細胞的制作方法
【專利摘要】本發明提供了在細胞表面上共表達第一嵌合抗原受體(CAR)和第二CAR的細胞，每個CAR包含：(i)抗原結合域；(ii)間隔區；(iii)跨膜域；和(iv)內域，其中所述第一和第二CAR的抗原結合域結合不同抗原，且并且其中第一或第二CAR中的一個是包含活化性內域的活化性CAR，并且另一個CAR是包含連接關閉抑制性內域的抑制性CAR。
【專利說明】細胞 發明領域
[0001] 本發明涉及包含超過一種嵌合抗原受體(CAR)的細胞。由于靶細胞的兩個或更多 個抗原的表達(或非表達)的差異模式，所述細胞可以能夠特異性識別靶細胞。
[0002] 發明背景
[0003]已經描述了用于癌癥治療的許多免疫治療劑，包括治療性單克隆抗體(mAb)，免疫 綴合性mAb，放射綴合性mAb和雙特異性T細胞結合劑(engager)。
[0004] 通常，這些免疫治療劑革E1向單一抗原：例如，利妥昔單抗(Rituximab)革E1向⑶20 ; My elotarg革巴向CD33;并且阿侖珠單抗(Alemtuzumab)革巴向CD52。
[0005] 然而，單一抗原的存在(或缺乏)有效描述癌癥是相對罕見的，這可以導致缺少特 異性。革E1向正常細胞上的抗原表達導致中革E1脫瘤毒性(on-target off-tumour toxicity)。
[0006] 基于單一抗原不能將大多數癌癥與正常組織區分。因此，發生相當大的"中靶脫 瘤"毒性，由此正常組織被療法損傷。例如，雖然用利妥昔單抗靶向CD20以治療B細胞淋巴 瘤，但消耗了整個正常B細胞區室，雖然靶向CD52以治療慢性淋巴細胞性白血病，但消耗整 個淋巴樣區室，雖然靶向CD33以治療急性髓樣白血病，但損傷了整個髓樣區室等。
[0007] 預測的"中靶脫瘤"毒性的問題已經通過臨床試驗證實。例如，祀向ERBB2的方法引 起具有對肺和肝轉移性的結腸癌的患者的死亡。ERBB2在某些患者的結腸癌中過表達，但它 也在幾種正常組織，包括心臟和正常血管系統上表達。
[0008] 在一些癌癥中，腫瘤是通過一種抗原(通常是組織特異性抗原）的存在和存在于正 常細胞上的另一種抗原的缺乏來最佳限定。例如，急性髓樣白血病(AML)細胞表達⑶33。正 常干細胞表達⑶33，但也表達⑶34，而AML細胞通常是⑶34陰性的。僅靶向⑶33以治療AML與 顯著毒性相關，因為它消耗正常干細胞。然而，特異性靶向CD33陽性，但非CD34陽性的細胞 會避免這種相當大的中靶脫瘤毒性。
[0009] 因此，需要能夠更為靶向以反映與許多癌癥相關的標志物表達的復雜模式的免疫 治療劑。
[0010] 嵌合抗原受體(CAR)
[0011] 嵌合抗原受體是將單克隆抗體(mAb)的特異性嫁接到T細胞的效應子功能的蛋白 質。它們通常的形式是I型跨膜域蛋白的形式，具有全部連接到復合內域(endodomain)的抗 原識別氨基端，間隔區（spacer)，跨膜域，所述內域傳送T細胞存活和活化信號(參見圖1A)。
[0012] 這些分子的最常見形式是來源于識別靶抗原的單克隆抗體的單鏈可變片段 (scFv)的融合體，所述單鏈可變片段通過間隔區和跨膜域融合到信號傳導內域。這類分子 導致響應scFv對其靶標的識別的T細胞活化。當T細胞表達此種CAR時，它們識別并殺死表達 靶抗原的靶細胞。已經開發了針對腫瘤相關抗原的幾種CAR，并且使用這樣的CAR表達T細胞 進行的過繼轉移方法目前在臨床試驗中用于各種癌癥的治療中。
[0013] 然而，CAR表達性T細胞的使用也與中靶脫瘤毒性相關。例如，祀向羧基脫水酶-IX (carboxy anyhydrase_IX)(CAIX)以治療腎細胞癌的基于CAR的方法導致肝毒性，其被認為 是由于特異性攻擊膽管上皮細胞引起(Lamers et al(2013)Mol.Ther.21:904-912)。
[0014] 因此，需要具有更大的選擇性和降低的中靶脫瘤毒性的備選的基于CAR T細胞的 方法。
[0015] 附圖簡述
[0016]圖1: (a)CAR的一般化結構:結合域識別抗原；間隔區從細胞表面抬高結合域;跨膜 域將蛋白質錨定到膜上，并且內域傳遞信號。（b)至(d):CAR內域的不同代和排列：（b)起始 設計經由FceRl-γ或CD3G內域傳遞ITAM信號，而后來的設計順式傳遞額外的（c)一個或(d) 兩個共刺激信號。
[0017] 圖2:顯不本發明的不意圖
[0018] 本發明涉及工程化T細胞以響應靶細胞抗原表達的邏輯規則。這用設想的FACS散 點圖最好地例示。靶細胞群表達抗原"A"和"B"中的兩種或者一種，或均不表達這兩種抗原。 不同的靶標群(紅色標記)通過用不同門（gate)連接的一對CAR轉導的T細胞殺死。用或(0R) 門控的受體，將會殺死單陽性和雙重陽性細胞兩者。用和(AND)門控受體，僅殺死雙重陽性 靶細胞。用和非(和非）門孔，在單陽性靶標的情況下，雙重陽性靶標得到保持。
[0019] 圖3:靶細胞群的產生
[0020] SupTl細胞被用作靶細胞。轉導這些細胞以表達⑶19，CD33或⑶19和⑶33兩者。用 適宜的抗體染色靶細胞，并通過流式細胞術分析。
[0021] 圖4:或門的盒設計
[0022] 單個可讀框給這兩個CAR提供具有符合讀碼框的FMD-2A序列，導致兩種蛋白質。信 號1是來源于IgGl的信號肽(但可以是任何有效的信號肽hscFvl是識別CD19的單鏈可變區 段(但可以是scFv或肽環或配體或實際上是識別任何期望的任意靶標的任何域KSTK是CD8 莖，但可以是任何合適的胞外域。CD28tm是CD28跨膜域，但可以是任何合適的I型蛋白跨膜 域，并且⑶3Z是⑶3Zeta內域，但可以是包含ITAM的任何內域。信號2是來源于⑶8的信號肽， 但可以是在DNA序列上與信號1不同的任何有效的信號肽。scFv識別CD33,但就scFvl而言是 任意的。HC2CH3是人I gG 1的鉸鏈-CH2-CH3，但可以是不與第一CAR中使用的隔離區交叉配對 的任何胞外域。CD28tm '和CD3Z '與CD28tm和CD3Z編碼相同的蛋白質序列但密碼子擺動，以 防止同源重組。
[0023] 圖5:用于或門的嵌合抗原受體(CAR)的示意圖
[0024] 構建刺激性CAR，其由下列各項組成:N端A)抗⑶19scFv域，緊接著是人⑶8的胞外 鉸鏈區，或B)抗CD33的scFv域，緊接著是人IgGl的胞外鉸鏈區，CH2和CH3區（含有pvaa突變 以降低FcR結合）。這兩種受體包含人⑶28跨膜域和人⑶3Zeta(⑶247)內域。"S"描述了二硫 鍵的存在。
[0025] 圖6:顯示兩種CAR在一種T細胞表面上共表達的表達數據。
[0026] 圖7:或門的功能分析
[0027] 表達或門構建體的效應細胞(5 X104細胞)與可變數量的靶細胞共溫育，并且在16 小時后通過ELISA分析IL-2。圖顯示來自單獨的效應細胞的化學刺激（PMA和離子霉素 (lonomycin))的平均最大IL-2分泌和來自三個重復的無任何刺激的效應細胞的平均背景 IL-2〇
[0028] 圖8:顯示用于表達兩種和門的盒的兩種形式的草圖
[0029] 再一次使用FMD-2A序列共表達活化性和抑制性CAR。信號1是來源于IgGl的信號肽 (但可以是任何有效的信號肽hscFvl是識別CD19的單鏈可變區段(但可以是scFv或肽環或 配體或實際上是識別任何期望的任意靶標的任何域hSTK是CD8莖，但可以是任何不龐大 (non-bulky)的胞外域。CD28tm是⑶28跨膜域，但可以是任何穩定的I型蛋白跨膜域，并且 CD3Z是CD3Zeta內域，但可以是包含ITAM的任何內域。信號2是來源于CD8的信號肽，但可以 是DNA序列上與信號1不同的任何有效的信號肽。scFv識別⑶33,但就scFvl而言是任意的。 HC2CH3是人IgGl的鉸鏈-CH2-CH3,但可以是任意龐大的胞外域。CD45和CD148分別是CD45和 CD148的跨膜和內域，但可以來源于任何此類蛋白質。
[0030]圖9:針對和門的嵌合抗原受體(CAR)的蛋白質結構的不意圖。
[0031]刺激性CAR由N端抗⑶19的scFv域，緊接著是人⑶8的胞外莖區，人⑶28的跨膜域和 人⑶3Zeta(⑶247)胞內域組成。測試了兩種抑制性CAR。這些由以下組成:N端抗⑶33的scFv 域，緊接著是人IgGl的胞外鉸鏈區，CH2和CH3區（含有pvaa突變以降低FcR結合），緊接著是 人⑶148或⑶45的跨膜域和胞內域。"S"描述了二硫鍵的存在。
[0032] 圖10:活化和抑制性CAR的共表達
[0033] BW5147細胞被用作效應細胞，并被轉導以表達活化抗⑶19CAR和抑制性抗⑶33CAR 之一兩者。用⑶19-小鼠-Fc和⑶33-兔-Fc與合適的二抗染色效應細胞，并通過流式細胞術 分析。
[0034]圖11:和門的功能分析
[0035] 表達活化抗⑶19CAR和具有A)⑶148或B)CXD45胞內域的抑制性抗⑶33CAR的效應 細胞(5 X104細胞)與可變數量的靶細胞共溫育，并且在16小時后通過ELISA分析IL-2。圖顯 示來自單獨的效應細胞的化學刺激(PMA和離子霉素）的最大IL-2分泌和來自三個重復的無 任何刺激的效應細胞的背景IL-2。
[0036]圖12:顯示用于產生和非門的三種形式的盒的草圖
[0037]再一次使用FMD-2A序列共表達活化性和抑制性CAR。信號1是來源于IgGl的信號肽 (但可以是任何有效的信號肽hscFvl是識別CD19的單鏈可變區段(但可以是scFv或肽環或 配體或實際上是識別任何期望的任意靶標的任何域hSTK是人CD8莖，但可以是任何不龐大 的胞外域。⑶28tm是⑶28跨膜域，但可以是任何穩定的I型蛋白跨膜域，并且⑶3Z是⑶3Zeta 內域，但可以是包含I ΤΑΜ的任何內域。信號2是來源于CD8的信號肽，但可以是DNA序列上與 信號1不同的任何有效的信號肽。scFv識別CD33，但就scFvl而言是任意的。muSTK是小鼠 CD8 莖，但也可以是與活化性CAR的間隔物共定位但不交叉配對的任何間隔區。dPTPN6是PTPN6 的磷酸酶域。LAIR1是LAIR1的跨膜域和內域。2Aw是FMD-2A序列的密碼子擺動的形式。SH2-⑶148是與⑶148的磷酸酶域融合的PTPN6的SH2域。
[0038]圖13:針對非和(NOT AND)門的嵌合抗原受體(CAR)的示意圖。
[0039] A)刺激性CAR由N端抗⑶19的scFv域，緊接著是人⑶8的莖區，人⑶28的跨膜域和人 CD247的胞內域組成。B)抑制性CAR由N端抗⑶33的scFv域，緊接著是小鼠⑶8的莖區，小鼠 CD8的跨膜區和PTPN6的磷酸酶域組成。C)抑制性CAR由N端抗⑶33的scFv域，緊接著是小鼠 CD8的莖區，和LAIR1的跨膜和胞內區段組成。D)抑制性CAR與前面的CAR相同，只是它與 PTPN6 SH2域和⑶148磷酸酶域的融合蛋白共表達。
[0040]圖14:非和門的功能分析
[00411 表達A)全長SHP-1或B)SHP-1的截短形式的效應細胞(5X104細胞）與可變數量的 靶細胞共溫育，并且在16小時后通過ELISA分析IL-2。圖顯示來自單獨的效應細胞的化學刺 激(PMA和離子霉素）的平均最大的IL-2分泌和來自三個重復的無任何刺激的效應細胞的平 均背景IL-2。
[0042]圖15:或門的氨基酸序列 [0043] 圖16:基于⑶148和⑶145的和門的氨基酸序列
[0044] 圖17:兩種和非(AND NOT)門的氨基酸序列 [0045]圖18:和門功能的剖析
[0046] A.和門原型顯示于右側，并且其響應于⑶19,⑶33單陽性靶標和⑶19,⑶33雙重陽 性靶標的函數顯示于左側。B.交換scFv，以便活化性內域被⑶33觸發，并且抑制性內域通過 CD19活化。盡管此scFv交換，這種和門仍保持功能性。C.在抑制性CAR的間隔區中，CD8小鼠 莖替換了Fc。通過此種修飾，門不能響應⑶19單陽性或⑶19,⑶33雙重陽性靶標。
[0047]圖19:靶抗原在人工靶細胞上的表達
[0048] A.顯示原始組的來源于SupTl細胞的人工靶細胞的CD19相對于CD33的流式細胞術 散點圖。從左至右:雙陰性SupTl細胞，CD19陽性的SupTl細胞，CD33陽性的SupTl細胞，以及 ⑶19和⑶33陽性的SupTl細胞。B.顯示產生以測試⑶19和⑶2門的人工靶細胞的⑶19相比于 GD2的流式細胞術散點圖，從左至右依次為：陰性SupTl細胞，表達⑶19的SupTl細胞，用⑶2 和GM3合酶載體轉導從而成為GD2陽性的SupTl細胞，用CD19以及GD2和GM3合酶轉導從而成 為⑶2和⑶19陽性的SupTl細胞。C.顯示產生以測試⑶19和EGFRvIII門的人工靶標的⑶19相 比于EGFRvIII的流式細胞術散點圖。從左至右為：陰性SupTl細胞，表達CD19的SupTl細胞， 用EGFRvIII轉導的SupTl細胞，和用CD19以及EGFRvIII轉導的SupTl細胞。D.顯示產生以測 試⑶19和⑶5門的人工靶標的⑶19相比于⑶5的流式細胞術散點圖。從左至右為：陰性293T 細胞，用CD19轉導的293T細胞，用CD5轉導的293T細胞，和用CD5以及CD19載體轉導的293T細 胞。
[0049] 圖20:和門的一般化(genera lizability)
[0050] A.和門的草圖，其修改為使得第二CAR的特異性從CD33的原始特異性改變以產生3 個新的CAR:CD19和⑶2，CD19和EGFRvIII，CD19和0)53.0)19和⑶2AND門：左：顯示和門的表 達，CD19CAR的重組⑶19-Fc染色(X軸)對GD2CAR的抗人Fc染色(Y軸）。右：響應于單陽性和雙 重陽性靶標的函數。C.⑶19和EGFRvIII和門：左：顯示了和門的表達，CD 19CAR的重組⑶19-Fc的染色(X軸），對針對EGFRvIII CAR的抗人Fc染色(Y軸）。右：響應于單陽性和雙重陽性靶 標的函數。D. CD 19和⑶5和門：左:顯示了和門的表達，針對⑶19CAR的重組⑶19-Fc的染色(X 軸)對針對⑶5CAR的抗人Fc染色(Y軸）。右:響應于單陽性和雙重陽性靶標的函數。
[0051 ]圖21:和非門的功能
[0052] 顯示了和非門的三種實施方式的功能。經測試的門的草圖顯示于右側，并且響應 于單陽性和雙重陽性靶標的函數顯示于左側。A.基于PTPN6的和非門，其中第一CAR識別 CD19,具有人⑶8莖間隔區和包含ITAM的活化性內域;與第二CAR共表達，所述第二CAR識別 CD33，具有小鼠⑶8莖間隔區并具有由PTPN6磷酸酶域構成的內域。B.基于ITIM的和非門與 PTPN6門是相同的，只是內域被來自LAIR1的內域取代。C.CD148加強的和非門與基于Ι??Μ的 門是相同的，只是表達PTPN6SH2和CD 148的內域之間的額外的融合物。所有這三種門如預期 地工作，響應⑶19而活化，但不響應一起的⑶19和⑶33。
[0053]圖22:基于PTPN6的和非門功能的剖析
[0054]將原始的基于PTPN6的和非門與幾種對照比較來證明該模型。經測試的門的圖顯 示于右側，響應于單陽性和雙重陽性靶標的函數顯示于左側。A.原始的和非門，其中第一 CAR識別⑶19,具有人CD8莖間隔區和包含ITAM的活化性內域;與第二CAR的共表達，所述第 二CAR識別CD33，具有小鼠 CD8莖間隔區并具有由PTPN6磷酸酶域構成的內域。B.和非門，其 修飾為使得小鼠 CD8莖間隔區被替換為Fc間隔區。C.和非門，其修飾為使得PTPN6磷酸酶域 被替換為CD148內域。原始的和非門(A.)，功能如預期那樣，響應CD19而觸發，但不響應CD19 和CD33兩者。B中的門響應單獨的CD19或一起的CD19和CD33而觸發。C中的門控不響應一種 或兩種靶標而觸發。
[0055]圖23:基于LAIR1的和非門的剖析
[0056] 顯示了針對⑶19陽性，⑶33陽性和⑶19,⑶33雙重陽性靶標的功能活性。A.原始的 基于ITIM的和非門的結構和活性。此門由兩個CAR組成:第一CAR識別⑶19,具有人⑶8莖間 隔區和含有ITAM的內域;第二CAR識別CD33，具有小鼠 CD8莖間隔區和含有ITAM的內域。B基 于ITIM的對照門的結構和活性，其中小鼠 CD8莖間隔區已經替換成Fc域。此門由兩個CAR組 成:第一個識別⑶19，具有人⑶8莖間隔區和含有ITAM的內域;第二CAR識別⑶33，具有Fc間 隔區和含有ITAM的內域。這兩種門響應⑶19單陽性靶標，而僅原始門在對⑶19和⑶33雙重 陽性靶標的響應中是無活性的。
[0057]圖24:CAR邏輯門的動力學分離模型
[0058] 和門、非和門和對照的動力學分離和行為模型。CAR識別⑶19或⑶33。可以設想免 疫突觸在代表靶細胞膜的藍線和代表T細胞膜的紅線之間。'45'是存在于T細胞上的天然 ⑶45蛋白質。'H8 '是具有人⑶8莖作為間隔區的CAR胞外域。'Fc '是具有人HCH2CH3作為間隔 區的CAR胞外域。' M8 '是具有鼠 CD8莖作為間隔區的CAR胞外域。' 19 '表示靶細胞表面上的 〇〇19。'33'表示在靶細胞表面上的^33。符號、'表示包含1了41^的活化性內域。符號'0' 代表具有慢動力學的磷酸酶-'連接開啟'內域，諸如由PTPN6的催化域或Ι??Μ構成的內域。 符號'0'表示具有快速動力學的磷酸酶-'連接關閉'內域，如CD45或CD148的內域。在圖中這 個符號被放大以強調其強大的活性。
[0059] (a)顯示推測的功能性和門的行為，所述和門由一對CAR構成，其中第一CAR識別 CD19,具有人⑶8莖間隔區和活化性內域;并且第二CAR識別⑶33,具有Fc間隔區和⑶148內 域。
[0060] (b)顯示推測的對照和門的行為。此處，第一 CAR識別⑶19,具有人⑶8莖間隔區和 活化性內域;并且第二CAR識別⑶33，但具有小鼠⑶8莖間隔區和⑶148內域。
[0061] (c)顯示功能性和非門的行為，所述和非門由一對CAR構成，其中第一CAR識別 CD19，具有人⑶8莖間隔區和活化性內域;并且第二CAR識別⑶33，具有小鼠⑶8莖間隔區和 PTPN6內域。
[0062] (d)顯示推測的對照和非門的行為，所述對照和非門由一對CAR構成，其中第一CAR 識別CD19，具有人CD8莖間隔區和活化性內域；并且第二CAR識別CD33，但具有Fc間隔區和 PTPN6內域。
[0063] 在第一列中，靶細胞是⑶19和⑶33陰性的。在第二列中，靶標是⑶19陰性和⑶33陽 性的。在第三列中，靶細胞是CD19陽性和CD33陰性的。在第四列中，靶細胞是CD19和CD33陽 性的。
[0064] 圖25:基于APRIL的CAR的設計。
[0065] 修飾CAR設計，使得scFv被替換為增殖誘導配體(APRIL)的修飾形式，其與BCMA， TACI和蛋白聚糖相互作用以起抗原結合域作用:APRIL是截短的以使蛋白聚糖結合的氨基 端不存在。然后，將信號肽連接至截短的APRIL氨基端，以將蛋白質導向到細胞表面。產生了 三種具有這種基于APRIL的結合域的CAR: A.在第一 CAR中，人類⑶8莖域用作間隔域。B.在第 二CAR中，來自IgGl的鉸鏈用作間隔域。C.在第三CAR中，使用修飾為具有由Hombach et al (2010Gene Ther. 17:1206-1213)描述的pva/a突變以降低Fc受體結合的人IgGl的鉸鏈，CH2 和CH3域作為間隔區（因此稱作Fc-pvaa)。在全部CAR中，這些間隔區連接至⑶28跨膜域，然 后連接至含有CD28,0X40和CD3-Zeta內域的融合物的三部分內域(Pule et al,Molecular therapy,2005:Volume 12；Issue 5；Pages 933-41)〇
[0066] 圖26:注釋的上述三種APRIL-CAR的氨基酸序列
[0067] A:顯示注釋的⑶8莖APRIL CAR的氨基酸序列;B:顯示注釋的基于APRIL IgGl鉸鏈 的CAR的氨基酸序列;C:顯示注釋的基于APRIL Fc-pvaa的CAR的氨基酸序列。
[0068] 圖27:基于APRIL的不同CAR的表達和配體結合
[0069] A.在逆轉錄病毒基因載體中受體與標記基因截短的⑶34共表達。標記基因在經轉 導的細胞上的表達允許轉導的確認。B.用具有CD8莖間隔區，IgGl的鉸鏈或Fc間隔區的基于 APRIL的CAR轉導T細胞。為測試這些受體是否可以在細胞表面上穩定表達，然后用抗APRIL-生物素/鏈霉親合素 APC和抗CD34染色T細胞。進行流式細胞分析。在細胞表面上在三種CAR 中同等地檢測到APRIL，提示它們是同等穩定地表達。C.接著，測定了 CAR識別TACI和BCMA的 能力。用融合至小鼠 IgG2a Fc融合物的重組BCMA或TACI以及抗小鼠二抗和抗⑶34染色經轉 導的T細胞。所有三種受體形式顯示結合BCMA和TACI兩者。驚奇的發現是與BCMA的結合看起 來強于與TACI的結合。另一個驚奇的發現是，雖然這三種CAR都同等地表達，CD8莖和IgGl鉸 鏈CAR顯示比具有Fc間隔區的CAR更好地識別BCMA和TACI。
[0070] 圖28:不同CAR構建體的功能
[0071]用三種不同的基于APRIL的CAR進行了功能測定。正常供體外周血T細胞未轉導 (NT)，或經轉導以表達不同的CAR。使用相同滴度的上清液進行轉導。然后消耗這些T細胞的 CD56以除去非特異性NK活性并用作效應物。將未轉導的SupTl細胞(NT)或者經轉導以表達 BCMA或TACI的SupTl細胞用作靶標。顯示的數據是來自5個獨立實驗的平均值和標準偏差。 A.使用鉻釋放測定BCMA和TACI表達T細胞的特異性殺傷。B.也測定了干擾素 μ的釋放。以1:1 的比例共培養靶標和效應物。24小時后，通過ELISA測定在上清液中的干擾素 μ。CAR Τ細胞 的增殖/存活也通過計數再溫育6天的相同共培養物中的CAR的T細胞的數量確定。全部3種 CAR直接響應表達BCMA和TACI的靶標。對BCMA的響應比對TACI的響應強。
[0072]圖29:和門在原代細胞中的功能性
[0073] 從血液中分離PBMC，并使用PHA和IL-2刺激。兩天后，在Retronectin包被的板上用 含有CD19: CD33和門構建體的逆轉錄病毒轉導細胞。在第5天，通過流式細胞術評估了由和 門構建體翻譯的兩種CAR的表達水平并且對細胞消耗了CD56+細胞(主要是NK細胞）。在第6 天，以1:2的效應物比靶細胞的比例使PBMC與靶細胞共培養。在第8天收集上清液并通過 ELISA分析IFN- γ的分泌。
[0074] 圖30:在和非門中的IgM和IgG
[0075] 為了測試和非門是否可以在延長的間隔區長度上發揮功能，將激活性CAR(抗 CD19)和抑制性CAR(抗CD33)間隔區取代為較長間隔區。將人IgM和IgG的Fc區用于延長間隔 區的長度。IgM的Fc含有相比于IgG的額外的Ig域，由于此原因將IgM的間隔區放置在已知具 有膜近端結合表位的抗CD19 CAR上。相反，抗CD33結合表位位于該分子的遠端末端，因此在 此CAR上使用在相對較短的IgG間隔區。將延長間隔區的和非門構建體轉導到小鼠的T細胞 系中。然后將固定數量的經轉導的T細胞與可變數量的靶細胞共培養16-24小時，在此之后 通過ELI SA測定在上清液中分泌的IL-2的量。
[0076] 圖31:抗CD19/抗GD2和非門
[0077] 為了測試和非門平臺的穩健性(robustness)，用兩個其他的不相關的結合劑(抗 GD2和抗EGFRvIII)取代來自抑制性CAR(抗⑶33)的結合域。在具有截短SHP-1或LAIR胞質域 的和非門平臺中，將抗⑶2或抗EGFRvII I的scFv片段取代為抗⑶33。將這些構建體轉導到小 鼠 T細胞系中，并且將固定數量的T細胞與可變數量的靶細胞共培養。在共培養16-24小時 后，通過ELISA分析在上清液中分泌的IL-2的量。A)抗⑶19/抗GD2和非門，B)抗⑶19/抗 EGFRvIII和非門。
[0078] 圖32:用于構建邏輯門控CAR T細胞的設計規則。
[0079] 用草圖形式顯示或、和非及和門控的CAR，其中靶細胞在頂端，T細胞在底部，突觸 在中間。靶細胞表達任意的靶抗原A和B。
[0080] T細胞表達兩種CAR，其由抗A和抗B識別域，間隔區和內域構成。或門要求（1)僅間 隔區，其允許抗原識別和CAR活化，和（2)兩種CAR以具有活化性內域;和非門需要（1)間隔 區，其在識別兩種抗原后導致兩種CAR的共分離和(2)具有活化性內域的一種CAR，和其內域 包含或募集弱磷酸酶的另一種CAR;和門需要（1)間隔區，其導致在識別兩種抗原后兩種CAR 分離成免疫突觸的不同部分，和（2)具有活化性內域的一種CAR，和其內域包含強的磷酸酶 的另一種CAR。
[0081] 發明概述
[0082]本發明人已經開發了一組"邏輯門控"嵌合抗原受體對，它們當通過細胞（如T細 胞)表達時能夠檢測至少兩個祀抗原表達的特定模式。如果至少兩個祀抗原任意地表示為 抗原A和抗原B，三個可能的選項如下：
[0083] "或門（OR GATE)" ：當抗原A或抗原B存在于靶細胞上時T細胞觸發 [0084] "和門(AND GATE)" ：只有當兩種抗原A和B都存在于靶細胞上時，T細胞觸發
[0085] "和非門"：如果僅抗原A存在于靶細胞上，T細胞觸發，但如果這兩種抗原A和B都存 在于靶細胞上，T細胞不會觸發
[0086] 可以基于兩個或更多個標記物的其特定的表達(或表達缺乏），調整表達這些CAR 組合的工程化改造的T細胞，以對癌細胞敏銳特異性的。
[0087] 因此，在第一方面，本發明提供細胞，其在細胞表面上共表達第一嵌合抗原受體 (CAR)和第二CAR，每一 CAR包含：
[0088] (i)抗原結合域；
[0089] (ii)間隔區；
[0090] (iii)跨膜域;和
[0091] (iv)胞內T細胞信號傳導域（內域）
[0092]其中第一和第二CAR的抗原結合域結合不同抗原，其中第一或第二CAR中的一個是 包含活化性細胞內T細胞信號傳導域的活化性CAR，并且另一個CAR是包含"連接開啟"（如本 文定義)抑制性細胞內T細胞信號傳導域的抑制性CAR。
[0093]細胞可以是免疫效應細胞，如T細胞或天然殺傷(NK)細胞。本文提及的與T細胞相 關的特征同樣適用于其它免疫效應細胞，如NK細胞。
[0094] 第一CAR的間隔區可以與第二CAR的間隔區不同。
[0095] 第一和第二CAR的間隔區可以足夠不同以防止交叉配對，但是必須足夠相似以導 致CAR在T細胞膜上共定位。
[0096] 在第一和第二CAR的間隔區可以是直系同源的，如小鼠和人⑶8莖。
[0097]在涉及"和非"門的本發明中，第一CAR或第二CAR中的一個是包含活化性內域的活 化性CAR，而另一個CAR是包含"連接開啟"抑制性內域的抑制性CAR。在不存在抑制CAR連接 的情況中，抑制性CAR不顯著抑制通過激活性CAR的T-細胞活化，但是當連接抑制性CAR時， 抑制通過激活性CAR的T-細胞活化。在這些實施方案中，第一和第二CAR間隔區是足夠地不 同以防止第一和第二CAR的交叉配對，但是足夠相似以導致連接后的第一和第二CAR的共定 位。
[0098]抑制性內域可包含蛋白質-酪氨酸磷酸酶的至少一部分。
[0099] 抑制性內域可以包含PTPN6的全部或一部分。
[0100] 抑制性內域可以包含ITIM域。
[0101]抑制性內域可以包含與融合物共表達相結合的ITIM域，所述融合物在蛋白質-酪 氨酸磷酸酶的至少一部分和受體樣酪氨酸磷酸酶的至少一部分之間。該融合物可以包含來 自蛋白質-酪氨酸磷酸酶的一個或多個SH2域。例如，融合可以在PTPN6SH2域和CD45內域之 間或PTPN6SH2域和CD 148內域之間進行。
[0102] 如在導言中解釋的，急性髓樣白血病(AML)細胞表達⑶33。正常干細胞表達⑶33， 但也表達⑶34,而AML細胞通常是⑶34陰性的。僅靶向⑶33以治療AML與顯著毒性相關，因為 它消耗正常干細胞。然而，特異性靶向CD33陽性，但非CD34陽性的細胞會避免這種相當大的 脫靶毒性。因此，在本發明中，包含激活性內域的CAR可以包含結合CD33的抗原結合域，并且 包含連接開啟抑制性內域的CAR可以包含結合CD34的抗原結合域。
[0103]在第二方面，本發明提供核酸序列，其編碼在本發明的第一方面所定義的第一和 第二嵌合抗原受體(CAR)兩者。
[0104] 相應的核酸序列可以具有以下結構:AgBl_間隔區l-TMl-endol-coexpr_AgB2-間 隔區 2_TM2_endo2 [0105]其中，
[0106] AgBl是編碼第一 CAR的抗原結合域的核酸序列；
[0107] 間隔區1是編碼第一CAR的間隔區的核酸序列；
[0108] TM1是編碼第一 CAR的跨膜域的核酸序列；
[0109] endo 1是編碼第一 CAR的內域的核酸序列；
[0110] coexpr是允許兩個CAR共表達的核酸序列(例如，切割位點）；
[0111 ] AgB2是編碼第二CAR的抗原結合域的核酸序列；
[0112]間隔區2是編碼第二CAR的間隔區的核酸序列；
[0113] TM2是編碼第二CAR的跨膜域的核酸序列；
[0114] endo 2是編碼第二CAR的內域的核酸序列；
[0115] 其中當在T細胞中表達時，所述核酸序列編碼的多肽在切割位點被切割，使得第一 和第二CAR共表達在T細胞的表面上。
[0116] 允許兩個CAR共表達的核酸序列可編碼自我切割肽或序列（其是允許共表達兩個 CAR的備選手段)例如內部核糖體進入序列或2nd啟動子或其他這樣的手段，由此本領域技術 人員可以從同一載體表達兩種蛋白質。
[0117] 備選的密碼子可以用于編碼相同或相似的氨基酸序列的序列區，以避免同源重 組。
[0118] 在第三方面，本發明提供試劑盒，其包含
[0119] (i)第一核酸序列，其編碼在本發明的第一方面所定義的第一嵌合抗原受體 (CAR)，所述核酸序列具有以下結構：
[0120] AgBl-間隔區 1-TMl-endol
[0121] 其中，
[0122] AgBl是編碼第一 CAR的抗原結合域的核酸序列；
[0123 ]間隔區1是編碼第一CAR的間隔區的核酸序列；
[0124] TM1是編碼第一 CAR的跨膜域的核酸序列；
[0125] endo 1是編碼第一 CAR的內域的核酸序列;和
[0126] (ii)第二核酸序列，其編碼在本發明的第一方面所定義的第二嵌合抗原受體 (CAR)，所述核酸序列具有以下結構：
[0127] AgB2_間隔區 2-TM2_endo2
[0128] 其中，
[0129] AgB2是編碼第二CAR的抗原結合域的核酸序列；
[0130] 間隔區2是編碼第二CAR的間隔區的核酸序列；
[0131] TM2是編碼第二CAR的跨膜域的核酸序列；
[0132] endo 2是編碼第二CAR的內域的核酸序列。
[0133] 在第四方面，本發明提供試劑盒，其包含:第一載體，其包含如上定義的第一核酸 序列;和第二載體，其包含如上定義的第一核酸序列。
[0134] 載體可以是質粒載體，逆轉錄病毒載體或轉座子載體。載體可以是慢病毒載體。
[0135] 在第五方面，本發明提供載體，其包含根據本發明的第二個方面的核酸序列。載體 可以是慢病毒載體。
[0136] 載體可以是質粒載體，逆轉錄病毒載體或轉座子載體。
[0137] 在第六個方面，本發明涉及以下述方式共表達超過兩個(more than two)CAR，使 得在靶細胞上可以識別超過兩種抗原的復雜模式。
[0138] 在第七方面，本發明提供了制備根據本發明的第一方面的T細胞的方法，其包括將 編碼第一和第二CAR的一個或多個核酸序列或如上定義的一種或多種載體導入T細胞的步 驟。
[0139] T細胞可以來自從患者，相關的或不相關的造血移植供體，完全不相關的供體，從 臍帶血分離的樣品，或從胚胎細胞系分化，從誘導的祖細胞系分化，或來源于經轉化的T細 胞系。
[0140] 在第八方面，本發明提供了包含根據本發明的第一方面的多個Τ細胞的藥物組合 物。
[0141] 在第九方面，本發明提供了用于治療和/或預防疾病的方法，其包括將根據本發明 的第八方面的藥物組合物施用于受試者的步驟。
[0142] 該方法可以包括以下步驟：
[0143] (i)分離如上列出的Τ細胞。
[0144] (ii)用編碼第一和第二CAR的一種或多種核酸序列或包含此種核酸序列的一種或 多種載體轉導或轉染所述T細胞;和
[0145] (iii)將來自（ii)的T細胞施用于受試者。
[0146] 疾病可以是癌癥。
[0147] 在第十個方面，本發明提供根據本發明的第八方面的藥物組合物，其用于治療和/ 或預防疾病。
[0148] 疾病可以是癌癥。
[0149] 在第十一方面，本發明提供根據本發明第一方面的T細胞的用途，用于制備用于治 療和/或預防疾病的藥物。
[0150] 疾病可以是癌癥。
[0151] 本發明還提供了核酸序列，其包含：
[0152] a)編碼第一嵌合抗原受體(CAR)的第一核苷酸序列；
[0153] b)編碼第二CAR的第二核苷酸序列；
[0154] c)編碼位于第一和第二核苷酸序列之間的自我切割肽的序列，從而使得兩個CAR 被表達為單獨的實體。
[0155] 備選密碼子可以用于編碼相同或相似氨基酸序列的區域中的第一和第二核苷酸 序列中的一個或多個部分。
[0156] 本發明還提供此類核酸的載體和細胞。
[0157] 本發明的"和非門"提供了相比于至今描述的涉及靶向單一腫瘤相關抗原的CAR的 顯著的優勢。這里，當腫瘤細胞的特征在于存在一個(或多個)抗原和不存在另一個抗原時， 這可以使用本發明的基于CAR的和非方法可以特異性靶定。將不會靶定表達這兩種抗原的 正常細胞，導致更大的選擇性和降低的中靶脫瘤毒性。在這種情況下，針對單一抗原的CAR 方法將同時靶向腫瘤細胞和正常細胞。
[0158]本發明的其它方面
[0159] 本發明還涉及在下述編號的段落中列出的方面：
[0160] 1. T細胞，其在細胞表面上共表達第一嵌合抗原受體(CAR)和第二CAR，每一 CAR包 含：
[0161] (i)抗原結合域；
[0162] (ii)間隔區
[0163] (iii)跨膜域;和
[0164] (iv)內域
[0165] 其中所述第一和第二CAR的抗原結合域結合不同抗原，其中所述第一 CAR的間隔區 不同于所述第二CAR的間隔區，并且其中第一或第二CAR中的一個是包含活化內域的活化性 CAR，并且另一個CAR是包含活化內域的活化性CAR或包含連接開啟或連接關閉的抑制性內 域的抑制性CAR。
[0166] 2.根據段1的T細胞，其中第一CAR的間隔區具有與第二CAR的間隔區不同的長度 和/或電荷和/或大小和/或構造和/或糖基化，使得當第一 CAR和第二CAR結合它們各自的靶 抗原時，第一 CAR和第二CAR在T細胞膜上是空間上分離的。
[0167] 3.根據段2的T細胞，其中第一間隔區或第二間隔區包含⑶8莖，并且另一個間隔區 包含I gG 1的鉸鏈，CH2和CH3域。
[0168] 4.根據段1的T細胞，其中第一 CAR和第二CAR是活化性CAR。
[0169] 5.根據段4的T細胞，其中一種CAR結合⑶19，并且另一種CAR結合⑶20。
[0170] 6.根據段2或3的T細胞，其中第一CAR或第二CAR中的一個是包含活化內域的活化 性CAR，和另一個CAR是包含連接關閉的抑制性內域的抑制性CAR，在不存在抑制性CAR連接 時，所述抑制性CAR抑制通過活化性CAR的T-細胞活化，當連接抑制性CAR時，抑制性CAR不會 顯著地抑制通過活化性CAR的T-細胞活化。
[0171] 7.根據段6的T細胞，其中抑制性內域包含來自⑶148或⑶45的內域的全部或部分。
[0172] 8.根據段6或7的T細胞，其中第一CAR的抗原結合域結合CD5和第二CAR的抗原結合 域結合CD19。
[0173] 9.根據段1的T細胞，其中第一和第二間隔區是足夠不同的，從而防止第一和第二 CAR的交叉配對，但足夠相似以導致第一和第二CAR在連接后的共定位。
[0174] 10.根據段9的T細胞，其中第一 CAR或第二CAR中的一個是包含活化內域的活化性 CAR，和另一個CAR是包含連接開啟的抑制性內域的抑制性CAR，在不存在抑制性CAR連接時， 所述抑制性CAR不會顯著地抑制通過活化性CAR的T-細胞活化，當連接抑制性CAR時，抑制性 CAR抑制通過活化性CAR的T-細胞活化。
[0175] 11.根據段10的T細胞，其中所述連接開啟的抑制性內域包含磷酸酶的至少一部 分。
[0176] 12.根據段11的T細胞，其中所述連接開啟的抑制性內域包含PTPN6的全部或部分。
[0177] 13.根據段10的T細胞，其中所述連接開啟的抑制性內域包含至少一種ITIM域。
[0178] 14.根據段13的T細胞，其中所述連接開啟的抑制性內域的活性通過PTPN6-⑶45或 ⑶148融合蛋白的共表達而增強。
[0179] 15.根據段10-14中任一項的T細胞，其中所述包含活化內域的CAR包含結合⑶33的 抗原結合域，并且包含連接開啟的抑制性內域的CAR包含結合CD34的抗原結合域。
[0180] 16. T細胞，其包含如前述段落中定義的兩種以上的CAR，使得所述CAR被具有兩種 以上抗原的不同模式的細胞，如T細胞特異性刺激。
[0181] 17.核酸序列，其編碼如段1-16中之一所定義的第一和第二嵌合抗原受體(CAR)。
[0182] 18.根據段7的核酸序列，其具有以下結構：
[0183] AgBl-間隔區 l-TMl-endol-coexpr-AgB2-間隔區 2-TM2-endo2
[0184] 其中，
[0185] AgBl是編碼第一 CAR的抗原結合域的核酸序列；
[0186]間隔區1是編碼第一 CAR的間隔區的核酸序列；
[0187] TM1是編碼第一 CAR的跨膜域的核酸序列；
[0188] endo 1是編碼第一 CAR的內域的核酸序列；
[0189] coexpr是使兩個CAR共表達的核酸序列；
[0190] AgB2是編碼第二CAR的抗原結合域的核酸序列；
[0191]間隔區2是編碼第二CAR的間隔區的核酸序列；
[0192] TM2是編碼第二CAR的跨膜域的核酸序列；
[0193] endo 2是編碼第二CAR的內域的核酸序列；
[0194] 其中當在T細胞中表達時，所述核酸序列編碼的多肽在切割位點被切割，使得第一 和第二CAR共表達在T細胞的表面上。
[0195] 19.根據段18的核酸序列，其中所述coexpr編碼包含自我切割肽的序列。
[0196] 20.根據段18或19的核酸序列，其中備選密碼子用于編碼相同或相似的氨基酸序 列的序列區，以避免同源重組。
[0197] 21.試劑盒，其包含
[0198] (i)第一核酸序列，其編碼段1-16中之一所定義的第一嵌合抗原受體(CAR)，所述 核酸序列具有以下結構：
[0199] AgBl-間隔區 1-TMl-endol
[0200] 其中，
[0201] AgBl是編碼第一 CAR的抗原結合域的核酸序列；
[0202]間隔區1是編碼第一CAR的間隔區的核酸序列；
[0203] TM1是編碼第一 CAR的跨膜域的核酸序列；
[0204] endo 1是編碼第一 CAR的內域的核酸序列;和
[0205] (ii)第二核酸序列，其編碼段1-16中之一所定義的第二嵌合抗原受體(CAR)，所述 核酸序列具有以下結構：
[0206] AgB2-間隔區 2-TM2-endo2
[0207] 其中，
[0208] AgB2是編碼第二CAR的抗原結合域的核酸序列；
[0209 ]間隔區2是編碼第二CAR的間隔區的核酸序列；
[0210] TM2是編碼第二CAR的跨膜域的核酸序列；
[0211] endo 2是編碼第二CAR的內域的核酸序列。
[0212] 22.試劑盒，其包含:第一載體，其包含如段21定義的第一核酸序列；和第二載體， 其包含如段21定義的第一核酸序列。
[0213] 23.根據段22的試劑盒，其中所述載體是整合型病毒載體或轉座子。
[0214] 24.載體，其包含根據段17-20中任一項所定義的的核酸序列。
[0215] 25.根據段24的逆轉錄病毒載體或慢病毒載體或轉座子。
[0216] 26.制備根據段1-16中任一項的T細胞的方法，其包括將根據段17-20中任一項的 核酸序列，如段21中定義的第一核酸序列和第二核酸序列;和/或如段22中定義的第一載體 和第二載體或根據段24或25的載體導入T細胞的步驟。
[0217] 27.根據段24的方法，其中所述T細胞來自從受試者分離的樣品。
[0218] 28.藥物組合物，其包含根據段1-16中任一項的多種T細胞。
[0219] 29.用于治療和/或預防疾病的方法，其包括將根據段28的藥物組合物施用于受試 者的步驟。
[0220] 30.根據段29的方法，其包括以下步驟：
[0221 ] (i)從受試者分離包含Τ細胞的樣品。
[0222] (ii)用根據段17-20中任一項的核酸序列，如段21中定義的第一核酸序列和第二 核酸序列；和/或如段22或23中定義的第一載體和第二載體或根據段24或25的載體轉導或 轉染所述T細胞;和
[0223] (iii)將來自（ii)的T細胞施用于受試者。
[0224] 31.根據段29或30的方法，其中所述疾病是癌癥。
[0225] 32.根據段28的藥物組合物，其用于治療和/或預防疾病。
[0226] 33.根據段1-16中任一項的T細胞用于制備用于治療和/或預防疾病的藥物的用 途。
[0227] 發明詳述
[0228]嵌合抗原受體(CAR)
[0229] 在圖1中示意性顯示的CAR是嵌合的I型跨膜蛋白質，其將胞外抗原識別域（結合 劑)連接至胞內信號傳導域（內域）。結合劑通常為來源于單克隆抗體(mAb)的單鏈可變片段 (scFv)，但它可以是基于包含抗體樣抗原結合位點的其他形式。為將結合劑與膜分離并允 許它具有合適的方向，間隔域通常是必需的。常用的間隔域是IgGl的Fc。取決于抗原，更緊 湊的間隔區可以足夠，例如來自CD8a的莖和甚至是僅IgGl的鉸鏈。跨膜域將蛋白質錨定在 細胞膜中，并將間隔區連接至內域。
[0230] 早期的CAR設計具有來源于FceRl或⑶3ζ的γ鏈的細胞內部分的內域。因此，這些 第一代受體傳輸免疫信號1，其足以觸發相關靶細胞的Τ細胞殺死，但未能充分活化Τ細胞以 增殖和存活。為了克服此限制，已構建了復合內域:Τ細胞共刺激分子的胞內部分與CD3G的 胞內部分的融合導致了可在抗原識別后同時傳輸活化和共刺激信號的第二代受體。最常使 用的共刺激域是CD28的共刺激域。這提供最有效的共刺激信號-即觸發Τ細胞增殖的免疫信 號2。也已經描述了包括TNF受體家族內域的一些受體，例如密切相關的傳輸存活信號的 0X40和41ΒΒ。甚至現在已經描述了更強大的第三代CAR，其具有能夠傳輸活化，增殖和存活 信號的內域。
[0231] 使用例如逆轉錄病毒載體可以將CAR編碼核酸轉移到T細胞。可使用慢病毒載體。 通過這種方式可產生用于過繼性細胞轉移的大量的癌特異性T細胞。當CAR結合靶抗原時， 這導致活化信號傳輸到表達所述CAR的T細胞上。因此，CAR指導T細胞的針對表達靶抗原的 腫瘤細胞的特異性和細胞毒性。
[0232] 本發明的第一方面涉及共表達第一 CAR和第二CAR的T細胞，使得T細胞可以以在真 值表(truth tab 1 e)(表1，2和3)中詳細描述的邏輯門的方式識別革E1細胞上表達的所希望的 模式。
[0233] 第一 CAR和第二CAR兩者(和任選地后來的CAR)包含：
[0234] (i)抗原結合域；
[0235] (ii)間隔區
[0236] (iii)跨膜域;和
[0237] (iv)胞內域。
[0238] 表1:CAR或門的真值表
[0240] 表2: CAR和門的真值表
[0242] 表3: CAR和非門的真值表
[0245] 本發明的T細胞的第一和第二CAR可以產生為包含兩個CAR和切割位點的多肽。
[0246] SEQ ID No. 1-5給出了這樣的多肽的實例，其中每一個包含兩個CAR。因此，CAR可 包含對應于單個CAR的以下氨基酸序列中的一個或其它部分。
[0247] SEQ ID No 1 是識別CD19或CD33的CAR或門。
[0248] SEQ ID No 2是使用CD148磷酸酶識別CD19和CD33的CAR和門。
[0249] SEQ ID No 3是使用⑶45磷酸酶識別⑶19和⑶33的CAR和門的備選實施方式。
[0250] SEQ ID No 4是基于PTPN6磷酸酶識別CD19和非CD33的CAR和非門。
[0251] SEQ ID No 5是識別⑶19和非⑶33的CAR和非門的備選實施方式并且基于來自 LAIR1的含有Ι??Μ的內域。
[0252] SEQ ID No 6是識別⑶19和非⑶33的CAR和非門的其他備選實施方式并且募集 PTPN6-CD148融合蛋白至含有Ι??Μ的內域。
[0253] SEQ ID No.l
[0261] SEQ ID No.5
[0265] CAR可以包含如SEQ ID No. 1，2,3,4,5或6中所示序列的CAR編碼部分的變體，其具 有至少80%，85 %，90 %，95 %，98 %或99 %的序列同一性，條件是變體序列是具有所需性質 的 CAR。
[0266] 序列比對的方法是本領域是公知的，并且使用合適的比對程序來完成。％序列同 一性指的是當在最佳比對兩個序列時，它們中相同的氨基酸或核苷酸殘基的百分比。可使 用標準算法諸如BLAST程序（在國家生物技術信息中心基本局部比對搜索工具（Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biotechnology Informat ion))使用默認參數確定核苷酸和蛋白質序列的同源性或同一1性，這在// blast .ncbi .nlm.nih. gov是可公開獲得的。用于確定序列同一"性或同源性的其它算法包 j^:LALIGN(//www.ebi.ac.uk/Tools/psa/lalign/^n//www.ebi.ac.uk/Tools/ psa/lalign/nucleotide .html)，AMAS(多比對序列分析(Analysis of Multiply Aligned Sequences), jSi //www.compbio.dundee.ac.uk/Software/Amas/amas.html),FASTA (//www.ebi.ac.uk/Tools/sss/fasta/),Clustal Omega(//www.ebi.ac.uk/ Tools/msa/clustalo/),SIM(//web.expasy.org/sim/),and EMBOSS Needle ( //www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/nucleotide.html)〇
[0267] CAR邏輯或門
[0268] 在本實施方案中，本發明的第一和第二CAR的抗原結合域結合不同的抗原并且兩 個CAR均包含活化內域。兩個CAR具有不同的間隔區域以防止兩個不同受體的交叉配對。因 此可以工程化改造 T細胞以在識別任一個或兩個抗原后活化。如Goldie-Coldman假說所指 示的，這在腫瘤學領域是有用的：由于在大多數癌癥中所固有的高突變率，單一抗原的單一 靶向可以導致通過調制所述抗原進行腫瘤逃逸。通過同時靶向兩種抗原，此種逃逸的概率 可以成指數地減少。
[0269] 如下表4中所示，各種腫瘤相關抗原是已知的。對于給定的疾病，第一CAR和第二 CAR可以結合到與該疾病相關的兩個不同的TAA。以這種方式，由于第二抗原也被靶向，防止 了通過調控單一抗原進行的腫瘤逃逸。例如，當靶向B細胞惡性腫瘤時，可同時靶向CD19和 CD20兩者。在本實施方案中，這兩個CAR不異二聚體化是重要的。
[0270] 表 4
[0272]動力學分離模型
[0273]產生和門及和非門的CAR的隨后配對是基于T細胞活化的動力學分離模型(KS)。這 是由實驗數據支持的功能性模型，其解釋了如何將通過T細胞受體進行的抗原識別轉換成 下游活化信號。簡要地:在基態下，在T細胞膜上的信號傳導組分處于動態平衡，由此相比于 磷酸化ITAM，有利于脫磷酸化ITAM。這是由于跨膜CD45/CD148磷酸酶比膜栓系(membrane-tethered)激酶例如lck更大的活性。當T細胞通過相關抗原的T細胞受體(或CAR)識別而銜 接靶細胞時，形成了緊密的免疫突觸。T細胞和靶標膜的這種緊密并置排除了CD45/CD148， 這是因為它們的不能裝配到突觸中的較大胞外域。在無磷酸酶的存在下，高濃度的T細胞受 體相關I ΤΑΜ和激酶在突觸中的分離導致了有利于磷酸化I ΤΑΜ的狀態。ZAP 7 0識別磷酸化 ITAM的閾值并且傳播T細胞活化信號。本發明利用了 T細胞活化的這種先進的見解。具體而 言，本發明是基于這樣的見解:不同長度和/或體積和/或電荷和/或構造和/或糖基化的胞 外域如何在突觸形成后導致差別分離。
[0274] CAR邏輯和門
[0275] 在本實施方案中，一個CAR包含活化性內域，并且一個CAR包含抑制性內域，其中抑 制性CAR組成性抑制第一活化性CAR，但在識別其相關抗原后解除其對活化性CAR的抑制。以 這種方式，可以工程化改造 T細胞，從而僅當靶細胞表達兩種相關抗原時觸發。此行為是由 包含含有ITAM域的活化性內域(例如CD3Zeta內域）的活化性CAR和包含來自能夠使ITAM脫 磷酸的磷酸酶的內域(例如CD45或CD 148)的抑制性CAR實現的。關鍵的是，兩個CAR的間隔區 域在大小和/或形狀和/或電荷等方面顯著地不同。當僅連接活化性CAR時，抑制性CAR在T細 胞表面上在溶液中（in solution)，并可以在抑制活化性CAR的突觸中擴散并且擴散出抑制 活化性CAR的突觸。當連接這兩個CAR時，由于間隔區性質的差異，活化和抑制性CAR被差異 地分開，從而允許活化性CAR觸發T細胞活化而不會受抑制性CAR的阻礙。
[0276] 這是在癌癥治療領域相當有用的。目前，免疫療法一般靶向單一抗原。大多數癌癥 基于單一抗原不能與正常組織區分。因此，發生大量的"中靶脫瘤"毒性，由此使正常組織被 治療損傷。例如，雖然用利妥昔單抗靶向CD20以治療B細胞淋巴瘤，但消耗了整個正常B細胞 區室。例如，雖然靶向CD52以治療慢性淋巴細胞性白血病，但消耗整個淋巴樣區室。例如，雖 然靶向CD33以治療急性髓樣白血病，但損傷了整個髓樣區室等。通過將活性限制到一對抗 原上，可以開發精細多得多的靶向和因此毒性較低的治療。實際的實例是靶向同時表達CD5 和⑶19的CLL。僅正常B細胞的一小部分表達這兩種抗原，因此用邏輯和門靶向這兩種抗原 的脫靶毒性實質性小于單獨靶向每種抗原。
[0277] 本發明的設計相對于Wilkie et al. ((2012) .J.Clin.Immunol.32,1059-1070)描 述和之后在體內測試的(Kloss et al(2013)Nat.Biotechnol.31，71-75)的先前的實施方 式是相當大的改進。在本實施方式中，第一CAR包含(comprises of)活化性內域，并且第二 CAR包含共刺激域。以此方式，當兩種抗原都存在時，T細胞只接收活化和共刺激信號。然而， 在僅存在第一抗原的情況下，T細胞將仍然活化，這導致潛在的脫靶毒性。另外，本發明的實 施方式允許多個復合連接門（compound linked gate)，由此細胞可以解讀抗原的復雜模 式。
[0278] 表 5
[0279]
[0280]
[0281] CAR邏輯和非門
[0282] 在本實施方案中，一個CAR包含活化性內域，并且一個CAR包含抑制性內域，使得此 抑制性CAR僅在它識別其相關抗原時活化。因此，以這種方式工程化改造的T細胞響應第一 抗原的單獨存在而活化，但在兩種抗原均存在時不被活化。本發明是通過具有與第一 CAR共 定位的間隔區的抑制性CAR實施的，但抑制性CAR的磷酸酶活性應當不是如此有力的，以致 于它在溶液中抑制，或僅當抑制性CAR識別其相關靶標時，抑制內域實際上募集磷酸。這種 內域在本文被稱為"連接開啟"或半抑制。
[0283] 當通過腫瘤相關抗原的存在和在正常組織表達的抗原的丟失可以區分腫瘤和正 常組織時，本發明在改善靶向中是有用的。和非門在腫瘤學領域中是相當有用的，因為它允 許靶向由正常細胞表達的抗原，所述正常細胞也表達包含活化性內域的CAR識別的抗原。這 種抗原的實例是CD33,其是由正常干細胞和急性髓樣白血病(AML)細胞表達。CD34在干細胞 上表達，但通常不在AML細胞上表達。識別⑶33和非⑶34的T細胞將導致白血病細胞的破壞， 但節約了（spare of)正常干細胞。
[0284] 用于與和非門一起使用的潛在抗原對顯示于表6。
[0285] 表 6
[0286]
[0287] 復合門（compound gate)
[0288] 具有上述組份的動力學分離模型允許制備復合門，例如響應超過兩個靶抗原的模 式而觸發的T細胞。例如，有可能制備僅當3種抗原存在(A和B和C)時觸發的T細胞。此處，細 胞表達3個CAR，各自識別抗原A，B和C。一個CAR是興奮性的（excitatory)，并且兩個是抑制 性的，其中的每個CAR具有導致差別分離的間隔區域。只有當連接所有三個時，T細胞會活 化。另一個實例：（A或B)和C:此處，識別抗原A和B的CAR在活化，并具有共定位的間隔區，而 識別抗原C的CAR是抑制性的并且具有導致差別共分離的間隔區。另一個實例(A和非B)和C: 此處，針對抗原A的CAR具有活化性內域并且與針對抗原B的具有條件性抑制性內域的CAR共 定位。針對抗原C的CAR具有與A或B差別分離的間隔區并且是抑制性的。事實上，甚至更復雜 的布爾(boolean)邏輯可以用本發明的這些簡單的組分與具有任何數量的CAR和間隔區一 起進行編程。
[0289]信號肽
[0290] 本發明的T細胞的CAR可以包含信號肽使得當CAR在細胞，如T細胞內表達時，初生 蛋白被引導至內質網并隨后引導至其表達的細胞表面上。
[0291] 信號肽的核心可含有一段長的疏水性氨基酸，其具有形成單個α-螺旋的傾向。信 號肽可以起始于短的帶正電的一段氨基酸，這有助于在移位期間實施多肽的合適的拓撲 學。在信號肽的末端通常有被信號肽酶識別和切割的一段氨基酸。信號肽酶可以在移位期 間或完成移位之后切割以產生游離的信號肽和成熟蛋白。然后游離的信號肽被特定的蛋白 酶消化。
[0292] 信號肽可以是在分子的氨基末端。
[0293] 信號肽可包含SEQ ID No.7，8或9或其變體，所述變體具有5，4,3,2或1個氨基酸突 變(插入，取代或添加），條件是信號肽仍然行使導致CAR的細胞表面表達的功能。
[0294] SEQ ID No.7:MGTSLLCWMALCLLGADHADG
[0295] SEQ ID No. 7的信號肽是緊湊和高效的。預測通過信號肽酶在末端甘氨酸后產生 約95 %的切割，產生有效的移除。
[0296] SEQ ID No.8:MSLPVTALLLPLALLLHAARP
[0297] SEQ ID No .8的信號肽來源于IgGl。
[0298] SEQ ID No.9:MAVPTQVLGLLLLWLTDARC
[0299] SEQ ID No .9的信號肽來源于CD8。
[0300] 第一 CAR的信號肽可以具有與第二CAR(和第三CAR和第四CAR等）的信號肽不同的 序列。
[0301 ]抗原結合域
[0302]抗原結合域是CAR的識別抗原的部分。眾多的抗原結合域是本領域公知的，包括基 于抗體，抗體模擬物和T細胞受體的抗原結合位點的那些抗原結合域。例如，抗原結合域可 以包含：由單克隆抗體衍生的單鏈可變片段(scFv);靶抗原的天然配體;具有針對靶標的足 夠親和性的肽；單域抗體;人工單結合劑諸如Darpin(設計的錨蛋白重復蛋白）；或T細胞受 體衍生的單鏈。
[0303]抗原結合域可包含不基于抗體的抗原結合位點的域。例如，抗原結合域可包含基 于蛋白質/肽的域，所述蛋白質/肽為腫瘤細胞表面受體的可溶性配體(例如可溶性肽，如細 胞因子或趨化因子）；或膜錨定配體或者受體的胞外域，對于所述配體或者受體，結合對對 應物表達在腫瘤細胞上。
[0304] 實施例11-13涉及結合BCMA的CAR，在其中抗原結合域包含包括APRIL，即BCMA的配 體。
[0305]抗原結合域可基于抗原的天然配體。
[0306]抗原結合域可包含來自組合文庫的親和肽或從頭設計的親和蛋白質/肽。
[0307] 間隔區域
[0308] CAR包含間隔區序列以連接抗原結合域與跨膜域并且在空間上分離來自內域的抗 原結合域。柔性間隔區允許抗原結合域在不同方向上定向以促進結合。
[0309] 在本發明的T細胞中，第一和第二CAR可以包含不同的間隔區分子。例如，間隔區序 列可以例如包含IgGIFc區，IgGl鉸鏈或人⑶8莖或小鼠⑶8莖。間隔區可以備選地包含備選 的接頭序列，其具有與IgGIFc區，IgGl鉸鏈或CD8莖相似的長度和/或域間距性質。可以改變 人IgGl間隔區以除去Fc結合基序。
[0310]這些間隔區的氨基酸序列的實例如下：
[0311] SEQ ID 如.10(人1861的鉸鏈〇12(：!13)
[0321] 因為CAR通常是同二聚體(見圖la)，所以交叉配對可能導致異二聚體嵌合抗原受 體。基于各種原因，這是不希望的，例如：（1)表位可能不是處在靶細胞的相同"水平"上，使 得交叉配對的CAR可能只能夠結合一種抗原；（2)來自兩個不同的scFv的VH和VL可以交換并 且不能識別靶標或者更壞識別意外的和不可預測的抗原。對于"或"門和"和非"門，第一CAR 的間隔區可以與第二CAR的間隔區是足夠地不同的，以避免交叉配對。第一間隔區的氨基酸 序列可以與第二間隔區在氨基酸水平上共享小于50%，40%，30%或20%的同一性。
[0322] 在本發明的其他方面（例如和門），重要的是，第一CAR的間隔區具有不同的長度 和/或電荷和/或形狀和/或構造和/或糖基化，使得當第一 CAR和第二CAR兩者結合它們的靶 抗原時，間隔區電荷或尺寸的不同導致兩種類型的CAR的空間分離至膜的不同部分，從而導 致活化，如通過動力學分離模型所預測的。在這些方面，牢記大小和靶抗原上的結合表位， 仔細地選擇間隔區的不同長度和/或形狀和/或構造，以允許在相關靶標識別后的差別分 離。例如，預期IgGl鉸鏈，CD8莖，IgGlFc，CD34的胞外域，CD45胞外域差別分離。
[0323] 差別分離并且因此適用于與和門一起使用的間隔區對的實例在下表中顯示：
[0324]
[0325] 在本發明的其他方面(例如和非門），重要的是間隔區足夠不同以防止交叉配對， 但要足夠相似以共定位。可采用直系同源間隔區序列對。實例是鼠和人CD8莖，或備選地單 體的間隔區域-例如CD2的胞外域。
[0326]共定位并因此適用于與和非門一起使用的間隔區對的實例在下表中顯示：
[0327]
[0328] 上述提到的所有間隔區域形成同二聚體。然而，該機制不限于使用同二聚體受體， 并且應該與單體受體一起使用，只要間隔區具有足夠的剛性。這樣的間隔區的實例是CD2或 截短的CD22。
[0329] 跨膜域
[0330]跨膜域是CAR的跨越膜的序列。
[0331]跨膜域可以是在膜中熱力學穩定的任何蛋白質結構。這通常是由幾個疏水性殘基 構成的螺旋。可以將任何跨膜蛋白質的跨膜域用于提供本發明的跨膜部分。蛋白質的跨 膜域的存在和跨度可以通過本領域的技術人員使用ΤΜΗΜΜ算法(http: //www. cbs. dtu. dk/ services/TMHMM-2.0/)來確定。此外，考慮到蛋白質的跨膜域是相對簡單的結構，即預測形 成足夠長的疏水α螺旋以跨越膜的多肽序列，也可以使用人工設計的TM域(US7052906B1描 述了合成的跨膜組分）。
[0332]跨膜域可以來源于⑶28，其提供了良好的受體穩定性。
[0333] 活化性內域
[0334] 內域是CAR的信號傳輸部分。在抗原識別后，受體聚簇，天然CD45和CD148被排除在 突觸外，并且將信號傳輸到細胞。最常用的內域組分是含有3個ITAM的CD3-zeta的內域。這 在結合抗原后將活化信號傳輸到T細胞。CD3_zeta可能不能提供完全有能力（competent)的 活化信號，并且可能需要額外的共刺激信號。例如，可以將嵌合CD28和0X40與CD3-zeta-起 用于傳輸增殖/存活信號，或全部三種可以一起使用。
[0335] 在本發明的T細胞包含具有活化性內域的CAR的情況中，它可以僅包含⑶3-Zeta內 域，CD3-Zeta內域與CD28或0X40的內域，或CD28內域和0X40和CD3-Zeta內域。
[0336] 包含ITAM基序的任何內域可以作為本發明的活化性內域起作用。已知幾種蛋白質 含有內域，所述內域具有一個或更多個ITAM基序。這種蛋白質的實例包括CD3e鏈、CD3y鏈 和CD3S鏈等等。考慮標簽YxxL/Ι，任意兩個其他氨基酸可以容易地將ITAM基序識別為與亮 氨酸或異亮氨酸分開的酪氨酸。通常但不總是，這些基序中的兩個是由分子尾部的6-8個氨 基酸分隔(YxxL/IX(6-8)Y xxL/I)。因此，本領域技術人員可以容易地找到含有一個或更多 ITAM的現存蛋白質以傳輸活化信號。此外，考慮到基序是簡單的，并且不需要復雜的二級結 構，本領域的技術人員可以設計含有人工ITAM的多肽以傳輸活化信號(參見W02000063372， 其涉及合成的信號分子）。
[0337] 具有活化性內域的CAR的跨膜和胞內T細胞傳遞域（內域）可以包含如SEQ ID No. 15，16中顯示的序列或其變體，所述變體具有至少80 %序列同一性。
[0338] SEQ ID吣.15，包含0)28跨膜域和0)32內域
[0344] 變體序列可具有與SEQ ID 吣.15，16或17至少80%，85%，90%，95%，98%或99% 的序列同一性，條件是該序列提供了有效的跨膜域和有效的細胞內T細胞信號傳導域。
[0345] "連接關閉"抑制性內域
[0346] 在上面稱為和門的實施方案中，CAR中的一個包含抑制性內域，使得在不存在抑制 性CAR連接的情況下，抑制性CAR抑制通過活化性CAR導致的T細胞活化，當連接抑制性CAR 時，不顯著抑制通過活化性CAR導致的T細胞活化。這被稱為"連接關閉"抑制性內域。
[0347] 在這種情況下，抑制性CAR的間隔區具有與活化性CAR不同的長度，電荷，形狀和/ 或構造和/或糖基化，使得當連接兩個受體時，間隔區尺寸的差異導致抑制性CAR和活化性 CAR在免疫突觸的不同膜區室中分離，使得活化性內域從由抑制性內域導致的抑制中解除 出來。
[0348] 因此，用于連接關閉抑制性CAR的抑制性內域可以包含任何序列，當其在相同膜區 室中時(在不存在抑制性CAR的抗原的情況中）其抑制通過活化性CAR的T細胞信號傳導，但 當它與抑制性CAR在膜的不同部分中分離時不顯著抑制T細胞傳遞。
[0349] 連接關閉抑制性內域可以是或包含酪氨酸磷酸酶，例如受體樣酪氨酸磷酸酶。抑 制性內域可以是或包含任何酪氨酸磷酸酶，當僅連接刺激性受體時，所述酪氨酸磷酸酶能 夠抑制TCR信號傳導。抑制性內域可以是或包含具有針對磷酸化的ΙΤΑΜ的足夠快的催化速 率的任何酪氨酸磷酸酶，當僅連接刺激性受體時，所述酪氨酸磷酸酶能夠抑制TCR信號傳 導。
[0350] 例如，和門的抑制性內域可以包含⑶148或⑶45的內域。CD148和⑶45已顯示天然 地作用于TCR信號傳導的磷酸化的酪氨酸上游。
[0351 ]⑶148是受體樣蛋白質酪氨酸磷酸酶，其通過干擾PLC γ 1和LAT的磷酸化和功能負 調節TCR信號傳導。
[0352] CD45存在于所有造血細胞中，是一種蛋白酪氨酸磷酸酶，它能夠再次通過磷酸化 PLCy 1調節信號轉導和功能性響應。
[0353] 抑制性內域可包含受體樣酪氨酸磷酸酶的全部或一部分。磷酸酶可以干擾參與T 細胞信號傳導的元件如PLC γ 1和/或LAT的磷酸化和/或功能。
[0354] CD45和CD148的跨膜和內域分別顯示為SEQIDNo·18和No·19。
[0355] SEQ ID 18-CD45跨膜和內域序列
[0357] SEQ ID 19-CD148跨膜和內域序列
[0359] 抑制性CAR可以包含SEQ ID No 18或19的全部或部分(例如，它可以包含內域的磷 酸酶功能）。它可以包含該序列或其部分的具有至少80%的序列同一性的變體，只要所述變 體保留了基本上抑制由活化性CAR導致的T細胞信號傳導的能力。
[0360] 其他間隔區和內域可以例如使用本文列舉的模型系統來進行測試。可以通過單獨 或雙重轉導合適的細胞系諸如SupTl細胞系產生靶細胞群以建立針對兩種抗原呈陰性的細 胞(野生型），針對任一種抗原呈陽性的細胞和針對兩種抗原呈陽性的細胞(如⑶19-CD33-， 0)19+0)33-，0)19,0)33+和0)19+0033+)。可以用一對041?轉導1'細胞如在活化后釋放11^-2的 小鼠 T細胞系BW5147,并且通過測量IL-2的釋放(例如通過ELISA)測量它們在邏輯門中發揮 作用的能力。例如，在實施例4中顯示CD148和CD45內域兩者可以作為抑制性CAR與含有 ⑶3Zeta內域的活化性CAR組合行使功能。這些CAR依靠一個CAR上的短/不龐大的⑶8莖間隔 區和另一個CAR上龐大的Fc區實現和門控。當連接了兩個受體時，間隔區尺寸的差異導致不 同受體在不同膜區室中的分離，從而將CD3Zeta受體從由CD148或CD45內域導致的抑制中解 除出來。以這種方式，僅當兩種受體被活化時才發生活化。可以容易地看出，這種模塊系統 可用于測試備選的間隔區對和抑制性內域。如果在兩種受體的連接之后，間隔區沒有實現 分離，那么抑制將不會被釋放，所以不會發生活化。如果所測試的抑制性內域是無效的，那 么在活化性CAR的連接的存在下將預期活化，與抑制性CAR的連接狀態無關。
[0361] "連接開啟"內域
[0362] 在上述稱為和非門的實施方案中，CAR中的一個包含"連接開啟"抑制性內域，使得 在缺乏抑制性CAR連接的情況下，抑制性CAR不顯著抑制由活化性CAR導致的T細胞活化，當 連接抑制性CAR時，其抑制由由活化性CAR導致的T細胞活化。
[0363] "連接開啟"抑制性內域可以是或包含酪氨酸磷酸酶，當僅連接刺激性受體時，所 述酪氨酸磷酸酶不能抑制TCR信號傳導。
[0364] "連接開啟"抑制性內域可以是或包含具有針對磷酸化的ITAM的足夠慢的催化速 率的酪氨酸磷酸酶，當僅連接刺激性受體時，所述酪氨酸磷酸酶不能夠抑制TCR信號傳導， 但當在突觸處集中時，能抑制TCR信號傳導響應。通過抑制性受體連接實現了突觸處的富 集。
[0365] 如果酪氨酸磷酸酶具有針對"連接開啟"抑制性內域太快的催化速率，則有可能通 過修飾如點突變和短接頭(其導致位阻）來下調（tune-down)磷酸酶的催化速率，以使其適 合于"連接開啟"抑制性內域。
[0366]在第一實施方案中，內域可以是或包含具有比⑶45或⑶148具有少得相當多的活 性的磷酸酶，使得ITAMS的顯著脫磷酸化僅在活化和抑制性內域共定位時發生。許多合適的 序列是本領域已知的。例如，非和門的抑制性內域可包含蛋白質-酪氨酸磷酸酶如PTPN6的 全部或部分。
[0367] 蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)是調節多種細胞過程，包括細胞生長，分化，有絲分裂周 期和致癌性轉化的信號傳導分子。此PTP的N末端部分含有兩個串聯的Sr c同源（SH2)域，它 作為蛋白質磷酸酪氨酸結合域起作用，并介導此PTP與其底物的相互作用。此PTP主要在造 血細胞中表達，并在造血細胞中作為多種信號傳導途徑的重要調節劑發揮作用。
[0368] 抑制劑域可包含整個PTPN6(SEQ ID No.20)或僅磷酸酶域(SEQ ID No.21)。
[0369] SEQ ID Νο·20-ΡΤΡΝ6序列
[0373] 連接開啟抑制性內域的第二種實施方案是含有Ι??Μ(基于免疫受體酪氨酸的抑制 基序）的內域，如來自CD22，LAIR-1，殺手(killer)抑制性受體家族(KIR)，LILRB1，CTLA4， PD-1，BTLA等的內域。當被磷酸化時，Ι??Μ通過其SH2域募集內源PTPN6。如果與含ITAM的內 域共定位，那么發生脫磷酸化，并且抑制了活化性CAR。
[0374] ITIM是在免疫系統的許多抑制性受體的胞質尾部中發現的氨基酸的保守序列（S/ I/V/LxYxxI/V/L)。本領域技術人員可以很容易地發現含Ι??Μ的蛋白質域。已經通過蛋白質 組全掃描（Staub，et al(2004)CelL·Signal. 16，435-456)產生含Ι??Μ的人類候選蛋白質的 列表。此外，由于共有序列是公知的并且小的二級結構似乎是需要的，本領域技術人員可以 產生人工ITIM。
[0375] 來自 PDCD1，BTLA4，LILRB1，LAIR1，CTLA4，KIR2DL1，KIR2DL4，KIR2DL5，KIR3DL1 和 KIR3DL3的ITIM內域分別顯示于SEQ ID 22至31中。
[0396] 連接開啟抑制性內域的第三個實施方案是含有Ι??Μ的與融合蛋白共表達的內域。 融合蛋白可以包含蛋白質-酪氨酸磷酸酶的至少一部分和受體樣酪氨酸磷酸酶的至少一部 分。該融合物可以包含來自蛋白質-酪氨酸磷酸酶的一個或多個SH2域。例如，融合可以是在 PTPN6SH2域和CD45內域之間或PTPN6SH2域和CD148內域之間進行。當被磷酸化時，Ι??Μ±或募 集融合蛋白，使高度有力的CD45或CD148磷酸酶接近活化性內域以阻斷活化。
[0397] 融合蛋白的序列列在32和33
[0398] SEQID 32PTPN6-CD45融合蛋白
[0400] SEQ ID 33PTPN6-CD148融合蛋白
[0402] 連接開啟抑制性CAR可以包含SEQ ID No 20或21的全部或部分。它可以包含SEQ ID No 20至31的全部或部分。它可以包含與SEQ ID 32或33共表達的SEQ ID 22至31的全部 或部分。它可以包含具有至少80%序列同一性的序列或其部分的變體，只要所述變體保留 了在抑制性CAR連接后抑制由活化性CAR導致的T細胞信號傳導的能力。
[0403] 如上述，可以例如使用本文列舉的模型系統測試備選的間隔區和內域。在實施例5 中顯示，PTPN6內域可以作為半抑制性CAR與含有⑶3Zeta內域的活化性CAR組合發揮功能。 這些CAR依靠一個CAR上的人⑶8莖間隔區和另一 CAR上的小鼠⑶8莖間隔區。直系同源序列 防止交叉配對。然而，當連接兩種受體時，間隔區的相似性導致在相同的膜區室中的不同受 體的共分離。這導致了 PTPN6內域抑制⑶3Zeta受體。如果只是活化性CAR連接，那么PTPN6內 域不是足夠有活性以防止T細胞的活化。以這種方式，僅當活化性CAR連接并且抑制性CAR不 連接時（和非門）時發生活化。可以容易地看出，這種模塊系統可用于測試備選的間隔區對 和抑制性域。如果在兩種受體連接后，間隔區沒有實現共分離，那么抑制不會是有效的，并 且因此不會發生活化。如果所測試的半抑制性內域是無效的，將預期在活化性CAR連接的存 在下活化，與半抑制性CAR的連接狀態無關。
[0404]共表達位點
[0405] 本發明的第二方面涉及編碼第一 CAR和第二CAR的核酸。
[0406] 核酸可以產生多肽，其包含通過切割位點連接的兩個CAR分子。切割位點可以自我 切割，使得當多肽產生時，它立即被切割成第一 CAR和第二CAR而不需要任何外部切割活性。 [0407]多種自我切割位點是已知的，包括口蹄疫病毒(FMDV)2a自我切割肽，其具有如SEQ ID No. 34中所不的序列：
[0408] SEQ ID No.34
[0409] RAEGRGSLLTCGDVEENPGP
[0410] 共表達序列可以是內部核糖體進入序列（IRES)。共表達序列可以是一個內部啟動 子。
[0411] 細胞
[0412] 本發明的第一方面涉及在細胞表面共表達第一 CAR和第二CAR的細胞。
[0413] 細胞可以是能夠在細胞表面表達CAR的任何真核細胞如免疫細胞。
[0414]具體地，細胞可以是免疫效應細胞，如T細胞或天然殺傷(NK)細胞。
[0415] T細胞或T淋巴細胞是在細胞介導的免疫中起中心作用的一類淋巴細胞。可以通過 細胞表面上存在的T細胞受體(TCR)將它們與其他的淋巴細胞，如B細胞和天然殺傷細胞(NK 細胞)區分開來。有多種類型的T細胞的，總結如下。
[0416] 輔助性T輔助細胞(ΤΗ細胞)在免疫學過程中協助其他的白細胞，所述免疫學過程 包括Β細胞成熟為漿細胞和記憶Β細胞，細胞毒性Τ細胞和巨噬細胞的活化。ΤΗ細胞在其表面 表達⑶4。?細胞當它們通過在抗原呈遞細胞(APC)表面上的MHC II類分子而呈遞有肽抗原 時被活化。這些細胞能夠分化成幾種亞型之一，包括ΤΗ1，ΤΗ2，ΤΗ3，ΤΗ17，ΤΗ9，或TFH，其分泌 不同細胞因子以促進不同類型的免疫應答。
[0417] 細胞毒性Τ細胞(TC細胞，或CTL)破壞病毒感染的細胞和腫瘤細胞，并且也涉及移 植排斥。CTL在其表面表達CD8。這些細胞通過結合與存在于所有有核細胞的表面上的MHC I 類結合的抗原識別它們的靶標。通過調節性Τ細胞分泌的IL-10,腺苷和其它分子，可以使 CD8+細胞失活至無反應性狀態，這防止自身免疫疾病如實驗性自身免疫性腦脊髓炎。
[0418]記憶Τ細胞是感染已經結束后長期存在的抗原特異性Τ細胞的亞組。在重新暴露于 它們的相關抗原后，它們很快擴展成大量的效應Τ細胞，從而給免疫系統提供針對過去感染 的"記憶"。記憶Τ細胞包括三個亞型：中樞記憶Τ細胞(TCM細胞)和兩種類型的效應子記憶Τ 細胞(ΤΕΜ細胞和TEMRA細胞）。記憶細胞可以是⑶4+或⑶8+。記憶Τ細胞通常表達細胞表面蛋 白CD45R0。
[0419]調節性Τ細胞(Treg細胞），以前稱作抑制性Τ細胞，對于維持免疫耐受是關鍵的。它 們的主要作用是朝向免疫反應結束關閉T細胞介導的的免疫并抑制逃脫了胸腺中的負選擇 過程的自身反應性T細胞。
[0420] 已經描述了兩種主要類型的⑶4+Treg細胞-天然存在的Treg細胞和適應性Treg細 胞。
[0421] 天然存在的Treg細胞(也稱為CD4+CD25+FoxP3+Treg細胞)在胸腺中出現并且已經 與發展中的T細胞與用TSLP活化的兩種髓樣(CDllc+)以及漿細胞樣(CD123+)樹突細胞之間 的相互作用相關。通過稱為FoxP3的胞內分子的存在，可以將天然存在的Treg細胞與其他T 細胞區分開來。F0XP3基因突變可以阻止調節性T細胞發育，導致致命的自身免疫性疾病 IPEXo
[0422] 適應性Treg細胞(也稱為Trl細胞或Th3的細胞)可以在正常免疫應答過程中起源。
[0423] 本發明的T細胞可以是上文提到的任何T細胞類型，特別是CTL。
[0424]自然殺傷(NK)細胞是一類形成先天性免疫系統的一部分的細胞溶解性細胞。NK細 胞以獨立于MHC的方式，提供對來自病毒感染細胞的先天信號的快速應答。
[0425] NK細胞（屬于先天淋巴樣細胞組)被定義為大顆粒淋巴細胞(LGL)，并構成了區分 于通常的產生B和T淋巴細胞的淋巴樣前體的第三種細胞。已知NK細胞在骨髓、淋巴結，脾， 扁桃體和胸腺中分化和成熟，在那里它們進入中循環。
[0426] 本發明的CAR細胞可以是上文提到的任何細胞類型。
[0427] CAR表達細胞，如CAR表達T或NK細胞可以從患者自身的外周血(第一方），或在來自 供體外周血(第二方)的造血干細胞移植物的背景中，或者從無關供體(第三方)的外周血離 體產生。
[0428] 本發明還提供細胞組合物，其包含根據本發明的CAR表達性T細胞和/或CAR表達性 NK細胞。細胞組合物可以通過用根據本發明的核酸離體轉導或轉染血液樣品來制備。
[0429] 備選地，CAR表達細胞可以來源于誘導祖細胞或胚胎祖細胞到相關的細胞類型，如 T細胞的離體分化。備選地，可以使用永生化細胞系，如保留其裂解功能并能用作治療劑的T 細胞系。
[0430] 在所有這些實施方案中，通過許多方式之一，包括用病毒載體轉導，用DNA或RNA轉 染導入編碼CAR的DNA或RNA來產生CAR細胞。
[0431] 本發明的CAR T細胞可以是來自受試者的離體T細胞。T細胞可以來自外周血單核 細胞(PBMC)樣品。在用CAR編碼核酸轉導之前，可以例如通過用抗CD3單克隆抗體處理來活 化和/或擴增T細胞。
[0432] 本發明的CAR T細胞可以通過以下制備：
[0433] (i)從受試者或上面列出的其它來源分離含T細胞的樣品；和
[0434] (ii)用編碼第一和第二CAR的一種或多種核酸序列轉導或轉染T細胞。
[0435] 然后可以純化T細胞，例如基于第一和第二CAR的共表達來選擇。
[0436] 核酸序列
[0437] 本發明的第二方面涉及編碼如在本發明的第一方面所定義的第一 CAR和第二CAR 的一個或多個核酸序列。
[0438] 核酸序列可包含以下序列之一或其變體：
[0439] SEQ ID 35或門
[0440] 使用CD45的SEQ ID 36和門 [0441 ]使用CD148的SEQ ID 37和門
[0442] 使用PTPN6作為內域的SEQ ID 38和非門
[0443] 使用LAIR1內域的SEQ ID 39和非門
[0444] 使用具有CD148磷酸酶的LAIR1和PTPN6SH2融合物的SEQ ID 40和非門
[0445] SEQ ID No.35:
[0463] 核酸序列編碼的氨基酸序列可以與SEQ ID No.35,36,37,38,39或40編碼的氨基 酸序列相同，但由于遺傳密碼的簡并性可以具有不同的核酸序列。核酸序列可具有與SEQ ID No.35,36,37,38,39或40中顯示的序列至少80%，85,90，95,98或99%的同一性，條件是 它編碼如在本發明的第一方面限定的第一 CAR和第二CAR。
[0464] 載體
[0465] 本發明還提供包含一個或多個CAR編碼核酸序列的載體或載體試劑盒。這樣的載 體可用于將核酸序列導入宿主細胞中，使得其表達第一和第二CAR。
[0466] 載體可以是例如質粒或病毒載體，例如逆轉錄病毒載體或慢病毒載體，或基于轉 座子的載體或合成的mRNA。
[0467] 載體可以能夠轉染或轉導的T細胞。
[0468] 藥物組合物
[0469] 本發明還涉及含有根據本發明的第一方面的多個CAR表達細胞，例如Τ細胞或ΝΚ細 胞的藥物組合物。藥物組合物可另外包含可藥用的載體，稀釋劑或賦形劑。藥物組合物可任 選包含一種或多種其它藥物活性多肽和/或化合物。這樣的制劑可以例如是適合于靜脈內 輸注的形式。
[0470]治療方法
[0471] 本發明的T細胞可以能夠殺死靶細胞，例如癌細胞。靶細胞可以通過限定的抗原表 達模式識別，例如抗原A和抗原B的表達;抗原A或抗原B的表達;或抗原A和非抗原B的表達或 這些門的復雜迭代。
[0472] 本發明的T細胞可用于感染如病毒感染的治療。
[0473] 本發明的T細胞也可以用于控制病原性免疫應答，例如，自身免疫性疾病，變態反 應和移植抗宿主排斥。
[0474] 本發明的T細胞可以用于治療癌性疾病，如膀胱癌，乳腺癌，結腸癌，子宮內膜癌， 腎癌(腎細胞），白血病，肺癌，黑素瘤，非霍奇金淋巴瘤，胰腺癌，前列腺癌和甲狀腺癌。
[0475] 它特別適合于治療實體瘤，其中良好選擇性的單一靶標的利用度是有限的。
[0476] 本發明的T細胞可用于治療：口腔和咽的癌癥，包括舌癌，口腔癌和咽癌;消化系統 的癌癥，其包括食管癌，胃癌和結腸直腸癌;肝臟和膽道系統的癌癥，其包括肝細胞癌和膽 管上皮癌(cholangiocarcinoma);呼吸系統的癌癥，其包括支氣管癌和喉癌;骨和關節的癌 癥，包括骨肉瘤;皮膚癌，其包括黑素瘤;乳腺癌;生殖道的癌癥，其包括在女性中的子宮癌， 卵巢癌和宮頸癌，以及在男性中的前列腺癌和睪丸癌；腎道的癌癥，其包括腎細胞癌，尿道 或膀胱的移行細胞癌；腦癌，其包括膠質瘤，多行性膠質母細胞瘤和髓母細胞瘤 (medullobastomas);內分泌系統的癌癥，包括甲狀腺癌，腎上腺癌和與多發性內分泌腺新 生物綜合征相關的癌癥;淋巴瘤，其包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤;多發性骨髓瘤和 漿細胞瘤;急性和慢性白血病，髓樣或淋巴性白血病；以及其他的未指明位點的癌癥，包括 神經母細胞瘤。
[0477] 用本發明的T細胞進行的治療可以幫助防止在標準方法中經常發生的腫瘤細胞的 逃逸或釋放。
[0478] 本發明現在將通過實施例進一步描述，所述實施例意在用于協助本領域普通技術 人員中實施本發明，并且不是意在以任何方式限制本發明的范圍。 實施例
[0479] 實施例1:靶細胞群的產生
[0480]為了證明本發明的原理的目的，任意地選擇了基于抗⑶19和抗⑶33的受體。使用 逆轉錄病毒載體，克隆了 CD19和CD33。將這些蛋白質截短，以便它們不能發信號并且可以長 時段穩定地表達。接著，單一或雙重使用這些載體來轉導SupTl細胞系以建立針對兩種抗原 呈陰性(野生型），對任一種抗原呈陽性和對兩種抗原呈陽性的細胞。表達數據顯示于圖3。
[0481] 實施例2:或門的設計和功能
[0482] 為了構建或門，共表達識別CD19和CD33的一對受體。將不同的間隔區用于防止交 叉配對。這兩種受體具有來源于CD28的用于改善表面穩定性的跨膜域和來源于CD3Zeta的 內域的用于提供簡單的活化信號的內域。以這種方式，共表達了一對獨立的第1代CAR。用于 共表達序列的逆轉錄病毒載體盒利用口蹄疫病毒2A自我切割肽，以允許共表達1:1的兩種 受體。盒設計顯示于圖4,并且蛋白質結構顯示于圖5中。同源區的核苷酸序列是密碼子擺動 的，以防止在逆轉錄病毒載體逆轉錄過程中的重組。
[0483] 實施例3:測試或門
[0484] 通過用融合至Fc的相關抗原染色在T細胞表面上測試兩種CAR的表達。通過使用不 同種類的Fc域(對于CD19為小鼠并且對于CD33為兔），通過用綴合有不同熒光團的不同二抗 染色在細胞表面上確定兩種CAR的共表達。這顯示于圖6。
[0485] 然后使用小鼠 T細胞系BW5147進行功能測試。這種細胞系在活化后釋放IL2,以允 許簡單的定量讀數。這些T細胞與增加量的上述人工靶細胞共培養。如通過ELISA測量的IL2 釋放顯示的，T細胞響應表達任一抗原的靶細胞。顯示兩種CAR在細胞表面上表達，并且顯示 T細胞響應任一種或兩種抗原。這些數據顯示在圖7中。
[0486] 實施例4:和門的設計和功能
[0487] 和門組合簡單活化受體與基本上抑制活性但其活性在連接受體后被關閉的受體。 這通過組合標準的第一代CAR與第二受體實現，所述第一代CAR具有短/非龐大的CD8莖間隔 區和CD3Zeta內域，所述第二受體具有龐大的Fc間隔區，它的內域包含⑶148或⑶45內域。當 連接兩個受體時，間隔區尺寸的差異導致不同受體在不同膜區室中的分離，從而使CD3Zeta 受體從由CD 148或CD45內域導致的抑制中解除出來。以這種方式，僅在兩種受體被活化時發 生活化。對此選擇了CD148和CD45,因為它們天然地在這種方式發揮功能:例如，非常龐大的 CD45胞外域將整個受體排除在免疫突觸外。表達盒描述在圖8中并且在圖9中描述了后續蛋 白質。
[0488] 針對不同的特異性的表面染色顯示，兩種受體對可以在圖10中顯示的細胞表面上 有效地表達。在BW5147中的功能顯示T細胞僅在兩種抗原的存在下才被活化(圖11)。
[0489] 實施例5:和門的一般化的證明
[0490]為了確保觀察結果不是⑶19/CD33和已經使用的其結合劑的一些特定特征的表 現，交換了兩個靶向性scFv，使得現在活化（ITAM)信號在識別CD33,而不是CD19后傳輸;并 且抑制信號(CD148)在識別⑶19而不是⑶33后傳輸。因為認為⑶45和⑶148內域在功能上類 似，所以將實驗限制到具有CD148內域的和門。這應當仍然導致功能性和門。用具有單獨的 ⑶19或⑶33或兩者的靶標攻擊表達新邏輯門的T細胞。T細胞響應同時表達⑶19和⑶33的靶 標，但不響應只表達這些抗原中的一種或不表達這些抗原的靶標。這表明，和門在此形式中 仍是有功能的（圖18B)。
[0491]以同樣的思路，試圖確立如何一般化我們的和門：和門應當在不同的靶標間一般 化。雖然門給出的相對抗原密度，相關scFv結合動力學和scFv結合表位的精確距離可能具 有更低或更高的保真度，但將預期用一大批靶物和結合劑看到一些和門的表現。為了測試 這點，產生了三種另外的和門。再一次，將實驗限制到CD148形式的和門。將來自原始的 CD148和門的第二scFv替換成抗⑶2scFv huK666(SEQ ID41 和SEQ ID42)，或抗CD5scFv(SEQ ID43和SEQ ID44)，或抗EGFRvIII scFv MR1.1(SEQ ID45和SEQ ID46)，以產生以下CAR和 門：⑶19和⑶2;⑶19和⑶5;⑶19和EGFRvII I。也產生了下面的人工抗原表達細胞系:通過用 GM3和GD2合酶轉導SupTl和我們的SupTl · CD19，產生了 SupTl · GD2和SupTl · CD19 ·⑶2。通過 用編碼EGFRvIII的逆轉錄病毒載體轉導SupTl和SupTl.CD19產生了 SupTl.EGFRvIII和 SupTl.⑶19.EGFRvIII。因為⑶5在SupTl細胞上表達，所以將不同的細胞系用于產生靶細 胞:產生了表達單獨的⑶19，單獨的CD5和CD5和⑶19兩者的293T細胞。表達通過流式細胞術 確認（圖19)。用SupTl.⑶19和各自的相關雙重陽性和單陽性靶細胞攻擊表達三種新CAR和 門的T細胞。所有三種和門顯示與單陽性靶標相比通過雙重陽性細胞系導致的活化降低（圖 20)。這顯示了和門設計至任意靶標和相關結合劑的一般化。
[0492]實施例6: CAR和門的動力學分離模型的實驗證據
[0493] 目的是要證明下述模型，即通過不同間隔區引起的差別分離是產生這些邏輯CAR 門的能力背后的中心機制。該模型是，如果僅連接活化性CAR，那么有力的的抑制性"連接關 閉"型CAR在膜中在溶液中，并且可以抑制活化性CAR。一旦兩個CAR均連接，若兩個⑶R間隔 區充分不同，那么它們將在突觸內分離并且不會共定位。因此，關鍵的需求是間隔區是充分 不同的。如果模型是正確的，如果這兩個間隔物充分相似，從而當連接兩個受體時它們共定 位，那么門將不能發揮功能。為了驗證這一點，我們用鼠 CD8間隔區替換了原始CAR中的龐大 Fc間隔區。預測這具有與人CD8類似的長度，體積和電荷，但因此不應與它交叉配對。因此， 新的門具有識別⑶19的第一 CAR，人⑶8莖間隔區和活化性內域;而第二CAR識別⑶33，具有 小鼠 CD8莖間隔區和⑶148內域（圖18C)。轉導T細胞以表達這種新的CAR門。然后用表達單獨 的⑶19,單獨的⑶33或一起的⑶19和⑶33的SupTl細胞攻擊這些T細胞。按照原始的和門，T 細胞不響應單獨表達任一種抗原的SupTl細胞。然而，CAR T細胞不能響應表達兩種抗原的 SupTl細胞，從而證實了模型（圖18C)。功能性和門需要兩種CAR具有充分不同的間隔區，使 得它們不在免疫突觸內共定位(圖23A和B)。
[0494] 實施例7:和非門的設計和功能
[0495] 磷酸酶如CD45和CD148是如此有力的，以致少量進入了免疫突觸的磷酸酶能抑制 ITAM活化。這是邏輯和門抑制的基礎。其他類別的磷酸酶不是如此有力，例如PTPN6及相關 磷酸酶。據預測，通過擴散進入突觸的少量PTPN6不會抑制活化。此外，據預測，如果抑制性 CAR與活化性CAR具有充分相似的間隔區，那么若連接這兩個CAR，則它可以在突觸內共定 位。在這種情況下，當兩種抗原均存在時，大量的抑制性內域將足以停止ITAMS活化。以這種 方式，可以創建和非門。
[0496] 對于非和門，第二信號需要"否決(veto)"活化。這是通過使抑制性信號進入免疫 突觸中完成的，例如通過引入酶的磷酸酶，如PTPN6完成。我們因此產生如下的和非門：兩個 CAR共表達，其中第一個識別⑶19，具有人⑶8莖間隔區和活化性內域;與抗⑶33CAR共表達， 所述抗⑶33CAR具有小鼠⑶8莖間隔區和由PTPN6的催化域構成的內域(SEQ ID 38，圖13A和 B)。合適的盒顯示于圖12,并且初步功能數據顯示于圖14。
[0497] 此外，發展了一種用于產生和非門的備選策略。免疫酪氨酸酶抑制基序（Ι??Μ)以 與ITAMS類似的方式活化，因為它們在聚簇和磷酸酶排斥后通過lck磷酸化。代替通過結合 ZAP70觸發活化，磷酸化的Ι??Μ通過它們的相關SH2域募集磷酸酶，如PTPN6。ITIM可以作為 抑制性內域發揮功能，只要活化和抑制性CAR上的間隔區可以共定位。為了產生這種構建 體，如下產生了和非門：兩個CAR共表達，其中第一個識別CD19,具有人CD8莖間隔區和活化 內域；與抗⑶33CAR共表達，所述抗⑶33CAR具有小鼠⑶8莖間隔區和來源于LAIR1的內源的 含有Ι??Μ的內域(SEQ ID 39,圖13A和C)。
[0498] 也開發了另外的更復雜的和非門，其中ITIM通過額外的嵌合蛋白質的存在而增 強:ΡΤΡΝ6的SH2域和⑶148的內域的胞內融合物。在這種設計中表達三種蛋白質-第一種識 別⑶19,具有人⑶8莖間隔區和活化內域;與抗⑶33CAR共表達，所述抗⑶33CAR具有鼠⑶8莖 間隔區和來源于LAI R1的內域的含有Ι??Μ的內域。另外的2Α肽允許ΡΤΡΝ6-⑶148融合物的共 表達(SEQ ID40，圖13Α和D)。預測這些和非門將具有不同程度的抑制:PTPN6-CD148>PTPN6> >ITIM〇
[0499] 用這些門轉導T細胞并用表達單獨的任一種⑶19或⑶33或一起的⑶19和⑶33兩者 的靶標攻擊Τ細胞。所有三個門響應僅表達CD19的靶標，但不響應表達一起的CD19和CD33兩 者的靶標(圖21)，證實全部三種和非門均是有功能的。
[0500] 實施例8:基于ΡΤΡΝ6的和非門的動力學分離模型的實驗證據
[0501] 和非門的模型集中于這樣的事實，即在兩個CAR中使用的間隔區的性質對于門的 正確功能是關鍵的。在具有PTPN6的功能性和非門中，兩個CAR間隔區充分相似，使得當兩個 CAR連接時，這兩者在突觸內以如此高的濃度共定位，即使弱PTPN6足以抑制活化。如果間隔 區是不同的，那么在突觸中的分離會使PTPN6與ITAM分離，從而允許擾亂和非門的活化。為 了測試這一點，產生用Fc間隔區替換鼠 CD8莖間隔區的對照。在這種情況下，測試門由兩個 CAR組成:第一識別⑶19，具有人⑶8莖間隔區和ITAM內域;而第二CAR識別⑶33，具有Fc間隔 區和由來自PTPN6的磷酸酶構成的內域。這種門響應CD19而活化，但也響應一起的CD19和 CD33而活化（圖22B，其中這種門的功能與原始和非，和在實施例6中描述的對照和門變體比 較）。這種實驗數據證明了以下模型：對于具有PTPN6的功能性和非門，需要共定位的間隔 區。
[0502]實施例9:基于ITIM的和非門的動力學分離模型的實驗證據 [0503]與基于PTPN6的和非門相似，基于ITIM的門也需要在免疫突觸中共定位以作為和 非門發揮功能。為了證明這一假設，如下產生了基于Ι??Μ的對照門：兩個CAR共表達-第一種 識別⑶19，具有人⑶8莖間隔區和活化性內域;與抗⑶33CAR共表達，所述抗⑶33CAR具有Fc 間隔區和來源于LAIR1的內域的含有ITIM的內域。將這種門的活性與原始的基于ITTM的和 非門的活性相比較。在這種情況下，經修飾的門響應于表達CD 19的靶標而活化，但也響應于 表達CD19和CD33兩者的細胞而活化。這些數據表明，基于Ι??Μ的和非門遵循基于動力學分 離的模型，并且必須選擇正確的間隔區以創建功能性門（圖23Β)。
[0504] 實施例10:通過動力學分離產生的CAR邏輯門的模型的總結
[0505] 基于動力學分離模型和本文所描述的實驗數據的正確理解，在圖24中呈現了兩個 CAR門模型的總結。此圖顯示表達兩種CAR的細胞，每種CAR識別不同抗原。當任一或兩個CAR 識別細胞上的靶抗原時，形成了突觸，并且天然CD45和CD148由于其龐大的胞外域而被排除 在突觸之外。這設置T細胞活化階段。在靶細胞僅具有一種相關抗原的情況下，相關CAR連 接，并且相關CAR分離到突觸中。未連接的CAR仍然保留在T細胞膜上的溶液中，并且可以擴 散進出突觸，使得形成了連接的CAR的高局部濃度區域與未連接的CAR的低濃度的區域。在 這種情況下，如果連接的CAR具有ITAM，并且未連接的CAR具有"連接關閉"類型的抑制性內 域如CD148的內域，那么未連接的CAR的量足以抑制活化并且門是關閉的。與此相反，在此情 況下，如果連接的CAR具有ITAM，并且未連接的CAR具有"連接開啟"類型的抑制內域如 PTPN6,那么未連接的CAR的量不足以抑制活化并且門是開啟的。當受到具有兩種相關抗原 的靶細胞攻擊時，連接了這兩個相關的CAR并且形成免疫突觸的一部分。重要的是，如果CAR 間隔區足夠相似，那么CAR在突觸內共定位，但如果CAR間隔區足夠不同，CAR在突觸內分離。 在后一種情況下，形成了膜區域，其中存在高濃度的一種CAR，但是另一種CAR是不存在的。 在這種情況下，由于分離完成，即使抑制性內域是"連接關閉"類型，門仍是開啟的。在前者 的情況下，形成了高濃度的兩種CAR混合在一起的膜區域。在這種情況下，由于兩個內域都 被濃縮，即使抑制內域是"連接開啟"類型，門仍關閉。通過選擇間隔區和內域的正確組合， 可將邏輯編程到CAR T細胞中。
[0506] 基于我們的以上工作，我們已經建立了一系列的設計規則，以允許產生邏輯門控 的CAR(如圖32所示）。為產生"抗原A或抗原B"門控的CAR T細胞，必須產生抗A和抗B CAR，使 得(1)每一CAR具有僅允許抗原訪問和突觸形成的間隔區，使得CAR發揮功能，和(2)每一CAR 具有活化性內域;為了產生"抗原A和非B"門控的CAR T細胞，必須產生抗A和抗B CAR，使得 (1)這兩個CAR具有間隔區，所述間隔物不交叉配對，但會允許CAR在識別靶細胞上的兩個相 關抗原后共分離，（2)并且一個CAR具有活化性內域，而另一個CAR具有包含或募集弱磷酸酶 (例如PTPN6)的內域；（3)為了產生"抗原A和抗原B"門控的CAR T細胞，必須產生抗A和抗B CAR，使得（1)一個CAR具有與另一個CAR足夠不同的間隔區，使得在識別靶細胞上的兩個相 關抗原后，兩個CAR不會共分離，（2)-個CAR具有活化性內域，而另一個CAR具有由有力的磷 酸酶構成的內域(例如，CD45或CD148的內域）。實現期望的效應的正確的間隔區可以從一組 具有已知尺寸/形狀等的間隔區選擇，同時考慮靶抗原的尺寸/形狀等和靶抗原上相關表位 的位置。
[0507] SEQ ID No 41:
[0508] SFG·aCD19-CD8STK-CD28tmZ-2A-aGD2-HCH2CH3pvaa-dCD148
[0525] 實施例11:基于APRIL的CAR的設計和構建
[0526] 天然形式的APRIL是一種分泌性II型蛋白。將APRIL用作CAR的BCMA結合域需要將 這種II型分泌蛋白轉化成I型膜結合蛋白，并且對于這種蛋白質是穩定的，并在這種形式中 保留對BCMA的結合。為了產生候選分子，將APRIL的最終氨基末端刪除以除去與蛋白聚糖的 結合。接著，加入信號肽以將新生蛋白質引導至內質網，從而引導至細胞表面。此外，由于使 用的間隔區的性質可以改變CAR的功能，測試了三種不同的間隔區域:產生了基于APRIL的 CAR，其包含（i)經改變以除去Fc結合基序的人IgGl間隔區；（ii)⑶8莖;和（iii)僅IgGl鉸鏈 (草圖25中的圖和圖26中的氨基酸序列）。這些CAR在雙順反子逆轉錄病毒載體中表達（圖 27A)，使得標記蛋白一截短的⑶34可共表達為一種方便的標記基因。
[0527] 實施例12:基于APRIL的CAR的表達和功能
[0528] 本研究的目的是測試已經構建的基于APRIL的CAR是否在細胞表面上表達和APRIL 是否已經折疊以形成天然蛋白。用這些不同的CAR構建體轉導T細胞，并使用市售的抗APRIL mAb染色以及對標記基因染色，并通過流式細胞術分析。實驗結果顯示于圖27B，其中將 APRIL結合對標記基因熒光作圖。這些數據顯示，在這種形式中，基于APRIL的CAR是細胞表 面上表達，并且APRIL充分折疊從而通過抗APRIL mAb識別。
[0529] 接著，確定這種形式中的APRIL是否可識別BCMA和TACI。以與小鼠 IgG2a-Fc的融合 物產生了重組BCMA和TACI。將這些重組蛋白與經轉導的T細胞一起溫育。在此之后，洗滌細 胞并用抗小鼠熒光團綴合的抗體和檢測綴合到不同熒光團的標記基因的抗體對細胞染色。 通過流式細胞術分析細胞，結果在圖27C中呈現。不同的CAR能夠同時結合BCMA和TACI。出人 意料地，相比于TACI，CAR能夠更好地結合BCMA。此外，出人意料地，相比于具有Fc間隔區的 CAR，具有⑶8莖或IgGl鉸鏈間隔區的CAR能夠更好地結合BCMA和TACI。
[0530]實施例13:基于APRIL的嵌合抗原受體針對BCMA表達性細胞是有活性的
[0531] 用不同APRIL CAR轉導來自正常供體的T細胞，并且針對野生型或經工程化改造表 達BCMA和TACI的SupTl細胞進行測試。使用幾種不同的測定法來確定功能。進行了經典的鉻 釋放測定法。這里，用51Cr標記靶細胞（SupTl細胞）并以不同比例與效應物（經轉導的T細 胞)混合。靶細胞的裂解通過計數共培養物上清液中的51Cr確定(圖28A顯示了累積數據）。
[0532] 此外，通過ELISA測定了來自以1:1與SupTl細胞一起培養的T細胞的上清液中的γ 干擾素（圖28Β顯示出了累積數據）。也進行了與SupTl細胞共培養一周后的Τ細胞擴增的測 量（圖28C)。通過用計數珠校準的流式細胞術對T細胞計數。這些實驗數據顯示，基于APRIL 的CAR可以殺死表達BCMA的靶標。此外，這些數據顯示，基于CD8莖或IgGl鉸鏈的CAR比基于 Fc -p vaa的CAR表現得更好。
[0533 ]實施例14:和門在原代細胞中的功能分析
[0534] 從血液中分離PBMC，并使用PHA和IL-2刺激。兩天后，在Retronectin包被的板上用 含有CD19:CD33和門構建體的逆轉錄病毒轉導細胞。在第5天，通過流式細胞術評估了通過 和門構建體翻譯的兩種CAR的表達水平并且細胞消耗了CD56+的細胞(主要是NK細胞）。在第 6天，以1:2的效應物比靶細胞的比例使PBMC與靶細胞共培養。在第8天收集上清液并通過 ELISA分析IFN- γ的分泌（圖29)。
[0535] 這些數據證明和門在原代細胞中發揮功能。
[0536] 實施例15:測試具有延長的間隔區的和非門
[0537] 為了測試和非門是否可以在延長的間隔區長度上發揮功能，將激活性CAR(抗 CD19)和抑制性CAR(抗CD33)間隔區兩者取代為較長的間隔區。將人IgM和IgG的Fc區用于延 長間隔區的長度。IgM的Fc含有相比于IgG的額外的Ig域，由于此原因將IgM的間隔區放置在 已知具有膜近端結合表位的抗⑶19CAR上。相反，抗⑶33結合表位位于該分子的遠端末端， 因此在此CAR上使用在相對較短的IgG間隔區（參見圖30)。將延長間隔區的和非門構建體轉 導到小鼠的T細胞系中。然后將固定數量的經轉導的T細胞與可變數量的靶細胞共培養16-24小時，在此之后通過ELI SA測定在上清液中分泌的IL-2的量。
[0538]結果顯示于圖30中。具有IgG/IgM間隔區對的和非門運行良好。
[0539] 實施例16:測試和非門平臺的穩健性(r obus tne s s)
[0540] 為了測試和非門平臺的穩健性，用兩個其他的不相關的結合劑（抗GD2和抗 EGFRvIII)取代來自抑制性CAR(抗⑶33)的結合域。在具有截短SHP-1或LAIR胞質域的和非 門平臺中，將抗⑶2或抗EGFRvII I的scFv片段取代為抗⑶33。將這些構建體轉導到小鼠 T細 胞系中，并且將固定數量的T細胞與可變數量的靶細胞共培養。在共培養16-24小時后，通過 ELI SA分析在上清液中分泌的IL-2的量。
[0541 ] 結果顯示于圖31中。具有截短的SHP-1或LAIR胞質域的和非門與抗⑶19/抗⑶2結 合劑和抗⑶19/抗EGFRvII I結合劑一起運行良好。
[0542]將上述說明書中提及的所有出版物并入本文作為參考。對描述的本發明的方法和 系統的多種修改和變化在不背離本發明的范圍和精神的情況下對于本領域技術人員是顯 而易見的。盡管已經結合具體優選的實施方案描述了本發明，但應當理解，要求保護的本發 明不應當不適當地受限于這些具體實施方案。實際上，對描述的用于實施本發明的模式的 多種修改對于分子生物學，細胞生物學或相關領域的技術人員是顯而易見的，預期落在所 附權利要求書的范圍之內。
【主權項】
1. T細胞，其在細胞表面上共表達第一嵌合抗原受體(CAR)和第二CAR，每個CAR包含： (i) 抗原結合域； (ii) 間隔區； (iii) 跨膜域;和 (iv) 內域； 其中所述第一和第二CAR的抗原結合域結合不同抗原，并且其中所述第一或第二CAR之 一是包含激活性內域的激活性CAR，并且另一個CAR是包含連接開啟抑制性內域的抑制性 CAR〇2. 根據權利要求1的T細胞，其中所述第一和第二CAR的間隔區是足夠不同的，從而防止 交叉配對，但是是足夠相似的，以引起所述CAR在T細胞膜上共定位。3. 根據權利要求2的T細胞，其中所述第一和第二CAR的間隔區是直系同源的。4. 根據權利要求1的T細胞，其中所述第一和第二CAR的間隔區是足夠不同的，從而防止 交叉配對，但是是足夠相似的，從而引起所述第一和第二CAR在連接后共定位。5. 根據權利要求4的T細胞，其中所述第一 CAR或第二CAR之一是包含激活性內域的激活 性CAR，并且另一個CAR是包含連接開啟抑制性內域的抑制性CAR，其在不存在抑制性CAR連 接的情況下不顯著抑制通過所述激活性CAR的T-細胞活化，但是當連接所述抑制性CAR時抑 制通過所述激活性CAR的T-細胞活化。6. 根據權利要求5的T細胞，其中所述連接開啟抑制性內域包含磷酸酶的至少一部分。7. 根據權利要求6的T細胞，其中所述連接開啟抑制性內域包含PTPN6的全部或部分。8. 根據權利要求5的T細胞，其中所述連接開啟抑制性內域包含至少一種Ι??Μ域。9. 根據權利要求8的T細胞，其中所述連接開啟抑制性內域的活性通過PTPN6-CD45或-⑶148融合蛋白的共表達而增強。10. 根據權利要求5-9中任一項的T細胞，其中所述包含激活性內域的CAR包含結合CD33 的抗原結合域，并且包含所述連接開啟抑制性內域的CAR包含結合CD34的抗原結合域。 11. T細胞，其包含超過兩種如前述權利要求中定義的CAR，使得它被具有超過兩種抗原 的獨特模式的細胞，如T細胞特異性刺激。12. 核酸序列，其編碼如權利要求1-11中任一項所定義的第一和第二嵌合抗原受體 (CAR)〇13. 根據權利要求12的核酸序列，其具有以下結構： AgBl-間隔區 l-TMl-endol-coexpr_AgB2-間隔區 2-TM2_endo2 其中， AgBl是編碼所述第一 CAR的抗原結合域的核酸序列； 間隔區1是編碼所述第一CAR的間隔區的核酸序列； TM1是編碼所述第一 CAR的跨膜域的核酸序列； endo 1是編碼所述第一 CAR的內域的核酸序列； coexpr是使兩個CAR能夠共表達的核酸序列； AgB2是編碼所述第二CAR的抗原結合域的核酸序列； 間隔區2是編碼所述第二CAR的間隔區的核酸序列； TM2是編碼所述第二CAR的跨膜域的核酸序列； endo2是編碼所述第二CAR的內域的核酸序列； 其中當在T細胞中表達時，核酸序列編碼多肽，所述多肽在切割位點處被切割，使得所 述第一和第二CAR共表達在T細胞的表面上。14. 根據權利要求13的核酸序列，其中所述coexpr編碼包含自我切割肽的序列。15. 根據權利要求13或14的核酸序列，其中備選密碼子用于編碼相同或相似的氨基酸 序列的序列區中，以避免同源重組。16. 試劑盒，其包含 (i) 第一核酸序列，其編碼權利要求1-11中任一項所定義的第一嵌合抗原受體(CAR)， 所述核酸序列具有以下結構： AgB 1 -間隔區 1-TM1 -endo 1 其中， AgBl是編碼所述第一 CAR的抗原結合域的核酸序列； 間隔區1是編碼所述第一CAR的間隔區的核酸序列； TM1是編碼所述第一 CAR的跨膜域的核酸序列； endo 1是編碼所述第一 CAR的內域的核酸序列;和 (ii) 第二核酸序列，其編碼權利要求1-11中任一項所定義的第二嵌合抗原受體(CAR)， 所述核酸序列具有以下結構： AgB2-間隔區 2-TM2-endo2 其中， AgB2是編碼所述第二CAR的抗原結合域的核酸序列； 間隔區2是編碼所述第二CAR的間隔區的核酸序列； TM2是編碼所述第二CAR的跨膜域的核酸序列； endo 2是編碼所述第二CAR的內域的核酸序列。17. 試劑盒，其包含：第一載體，其包含如權利要求16定義的第一核酸序列；和第二載 體，其包含如權利要求16定義的第一核酸序列。18. 根據權利要求17的試劑盒，其中所述載體是整合型病毒載體或轉座子。19. 載體，其包含根據權利要求12-15中任一項所定義的核酸序列。20. 根據權利要求19的逆轉錄病毒載體或慢病毒載體或轉座子。21. 制備根據權利要求1 -11中任一項的T細胞的方法，其包括將根據權利要求12-15中 任一項的核酸序列；如權利要求16中定義的第一核酸序列和第二核酸序列;和/或如權利要 求17中定義的第一載體和第二載體或根據權利要求19或20的載體導入T細胞的步驟。22. 根據權利要求21的方法，其中所述T細胞來自從受試者分離的樣品。23. 藥物組合物，其包含根據權利要求1-11中任一項的多種T細胞。24. 用于治療和/或預防疾病的方法，其包括將根據權利要求23的藥物組合物施用于受 試者的步驟。25. 根據權利要求24的方法，其包括以下步驟： (i) 從受試者分離包含T細胞的樣品。 (ii) 用根據權利要求12-15中任一項的核酸序列；如權利要求16中定義的第一核酸序 列和第二核酸序列；如權利要求17或18中定義的第一載體和第二載體或根據權利要求19或 20的載體轉導或轉染所述T細胞;并 (iii)將來自（ii)的Τ細胞施用于所述受試者。26. 根據權利要求24或25的方法，其中所述疾病是癌癥。27. 根據權利要求23的藥物組合物，其用于治療和/或預防疾病。28. 根據權利要求1-11中任一項的T細胞在制備用于治療和/或預防疾病的藥物中的用 途。29. 天然殺傷(NK)細胞，其在細胞表面上共表達第一嵌合抗原受體(CAR)和第二CAR，每 個CAR包含： (i) 抗原結合域； (ii) 間隔區； (iii) 跨膜域;和 (iv) 內域 其中所述第一和第二CAR的抗原結合域結合不同抗原，并且其中所述第一或第二CAR之 一是包含激活性內域的激活性CAR，并且另一個CAR是包含連接開啟抑制性內域的抑制性 CAR〇30. 包含根據權利要求1的CAR表達性T細胞和/或根據權利要求29的CAR表達性NK細胞 的細胞組合物，其通過用編碼所述第一和第二CAR的核酸轉導離體血液樣品制備。
【文檔編號】C07K14/705GK105848673SQ201480063899
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2014年11月21日
【發明人】M.普利, K.孔, S.科多巴
【申請人】Ucl商務股份有限公司