通過誘導對血液因子的耐受治療血友病的方法
【專利摘要】本發明涉及血友病的治療。更具體地，本發明涉及一種經表皮途徑通過應用包含血液因子的皮膚貼片裝置以持續性地進行血友病治療的誘導針對至少一種治療血友病使用的血液因子免疫耐受的新方法。本發明還涉及含有因子VIII的皮膚貼片裝置。
【專利說明】通過誘導對血液因子的耐受治療血友病的方法 發明領域
[0001] 本發明涉及一種通過誘導對血液因子的耐受治療血友病的方法。更具體地，本發 明涉及一種通過表皮途徑治療血友病的新方法。
[0002] 特別地，本發明的方法涉及一種在患有甲型血友病的對象中誘導對因子VIII的耐 受的方法。
[0003] 更特別地，本發明的方法包括在使得所述組合物與皮膚之間接觸的條件下向需要 其的對象的皮膚區域應用包含因子VIII的皮膚貼片裝置。本發明還涉及含有因子VIII (也 稱為FVIII)的皮膚貼片裝置。
[0004] 發明背景
[0005] 血友病(Haemophilia, hemophilia)是一種特征為由于因子VIII或IX缺乏導致自 發性出血或出血時間延長的遺傳性疾病。
[0006] 甲型血友病（HA)是一種罕見的X染色體連鎖的隱性出血性疾病，其涉及5000至 10000分之一的個體。在編碼因子VIII的基因中的遺傳異常結果導致不能產生FVIII或產生 有缺陷的FVIII分子。三分之二的HA是經遺傳而得的。其余的三分之一患者不具有HA家族 史。在后一種患者中，FVIII編碼基因中的缺陷在X染色體從頭合成時已產生。可以通過在血 漿中可檢測的殘余FVIII活性對HA的若干嚴重性進行區分，并且其直接與血友病導致突變 的類型相關。
[0007] 因此，嚴重的HA患者不具有可檢測的FVIII活性(〈1%)，而中度或輕度HA患者分別 具有正常值的1至5%或5至35%。盡管威脅生命的出血在輕度或中度HA患者中是罕見的，但 是嚴重的HA是一種及其有害的出血性疾病，其具有較高的發病率和死亡率。迄今為止，并且 盡管基因治療取得了最新進展，但是尚無能夠治愈HA的療法。
[0008] 因此，在患者中治療或預防出血發作是通過使用外源性FVIII的替代療法實現的。 治療涉及圍繞著使用血漿衍生物或經基因工程改造的重組替代物的替代療法。治療可以在 出血后給予(根據要求治療)或者用于預防出血(預防性治療）。
[0009] 已將因子VIII的若干形式作為活性成分用于或擬用于治療血友病。這些包括基于 人血衆的因子VIII 如活性成分 Humate? P、Monoc late? P、Irnniunate? 或 Hemofi 丨? VI; 重組人因子VIII如缺少B-結構域的因子VIII(莫羅凝血素 α)，在PCT專利申請W0 91/09122 中對其進行了描述，和活性成分ReFacto?。其他重組人因子vi II包括活性成分 Kogenate?或Recombinate?，（辛凝血素 α)或豬因子viiI(其是由ipSen，Inc·，USA銷售 的產品Hyate.C?的活性成分)或者重組的全長或截短的豬因子νιιι如在專利申請wo οι/ 68109中披露的豬因子VIII經修飾的缺少B-結構域的形式。
[0010] 經修飾的因子VIII蛋白如在W0 2008/129422中披露的脫甘露糖化的重組因子 VIII也能夠用于治療血友病。
[0011] 片段如在W02006/003183中披露的包含8至15個氨基酸的肽或在W02009/095646中 披露的肽也能夠作為用于治療血友病的活性成分。因子VIII的結構域A2和/或C2也能用于 本發明的方法中。
[0012] 然而，在高達30%的患者中，替代療法是復雜的，因為產生了稱為抑制性抗FVIII 抗體(或FVIII抑制物）的抗藥抗體，其妨礙了 FVIII的使用。抑制性抗FVIII抗體是IgG同種 型的，并且大部分是IgGl和IgG4亞型的。抗-FVIII IgG在每位患者中均是多克隆的。已描述 了抗-FVII I IgG通過其降低治療性施用的FVII I療效的若干機制:抑制性抗FVII I IgG抗體 被定向至FVIII的功能性表位并通過空間位阻阻止其與參與凝血級聯的不同分子(例如血 管性血友病因子(von Willebrand factor)、活化的因子IX、因子X或磷脂）之間的相互作 用;非抑制性抗FVII I IgG可能與治療性施用的FVII I形成免疫復合物，從而加速其從循環 中除去并縮短其半衰期。
[0013] 已有記載在甲型血友病患者的血液中存在當在體外使用FVIII或來源于FVIII的 肽刺激時增殖的CD4+T淋巴細胞。而且，在重度甲型血友病的實驗模型中的分析已證實使用 針對CD40(CD40L或CD154)配體的抗體或使用CTLA4-Ig構建體消除T細胞的輔助阻止抗 FVII I的免疫應答。類似地，發現施用抗⑶40L抗體在一些甲型血友病患者中阻斷回憶應答， 但是由于出現了對患者致命的血栓并發癥該臨床試驗中止。
[0014] 在出血抑制物陽性患者中糾正出血需要使用旁路試劑(bypassing agents)如活 化的凝血酶原濃縮物或活化的重組因子VII。在出現治療性FVIII抑制物的患者中治療開銷 增加3倍以上，在發達國家達到200,000€/年。
[0015] 免疫耐受誘導（ITI)是能夠在甲型血友病患者中有效消除FVIII抑制物的唯一可 用的療法。ITI是高劑量的治療性FVIII重復施用。其在60至80%的患者中是成功的。然而， ITI是復雜的，因為其要求患者的極端依從性并且其治療花費可達20萬歐元/患者/年以上。 若干參數與ITI的后果和ITI成功前的治療持續時間相關。這些參數包括ITI開始時患者的 年齡、高劑量或低劑量的FVIII治療、用于ITI的重組或血漿來源的FVIII以及FVIII抑制劑 的性質。
[0016] 已使用重度甲型血友病的小鼠模型對若干方法進行了研究以誘導對外源性FVIII 的耐受。Lei等人(Blood. 2005; 105:4865-4870)證實了在FVIII缺陷小鼠中可以使用免疫球 蛋白（IgG)-FVIII融合構建體轉導的脂多糖（LPS)活化的B母細胞(B-cell blasts)誘導 FVIII特異性耐受。在另一種策略中，使用FVIII編碼基因轉染的自體可凋亡成纖維細胞的 過繼轉移顯示出誘導FVIII特異性耐受。最近，Moghimi等人(J Thromb Haemost 2011 ;9: 1524- 33)發現使用雷帕霉素能夠發展出針對FVII I的預防性免疫耐受方案。
[0017] 盡管具有這些初步結果，細胞療法仍是經驗性的，很難大規模在人體內使用、非常 昂貴并且免疫抑制藥物的使用可能使患者暴露于機會性疾病。
[0018] 因此，存在對有效地、更加安全地和對患者更加友好地治療血友病的組合物和方 法的實際需要。
[0019] 發明概述
[0020] 本發明提供了一種治療和/或預防血友病和/或血友病的癥狀的新方法。更具體 地，本發明首次顯示了能夠通過表皮免疫療法實現對血友病的有效治療。
[0021] 特別地，本發明的方法包括在使得所述物質與皮膚之間接觸的條件下向需要其的 對象的皮膚區域應用包含血液因子優選因子VIII的皮膚貼片裝置。本發明顯示了此類應用 激發針對外源性(治療性)因子VIII的耐受，導致血友病癥狀的極大減輕和療效的改善。
[0022] 因此，本發明的一個目的為提供了一種在對象中治療和/或預防血友病和/或血友 病的癥狀的方法，所述方法包括在使得活性物質與皮膚接觸的條件下向所述對象的皮膚區 域應用包含血液因子優選地因子VIII(在后文中也將其稱為"活性物質"）的皮膚貼片裝置。
[0023] 本發明的又一個目的涉及包含干燥形式的通過靜電力粘附于貼片的血液因子優 選因子VIII的閉合的皮膚貼片裝置，并且其用于在對象中治療和/或預防血友病和/或血友 病的癥狀。
[0024] 本發明還涉及包含干燥形式的通過靜電力粘附于貼片的血液因子優選因子VIII 的皮膚貼片裝置在生產用于治療和/或預防血友病和/或血友病癥狀的組合物中的用途。
[0025] 本發明的又一個目的是提供了一種在對象中治療和/或預防血友病的方法，所述 方法包括在使得所述血液因子與皮膚之間接觸的條件下向所述對象皮膚的一個或若干區 域應用干燥形式的血液因子優選因子VIII，并且將與所述皮膚接觸的血液因子保持在足以 引起所述對象的免疫反應性降低的條件下。
[0026] 本發明的又一個目的是提供了一種降低患有血友病的對象的免疫反應性的方法， 所述方法包括向所述對象的一個或若干皮膚區域應用干燥形式的血液因子優選因子VIII 并且保持所述血液因子在足以引起所述對象的免疫反應性降低的條件下與所述皮膚接觸。
[0027] 本發明的又一個目的是提供了一種在需要其的對象中治療血友病的方法，所述方 法包括在足以誘導對外源性因子VIII的耐受或降低其中和的條件下（i)向所述對象施用外 源性因子VIII和(i i)向所述對象皮膚的一個或若干區域表皮應用因子VIII。
[0028]本發明的又一個目的是提供了一種在給予外源性因子VIII的對象中治療血友病 的改進的方法，所述改進為向所述對象皮膚的一個或若干區域表皮應用因子VIII以誘導對 外源性因子VIII的耐受或降低其中和。
[0029] 本發明的又一個目的是提供了一種在對象中治療或預防血友病的方法，所述方法 包括向所述對象皮膚的一個或若干區域應用干燥形式的血液因子優選因子VIII。
[0030] 本發明的又一個目的涉及一種包含血液因子優選因子VIII的組合物以及通過表 皮應用使用其在需要其的對象中治療或預防血友病的用途。
[0031] 本發明的又一個目的涉及一種包含血液因子優選因子VIII的組合物通過表皮應 用用于在需要其的對象中減輕出血的用途。
[0032] 發明詳述
[0033]本發明涉及一種使用表皮施用用于在對象中治療和/或預防血友病和/或血友病 的癥狀的方法。
[0034]血友病是一種特征為由于因子VIII (甲型血友病）或IX(乙型血友病)缺乏導致自 發性出血或出血時間延長的遺傳性疾病。其年發病率在男嬰中估計為1/5,000和在法國其 患病率估計為1/12,000。其臨床表現的嚴重程度取決于凝血因子的缺乏程度。診斷是在顯 示延長的血液凝固時間的凝血檢測的基礎上做出的。通過對因子VIII水平的特異性檢測確 定血友病的類型和嚴重程度。
[0035]當在本申請中使用時，術語"因子VIIΓ或"FVIIΓ指全長的或截短的、基于血漿的 或重組的因子VIII，或重組的因子VIII的結構域和特別地上述產品之一或其組合。因此，術 語"因子VIIΓ或"FVIIΓ包括具有因子VIII活性的任意多肽。在本發明的方法中使用的因 子VIII的優選形式是缺少B結構域的因子VIII(莫羅凝血素 α)，在下文中也將其稱為B結構 域缺失的FVIII (FVIII-HSQ)。可以在本發明的方法中使用的其他特殊形式的因子VIII包括 因子VIII的結構域A2和/或C2。
[0036] 術語"外源性因子VIII"指通常是通過注射的用于治療對象的任意治療性因子 VIIIo
[0037] 特別地，本發明的方法涉及一種在對象中治療和/或預防甲型血友病和/或甲型血 友病的癥狀的方法，所述方法包括在使得所述組合物與所述皮膚之間相接觸的條件下向所 述對象皮膚的至少一個區域應用皮膚貼片裝置，所述皮膚貼片裝置包含含有導致血栓產生 的活性物質的組合物，所述活性物質優選血液因子，最優選因子VIII。
[0038] 當遭受因子VIII缺乏時，患者通常接受外源性(治療性)FVIII注射作為治療。不幸 的是，在開始治療若干年后，對所述外源性（即非自身或"外來的"）因子VIII出現免疫應答， 特別是產生抗因子VIII抗體，導致所述外源性因子VIII的破壞或中和。本發明能夠有效地 降低所述對"外源性"因子VIII的免疫應答，導致所述外源性因子VIII治療效果基本上的改 善或恢復以治療患者。
[0039] 因此，本發明涉及一種血液因子優選因子VIII通過向需要其的對象特別是向給予 外源性因子VIII的對象表皮應用在治療甲型血友病的方法中的用途。本發明還涉及包含血 液因子優選因子VIII的皮膚貼片裝置，以及其在需要其的對象中治療甲型血友病的方法中 的用途。
[0040] 在一個特定的實施方式中，本發明的方法包括在需要其的對象中誘導針對因子 VIII特別是外源性因子VIII的免疫耐受。
[0041] 特別地，本發明涉及一種在需要其的對象中預防或治療針對因子VIII特別是外源 性因子VIII的任何不利的免疫反應的皮膚貼片或方法。通過減少此類不利的免疫應答，本 發明恢復和/或大大增加外源性因子VIII在所述對象中的治療效果。
[0042] 在這一點上，在一個特定的實施方式中，本發明的方法涉及通過同時或順序施用 (i)包含至少一種血液因子優選因子VIII的皮膚貼片裝置與（ii)可注射因子VIII組合物的 組合用于在需要其的對象中治療血友病的用途。在一個特定的實施方式中，所述方法包括 向需要其的對象應用包含至少一種血液因子特別是因子VIII的皮膚貼片裝置，并且隨后向 所述對象注射至少一種血液因子優選因子VIII。或者，一旦在所述對象中出現不利的免疫 應答可以應用所述皮膚貼片裝置以便對其進行中和。在實踐中，當有可能時，應將本發明方 法的兩個組分用作為治療方案的起始使用。
[0043] 特別地，本發明的方法涉及針對其如上文所定義用途的皮膚貼片裝置，其包括在 使得至少一種血液因子優選因子VIII與所述皮膚之間相接觸并且將所述至少一種血液因 子優選因子VIII滲透進入表皮的條件下向所述對象皮膚的至少一個區域重復應用所述裝 置。
[0044] 特別地，本發明涉及針對其如上文所定義用途的方法或皮膚貼片裝置，其中所述 血液因子是因子VIII并且選自下組:全長的或截短的因子VIII。
[0045] 特別地，本發明涉及針對其如上文所定義用途的方法或皮膚貼片裝置，其中所述 血液因子是重組的因子VIII，優選地重組的缺少B結構域的因子VIII。
[0046]特別地，本發明涉及針對其如上文所定義用途的方法或皮膚貼片裝置，其中所述 血液因子是基于血漿的因子VIII。
[0047]在本發明的一個特定的實施方式中，所述血液因子是干燥形式的。在又一個特定 的實施方式中，所述血液因子在不存在佐劑的條件下應用。
[0048] 特別地，本發明涉及一種皮膚貼片裝置，所述皮膚貼片裝置包含至少一種血液因 子優選因子VIII和可能的一種或若干種載體(例如賦形劑、稀釋劑等）。
[0049] 特別地，本發明涉及一種藥物遞送系統，包括：
[0050]-皮膚貼片，
[0051 ]-血液因子，優選因子VIII，和 [0052]-可能的一種或若干種載體
[0053]其中所述皮膚貼片被配置成與個體皮膚的一部分附接，并且不需要針經皮向個體 遞送所述血液因子，優選因子VIII。
[0054]本發明還涉及一種試劑盒，包括：
[0055] -含有血液因子優選因子VIII的皮膚貼片，和
[0056] -含有血液因子優選因子VIII的可注射組合物。
[0057]本發明涉及一種在需要其的對象中治療血友病的方法，所述方法包括在使得至少 一種血液因子優選因子VIII與所述皮膚之間相接觸并且將所述至少一種血液因子優選因 子VIII滲透進入表皮的條件下向所述對象皮膚的至少一個區域重復應用包含至少一種血 液因子優選因子VIII和可能的藥學上可接受載體的皮膚貼片裝置。
[0058] 在本發明一個特定的方面，向皮膚應用包含血液因子的所述皮膚貼片裝置導致所 述對象的免疫反應性降低。"免疫反應性降低"指對外源性注射的血液因子優選因子VIII的 免疫應答降低。所述貼片可以在使用外源性血液因子治療前或者在所述治療過程中的任意 時間使用。本發明的方法是基于向患有甲型血友病的患者皮膚應用外源性因子血液因子優 選VIII發生的免疫治療過程。
[0059] 本發明有利地顯示了此類方法導致免疫反應性的大幅下降以及使外源性因子 VIII的活性成分可能。
[0060] 本發明可以用于治療任意類型的甲型血友病，包括但不限于輕度甲型血友病、中 度甲型血友病和重度甲型血友病。在本發明的一個優選實施方式中，所述甲型血友病是重 度甲型血友病。
[0061] 甲型血友病是血友病的最常見形式，其特征為由因子VIII缺乏導致的自發性或持 續性出血。其是X-連鎖隱性遺傳的并且該疾病由編碼凝血因子VIII的F8基因（Xq28)突變引 起。其臨床表現的嚴重程度取決于因子VIII的缺乏程度。
[0062] 輕度甲型血友病是一種特征為因子VIII較少缺乏導致的由較小損傷或者手術或 拔牙引起的異常出血形式的甲型血友病。輕度甲型血友病占各種情況甲型血友病的約 40%。因子VIII的生物活性為5至40%。不發生自發性出血。
[0063] 中度甲型血友病是一種特征為因子VIII缺乏導致的由較小損傷或者手術或拔牙 引起的異常出血形式的甲型血友病。中度甲型血友病占各種情況甲型血友病的約20%。因 子VIII的生物活性為1 %至5%。自發性出血較罕見。
[0064] 重度甲型血友病是一種特征為因子VIII大量缺乏導致的頻繁自發出血和由較小 損傷或者手術或拔牙引起的異常出血形式的甲型血友病。重度甲型血友病占各種情況甲型 血友病的約40%。因子VIII的生物活性低于1 %。兒童期或青春期的重度甲型血友病通常是 致命的。
[0065] 通過本發明，外源性因子VIII的活性與對象中的殘余活性相比可以恢復或增加至 少 10%、20%、30%、40%、50% 或更多。
[0066] 在重度HA的情況下，其中因子VIII的活性通常低于1%，本發明的方法能夠將此類 活性恢復至基本上高于10%的水平、甚至高于30%或者更顯著地高于50%。任何此類水平 均是適于避免自發性出血和減少出血的。50%以上足以在對象中恢復正常出血并且避免任 何血友病的并發癥。
[0067] 在一個特定的實施方式中，所述方法包含通常在較長的時間段內重復應用皮膚貼 片裝置。例如，所述方法通常涉及在1個月或更長時間段內順序應用至少2個貼片。可以重復 應用直至耐受建立。然后，根據患者的耐受情況，可以停止、或中斷、或間隔開。
[0068] 本發明涉及一種包含血液因子優選因子VIII的皮膚貼片裝置在需要其的對象中 治療血友病的方法中的用途，所述方法通過在使得血液因子優選因子VIII與所述皮膚之間 相接觸并且將所述血液因子優選因子VIII滲透進入表皮的條件下向所述對象皮膚的至少 一個區域重復應用所述裝置。
[0069] 本發明一個特定的目的涉及一種用于治療甲型血友病的包含干燥形式的因子 VIII的封閉的皮膚貼片裝置。在又一個特定的實施方式中，因子VIII通過靜電力保持在貼 片上，其中在使得所述組合物與所述皮膚之間接觸的條件下將所述貼片應用于所述對象皮 膚的至少一個區域。
[0070] 本發明的又一個實施方式是上文所述的封閉的皮膚貼片在制備用于治療甲型血 友病的組合物中的用途。
[0071] 本發明提供了一種新的用于治療甲型血友病的表皮免疫治療方法，所述方法包括 通過皮膚貼片裝置經由表皮途徑向所述對象重復施用組合物，所述皮膚貼片裝置包含作為 活性物質的因子VIII和襯墊，所述襯墊的周邊適于與皮膚形成密封的腔室，其中所述襯墊 在腔室中皮膚的對側負載含有一種或多種蛋白，其劑量足以減輕向所述皮膚應用所述皮膚 貼片裝置后在所述對象中的皮膚反應性，在向皮膚應用所述貼片裝置后所述組合物從襯墊 上移除并在隨后經表皮途徑遞送至所述對象，重復進行所述施用導致針對外源性因子VIII 的免疫反應性進行性降低。
[0072] 在另一個方面，本發明還涉及皮膚貼片裝置在制備用于在對象中治療血友病的組 合物中的用途，所述皮膚貼片裝置包含作為活性成分的血液因子優選因子VIII和襯墊，所 述襯墊的周邊適于與皮膚形成密封的腔室，其中所述襯墊在腔室中皮膚的對側負載血液因 子優選因子VIII。本發明可以用于任意對象，例如動物或人對象，并且特別地用于任意人對 象，包括兒童和成人。優選地，所述對象患有甲型血友病。
[0073] 本發明的免疫治療方法涉及使用導致免疫反應性降低的皮膚貼片裝置經表皮途 徑向對象施用含有血液因子優選因子VIII的組合物。
[0074] 如在本說明書中使用的，術語"表皮途徑"指通過向皮膚上應用該活性物質向對象 施用活性物質。所述表皮途徑不需要使用針頭、注射器或任意其他方式刺穿或改變表皮表 面層的完整性。將所述活性物質保持與皮膚接觸一段時間并且使其處于足以使所述活性物 質滲透進入表皮角質層的條件下。
[0075] 術語"治療"包括甲型血友病嚴重程度的任意降低、減少或減弱。例如，治療包括將 在對象中甲型血友病重度形式轉化為輕度或中度形式。
[0076] 術語"治療"還包括減輕甲型血友病的癥狀，特別是出血，不僅是其強度而且是其 持續時間。甲型血友病的癥狀主要是頻繁的自發性出血和由較小損傷或者手術或拔牙引起 的異常出血。出血通常發生在關節周圍（關節積血)和肌肉中（血腫）。自發性血腫是相當頻 繁的并且是該疾病的高度特征性標志。因此，治療包括在對象中縮短出血時間，和/或在對 象中降低出血強度。
[0077] "免疫反應性降低"指對外源性注射的血液因子優選因子VIII的免疫應答降低。
[0078] 在一個優選的實施方式中，在本發明中使用的因子VIII選自全長的因子VIII蛋 白、截短的因子VIII(其中部分蛋白缺失)或因子VIII的結構域如A2和C2結構域、或者其任 意混合物。在一個特定的實施方式中，因子VIII或截短的FVIII是人源的。在一個優選的實 施方式中，因子VIII是重組的缺少B結構域的因子VIII。所述因子VIII可以以天然形式使 用，或修飾的，例如經化學、酶促和/或熱修飾。
[0079] 如果適宜地對蛋白酶的作用進行保護，所述血液因子組合物可以是液體形式，如 溶液或顆粒的分散液。在這種情況下，將所述活性物質從液相的組合物轉移至皮膚以使得 所述活性物質滲透進入皮膚的角質層以確保有效的表皮施用。在一個特定的實施方式中， 通過使活性物質擴散進入密封腔室中例如由出汗形成的凝結物確保所述活性物質從液相 組合物的迀移。
[0080] 在一個優選的實施方式中，所述血液因子組合物是干燥形式的，特別是例如通過 凍干獲得的顆粒形式。以干燥形式使用蛋白是有利的。事實上，可以將此類顆粒狀的活性物 質直接附著于所述裝置的襯墊上，從而避免可能破壞這些蛋白的免疫原性的任何化學相互 作用或任何反應。而且，使用顆粒使得所述物質保存在適宜的包裝中，以使得不再需要進行 任何的臨時制劑。在這種情況下，可以通過將這些活性物質溶解在密封腔室內形成的凝結 物中確保貼片襯墊上活性物質的表皮施用。
[0081 ] 所述活性物質組合物還可以包含附加成分，如Handbook of Pharmaceutical Excipients(藥物賦形劑手冊），第6版2009，Rowe等人，Pharmaceutical Press中披露的那 些藥學上可接受的賦形劑或載體。適宜的賦形劑或載體是本領域技術人員熟知的并且包括 但不限于無菌鹽水、乳糖、蔗糖、磷酸鈣、明膠、糊精、瓊脂、果膠、花生油、橄欖油、芝麻油和 水。此外，所述載體或稀釋劑可以包括時滯材料，如單獨的或與蜂蠟混合的單硬脂酸甘油酯 或二硬脂酸甘油酯。
[0082] 在一個實施方式中，在本發明中使用的組合物不使用任何佐劑制劑。
[0083] 在另一個實施方式中，在本發明中使用的所述活性物質組合物可以包含或與佐劑 一起使用。在本發明的上下文中，佐劑指當與特定活性物質聯用時用于活化、加速、延長或 增強活性物質的特異性免疫應答的任意物質。
[0084] 在本發明的方法中使用的皮膚貼片裝置優選包含襯墊，所述襯墊的周邊適于與皮 膚形成密封的腔室。該襯墊在腔室中的皮膚對側負載用于降低免疫反應性的組合物。
[0085] 優選地，所述襯墊的周邊具有粘附性質并且形成氣密接合以便與皮膚形成密封腔 室。
[0086]在一個特定的實施方式中，通過靜電力和/或范德華力將所述活性物質保持在襯 墊上。該實施方式特別適于在組合物中存在的所述活性物質是固體或干燥形式的（例如顆 粒），但是當所述血液因子優選因子VIII是液體形式時也可以間接地使用其。
[0087] 在本發明的上下文中，術語"靜電力"通常指包含電荷的任意非共價力。術語"范德 華力"指在在襯墊表面與固體過敏原之間形成的非共價力，并且其可以是三種類型:永久偶 極力、誘導偶極力和倫敦-范德華力。靜電力和范德華力可以單獨或一起作用。
[0088] 在這個方面，在一個優選的實施方式中，所述貼片裝置包含靜電襯墊。如在本申請 中所使用的，表述"靜電襯墊"表示由能夠例如通過摩擦、加熱或電離累積靜電電荷和/或產 生范德華力并且保護這些電荷的材料制成的任意襯墊。所述靜電襯墊通常包括具有空間電 荷的表面，所述空間電荷可以均勻地或不均勻地分散。在所述襯墊表面的一側或另一側出 現的電荷可以是正電荷或負電荷，其取決于構成所述襯墊的材料和用于形成所述電荷的方 法。在所有情況下，在所述襯墊表面上分布的正電荷或負電荷導致了在導電或非導電材料 上的吸引力，從而維持了所述血液因子優選因子VIII。還可以將所述顆粒離子化，從而導致 在所述顆粒和襯墊之間產生相同類型的靜電吸引力。適于提供靜電襯墊的材料的示例是玻 璃或選自下組的聚合物:纖維素塑料(CA，CP)、聚乙烯(PE)、聚乙烯對苯二甲酸酯(PET)、聚 氯乙烯(PVC)、聚丙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯酸，特別是聚（甲基丙烯酸甲酯）（PMMA) 和氟聚合物(例如PTFE)。前述列表不以任何方式構成限制。襯墊的背面可能覆蓋可以在臨 用前揭下的標簽。當所述襯墊至少部分透明時，該標簽使得例如將含有血液因子優選因子 VIII的組合物避光保存成為可能。
[0089] 可以通過存在薄水膜由于存在濕氣增強或減弱表面與顆粒之間力的強度。在通常 情況下，在干燥的地方制備和保存所述貼片。水分應足夠少以保護活性成分。可以對吸濕率 進行調節以獲得最大的粘附力。如上文所討論的，當所述血液因子優選因子VIII是干燥形 式例如顆粒形式時，使用靜電襯墊是特別有利的。而且，本領域技術人員可以對顆粒尺寸進 行調整以改善靜電力和/或范德華力的效能，以維持支持物上的顆粒。
[0090] 在一個特定的實施方式中，所述貼片包含聚合物或金屬或金屬涂覆的聚合物襯墊 以及基本通過范德華力保持在襯墊上的存在于組合物中的活性物質顆粒。優選地，為了通 過范德華力將顆粒保持在支持物上，所述顆粒的平均尺寸小于60微米。在另一個實施方式 中，所述血液因子優選因子VIII通過襯墊上的粘附涂層保持在所述襯墊上。所述襯墊可以 完全或僅部分覆蓋粘附材料。可以使用不同的封閉襯墊如使用鋁涂覆的聚乙烯或PET薄膜， 或者具有粘附層(丙烯酸、硅酮等）的PE、PVC或PET泡沫。
[0091] 在TO 02/071950或US 7,635,488(Viaskin?)中披露了在本發明中使用的貼片裝 置的優選示例。
[0092]其他示例參見W0 2009/095591，其也公開了一種將顆粒形式的物質負載于貼片裝 置襯墊上的噴霧干燥工藝。利用使用較高電壓的電噴霧裝置將液體分散于細粒態氣溶膠 中。然后將溶解在溶劑中的蛋白在所述貼片的襯墊上霧化，使溶劑在其上蒸發留下顆粒形 式的過敏原。根據所需的蒸發時間，所述溶劑可以是例如水或乙醇。本領域技術人員可以選 擇其他溶劑。對貼片襯墊上的物質應用這種類型的工藝使得所述襯墊上的顆粒重新分配為 納米尺寸的以及規則和均一的單一尺寸的顆粒。這種技術適于任意類型的貼片如包含絕緣 聚合物、摻和聚合物或覆蓋導電層的聚合物的襯墊的貼片。優選地，所述襯墊包含導電材 料。
[0093]在另一個實施方式中，所述襯墊的周邊覆蓋干燥的親水性聚合物，其能夠通過與 濕潤的皮膚接觸形成粘附的水凝膠薄膜(如W02009/050403中所述）。在這個實施方式中，在 應用所述貼片前將皮膚濕潤。當水凝膠與濕潤的皮膚接觸時，聚合物顆粒吸附液體并變得 具有粘附性，從而形成當在皮膚上應用貼片時形成密封的腔室。此類水凝膠的示例包括聚 乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸鈉、甲基乙烯基醚和馬來酸酐的共聚物。
[0094] 在另一個特定的實施方式中，將包含活性物質的液體組合物置于所述貼片支持物 上的吸收材料儲庫中。所述組合物可以包含在過敏原溶液中或者在過敏原的分散液中，例 如在甘油中。所述吸收材料可以由例如醋酸纖維素制成。
[0095] 所述襯墊可以是剛性的或柔性的，可以是或者不是親水性的，以及可以是或者不 是半透明的，其取決于構成材料。在玻璃的情況下，可以通過將塑料片結合在玻璃上使所述 支持物具有抗破碎性。
[0096] 在一個實施方式中，所述貼片的襯墊包含不需要除去貼片能夠直接觀察和控制炎 癥反應的透明區域。適宜的透明材料包括聚乙烯薄膜、聚酯(聚對苯二甲酸乙二酯)薄膜、聚 碳酸酯和每種透明或半透膜的生物相容性薄膜或材料。
[0097] 在一個特定的實施方式中，負載過敏原的襯墊部分不直接與皮膚接觸。在這個實 施方式中，由襯墊、襯墊周邊和皮膚所定義的腔室的高度在〇. 1_至1_范圍內。
[0098] 所述皮膚貼片裝置優選非穿孔性的，其允許滲透或通過被動擴散與血液因子接 觸。
[0099] 本發明的方法通常包括如上文所公開的向對象重復應用根據本發明的裝置，以使 得在所述對象中的免疫反應性進行性降低。本領域技術人員可以對活性物質的特定劑量以 及應用次數和接觸持續時間進行調整，其取決于甲型血友病的嚴重程度、對象、血液因子制 備物的性質、所使用的貼片裝置的類型等。
[0100]在通常情況下，所述方法包括在一段時間內優選地應用如上文所公開的貼片裝置 至少3、5、10、15次或更多次，所述一段時間可以是一周內和數月或數年。所述治療可以在任 何時間停止，例如一旦重度甲型血友病降至輕度或中度形式，或者一旦出血時間或強度充 分降低，或者例如更通常地一旦醫師決定可以停止治療。
[0101]各貼片上活性物質的量通常的范圍為0.1至l〇〇〇yg/cm貼片表面，優選的范圍為20 至500yg/cm貼片表面，更優選的范圍為20至200yg/cm2貼片表面。所述貼片表面的范圍為 lcm至10cm，優選地范圍為lcm至5cm。
[0102] 對于應用而言，所述貼片裝置可以直接用于皮膚，不需要任何預處理，優選在身體 沒有毛發的部位上。或者，可以在應用所述裝置之前在與所述貼片裝置接觸的位置對皮膚 進行處理，以破壞角質層，除去毛發或者簡單地使皮膚水化。如實驗部分所公開的，本發明 的方法使得對象的皮膚反應性進行性降低。
[0103] 可以通過表皮應用若干皮膚貼片裝置，其均含有特定的活性物質組合物，和/或通 過應用包含這些活性物質組合的裝置治療患有甲型血友病的患者。在這一點上，在一個特 定的實施方式中，為了治療需要其的患者的甲型血友病，可以通過表皮途徑應用兩個裝置， 一個含有全長的FVIII過敏原組合物和另一個含有截短的FVIII組合物。當使用若干含有不 同活性物質的貼片時，可以同時或順序應用，或者兩者兼有之。通常地，在通常的時間段內 在使得其與皮膚接觸的條件下應用。
[0104] 本發明還涉及如上文所述的皮膚貼片裝置在制備用于在對象中治療甲型血友病 的組合物中的用途。本發明可以用于任意哺乳動物對象，特別是人對象。
[0105] 給出下述實施例用于說明目的并且并非進行限制。 實施例
[0106] 1-B結構域缺失的FVIII(FVIII-HSQ)的制備和純化
[0107]使用兩步離子交換色譜法從條件無血清培養基中分離HSQ。簡言之，將含有HSQ的 培養基裝載于在0·15MNaCl、20mMHEPES、5mMCaCl2、0·01%吐溫80，pH7·4中平衡的 !1讓〇3(126/108口36口1^1〇86冊上。在相同的緩沖液中使用線性0.2-0.651恥(：1梯度洗脫 HSQ。將含有FVIII的組分混合，在相同的緩沖液中稀釋至0.15M NaCl，將其應用于Resource Q蛋白液相色譜柱并使用線性〇. 2-1.0M NaCl梯度洗脫。使用Sysmex CA-500自動凝血儀進 行一步凝血測定、在A28Q下測定吸光度和進行4-12%SDS聚丙烯凝膠電泳對組分進行分析。 將含有峰FVIII活性的片段混合，使用Amican Ultracel離心過濾其(截止分子量10kDa)對 20mM Tris、5mM CaCl2、0.01%吐溫80，pH 7.4進行緩沖液交換，并使用0.2以111針筒過濾器過 濾。使用由在280nm處確定的摩爾消光系數和預計的酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸含量計算比 活性。
[0108] 2-含有B結構域缺失的FVIII (FVIII-HSQ)或血漿來源的FVIII (pd-FVIII)或FVIII +AhR(芳基烴受體)配體的貼片裝置的制備
[0109] 根據美國專利申請號US2010/0297213中公開的工藝生產下述報道的實驗中使用 的貼片。
[0110] 將？￥111-邯0洗脫進入含有20111]\11^8、5111]\1〇3(：12、謂他(：1和0.01%吐溫80的緩 沖液中。使用微量移液器將含有25yg FVIII-HSQ的液滴(lOOyL)置于Viaskin?貼片上。 將在其初始緩沖液中的FVIII-HSQ與AhR配體(例如犬尿氨酸)混合并且使用微量 移液器將混合物的液滴置于Viaskin?貼片上。
[0112]使用血漿來源的FVIII(pd-FVIII)，無需任何特別的制備。使用微量移液器將含有 25yg FVIII的液滴置貼片上。
[0113] 使用微量移液器將FVIII-HSQ洗脫緩沖液（即20mM Tris、5mM CaCl2、lM NaCl和 0.01 % 吐溫80) (50yL)置于 Viaskill?貼片上。
[0114] 在所有貼片上最終沉積后，將其在風機輔助爐中在30°C下干燥2小時。
[0115] 干燥后，將所有貼片覆蓋保護膜并且按照如下所示進行初步包裝:將五張貼片放 入PET/Alu/PE薄膜袋中，再將N2加入該袋中并且隨后熱封。
[0116] 3-體內效能
[0117] 在缺乏FVIII的小鼠模型中評估治療血友病的表皮技術的可行性和有效性。向四 組每組10只C57B1/6背景的8至10周齡的小鼠靜脈施用2yg人全長重組FVIII(FVIII-FL)。隨 后，給予小鼠實施例2中描述的含有50yg B結構域缺失的FVII I (FVII Ι-HSQ)(第2組）、或50μ g血漿來源的FVIII(第3組）、或50yg FVIII-HSQ+AhR配體(第IV組)的貼片裝置，或者作為陰 性對照的空貼片(第I組）。治療進行連續8周。
[0118] 接下來使用lyg FVIII-FL每周1次給予4組小鼠4周。在第55天第4次注射lyg FVIII-FL之前，在第3次和第4次注射lyg FVIII-FL之間和最后在第94天即第4次注射lyg FVIII-FL 7天后收集血樣。實驗方案的細節見圖1。
[0119] 這些實驗的結果顯示表皮應用因子VIII使得治療組的免疫反應性降低，其增強了 注射的外源性因子VIII的作用，導致對甲型血友病治療的改善。
[0120] 4-體液抗FVIII免疫應答的評估
[0121] 通過ELISA評估體液抗FVIII免疫應答。為了檢測抗FVIII IgG，使用重組FVIII(2μ g/ml，FVIII-HSQ)將 ELISA 板（恥11(3，1?〇81^1(16,〇61111^11〇在4°(：下包被過夜。使用？85和1% BSA封閉板。然后將血清稀釋物在37°C下孵育lh。使用辣根過氧化物酶偶聯的單克隆抗小鼠 IgG(Southern Biotech)和底物顯示結合的IgG。使用小鼠單克隆抗FVIII IgG ESH8 (American Diagnostica,Stamford，CT,USA)作為標準品。結果以微克每毫升抗FVIII IgG ESH8等價物表示。
[0122] 該實驗的結果表明在經治療的對象中體液抗FVIII免疫應答降低。
[0123] 5-FVIII抑制物的評估
[0124] 通過功能性凝血測定評估FVIII抑制物的水平。使用標準人血衆(Dade-Behring, Marburg,Germany)將血清在37°C下孵育2h。根據生產廠商的建議(Dade-Behring)，使用顯 色法測定殘余促凝劑FVIII的活性。根據此前的描述計算貝塞斯達(Bethesda)滴度，以貝塞 斯達單位(BU)每毫升血清表示。將貝塞斯達滴度定義為產生50 %殘余FVIII活性的血清稀 釋物的倒數。
[0125] 這些實驗的結果確證了誘導了對FVIII的耐受。
【主權項】
1. 一種包含因子VIII的皮膚貼片裝置在需要其的對象中治療甲型血友病的方法中的 用途。2. 根據權利要求1所述的皮膚貼片裝置的用途，其中應用所述裝置在所述對象中誘導 針對因子VIII的免疫耐受。3. -種包含因子VIII的皮膚貼片裝置與可注射的血液因子VIII組合物聯用通過同時 或順序施用用于在需要其的對象中治療血友病的用途。4. 根據權利要求1至3中任意一項所述的皮膚貼片裝置的用途，其中所述方法包括在允 許因子VIII與皮膚之間接觸和因子VIII滲透進入表皮的條件下，向所述對象皮膚的至少一 個區域重復應用所述裝置。5. 根據權利要求1至4中任意一項所述的皮膚貼片裝置用于治療輕度、中度或重度形式 的甲型血友病的用途。6. 根據權利要求1至5中任意一項所述的皮膚貼片裝置的用途，其中因子VIII是全長的 或截短的因子VIII多肽。7. 根據權利要求1至6中任意一項所述的皮膚貼片裝置的用途，其中所述因子VIII是重 組的缺少B-結構域的因子VIII。8. 根據權利要求1至7中任意一項所述的皮膚貼片裝置的用途，其中所述因子VIII是基 于血漿的蛋白或重組蛋白。9. 根據權利要求1至8中任意一項所述的皮膚貼片裝置的用途，其中所述因子VIII在皮 膚貼片裝置上是干燥形式。10. 根據權利要求1至9中任意一項所述的皮膚貼片裝置的用途，其中所述因子VIII是 在不存在佐劑的條件下應用的。11. 一種皮膚貼片裝置，所述皮膚貼片裝置包含因子VIII和可能的一種或若干種藥學 上可接受的賦形劑或載體。12. -種藥物遞送系統，所述藥物遞送系統包含： _皮膚貼片， -血液因子，優選因子VIII，和 -可能的一種或若干種載體， 其中所述皮膚貼片被配置成與個體皮膚的一部分附接，并且不需要針經皮向對象遞送 所述血液因子，優選因子VIII。13. -種試劑盒，所述試劑盒包含： -含有因子VIII的皮膚貼片，和 -含有因子VIII的可注射組合物。14. 一種在需要其的對象中治療血友病的方法，所述方法包括在足以在所述對象中誘 導對因子VIII的耐受的條件下向需要其的對象的皮膚區域重復應用皮膚貼片裝置，所述皮 膚貼片裝置包含因子VIII和可能的藥學上可接受的載體。
【文檔編號】A61K38/48GK105848670SQ201480064955
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2014年10月21日
【發明人】S.拉克羅伊克斯-德馬茲, L.蒙道萊特, V.迪奧塞吉
【申請人】Dbv技術公司, 國家健康與醫學研究院