4D抗體阻斷內皮祖細胞向動脈粥樣硬化斑塊中迀移，這進而導致斑塊 新血管形成和斑塊生長減少。通過以上描述和相關圖所示內容，本發明相關領域技術人員 可以想到本發明的許多改良和其它的實施方式。因此，應當理解本發明不僅限于所公開的 【具體實施方式】，所述改良和其它實施方式也包括在所附權利要求書和所列實施方式的范圍 之內。盡管在本發明中使用了具體的術語，但是這些術語僅以通用和描述性意義使用，而不 用于對本發明構成限制。
【主權項】
1. 一種用于在患有動脈粥樣硬化的對象中抑制、阻止、減少或延遲動脈粥樣硬化斑塊 生長的方法，包括向所述對象給予有效量的特異性結合腦信號蛋白-4D(SEMA4D)的分離的 結合分子。2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述結合分子抑制SEMA4D與其受體的相互作 用。3. 如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述受體是叢蛋白-B1或叢蛋白-B2。4. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述結合分子抑制SEMA4D-介導的叢蛋白-B1 信號轉導。5. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述對象患有心血管疾病。6. 如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述心血管疾病選自下組:冠心病(也稱為缺 血性心臟病或冠狀動脈疾病）、心肌病、高血壓心臟病、心力衰竭、肺源性心臟病、心臟節律 障礙、炎性心臟病心內膜炎、炎性心臟肥大、心肌炎、心臟瓣膜病、腦血管病、外周動脈疾病、 先天性心臟病、風濕性心臟病、及其組合。7. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述分離的結合分子與參照單克隆抗體 VX15/2503或67特異性結合相同的SEMA4D表位。8. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述分離的結合分子競爭性抑制參照單克隆 抗體VX15/2503或67與SEMA4D的特異性結合。9. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述分離的結合分子包括抗體或其抗原結合 片段。10. 如權利要求9所述的方法，其特征在于，所述抗體或其抗原結合片段的可變重鏈 (VH)含有VHCDR 1-3且可變輕鏈(VL)含有VLCDR 1-3,其中VHCDR 1-3分別包含SEQ ID NO: 6、7和8，VLCDR1-3分別包含SEQIDN0:14、15和16。11. 如權利要求10所述的方法，其特征在于，所述VH和VL分別包含SEQ ID NO :9和SEQ ID NO: 17或分別包含SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 18。12. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括抑制、延緩、減少或延遲所 述動脈粥樣硬化斑塊周圍的新血管形成。13. 用于在患有動脈粥樣硬化的對象中抑制、延緩、減少或延遲新血管形成的方法，包 括向所述對象給予有效量的特異性結合腦信號蛋白_4D(SEMA4D)的分離的結合分子。14. 如權利要求13所述的方法，其特征在于，所述結合分子抑制SEMA4D與其受體的相互 作用。15. 如權利要求14所述的方法，其特征在于，所述受體是叢蛋白-B1。16. 如權利要求13所述的方法，其特征在于，所述結合分子抑制SEMA4D-介導的叢蛋白-B1信號轉導。17. 如權利要求13所述的方法，其特征在于，所述對象患有心血管疾病。18. 如權利要求17所述的方法，其特征在于，所述心血管疾病選白下組:冠心病(也稱為 缺血性心臟病或冠狀動脈疾病）、心肌病、高血壓心臟病、心力衰竭、肺源性心臟病、心臟節 律障礙、炎性心臟病心內膜炎、炎性心臟肥大、心肌炎、心臟瓣膜病、腦血管病、外周動脈疾 病、先天性心臟病、風濕性心臟病、及其組合。19. 如權利要求13所述的方法，其特征在于，所述分離的結合分子與參照單克隆抗體 VX15/2503或67特異性結合相同的SEMA4D表位。20. 如權利要求13所述的方法，其特征在于，所述分離的結合分子競爭性抑制參照單克 隆抗體VX15/2503或67與SEMA4D的特異性結合。21. 如權利要求13所述的方法，其特征在于，所述分離的結合分子包括抗體或其抗原結 合片段。22. 如權利要求21所述的方法，其特征在于，所述抗體或其抗原結合片段的可變重鏈 (VH)含有VHCDR 1-3且可變輕鏈(VL)含有VLCDR 1-3,其中VHCDR 1-3分別包含SEQ ID NO: 6、7和8，VLCDR1-3分別包含SEQIDN0:14、15和16。23. 如權利要求22所述的方法，其特征在于，所述VH和VL分別包含SEQ ID NO: 9和SEQ ID NO: 17或分別包含SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 18。24. -種治療患有動脈粥樣硬化的對象的方法，所述方法包括： 向確定有動脈粥樣硬化斑塊的對象給予有效量的特異性結合腦信號蛋白_4D(SEMA4D) 的分離的結合分子，從而抑制、延緩、減少或延遲動脈粥樣硬化斑塊的生長。
【文檔編號】A61K39/395GK105848679SQ201480067853
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2014年10月10日
【發明人】M·左德勒
【申請人】瓦西尼斯公司