用于血友病的預防性治療的包含因子ix的融合蛋白及其方法

文檔序號(hao)：10493439閱(yue)讀：594來(lai)源(yuan)：國知局

用于血友病的預防性治療的包含因子ix的融合蛋白及其方法
【專利摘要】本發明涉及利用長效因子IX(FIX)的預防性給藥方案，給藥間隔為1周或更長時間，包括(但不限于)10天或更長時間，比如兩周、三周或甚至每月。
【專利說明】
用于血友病的預防性治療的包含因子IX的融合蛋白及其方法
[0001 ] 優先權內容
[0002] 本申請要求對于在2013年12月23日提交的標題為"用于血友病的預防性治療的包含因子IX的融合蛋白及其方法"的美國臨時專利申請第US61 /919884號的優先權，該臨時專利申請的全部內容通過引用并入本文。
技術領域
[0003] 本申請涉及利用長效因子IX(FIX)的預防性給藥方案，該方案以1周或更長時間為給藥間隔，包括(但不限于）1〇天或更長時間，比如兩周、三周或甚至每月。
【背景技術】
[0004] 血友病B是X連鎖的隱性遺傳性出血疾病，由對血液凝固過程重要的凝固因子IX (FIX)缺陷所導致。血友病B的體征和癥狀是不定的，取決于FIX缺陷的嚴重度和出血的位置。大多數情況下，出血特征為關節、肌肉和軟組織中自發的或創傷誘導的出血。同一位置的反復出血可導致關節的永久性損傷。罕見但危及生命的出血還可發生于中樞神經系統、咽喉或胃腸道。
[0005] 治療血友病B的目標是治療或預防出血，從而減少失能的關節和組織損傷，并提尚生活質量(Q〇L)。用FIX進行的補償療法提供了因子缺陷的暫時矯正并降低了出血傾向。目前，血漿來源的和重組的FIX產物用于血友病B的預防性治療和按需治療。然而，血漿來源的產物與傳染性病毒諸如人類免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒傳播相關風險相關聯。血漿來源的和重組的FIX產物具有短的半衰期，且因此，需要每周給藥2-3次以獲得出血事件的顯著降低。此外，可能需要重復給藥以控制施用后相對短的無出血期的出血事件。對于血漿來源的或重組的FIX產物的頻繁靜脈內（IV)注射的需要給患者和治療疾病的醫師帶來了大量負擔。該方案在年幼兒童中通常(并不全是）需要插入靜脈介入裝置，該裝置必須保持極為清潔以避免傳染性并發癥和預防管線中凝固的發生。與該裝置相關聯的風險和發病率可能阻止患有血友病的一些非常年幼的兒童接受適當的護理。具有延長的半衰期和較好的回收率的FIX產物可使患者獲得適當的止血，并具有更少的感染。
[0006] 已生成了聚乙二醇化形式的FIX，在迷你豬和狗中其顯示了長5-7倍的FIX的半衰期（0Stergaard,H，等人，2011.Blood. 118(8): 2333-2341)。在患者中觀察到相似的結果 (Negrier C等人.Blood.2011Sep8;118(10):2695-701)。
[0007] 在大鼠、兔和FIX-缺陷的小鼠中已證明了包含重組FIX和白蛋白（r IX-FP)的融合蛋白與目前市售的重組FIX產物(例如，rFIX)的公布的結果相比較具有改善的PK參數（即，提高的回收、終末半衰期和濃度時間曲線下面積[AUC]) (Metzner HJ，等人，2009. Thromb 他6111〇8丨.102:634-644)。人類中的研究顯示，與先前的？1乂產物相比較，用^乂4?進行的每周預防降低了FIX消耗，具有更少的輸注（Martinowitz等人，ISTH, Amsterdam, The Netherlands ,6月29 日-7月4 日，2013 摘要）。
[0008] 包含FIX的該融合蛋白的另一實例是rFIX-Fc。在W02012/006624中，描述了包含 FIX的治療性嵌合多肽，其可與FcRn結合配偶體諸如Fc或白蛋白融合。rFIX-Fc在體內顯示了增大的半衰期。該文獻建議用于預防性治療以每周20IU/kg、每10天40IU/kg或每兩周 120IU/kg來施用rFIXFcluk等人（Luk A,等人，2011 .Haemophilia. 17:352-380)還描述了與：BenenxK (即，rFIX)相比較，rFIX-Fc顯示了半衰期以及其他PK參數的增大。最近公布了rFIX-Fc的3期研究，其顯示了當以50IU/kg起始以每周為間隔，或以10天為給藥間隔以 100IU/kg起始進行施用時，患有血友病B的患者中具有低的年度化出血率(Powell JS，等人，Dec 12,2013.NEJM.369:2313-23)〇
[0009] 本申請提供了利用長效因子IX的預防性給藥方案，該方案以1周或更長時間為給藥間隔，比如10天或更長時間。根據本文所描述的發明，可獲得比先前設想的更長時間的預防性給藥，比如兩周、三周或甚至每月。
[0010] 在一個優選的實施方案中，本發明提供了包含Fix和HLEP的融合蛋白的預防性給藥方案，其中因子IX(FIX)部分經由可裂解的肽接頭連接于半衰期增強多肽(HLEPhHLEP (例如，白蛋白）增大了 FIX的半衰期，但沒有可裂解接頭時，FIX通常具有降低的活性或低活性。這樣的接頭的裂解將多肽從任何由HLEP導致的活性受損的位阻中釋放，從而允許生成保留了FIX的高摩爾比活性的融合蛋白。這樣的融合蛋白與其未裂解的對應物相比較表現出增高的半衰期和摩爾比活性。優選地，通過參與了凝固的蛋白來進行裂解。這使得未激活的FIX在出血事件發生之前具有增高的半衰期，以及FIX的同時激活和從HLEP(例如，白蛋白）的切割。激活的FIX從其與HLEP的融合中釋放，由于失去HLEP (例如，白蛋白）而具有高活性且從血液中快速清除。該快速清除率是需要的，因為延長時間的激活的FIX可能導致血栓并發癥。
[0011] 現有技術描述了包含具有非裂解接頭的FIX和白蛋白的融合蛋白。例如，W001/ 79271描述了大量不同的治療性多肽的融合多肽，當其與人類血清白蛋白融合時，預期其具有在體內增高的功能性半衰期和延長的壽命。所述作為實例的治療性多肽的列舉中包含因子IX。還描述了 FIX的融合物，其中在白蛋白和FIX之間存在肽接頭，但未明確該接頭是可裂解的。Sheffield等人（Sheffield W.P.等人（2004)，Br.J.Haematol. 126:565-573)公開了鼠類因子IX白蛋白融合蛋白，由鼠類FIX、8個氨基酸的接頭(GPG4TM)、鼠類白蛋白和22個氨基酸的肽標簽組成，還公開了人類因子IX白蛋白融合蛋白，由人類因子IX、7個氨基酸的接頭(G 6V)和人類白蛋白組成。Sheffield沒有使用或提示在FIX和白蛋白之間使用可裂解接頭。這些融合蛋白允許激活FIX，但由于白蛋白的存在，其具有低活性。
[0012] 一旦在凝固過程中通過酶原（如FIX)的蛋白水解裂解或通過現有的蛋白水解"預" 激活因子與第二多肽的接觸(如FVIIa與組織因子結合)而激活凝固因子，將不再需要維持現已激活的凝固因子的長半衰期，因為這可能導致血栓并發癥，若激活的因子具有增高的半衰期則甚至更為相關。因此本發明的目的之一是提供適宜于預防性治療的長壽命的FIX，所述治療具有1周或更長，甚至長至兩周、三周和甚至每月的治療周期。
[0013] 現有技術中描述的凝固因子與半衰期增強多肽的融合通常受到融合的凝固因子的降低的摩爾比活性的限制。本發明的另一方面是提供具有增大的半衰期的凝固因子，其與不具有可裂解接頭的相應治療性融合蛋白相比較顯示了增高的摩爾比活性。
[0014] US2008/0260755描述的融合蛋白包含凝固因子諸如FIX和半衰期增強多肽，它們由可裂解肽接頭連接，可被參與凝固的蛋白酶裂解。這些融合蛋白具有增高的半衰期和摩爾比活性。該申請以其整體通過引用并入本文。
[0015] 本發明的融合蛋白的一個實例是包含FIX和白蛋白的融合蛋白，其中可裂解接頭可被參與凝固的蛋白酶裂解。在本發明的意義中，凝固相關模式的蛋白水解裂解是作為至少一個凝固因子或凝固輔因子的激活的結果發生的任何蛋白水解裂解。凝固因子的激活與接頭肽的蛋白水解裂解幾乎是并行的。激活可能，例如，通過凝固因子的蛋白水解裂解或通過與輔因子的結合而發生。這導致了激活后具有長半衰期和高活性的FIX的激活(參見圖 1)。白蛋白增加了出血事件發生之前血液中FIX的半衰期，出血事件同時激活FIX并將其從白蛋白裂解，從而裂解的FIX由于失去白蛋白而具有高活性并能從血液中快速清除。
[0016] rIX-FP(rFIX-白蛋白融合蛋白）具有SEQ ID N0:1中所示的序列（參見圖2)，顯示了改良的PK參數。特別是，與rFix (例如，Benef丨X?)相比較，其具有血衆中延長的循環，如由長5.3倍的半衰期（t1/2)、低7倍的CL和高7倍的AUC(Santag 0Stin0E，等人 ? Blood. 2012Sep20; 120(12) :2405-11)所顯示的。這驚人地允許血友病的預防性治療具有比現有技術中關于rFIX所建議的顯著更長的給藥間隔。
[0017] 本發明的技術優點是融合蛋白（例如，rFIX-FP)具有比其他已知的FIX產物更長的半衰期和30%以上的增量回收。融合蛋白的更高的增量回收意味著基于標準的給藥公式，施用較少的劑量(即，較少的蛋白）而獲得需要的FIX活性水平：
[0019]因此，由于施用更少的宿主細胞蛋白，除了注射部位的局部反應的較低風險之外，融合蛋白（例如，rIX-FP)較不可能為免疫原性的。由于使用較少的產物(IU/kg每劑量和IU/ kg每周），更長的半衰期、較低的清除率、較大的AUC(增強的暴露)和增高的增量回收使患者受益，并且，需要不那么頻繁的施用以在患者中獲得相同的FIX峰和谷活性水平。

【發明內容】

[0020] 本發明涉及用于在受試者中預防出血的方法中的融合蛋白，其包含：
[0021] a)因子 IX(FIX)部分，和 [0022] b)半衰期增強多肽(HLEP)
[0023]其中將融合蛋白以約25_75IU/kg的劑量施用于受試者，給藥間隔為約每周一次。在一個優選的實施方案中，劑量是約35-75IU/kg。在另一個更優選的實施方案中，劑量是約 35-55IU/kg。在另一個更優選的實施方案中，劑量是約35-50IU/kg。在另一個更優選的實施方案中，劑量是約25-50IU/kg。在另一個優選的實施方案中，劑量是約30-40IU/kg。在一個優選的實施方案中，劑量是約50IU/kg。在另一個優選的實施方案中，劑量是約45IU/kg。在另一個非常優選的實施方案中，劑量是約40IU/kg。在另一個非常優選的實施方案中，每周劑量是約35IU/kg。在另一個非常優選的實施方案中，每周劑量是約25IU/kg。在最優選的實施方案中，每周劑量是約25-40 IU/kg。
[0024] 在這些實施方案的任何一個中，給藥間隔可以為約每6-8天一次，優選約每7天一次。在這些實施方案的任何一個中，HLEP可以是非Fc的HLEP。在這些實施方案的任何一個中，HLEP優選地為白蛋白。在優選的實施方案中，FIX的血漿水平維持在至少約1 %的低谷，優選至少約2%，優選至少約3%，優選至少約4%或優選至少約5%，高于整個給藥間隔的基線，且更優選在4%和15%之間，或甚至更優選在5%和15%之間，高于整個給藥間隔的基線。
[0025] 本發明還涉及用于在受試者中預防出血的方法中的融合蛋白，其包含：
[0026] a)因子 IX(FIX)部分，和 [0027] b)半衰期增強多肽(HLEP)
[0028] 其中將融合蛋白以約50_95IU/kg的劑量施用于受試者，給藥間隔為約每8-11天一次。在一個優選的實施方案中，劑量是約50-75IU/kg。在該優選的實施方案中，劑量可以為約75IU/kg。在該優選的實施方案中，劑量可以為約50IU/kg。優選地，給藥間隔為約每10天一次。在另一個優選的實施方案中，劑量是每月三次。
[0029] 本發明還涉及用于在受試者中預防出血的方法中的融合蛋白，其包含：
[0030] a)因子 IX(FIX)部分，和 [0031] b)半衰期增強多肽(HLEP)
[0032] 其中將融合蛋白以約50_95IU/kg的劑量施用于受試者，給藥間隔為約每兩周一次。在一個優選的實施方案中，劑量是約65-85IU/kg。在另一個優選的實施方案中，劑量是約60-80IU/kg。在另一個更優選的實施方案中，劑量是約70-80IU/kg。在最優選的實施方案中，劑量是約50_75IU/kg。在該優選的實施方案中，劑量可以為約75IU/kg或劑量可以為約 50IU/kg。在這些實施方案的任何一個中，給藥間隔可以為約每12-16天一次，優選為約每 13-15天一次，更優選地為約每14天一次。
[0033] 本發明還涉及用于在受試者中預防出血的方法中的融合蛋白，其包含：
[0034] a)因子 IX(FIX)部分，和 [0035] b)半衰期增強多肽(HLEP)
[0036]其中將融合蛋白以約90_250IU/kg的劑量施用于受試者，給藥間隔為約每三周或更長時間一次。在一個優選的實施方案中，劑量是約90-150IU/kg。在另一個優選的實施方案中，劑量是約95-110IU/kg。在另一個優選的實施方案中，劑量是約95-105IU/kg。在一個更優選的實施方案中，劑量是約l〇〇IU/kg。在這些實施方案的任何一個中，給藥間隔可以為約每19-23天一次，優選約每20-22天一次，更優選地約每21天一次。可選地，給藥間隔可以為約每月一次。在一個優選的實施方案中，劑量是約140-200IU/kg，且給藥間隔是約每月一次。在一個更優選的實施方案中，劑量是約140-160IU/kg，且給藥間隔是約每月一次。在一個非常優選的實施方案中，劑量是約150IU/kg，且給藥間隔是約每月一次。在這些實施方案的任何一個中，給藥間隔可以為約每28天一次。
[0037]在本發明的實施方案的任何一個中，半衰期增強多肽(HLEP)可以是白蛋白（FP)或不具有抗原結合結構域(例如，Fc)的免疫球蛋白。在一個優選的實施方案中，半衰期增強多肽(HLEP)是白蛋白（FP)。在一個特定的實施方案中，HLEP不是Fc。
[0038]在一個優選的實施方案中，融合蛋白的因子IX(FIX)部分經由肽接頭與半衰期增強多肽(HLEP)連接。在另一個非常優選的實施方案中，肽接頭是可裂解的。在一個甚至更優選的實施方案中，肽接頭可被參與凝固的蛋白酶或由凝固酶激活的蛋白酶裂解。一旦凝固級聯反應激活，參與凝固的蛋白酶被激活，該反應最終導致從纖維蛋白原生成纖維蛋白。
[0039] 在本發明的最優選的實施方案中，接頭可通過激活凝固因子的蛋白酶裂解，從而保證接頭的裂解與發生凝固的位點處凝固因子的激活相關聯。根據本發明，其他優選的融合蛋白是那些融合蛋白：一旦凝固因子被激活，接頭可通過凝固因子而裂解，凝固因子是融合蛋白的一部分，因此還確保了融合蛋白的裂解與凝血事件相關聯。根據本發明，其他優選的融合蛋白是那些融合蛋白：其中接頭可通過蛋白酶裂解，所述蛋白酶自身通過作為融合蛋白的一部分的凝固因子的活性直接或間接被激活，因此還確保了融合蛋白的裂解與凝血事件相關聯。
[0040] 在一個優選的實施方案中，接頭可通過FIXa裂解和/或通過FVIIa/組織因子(TF) 裂解。
[0041 ]在一個特別優選的實施方案中，接頭包括選自SEQ ID N0: 2和SEQ ID N0: 3的序列。
[0043] 在一個可選的實施方案中，接頭與SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3是90%相同的。在另一個實施方案中，接頭與SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3是80%相同的。在另一個實施方案中，接頭與SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3是70%相同的。在另一個實施方案中，接頭與SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3是60%相同的。在一個另外的實施方案中，接頭與SEQ ID N0:2和SEQ ID NO :3是50 %相同的。
[0044] 優選地，本發明的融合蛋白具有SEQ ID NO: 1所示的序列（參見圖2)。可選地，融合蛋白的序列與SEQ ID NO: 1中所示的序列具有至少70%同一性。融合蛋白的序列與SEQ ID N0:1中所示的序列具有至少75%同一性。融合蛋白的序列與SEQ ID N0:1中所示的序列具有至少80%同一性。融合蛋白的序列與SEQ ID NO: 1中所示的序列具有至少85%同一性。融合蛋白的序列與SEQ ID NO: 1中所示的序列具有至少90%同一性。融合蛋白的序列與SEQ ID NO: 1中所示的序列具有至少95%同一性。融合蛋白的序列與SEQ ID NO: 1中所示的序列具有至少98%同一性。融合蛋白的序列與SEQ ID N0:1中所示的序列具有至少99%同一性。
[0045] 對于本發明的任何實施方案，FIX的血漿水平維持在至少約1 %的低谷，高于整個給藥間隔的基線。優選地，FIX的血漿水平維持在至少約2-5%的低谷，高于整個給藥間隔的基線，和更優選至少約2%、3%、4%或5%，高于整個給藥間隔的基線。在其他更優選的實施方案中，FIX的血漿水平維持在4 %和15 %之間或5 %和15 %之間，高于整個給藥間隔的基線。
[0046] 為本發明的目的，待施用融合蛋白的優選的受試者是人。特別優選的是罹患血友病B的人。
[0047] 本發明的融合蛋白可用于包含預防性給藥方案的治療。在一個特別優選的實施方案中，劑量是靜脈內施用的。
[0048] 本發明還包括將因子IX(FIX)施用于需要其的受試者的方法，所述方法包括向受試者施用約25_75IU/kg的劑量的融合蛋白，所述融合蛋白包含：
[0049] a)因子 IX(FIX)部分，和
[0050] b)半衰期增強多肽(HLEP)
[0051] 給藥間隔為每周或更長時間一次。在一個優選的實施方案中，劑量是約35-75IU/ kg。在另一個更優選的實施方案中，劑量是約35-55IU/kg。在另一個更優選的實施方案中，劑量是約35-50IU/kg。在另一個更優選的實施方案中，劑量是約25-50IU/kg。在另一個優選的實施方案中，劑量是約30_40IU/kg。在一個優選的實施方案中，劑量是約50IU/kg。在另一個優選的實施方案中，劑量是約45IU/kg。在另一個非常優選的實施方案中，劑量是約40IU/ kg。在另一個非常優選的實施方案中，每周劑量是約35IU/kg。在另一個非常優選的實施方案中，每周劑量是約25IU/kg。在最優選的實施方案中，每周劑量是約25-40IU/kg。在這些實施方案的任何一個中，給藥間隔可以為約每6-8天一次，優選約每7天一次。在這些實施方案的任何一個中，HLEP可以是非Fc的HLEP。在這些實施方案的任何一個中，HLEP優選地為白蛋白。
[0052]在優選的實施方案中，FIX的血漿水平維持在至少約1%的低谷，優選至少約2-5%，高于整個給藥間隔的基線，和更優選至少約2%、3%、4%或5%，高于整個給藥間隔的基線。在其他更優選的實施方案中，FIX的血漿水平維持在4%和15%之間或5%和15%之間，高于整個給藥間隔的基線。
[0053]本發明還涉及將因子IX(FIX)施用給需要其的受試者的方法，所述方法包括向受試者施用約50-95IU/kg的劑量的融合蛋白，所述融合蛋白包括：
[0054] a)因子 IX(FIX)部分，和
[0055] b)半衰期增強多肽(HLEP)
[0056] 給藥間隔為約每8-11天一次。在一個優選的實施方案中，劑量是約50-75IU/kg。在該更優選的實施方案中，劑量是約75IU/kg或可選地，在該優選的實施方案中，劑量可以是 50IU/kg。優選地，給藥間隔為約每10天一次。在另一個優選的實施方案中，劑量是每月三次。
[0057] 本發明的另一實施方案涉及將因子IX(FIX)施用于需要其的受試者的方法，所述方法包括向受試者施用約50-95IU/kg的劑量的融合蛋白，所述融合蛋白包括：
[0058] a)因子 IX(FIX)部分，和
[0059] b)半衰期增強多肽(HLEP)
[0060] 給藥間隔為每兩周或更長時間一次。在一個優選的實施方案中，劑量是約50-75IU/kg。在另一個優選的實施方案中，劑量是約65-85IU/kg。在又一個另外的優選的實施方案中，劑量是約60_80IU/kg。在另一個更優選的實施方案中，劑量是約70-80IU/kg。在最優選的實施方案中，劑量是約50_75IU/kg。在該最優選的實施方案中，劑量可以為約50IU/ kg，或在最優選的實施方案中，劑量是約75IU/kg。在這些實施方案的任何一個中，給藥間隔可以為約每12-16天一次，優選約每13-15天一次，更優選地約每14天一次。
[0061] 本發明還包括將因子IX(FIX)施用于需要其的受試者的方法，所述方法包括向受試者施用約90-250IU/kg的劑量的融合蛋白，所述融合蛋白包括：
[0062] a)因子 IX(FIX)部分，和 [0063] b)半衰期增強多肽(HLEP)
[0064]給藥間隔為每三周或更長時間一次。在一個優選的實施方案中，劑量是約90-150IU/kg。在另一個優選的實施方案中，劑量是約95-110IU/kg。在另一個優選的實施方案中，劑量是約95-105IU/kg。在最優選的實施方案中，劑量是約100IU/kg。在這些實施方案的任何一個中，給藥間隔可以為約每19-23天一次，優選約每20-22天一次，更優選地約每21天一次。可選地，給藥間隔可以為約每月一次。在一個優選的實施方案中，劑量是約140-200IU/kg，且給藥間隔是約每月一次。在一個更優選的實施方案中，劑量是約140-160IU/ kg，且給藥間隔是約每月一次。在一個非常優選的實施方案中，劑量是約150IU/kg，且給藥間隔是約每月一次。在這些實施方案的任何一個中，給藥間隔可以為約每28天一次。
[0065]在以上任何的實施方案中，FIX的血漿水平維持在至少約1 %的低谷，優選至少約 2-5 %，更優選2-4%，高于整個給藥間隔的基線，和甚至更優選至少約2%、3%、4%或5%，高于整個給藥間隔的基線。在其他優選的實施方案中，FIX的血漿水平維持在5%和15%之間，高于整個給藥間隔的基線。在最優選的實施方案中，FIX的血漿水平維持在至少4%的低谷，高于整個給藥間隔的基線，持續多達21天。例如，在血友病患者中使用100IU/kg預防性給藥方案，在用本發明的優選的融合蛋白（rIX-FP)注射后21天顯示了高于基線的FIX活性 (參見表2,圖8和9)。
[0066]在本發明的任何方法中，半衰期增強多肽(HLEP)可以是白蛋白（FP)或不具有抗原結合結構域的免疫球蛋白（例如，Fc)。在一個優選的實施方案中，半衰期增強多肽(HLEP)是白蛋白（FP)。在一個特定的實施方案中，HLEP不是Fc。
[0067] 在一個非常優選的實施方案中，融合蛋白的因子IX(FIX)部分經由肽接頭與半衰期增強多肽(HLEP)連接。在另一個非常優選的實施方案中，肽接頭是可裂解的。在一個甚至更優選的實施方案中，肽接頭可被參與凝固的蛋白酶或由凝固酶激活的蛋白酶裂解。一旦凝固級聯反應激活，參與凝固的蛋白酶被激活，該反應最終導致從纖維蛋白原生成纖維蛋白。
[0068] 在本發明的最優選的實施方案中，接頭可通過激活凝固因子的蛋白酶裂解，從而保證接頭的裂解與發生凝固的位點處凝固因子的激活相關聯。根據本發明，其他優選的融合蛋白是那些融合蛋白：一旦凝固因子被激活，接頭可通過凝固因子而裂解，凝固因子是融合蛋白的一部分，因此還確保了融合蛋白的裂解與凝血事件相關聯。根據本發明，其他優選的融合蛋白是那些融合蛋白：其中接頭可通過蛋白酶裂解，所述蛋白酶自身通過作為融合蛋白的一部分的凝固因子的活性直接或間接被激活，因此還確保了融合蛋白的裂解與凝血事件相關聯。
[0069] 在一個優選的實施方案中，接頭可通過FIXa裂解和/或通過FVIIa/組織因子(TF) 裂解。
[0070] 在本發明的特別優選的方法中，接頭包括選自SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3的序列。
[0072] 在一個可選的實施方案中，接頭與SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3是90%相同的。在另一個實施方案中，接頭與SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3是80%相同的。在另一個實施方案中，接頭與SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3是70%相同的。在另一個實施方案中，接頭與SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3是60%相同的。在一個另外的實施方案中，接頭與SEQ ID N0:2和SEQ ID NO:3是50%相同的。
[0073]優選地，本發明的方法施用具有SEQ ID NO: 1中所示的序列的融合蛋白（參見圖 2)。可選地，融合蛋白的序列與SEQ ID N0:1中所示的序列具有至少70%的同一性。融合蛋白的序列與SEQ ID NO: 1中所示的序列具有至少75%的同一性。融合蛋白的序列與SEQ ID NO: 1中所示的序列具有至少80%的同一性。融合蛋白的序列與SEQ ID NO: 1中所示的序列具有至少85%的同一性。融合蛋白的序列與SEQ ID NO: 1中所示的序列具有至少90%的同一性。融合蛋白的序列與SEQ ID NO: 1中所示的序列具有至少95%的同一性。融合蛋白的序列與SEQ ID NO: 1中所示的序列具有至少98%的同一性。融合蛋白的序列與SEQ ID NO: 1中所示的序列具有至少99%的同一性。
[0074] 對于本發明的任何方法，FIX的血漿水平維持在高于整個給藥方案的基線的至少約1 %的低谷。優選地，FIX的血漿水平維持在高于整個給藥方案的基線的至少約1 %的低谷。
[0075] 對于本發明的方法，優選的受試者是人。特別優選的是罹患血友病B的人。
[0076] 本發明的方法可用于包含預防性給藥方案的治療。在本發明的一個特別優選的方法中，劑量是靜脈內施用的。
[0077] 對于本發明的任何實施方案，所提供的用于施用的融合蛋白濃度為約100至 400IU/ml，優選地為約100、200或400IU/ml。所提供的用于施用的融合蛋白濃度還可以為 600IU/ml或1200IU/ml。
[0078] 發明詳述
[0079] 如本文所用的"預防性治療"意為一段時間內將因子IX融合蛋白以多劑量施用于受試者以提高受試者血漿中因子IX活性的水平。優選地，增高的水平足以降低自發性出血的發生率或足以預防無法預料的傷害事件中的出血。預防性治療降低或預防出血事件，例如，關于按需治療所描述的那些。預防性治療可以是固定的或可以是個性化的，如"給藥間隔"下所討論的，例如，以補償患者間差異性。
[0080] 如本文所用的，"給藥間隔"意為施用于受試者的多劑量之間經過的時間量。本發明利用嵌合的FIX-HLEP諸如FIX-FP的方法中的給藥間隔，可以比等量的（以IU/kg為單位）不具有HLEP諸如白蛋白的所述因子IX(即，由所述FIX組成的多肽)所需的給藥間隔長至少約1.5倍到8倍。當施用諸如本發明的因子IX-HLEP融合蛋白時，給藥間隔可以比等量的不具有HLEP諸如白蛋白的所述因子IX所需的給藥間隔長1.5倍到8倍。給藥間隔可以比等量的不具有諸如白蛋白的所述因子IX(即，由所述因子IX組成的多肽)所需的給藥間隔長至少約 1.5倍到8倍。
[0081] 如本文所用的，"半數劑量"意為研究受試者中一半所用的高于該劑量，和研究受試者中一半所用的低于該劑量。"平均劑量"意為平均的劑量(通過將全部劑量加和并除以劑量的總數目而計算出）。對于給定的劑量，"約"意為該所示劑量加上或減去1 %、2%、5%、 10%、15%或20%所示的劑量。對于約每6-8天一次或約每7天一次的給藥間隔，"約"意為加上或減去12小時。對于約每8-11天一次或約每10天一次的給藥間隔，"約"意為加上或減去 18小時。對于約每月三次、約每兩周一次、約每13-15天一次或約每14天一次或約每月兩次的給藥間隔，"約"意為加上或減去1天。對于約每三周或更長時間一次、約每20-22天一次、約每21天一次或約每月一次的給藥間隔，"約"意為加上或減去2天。
[0082] "維持FIX的血漿水平在至少約某百分比的低谷"意為，在需要FIX的患者的某個給藥方案過程中，血漿中的FIX生物活性將不會落到所述百分比水平以下，其中所述FIX的 100%生物活性對應于lU/ml，這是正常人類血漿中的FIX活性濃度，和其中FIX生物活性優選地利用如實施例中所描述的經驗證的一步凝集法來確定。
[0083] "低谷"是在需要FIX的患者的治療過程中貫穿給藥方案所述FIX生物活性的最低水平。由于患者間差異性，低谷水平通常指中值，其意為研究受試者的一半具有較高的低谷水平和研究受試者的一半具有較低的低谷水平，參見，例如，圖7和12。雖然利用中值是較普遍的，來自PK數據的低谷水平還可作為平均值來計算，其通過將全部患者的值相加和然后除以患者數目來確定，參見，例如，表8。
[0084] "基線"意為給定患者中的FIX活性水平，優選表示為健康人中FIX活性的IU/dL 或％，所述健康人中FIX活性定義為100IU/dL或100%。在嚴重的血友病B中，給定患者的基線水平極低至零或幾乎為零，而在輕度的血友病中，患者的基線可以更高，比如高于健康人中FIX活性濃度的1 %、2%或3%或4%或5%。當施用根據本發明的包括i)因子IX(FIX)部分和ii)半衰期增強多肽(HLEP)的融合蛋白時，首先FIX活性濃度急劇增高且緩慢清除，即，其回到個體基線水平。尤其在嚴重的血友病B中，需要小心以使FIX活性濃度不會落到極低的水平以下以防止出血。該極低的水平稱作低谷水平。在嚴重的血友病B患者中，當基線實際上為零時，高于基線的1 %的低谷水平意為健康人中的FIX活性濃度的約1 %的FIX活性濃度。在具有健康人中FIX活性濃度的3%FIX活性的基線水平的輕度的血友病B患者中，高于基線的1 %的低谷水平意為健康人中FIX活性濃度的約4%的FIX活性濃度。
[0085] 在本發明中，給藥間隔可以為約每周一次、約每6-8天一次、約每7天一次、約每8-11天一次、約每10天一次、約每月三次、約每兩周一次、約每13-15天一次、約每14天一次、約每月兩次、約每三周或更長時間一次、約每20-22天一次、約每21天一次或約每月一次。特別地，考慮了 1周、2周、3周和甚至一個月的給藥間隔。最優選的給藥間隔是一周（7天）、兩周 (14天)或三周（21天）。
[0086]可選地，給藥間隔可以是個性化的間隔，對于每個受試者基于藥代動力學數據或其他有關該受試者的信息來確定。個性化的劑量/給藥間隔組合可以與前面段落中關于固定間隔方案的那些相同，或可以不同。方案可以初始為固定的給藥間隔，然后可改變為個性化的給藥間隔。方案可以初始為固定的劑量(IU/kg)和給藥間隔，然后可改變為具有固定劑量的個性化的給藥間隔。方案可以初始為固定的給藥間隔和劑量(IU/kg)，然后可改變為具有相同的固定的給藥間隔的個性化的劑量。
[0087] 可用于本發明的方法中的治療性劑量是每周給藥約25-75IU/kg、約35-75IU/kg、約30-50IU/kg、約35-55IU/kg、約35-50IU/kg、約25-50IU/kg、約50IU/kg、約45IU/kg、約 35IU/kg。在正在進行的研究中觀察到了約40IU/kg的半數/平均劑量。對于每周給藥方案考慮了 35IU/kg的劑量。對于每兩周一次的給藥計劃，考慮了 50-75IU/kg、約50IU/kg、約75IU/ kg、約60-90IU/kg、約65-85IU/kg、約70-80IU/kg、約75IU/kg的劑量。在正在進行的研究中觀察到了75IU/kg的固定劑量具有優異的效力。值得注意的，現有技術未公開低至50-75IU/ kg的劑量可以兩周的給藥間隔來使用。
[0088] 對于三周給藥間隔，本發明考慮了約90-250IU/kg、約90-150IU/kg、約95-110IU/ kg、約95-105IU/kg和約100IU/kg的劑量。對于每月給藥間隔，本發明考慮了 140-250IU/kg 的劑量。現有技術未公開可實現三周或按月給藥間隔。
[0089] 因此，優選的治療性劑量是約35-75IU/kg、約35-55IU/kg、約35-50IU/kg、約25- 50IU/kg、約30-60IU/kg、約30-50IU/kg、約30-40IU/kg about50IU/kg、約45IU/kg、約35IU/ kg、約75IU/kg、約70-80IU/kg、約75IU/kg、約95-110IU/kg、約95-105IU/kg、約100IU/kg和約140-250IU/kg。預防性劑量不應超過每月250IU/kg。
[0090] 優選的劑量和給藥間隔如下：約每周一次約25-75IU/kg、約每周一次約35-75IU/ kg、約每周一次約35_55IU/kg、約每周一次約35-50 IU/kg、約每周一次約25_50IU/kg、約每周一次約50IU/kg、約每周一次約45IU/kg和約每周一次約35IU/kg。"每周約一次"包括約每 6-8天一次和約每7天一次。
[0091] 其他優選的劑量和給藥間隔是:約每8-11天一次約50-75IU/kg、約每8-11天一次約50IU/kg和約每8-11天一次約75IU/kg。"約每8-11天一次"包括約每10天一次。
[0092]另外的優選的劑量和給藥方案是：約每兩周一次約50_90IU/kg、約每兩周一次約 50_75IU/kg、約每兩周一次約65_85IU/kg、約每兩周一次約60_80IU/kg、約每兩周一次約 70_80IU/kg、約每兩周一次約50IU/kg，和最優選地為約每兩周一次約75IU/kg。"每兩周約一次"包括約每12-16天一次或約每13-15天一次，優選地，約每14天一次。
[0093]另外的優選的劑量和給藥間隔是：約每3周或更長時間一次約90-250IU/kg，約90-150IU/kg、約80-120IU/kg、約每3周或更長時間約95-110IU/kg、約每3周或更長時間約95-105IU/kg，和約每3周或更長時間約100IU/kg。"約每3周或更長時間一次"包括約每19-23天一次、約每20-22天一次，優選地，約每21天一次和約每月一次。
[0094] 在本發明中，考慮了可以施用每月一次劑量。因此，另一個優選的劑量和給藥方案是約每月一次約14-250IU/kg。
[0095] 對于一周(7天)給藥方案將推薦25_40IU/kg的劑量，且其為一周方案最優選的。對于兩周（14天)給藥方案將推薦50-75IU/kg的劑量，且其為兩周方案最優選的。對于三周（21 天)給藥方案最優選的是l〇〇IU/kg的劑量。
[0096] 驚人地是，本發明的優選的融合蛋白（rlX-FP)是迄今為止在包括兒童的所有患者中維持3%或更高的低谷的產品，其以每7天或更長時間一次50IU/kg來給藥。并且，21天預防性方案顯示了在l〇〇IU/kg rIX-FP注射后第21天至少4%的FIX活性。結果總結于表8。先前，利用現有技術的FIX產品在這樣延長的時間中獲得這樣高的FIX水平是不可能的。
[0097]本發明包括實施方案，其中在施用25IU/kg rIX-FP劑量之后，對于7天的整個給藥間隔，FIX活性的半數血漿水平維持了高于基線至少約5%的低谷。在另一個實施方案中，其中在施用50IU/kg rIX-FP劑量之后，對于10天的整個給藥間隔，FIX活性的半數血漿水平維持了高于基線至少約5%的低谷。在另一個實施方案中，其中在施用75IU/kg rIX-FP劑量之后，對于14天的整個給藥間隔，FIX活性的半數血漿水平維持了高于基線至少約5%的低谷。 [0098]本發明還包括實施方案，其中每7天施用25IU/kg rIX-FP劑量，對于一周的整個給藥間隔，FIX活性的半數血漿水平維持了高于基線至少約7%。在另一個實施方案中，其中每 10天施用50IU/kg rIX-FP劑量，對于整個給藥間隔，FIX活性的半數血漿水平維持了高于基線至少約9%的低谷。在另一個實施方案中，其中每14天施用50IU/kg rIX-FP劑量，對于整個給藥間隔，FIX活性的半數血漿水平維持了高于基線至少約4%的低谷。在另一個實施方案中，其中每14天施用75IU/kg rIX-FP劑量，對于整個給藥間隔，FIX活性的半數血漿水平維持了高于基線至少約7%的低谷(參見，例如表9b)。在另一個實施方案中，其中每14天施用50IU/kg rIX-FP劑量，對于整個給藥間隔，FIX活性的半數血漿水平維持了高于基線至少約4%的低谷。在另一個實施方案中，其中每14天施用75IU/kg rIX-FP劑量，對于整個給藥間隔，FIX活性的半數血漿水平維持了高于基線至少約7%的低谷。在另一個實施方案中，其中每21天施用75IU/kg rIX-FP劑量，對于整個給藥間隔，FIX活性的半數血漿水平維持了高于基線至少約2%的低谷(參見，例如，表9b)。在另一個實施方案中，其中每21天施用100IU/ kg rIX-FP劑量，對于整個給藥間隔，FIX活性的半數血漿水平維持了高于基線至少約4%的低谷。
[0099] 可選地，在這些實施方案中，FIX活性的血漿水平可作為平均值來計算（參見，例如，表8)。
[0100] 特別地，本發明提供了包含Fix和HLEP白蛋白的融合蛋白的預防性給藥方案，其中因子IX(FIX)部分經由可裂解的肽接頭連接于半衰期增強多肽(HLEP)。給藥間隔可以是1周或更長時間，比如10天或更長時間，但可獲得比先前設想的更長的預防性給藥時間，比如兩周、三周或甚至按月。
[0101] 無接頭或具有非可裂解接頭的rIX-FP融合蛋白由于白蛋白的存在使得FIX具有增高的半衰期。然而，由于激活的FIX仍與白蛋白融合，其具有降低的活性的缺點。此外，因為激活的FIX仍與白蛋白融合，其甚至在出血事件解決后繼續具有長的半衰期。rIX-FP融合蛋白具有允許在FIX激活之前進行裂解的接頭，該融合蛋白由于白蛋白顯示了增高的FIX半衰期，但由于裂解發生在出血事件之前，激活的FIX的半衰期在激活之前減小了。若另一方面，裂解發生在FIX激活之后，白蛋白增大了FIX的半衰期，但激活的FIX仍與白蛋白融合，因此其具有低活性。
[0102] 本發明優選地涉及包含FIX和白蛋白的融合蛋白，其中可裂解接頭可通過參與凝固的蛋白酶而裂解。在本發明的意義上，凝固相關模式的蛋白水解裂解是作為至少一個凝固因子或凝固輔因子的激活的結果發生的任何蛋白水解裂解。凝固因子的激活幾乎與接頭肽的蛋白水解裂解是并行的（參見圖1)。激活可能，例如，通過凝固因子的蛋白水解裂解或通過與輔因子的結合而發生。白蛋白增加了出血事件發生之前血液中FIX的半衰期，出血事件同時激活了 FIX并將其從白蛋白裂解。這樣的裂解將多肽從任何由HLEP導致的活性受損的位阻中釋放，從而允許生成保留了FIX的高摩爾比活性的融合蛋白。然后由于失去白蛋白該裂解的FIX迅速地從血液中清除。這樣的融合蛋白與其未裂解的對應物相比較表現出增高的半衰期和摩爾比活性。因此，相較于包含rlX的非可裂解融合蛋白，需要較少的rlX-FP 以提供治療性作用。
[0103] 根據本發明的優選的融合蛋白是具有摩爾比活性尤其是如下治療性融合蛋白的摩爾比凝固相關活性的那些：在至少一個凝固相關測定中，相較于由具有氨基酸序列 GGGGGGV(SEQ ID N0:4)的非可裂解接頭連接的治療性融合蛋白，所述摩爾比凝固相關活性增高了至少25%。更優選的是這樣的融合蛋白：其中在至少一個可實現的不同的凝固相關測定中，摩爾比活性增高了至少50%，甚至更優選的是其中摩爾比活性增高了至少100%的那些融合蛋白。
[0104] 在另一個實施方案中，接頭肽包括用于一個以上的蛋白酶的裂解位點。這可通過可通過不同的蛋白酶在相同的位置裂解的接頭肽來實現，或通過提供兩個或多個不同的裂解位點的接頭肽來實現。可能存在有利的情況，其中治療性融合蛋白可通過蛋白水解裂解來激活以獲得酶活性，且其中不同的蛋白酶可有助于該激活步驟。FIX的激活可通過FXIa或通過FVIIa/組織因子(TF)來實現。在一個優選的實施方案中，接頭可通過FIXa裂解和/或通過FVIIa/組織因子(TF)裂解。
[0105] 具有SEQ ID N0:1中所示的序列的rIX-FP(rFIX-白蛋白融合蛋白）在血漿中具有延長的循環，如相較于rFIX(例如，Benefix?)高5.3倍的半衰期(切 2)、低7倍的(^和大7倍的AUC所示。
[0106] 并且，當將rIX-FP的藥代動力學參數與Alprolix? FDA處方信息中的FIX-Fc的相應的藥代動力學數據相比較時，相較于^以4〇以1^1?(^^1￥)4^4?具有約3.8倍高的41]〇)-inf，約3.7倍降低的CL/BW，約26 %高的增量回收，約3.2倍低的分布提及和增大約19 %的藥物平均停留時間。
[0107]預防是通過靜脈內注射因子濃縮物以預防預期的出血的治療。觀察到具有凝集因子水平>lIU/dl(>l%)的中度血友病患者罕有經歷自發性出血，并且更好地保持了關節功能，從而構想了預防。因此，FIX活性保持在1%以上以預防出血和關節破壞的預防應當是保持正常骨骼肌功能的治療的目標(GUIDELINES FOR THE MANAGEMENT OF HEMOPHILIA,第二版，Prepared by the Treatment Guidelines Working Group,on behalf of the World Federation of Hemophilia(WFH)) dlX-FP的單一劑量能夠將FIX活性維持在1%以上持續 14天和更長時間。
[0108] 由以下表la和lb中清楚的，rIX-FP相較于已知的rFIX-Fc產品具有有利的PK屬性。
[0109] 表la:50IU/kg rIX-FP、50IU/kg rIX-Fc和 100IU/kg rIX-Fc的單次劑量的時間依賴的FIX活性
[0110]
[0111] 表lb:50IU/kg rIX-FP、50IU/kg rlX-Fc的單次劑量的時間依賴的FIX活性
[0112]
[0113] FIX-FP在第7天提供如此高FIX活性和在第14天及以后提供持續的FIX活性的能力是出人意料的。如上所述，rIX-FP是迄今為止驚人地在包括兒童的所有患者中維持3 %或更高的低谷的產品，其以每7天或更長時間一次50 IU/kg來給藥。
[0114] 并且，利用患有嚴重的和中度嚴重的血友病B的五位患者進行了 100IU/kg rIX-FP 給藥方案的研究。在011、0.511、7211(3天）、16811(7天）、33611(14天）和504(21天）之后測量了 ?1父活性（11]/乩％)。預防性方案顯示了在10011]/1^^乂4?注射后第21天至少4.1%的卩1父活性。結果總結于表8。
[0115] 相較于其他已知FIX產品，rIX-FP的較長的半衰期和更高的比活性驚人地允許利用比現有技術關于rFIX(例如，Ben efixi;:_)和rFIX-Fc所建議的顯著更長的給藥間隔進行血友病的預防性治療。因此，rIX-FP具有超越rFIX-Fc的優點，因為rIX-FP具有相較于rFIX-Fc 改良的PK參數。
[0116] 融合蛋白的更高的活性意味著施用更少的蛋白，因為施用更少的宿主細胞蛋白較不可能具有免疫原性，意味著注射位點處局部反應的更低風險。降低的注射頻率降低了注射的風險、減少了患者的不適和所需要的拜訪醫療人員的次數。這些優點將積極地影響血友病的預防性治療的患者順應性，并從而影響治療效率。
[0117] 由于其有利性質，rIX-FP具有更低的FIX產物消耗，比如本文所公開的給藥方案。在優選的實施方案中，對于整個給藥間隔，FIX的血漿水平維持在高于基線至少約0.5%的低谷，或至少約1 %，或至少約2%，或至少約3%、至少約4%或至少約5%，優選對于整個給藥間隔高于基線的5%和15%之間。
[0118] 人類 FIX
[0119] 人類FIX是維生素 K依賴的多肽的組中的一個成員，其為單鏈的糖蛋白，具有57kDa 的分子量，作為415個氨基酸的無活性的酶原由肝細胞分泌到血流中。其包含位于多肽的N 端Gla結構域中的12個γ-羧基谷氨酸殘基。Gla殘基需要維生素 K用于其生物合成。在Gla結構域之后有兩個表皮生長因子結構域，激活肽和胰蛋白酶型絲氨酸蛋白酶結構域。另外的 FIX翻譯后修飾包括羥基化(Asp 64)、N-型(Asnl57和Asnl67)和0-型糖基化(Ser53、Ser61、 Thrl59、Thrl69和Thrl72)，硫酸鹽化(Tyrl55)和磷酸化(Serl58)。
[0120] 通過在Argl45-Alal46和Argl80-Vall81處的激活肽的蛋白酶解，導致了兩個多肽鏈，N端輕鏈（18kDa)和C端重鏈(28kDa)的形成，所示兩個多肽鏈由一個二硫橋保持在一起，將FIX轉化為其活性形式。因子IX的激活裂解可在體外實現，例如，通過因子XIa或因子 VIIa/TF實現。因子IX以5-10μg/ml的濃度存在于人類血漿中。發現人類中因子IX的終末血楽半衰期為約 15小時至 18小時（White GC等人.1997.Recombinant Factor IX.Thromb Haemost. 78: 261-265 ；Ewenstein BM等人· 2002 · Pharmacokinetic analysis of plasma-derived and recombinant F IX concentrates in previously treated patients with moderate or severe hemophilia B.Transfusion 42:190-197)。
[0121] 半衰期增強多肽(HLEP)
[0122] 已將白蛋白、白蛋白家族成員和免疫球蛋白及其片段或衍生物作為半衰期增強多肽(HLEP)的例子來描述。術語"人血清白蛋白"（HSA)和"人白蛋白"（HA)貫穿本申請互換使用。術語"白蛋白"和"血清白蛋白"較為寬泛，包括人血清白蛋白（及其片段和變體）以及來自其他物種的白蛋白（及其片段和變體）。
[0123] 如本文所用的，"白蛋白"泛指具有白蛋白的一種或多種功能活性（例如，生物活性)的白蛋白多肽或氨基酸序列或白蛋白片段或變體。尤其是，"白蛋白"指人白蛋白或其片段，尤其是人白蛋白的成熟形式。例如，白蛋白可具有序列或其變體，如US2008260755A1中所描述的，其以其整體通過引用并入本文。白蛋白融合蛋白的白蛋白部分可包括全長的HA 序列，或可包括其能夠穩定或延長治療活性的一個或多個片段。這樣的片段可以長10個或更多個氨基酸，或可包括來自HA序列的約15個、20個、25個、30個、50個或更多個連續的氨基酸，或可包括HA的特異性結構域的部分或全部。
[0124] 本發明的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分可以是正常HA(天然的或人工的）的變體。本發明的融合蛋白的治療型多肽部分還可以是如本文所描述的對應的治療性多肽的變體。術語"變體"包括保守的或非保守的、天然的或人工的插入、缺失和置換，其中該改變基本上不會改變賦予治療性多肽的治療性活性的活性位點或活性結構域，如US2008260755A1中所描述的，其以其整體通過引用并入本文。
[0125] IgG和IgG片段也可用作HLEP，只要HLEP片段提供了與非融合的凝固因子相比較至少25%的半衰期延長。可將治療性多肽部分經由接頭與IgG或IgG片段連接，接頭優選地為允許融合蛋白的高摩爾比活性的可裂解接頭，優選地為可通過參與凝固的蛋白酶裂解的可裂解接頭，其允許在激活凝固時融合蛋白具有高摩爾比活性。W02004/101740公開了 FIX-Fc 融合蛋白，其以其整體通過引用并入本文。如果這些FIX-Fc融合蛋白可裂解接頭，它們相當于本發明的融合蛋白。
[0126] 本發明特別涉及融合蛋白，所述融合蛋白包括將凝固因子或其片段或變體與HLEP 的N末端或C末端或其片段或變體連接，從而在治療性多肽和HLEP之間導入了介入可裂解肽接頭，從而在至少一項可獲得的不同的凝固相關的測定中，形成的融合蛋白與未與HLEP連接的凝固因子相比較具有增高的體內半衰期，且融合蛋白與具有非可裂解接頭的對應的融合蛋白相比較具有高至少25%的摩爾比活性。優選的是rlX在HLEP片段或其變體的N末端。
[0127] 以上定義中的"因子IX"包括具有含任何天然多態性的天然氨基酸序列的多肽。還包括具有輕微修飾的氨基酸序列的多肽，只要那些多肽基本上保持了各自的治療性多肽的活性，例如，包括末端氨基酸缺失或增加的修飾的N末端或C末端。變體包括與野生型序列不同的一個或多個氨基酸殘基。所述序列的例子可包括一個或多個氨基酸殘基(例如，優選地 1-30個氨基酸殘基）的N末端和/或C末端截短，或N末端和/或C末端的一個或多個額外殘基的增加，以及保守性氨基酸置換，即，在具有相似的特性的氨基酸組中進行的置換，所述氨基酸例如，（1)小氨基酸，（2)酸性氨基酸，（3)極性氨基酸，（4)堿性氨基酸，（5)疏水性氨基酸和(6)芳香族氨基酸。下表中顯示了這樣的保守性置換的例子。
[0128] 表2:保守性氨基酸置換

[0131] 本發明的融合蛋白的體內半衰期，一般作為終末半衰期或β半衰期來確定，通常比未融合的多肽的體內半衰期高至少約25%，優選至少約50%和更優選100%以上。
[0132] 本發明的融合蛋白與不具有可裂解接頭的對應的融合蛋白相比較具有至少25%，優選至少50%，更優選至少100%增高的摩爾比活性。
[0133] 在這方面，摩爾比活性(或尤其是本文考慮的摩爾比凝固相關活性)定義為感興趣的治療性多肽或治療性融合蛋白每摩爾（或例如，納摩爾）表達的活性。摩爾比活性的計算允許對不同的構建體的活性進行直接比較，所述活性不受不同分子量或所研究多肽的光密度的影響。摩爾比活性可如以下表3中關于FIX和FIX-FP融合蛋白所示例的來計算。
[0134] 表3:如關于純化的FIX-HSA融合蛋白所顯示的摩爾比活性的計算
[0135]
[0136]
[0137] l)R.G.Di Scipio等人，Biochem. 16:6698-706(1977)
[0138] 2)C· Chaudhury等人J · Exp ·Med · 197(3): 315-322(2003)
[0139] 為確定摩爾比凝固相關活性，可使用確定與凝固過程相關的酶活性或輔因子活性的任何測定。
[0140]因此，本發明意義上的"凝固相關測定"是確定在凝固過程中相關的酶活性或輔因子活性的任何測定，或能夠確定已激活的內在或外在凝固級聯反應的任何測定。因此"凝固相關的"測定可以是直接的凝固測定如aPTT、PT或凝血酶生成測定。然而，還包括其他測定，如，例如，用于特定的凝固因子的生色測定。用于這樣的測定或對應的試劑的例子是具有相應的凝固因子缺陷血衆（Dade Behring)的 Pathr〇mtinU?)SL(aPTT，Dade Behring)或 Thromborei$S(凝血酶原時間測定，Dade Behring)，利用例如凝固因子缺陷血楽；的凝血酶原生成測定試劑盒(Technoclone，Thrombinoscope )，生色測定如Biophen因子IX(Hyphen BioMed)，St_l0t^FVIIa-rTF(R〇Che Diagnostics GmbH)，C〇atest# 因子vm :c/4 (Chromogenix)，或其他。
[0141]為本發明的目的，認為以上測定中任一項或等效的凝固相關測定中的增高顯示了摩爾比活性的增高。例如，25%增高指以上測定中任一項或等效測定中的25%增高。
[0142]為確定治療性融合蛋白是否在本發明的范圍內，將這些蛋白的摩爾比活性所針對的標準與構建體相比較，所述構建體其中各自的凝固因子和各自的HLEP通過具有氨基酸序列GGGGGGV(SEQ ID N0:4)的非可裂解接頭所連接。
[0143] 對于FIX，常使用aPTT測定來確定凝固活性。實施例4中更加詳細地描述了這樣的凝固測定(aPTT測定）。然而，可使用其他凝固相關測定或測定原則以確定FIX的摩爾比活性。
[0144] 雖然對于未激活的凝固因子而言，具有高體內回收和長半衰期是所需的，有利的是在其激活或其輔因子激活之后限制凝固因子的半衰期以避免血栓前風險。因此，在凝固過程起始后，有活性的凝固因子的半衰期應當再次被降低。這可通過以凝固相關模式增強失活或通過除去凝固因子來實現。
[0145] 根據本發明的失活意為治療性多肽的活性的降低，其可通過例如以下來導致:通過凝固因子和對應的凝固因子的抑制物的復合物形成，或通過另外已知的蛋白水解裂解 (例如，在FVIII和FV的情況下）。
[0146] 激活的治療性融合蛋白的失活速率定義為活性下降的速率，例如，通過與抑制物的反應或通過蛋白水解失活。失活速率可通過以下的在該凝固因子的生理學量的抑制物存在下激活的凝固因子隨時間推移的摩爾比活性來測量。
[0147] 可選地，可這樣確定失活速率:在將激活的產物施用給動物之后，隨后利用活性和抗原測定在合適的時間對血漿樣品進行檢驗。
[0148] 當對于治療型融合蛋白而言需要確定這些蛋白是否落入本發明的范圍內，對這些治療性蛋白的失活速率進行比較的標準是這樣的構建體:所述構建體其中各自的凝固因子和各自的HLEP通過具有氨基酸序列GGGGGGV(SEQ ID N0:4)的非可裂解接頭所連接。
[0149] 激活的治療性融合蛋白的消除速率定義為多肽從人類或動物的循環中消除的速率。消除速率可通過在靜脈施用后測量激活的、治療性融合蛋白的藥代動力學來確定。利用抗原測定，可確定從循環里直接去除的消除。并且，利用活性測定，可確定特定的去除和失活速率。
[0150] 當對于治療型融合蛋白而言需要確定這些蛋白是否落入本發明的范圍內，對這些治療性蛋白的消除速率進行比較的標準是這樣的構建體:所述構建體其中各自的凝固因子和各自的HLEP通過具有氨基酸序列GGGGGGV(SEQ ID N0:4)的非可裂解接頭所連接。
[0151]根據本發明，治療性多肽部分通過可裂解肽接頭與HLEP部分偶聯。接頭應該是非免疫原性的，且應該是足夠柔性的以允許通過蛋白酶進行裂解。
[0152] 可裂解的接頭優選包括源自以下的序列：
[0153] a)待施用的治療性多肽自身，若其含有在治療性多肽的激活過程中可蛋白水解裂解的蛋白酶水解裂解位點，
[0154] b)該治療性多肽的底物多肽，或
[0155] c)通過蛋白酶裂解的底物多肽，所述蛋白酶通過治療性多肽的直接或間接參與而激活或形成。
[0156]在更優選的實施方案中，接頭區域包括待施用的治療性多肽的序列，其可導致所表達的融合蛋白的新抗原屬性的降低的風險。
[0157] 在一個優選的實施方案中，HLEP是白蛋白。在該情況中，接頭序列源自FIX的激活區域的序列，或源自FIX如FX或FVII的任何底物的可裂解區域，或來自通過由蛋白酶裂解的任何底物多肽的裂解區域，FIXa參與了所述蛋白酶的激活。
[0158] 在一個非常優選的實施方案中，接頭肽源自FIX自身。在另一個優選的實施方案中，接頭肽源自FX或FVII。在另一個優選的實施方案中，接頭序列包括可通過FIX的兩個生理學相關激活物FXIa或FVIIa/TF裂解的兩個裂解序列。
[0159] 本發明還包括所描述的接頭的變體和片段，只要該接頭仍可通過裂解該接頭的蛋白酶所裂解。術語"變體"包括保守性的或非保守性的插入、缺失和置換。
[0160] 藥物組合物和施用方式
[0161] 可將本發明的融合蛋白摻入到適宜于施用的藥物組合物中。這樣的組合物通常包括蛋白和藥學上可接受的載體。如本文所用的，"藥學上可接受的載體"意在包括任何的和所有的溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑和類似物，其與藥物施用相容。適宜的載體描述于雷明頓藥物科學的最新版本中，其為該領域中的標準參考文本，通過引用并入本文。這樣的載體或稀釋劑的優選的例子包括，但不限于，水、鹽水、林格(finger ' s)溶液、葡萄糖溶液和5 %人血清白蛋白。還可使用脂質體和非水性運載體諸如非揮發油。用于藥學活性物質的這樣的介質和劑的使用是本領域中已知的。除了與活性化合物不相容的任何常規介質或劑的范圍，考慮了其在組合物中的用途。還可將補充的活性化合物摻入到組合物中。
[0162] 本發明的藥物組合物可經配制與其目的施用途徑相兼容。施用途徑的例子包括，胃腸外施用，例如，靜脈內施用、皮內施用、皮下施用、口腔施用（例如，吸入）、透皮施用（局部施用）；透粘膜施用和直腸施用。用于胃腸外、皮內或皮下應用的溶液或懸浮液可包括以下的組分:無菌稀釋劑諸如注射用水、鹽溶液、非揮發油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成的溶劑;抗細菌劑諸如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲酯;抗氧化劑諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉;螯合劑諸如乙二胺四乙酸(EDTA);緩沖液諸如乙酸鹽類、檸檬酸鹽類或磷酸鹽類，和用于調節滲透壓的劑諸如氯化鈉或右旋糖。可利用酸或堿調節pH;諸如鹽酸或氫氧化鈉。胃腸外制劑可被封裝在安瓿瓶、由玻璃或塑料制成的一次性注射器或多劑量小瓶中。作為靜脈內注射來施用是優選的施用途徑。
[0163] 適宜于可注射用途的藥物組合物包括用于臨時制備無菌注射溶液或分散體的無菌水溶液(其中為水溶的）或分散體和無菌粉末。對于靜脈內施用，適宜的載體包括生理鹽水、抑菌水、Cremophor EL(BASF，Parsippany，N. J.)或磷酸緩沖鹽溶液(PBS)。在所有情況中，組合物必須是無菌的，且應為流動的達容易注射的程度。在制造和貯存條件下必須是穩定的，且必須抑制微生物諸如細菌和真菌的污染作用來保存。載體可以是溶劑或分散體介質，含有，例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、聚乙二醇和液體聚乙二醇，和類似物），及其適宜的混合物。可通過如下來維持合適的流動性，例如，通過使用包衣諸如卵磷脂，通過在分散體的情況下維持所需的粒度，和通過使用表面活性劑。對微生物作用的預防可通過不同的抗細菌劑和抗真菌劑來實現，例如，對羥基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞和類似物。在許多情況下，將優選地在組合物中包括等滲劑，例如，糖、多元醇諸如甘露醇、山梨醇、氯化鈉。通過在組合物中包含延長吸收的劑，例如，單硬脂酸鋁和明膠可產生可注射組合物的延長的吸收。
[0164] 無菌可注射溶液可通過將活性化合物(例如，rlX-FP)以所需的量和以上所列的成分之一或其組合一起摻入到適當的溶劑中然后過濾滅菌來制備。通常，通過將活性化合物摻入到無菌運載體中來制備分散體，所述無菌運載體包含堿性的分散體介質和來自以上所列的那些的其他所需成分。在用于配制無菌注射溶液的無菌粉末的情況下，制備的方法是真空干燥和冷凍干燥，其生成了活性成分和來自其先前無菌過濾溶液的任何其他所需成分的粉末。
[0165] 用于注射的制劑可包含治療有效量的因子IX(FIX)融合蛋白（例如，rFIX-FP)，該量可通過本領域技術人員來確定。尤其是，因子IX(FIX)融合蛋白（例如，rFIX-FP)可以約 100至400IU/ml的濃度來施用。例如，融合蛋白可以約100、200或400IU/ml的濃度來提供用于施用。融合蛋白可以較高的濃度諸如600IU/ml和1200IU/ml的濃度來提供用于施用。
[0166] 特別有利的是以易于施用和劑量的均一性的劑量單位形式配制藥物組合物，比如用于注射的組合物。如本文所用的劑量單位指適合于用于待治療的受試者的單位劑量的物理上不連續的單位;每個單位包含經計算產生所需治療作用的預定量的活性化合物和所需的藥物載體。劑量單位形式的規格直接取決于活性化合物的獨特性質和待獲得的特定治療效果并由它們所決定。
[0167] 可將藥物組合物包含在含施用說明書的容器、包或分配器中。
【附圖說明】
[0168] 圖l:rIX_FP的有利性質的示意圖。
[0169] 圖2:成熟的rIX-FP(SEQ ID NO: 1)的氨基酸序列。FIX顯示為氨基酸1-416,接頭序列為粗體和下劃線(氨基酸416-433)，白蛋白序列顯示為氨基酸434-1018。
[0170] 圖3:實施例1中的試驗設計的示意圖，包括時期、持續時間和受試者流程。PK，藥代動力學。
[0171] 圖4:顯示實施例1的試驗中的流程和患者的配置。
[0172] 圖5: (A)對于所有處理的血液，獲得止血的rIX-FP輸注數量。（B)對于所有處理的血液，出血的起始至第一次rIX-FP輸注之間的時間。
[0173] 圖6:對于(A)中所示的自發性出血和(B)中所示的所有出血的平均年度出血率。計算每個患者的年度出血率：研究的治療期間中的時間過程中（以天計）出血的數目除以 365.25。每個患者的歷史出血率是在研究開始之前的12個月時間中出血的數目。PT，預防性治療;0DT，按需治療。
[0174] 圖7:每21天一次100IU/kg rIX-FP的PK結果(模擬的FIX活性對比時間）。
[0175] 圖8:注射100IU/kg rIX-FP之后，rIX-FP活性隨時間推移的平均值。
[0176] 圖9:注射100IU/kg rIX-FP或注射50IU/kg rIX-FP之后，rIX-FP活性隨時間推移的平均值，和注射5〇iu/kg FIX之后先前的FIX(例如，Benefix?)的平均值。
[0177] 圖10: FIX活性中值水平或平均水平(實線），和對于給藥方案諸如每周25 IU/kg、每 10天和每14天50IU/kg，和每14天和每21天75IU/kg，表征FIX活性的最低5%和最高5%的邊界。對于中值和對于最低和最高5 %的低谷水平顯示于表9b。
[0178] 圖11:用于評估rIX-FP的效力、藥代動力學和安全性的II/III期研究分支1和2的流程表。
[0179] 圖12:對于每7天、每10天和每14天33.33、50和7511]/1^11乂-??的各自？1(結果（模擬的？以活性對比時間），和對于每7天、每10天和每14天50、100和10011]/1^41?仰1丨11的各自的PK結果的比較(模擬的FIX活性對比時間）。
[0180]現已經詳細地描述了本發明，通過參考以下實施例將更加清楚地理解本發明，本文所包括的實施例僅作闡釋的目的而并不意在限制本發明。所引用的所有專利和出版物通過引用而明確地并入。實施例
[0181] 實施例1:在血友病B患者中對連接凝固因子IX與白蛋白的新型重組融合蛋白 (rlX-FP)的安全性和效力的I/II期開放標示的試驗
[0182] 本試驗旨在評估在每周一次預防過程中用于出血事件預防的rlX-FP的效力和用于評估用于出血的治療的止血效力，以及評估rIX-FP的安全性和藥代動力學(PK)。
[0183] 患者和方法
[0184] 患者
[0185] 選擇受試者的標準基于人類用藥委員會的草稿Guideline on the clinical investigation of recombinant and human plasma-derived factor IX products(歐洲藥品管理局，人類用藥委員會（CHMP)，Guideline in the Clinical Investigation of Recombinant and Human Plasma-Derived Factor IX Products .2009.CHMP/BPWP/ 144552/2009 ·可見于此處：http: //www · ema · europa · eu/docs/en_GB/document_l ibrary/ Scientific_guidelin e/2009/09/WC500003634.pdf)。患者是先前經治療的（暴露于FIX產品2 150天）患有血友病B的男性(FIX活性<2%)，年齡在12到65歲之間。排除了具有針對 FIX的中和抗體(抑制物）的歷史、⑶4+淋巴細胞計數〈200/mm3(若HIV陽性)或患有除血友病 B的凝固疾病的患者。從2個國家（以色列和保加利亞）的2個位置募集了患者。在任何試驗相關活動之前，所有患者（或患者的父母或法律上可接受的代表人)提供了書面的知情同意書。該研究受到獨立的倫理學委員會的批準，并根據GCP和赫爾辛基宣言進行。該試驗注冊于 www. clinical trials .gov，編號為NCT01361126。
[0186] 試驗設計
[0187] 該試驗是評估rlX-FP的安全性、藥代動力學和效力的前瞻性的開放標示研究，在患有先天性因子IX(FIX)缺陷(血友病B)的患者中對于出血事件的預防和治療進行了研究。該研究由以下組成：10到14天的rlX-FP的PK評估，接受每周預防治療的受試者進行的11個月的安全性和效力評估期，和在接受按需治療的受試者中進行的3到5個月的安全性和效力評估期（參見圖3)。接受每周預防性治療的受試者初始用30±5IU/kg來處理。根據出血表型、物理活性水平和臨床結果可對劑量進行調整，同時保持7天治療間隔和個性化的低谷 FIX活性水平。在研究的活性治療期間發生的所有出血事件用rlX-FP來處理;根據研究者的自己判斷在篩查或藥代動力學評估期發生的出血事件可用受試者先前的產品來治療。對于出血事件的按需治療，劑量基于受試者的PK譜、WFH指南和護理的地方標準，最低劑量為 25IU/kg rlX-FP。對于出血事件的常規預防和治療，所有患者自我施用的rlX-FP治療，由受試者將治療和出血事件記錄于電子日記中。
[0188] 試驗目標和終點
[0189] 研究的主要目標是評估rlX-FP的靜脈內注射的長期安全性。通過不良事件的性質和發生率、實驗室值的改變和針對rlX-FP的抑制物或非中和性抗體的形成來評估安全性。
[0190] 研究的第二目標是在25IU/kg rlX-FP的單獨的IV劑量之后評估PK參數，關于出血事件的預防方面用r IX-FP進行的每周常規預防的臨床反應和用r IX-FP治療的出血事件的臨床反應。
[0191] 分析方法
[0192] 利用經驗證的一步凝集法測量FIX活性。簡言之，將檢驗樣品與等量的無 FIX血漿混合并通過利用Pathromtin SL(Siemens Healthcare Diagnostics,Marburg)作為活化劑的活化部分凝血活酶時間（aPTT)的體外測定來檢驗，利用Behring Coagulation System (BCS)進行rIX-FP活性測定。利用由制造商針對FIX的WHO標準（International Blood Coagulation Factors II，VII，IX，X,Human,Plasma)從標準人血楽_(SHPL)制備的參照曲線對結果進行解釋，結果以標準或國際單位的百分比來報告。
[0193]根據Nijmegen修正的Be thesda法(基于人類含梓檬酸鹽的血衆的aPTT的體外確定的凝固測定)對抑制物進行滴定。結果2 〇.6Bethesda單位(BU)被定義為陽性結果。
[0194] 在研究期間應用了針對rIX-FP的免疫原性檢驗的分層的方法。在rIX-FP暴露之前和暴露4周之后在所有患者中檢驗了 rlX-FP的抗體。應用了直接的結合ELISA測定檢測了針對rIX-FP的抗體;若獲得了陽性信號，則在獨立的直接結合ELISA測定中再檢驗血漿樣品以確定特定的抗體信號和區分針對血漿來源的FIX的抗體、針對重組FIX(BeneFIX)的抗體和針對白蛋白的抗體。
[0195] 在德國馬爾堡，CSL Behring的中心實驗室中進行了FIX活性、FIX抗原、針對rlX-FP的抑制物和抗體的分析。
[0196] 藥代動力學分析和統計學方法
[0197] 4天清除之后，在施用rIX-FP和輸注后30分鐘、3小時、24小時、48小時、72小時、120 小時、168小時、240小時和336小時收集用于測量關于PK分析的FIX活性的血漿樣品。根據 ISTH標準，利用實際收集時間計算所有的PK參數。將在PK采樣期間接受了用于治療出血的 FIX產物的患者或不具有顯著數量的可分析的PK樣品的患者從PK分析中排除。利用 WillNonlin?軟件(Pharsight)通過標準的無隔室分析(NCA)進行了 PK分析。PK參數包括：對于具有可計量的藥物濃度的最后的樣品的曲線下面積(AUCo-t);基于最后觀察到的FIX濃度，從給藥的時間外推至無窮大的曲線下面積(AUCo- inf);根據式C3Qmin(IU/dL)/劑量（IU/ kg)的增量回收(IRo-3()min);終末半衰期(t1/2);總的體清除率，相對于體重標準化(CL)。
[0198] 利用描述性統計總結了安全性終點，包括了暴露于rIX-FP的所有患者(安全性群體)。
[0199] 效力
[0200]將達到止血的輸注數量列表以確定rIX-FP對于出血事件的治療的效力。此外，研究者以四分法對出血事件的治療的效力進行定級，其中考慮了受試者接受的輸注的數量和治療后受試者報告的疼痛減輕。
[0201]通過rIX-FP的消耗和預防期間發生的自發性出血事件的次數(表示為年度出血率)測量了常規預防的效力。
[0202]藥物產品
[0203] rIX-FP是單鏈糖蛋白，分子量約為125,000Da，在CH0細胞中合成。制造和配制不包括添加來自動物或人類來源的賦形劑（Metzner HJ，Weimer T，Kronthaler U,等人， Genetic fusion to albumin improves the pharmacokinetic properties of Factor IX.Thrombosis and Haemostasis 2009; 102:634-44) jIX-FP是通過源自參與FIX激活的內源性FIX序列的短的、可裂解的接頭將重組人類凝固FIX與重組人類白蛋白連接的高度純化的重組融合蛋白。該接頭通過相同的酶從融合蛋白裂解，例如，凝固因子XIa或因子Vila/ 組織因子，它們在血液凝固過程中激活FIX，去除白蛋白部分。rIX-FP作為用于以500和 1000IU/瓶的一次性使用藥瓶的IV注射的凍干的無菌制劑來提供，用于注射時用2.5mL無菌水重構。
[0204] 結果
[0205] 患者特征
[0206] 篩查了來自以色列和保加利亞的血友病治療中心的17名研究受試者并將其全部登記入本研究中。所有受試者均為高加索人和非西班牙人，他們的年齡范圍為13-46歲（平均年齡26歲）。在以色列登記的13名受試者均在研究期間（37-48周)接受rlX-FP的每周預防性治療，在保加利亞登記的4名患者在研究期間（15-22周)接受了 rlX-FP的出血事件按需治療。圖4中概括了受試者處置情況。
[0207] 篩查時，5名受試者（29%)為丙型肝炎陽性，1名受試者（6%)為乙型肝炎陽性，無受試者是HIV陽性。幾乎一半受試者(8/17)報告了骨骼肌疾病，包括血友病性關節病和慢性滑膜炎。5名受試者具有先前記錄的吉爾伯特綜合征的歷史，由基線處的高膽紅素水平所證實。整體而言，預防受試者較按需受試者年輕，包括三名18歲以下的受試者。預防受試者相較按需受試者具有較少的急性肝炎感染，報告較少的關節損傷(表4)。
[0208] 表4患者基本信息和醫學歷史

[0211 ] Min，最小;Max，最大;η，患者數;SD:標準偏差
[0212]安全性群體中的受試者在研究開始之前具有對FIX產品的估計的平均815暴露天 (ED)(415-1450)。在預防治療組研究中，3名受試者在研究開始之前已經接受了按需治療， 10名受試者正在接受FIX產物的預防治療(80%的受試者中每周2-3次）。在研究前12個月中，3名先前接受按需治療的受試者報告了比先前預防受試者高得多的平均的總出血數 (43.3相對5.2)。研究中的按需組中的受試者在研究之前的12個月中具有27的出血平均數。 [0213]藥代動力學
[0214] 在研究開始時，在先前沒有接受rIX-FP的15名受試者中評估了25IU/kg rlX-FP的單一劑量的藥代動力學（PK)WK參數與I期研究中報告的那些相當（Santagostino E， Negrier C,Klamroth R,Tiede A,Pabinger-Fasching I,Voigt C,等人.Safety and pharmacokinetics of a novel recombinant fusion protein linking coagulation factor IX with albumin(rlX-FP)in hemophilia B patients.Blood 2012；120:2405-11)。且先前已公布了平均單一劑量藥代動力學曲線(Martinowitz U,Lubetsky A.Phase I/II, open-label,multicenter, safety, efficacy and PK study of a recombinant coagulation factor IX albumin fusion protein(rlX-FP)in subjects with hemophilia B.Thrombosis Research 2013; 131S2:S11-S14) JSIU/kg rlX-FP的劑量具有每11]/1^1.5211]/北的平均增量回收，和94.8小時的平均半衰期。在單一劑量2511]/1^^父-FP之后，在第7天、第10天和第14天平均基線未修正的FIX活性為5.6、3.9和2.9IU/dL。
[0215] 劑量
[0216] 如方案中所規定，起初對所有預防受試者分配每周25-35IU/kg(平均30IU/kg) rIX-FP的預防劑量。在研究過程中，由于醫生決策（69.7%)、出血（18.2%)或其他原因 (12.1%)由研究者對劑量進行調整。在研究的最后12周中，每周預防的平均劑量為58.6IU/ kg(47.6-75IU/kg)，目的是不僅利用高低谷FIX活性水平防止自發性出血，還防止創傷引起的出血。這些劑量的低谷水平是高的，在給藥后5天（122小時)具有36.2%的FIX活性。
[0217] 如方案中所規定，對于出血事件的按需治療，起初對所有預防受試者分配每周30-3511]/1^(平均3311]/1^化1乂4?的預防劑量。在研究過程中，由于醫生決策(67.6%)、出血 (21.6%)或其他原因（10.8%)由研究者對劑量進行調整。對于所有出血事件的治療的平均劑量為46IU/kg，其中預防受試者較按需受試者分配的劑量更高（平均劑量62IU/kg相對 28IU/kg)。將按需劑量分配如預防劑量一樣的時間和劑量進行調整，為了受試者方便，在預防組中產生了更高劑量。
[0218] 安全性
[0219] 所有受試者中rIX-FP均是良好耐受的。對于預防受試者，治療持續時間為259-335 天，對于按需受試者，為105-155天，且接受預防的受試者參與研究比按需受試者更長(平均 315天相對131天）。對于rIX-FP總共為718ED，在預防受試者中對于rIX-FP為平均51.5ED，在按需受試者中對于rIX-FP為12ED。在研究過程中9名預防受試者達到至少50ED。
[0220] 在rIX-FP施用之后沒有受試者形成FIX的抑制物或rIX-FP的抗體。一名受試者在第一次rIX-FP給藥之前顯示了對于血漿來源的FIX和BeneFIX的暫時的陽性抗體，12周時則消退，此時該受試者對于針對所檢測的所有抗原的抗體是陰性的。無超敏反應。在研究過程中在任何安全性相關的參數中不存在顯著性的治療意外發現。
[0221] 總共14名受試者(82.4%)報告了 46個治療意外不良事件，研究者認為其均與rlX-FP無關(表5)。
[0222]表5突發不良事件治療的概覽
[0225] N，不良事件的受試者數;E，事件;AE，不良事件
[0226]全部的AE就嚴重度而言是輕微的或中度的。未報告嚴重的不良事件，沒有由AE導致的退出。最頻繁的AE種類是骨骼肌疾病（7名受試者(41.2% )，17個事件），和損傷(7名受試者(41.2%)，9個事件）。
[0227] 效力
[0228] 出血的治療
[0229] 7名預防受試者(53.8%)和4名按需受試者（100%)對自發性出血事件進行治療。在研究過程中，報告了總共85個出血事件需要rlX-FP的治療，其中近一半(54.1%)是自發性的。在預防受試者中，在預防治療期間的14個自發性出血是踝關節或肘關節。
[0230] 在研究過程中經歷出血事件的所有受試者中評價了出血的控制;在研究過程中對于所有需要治療的出血事件用一個劑量(95.3%)或兩個劑量(4.7%)的rlX-FP進行了成功的治療（圖5六）。用2811]/1^^乂4?對按需受試者進行了出血治療，97.3%的出血(38之37) 用單一劑量的rlX-FP進行了治療。用62IU/kg rIX-FP對預防受試者進行了出血治療， 93.6%的出血(47之44)用單一劑量的rIX-FP進行了治療。有4個出血需要兩個劑量的rlX-FP以達到止血。另外5個出血用單一劑量的rIX-FP進行了治療，然后在治療劑量的30小時之內用計劃的預防劑量的rIX-FP進行了治療。
[0231 ]大部分的輸注得到了由研究者針對rIX-FP治療分級的優或良分級(96.5% )。得到中等分級的有3個劑量;利用1次或2次輸注這些出血全部消退，在出血起始后第一次rIX-FP 治療的時間延遲了 8小時以上。雖然鼓勵受試者立即治療出血，有16.4 %的出血在出血開始后8小時以上接受治療，有5.9%的出血在出血開始后16小時以上接受治療（圖5B)。
[0232] 常規預防在11個月研究中，13名預防受試者均維持了 rIX-FP的每周常規治療。約一半預防受試者(46%，6名受試者)在研究過程中沒有任何自發性出血事件。在研究的預防部分期間，7名預防受試者報告了 14個自發性出血，2個自發性出血發生在藥代動力學的末期。7名報告自發性出血的受試者中有4個具有血友病性關節病或關節滑膜炎的病史;其余3 名受試者均為青少年，其中2名在研究開始前僅在接受按需治療。
[0233] 在研究開始前接受FIX產物的預防的10名受試者中，在從每周一次到每周三次的不同治療方案中，5名接受了 pdFIX，5名接受了 rFIX。在進入研究之前，受試者具有平均每周 87.7IU/kg的FIX消耗，在研究末期具有58.6IU/kg的平均每周rIX-FP劑量。平均每周rIX-FP 消耗比研究開始之前所用的FIX產物的平均每周消耗低33%。
[0234] 年度出血率總體而言，預防受試者較之接受按需治療的受試者報告了更少的自發性出血事件。按需受試者在研究期間具有平均8.0的自發性出血事件，年度出血率(ABR)為每年21.74個自發性出血。按需受試者在研究期間具有平均1.1的自發性出血事件，年度出血率(ABR)為每年1.26個自發性出血。預防受試者和按需受試者具有相似的每年年度創傷出血事件率。在研究期間，對于預防受試者和按需受試者，總體出血的平均ABR分別為4.35 和28.8。
[0235] 在預防治療組中，在研究開始之前10名受試者接受了預防方案。在研究開始前12 個月中的10名受試者報告了比研究中的每周rIX-FP預防的ABR高約50%或30%的平均自發性出血率或總體出血率。
[0236] 在預防治療組中，在研究開始之前3名受試者接受了按需治療。該3名受試者在研究開始前12個月中的報告了比研究開始前接受了預防治療的預防受試者高得多的歷史平均自發性出血率(31.7)和總出血率(43.3)(圖6)。在開始rIX-FP的每周預防之后，平均年度自發性出血率和總出血率分別為1.56和7.3每年。在該受試者亞組中，當與歷史數據相比較時，平均年度自發性出血率或總出血率降低了95%或83%。
[0237] 討論
[0238]患有嚴重血友病B的13名患者接受了11個月的rIX-FP預防治療，9個接受了至少50 個暴露天。此外，4名患者在3-5個月的時間僅當經歷出血事件時接受rIX-FP。
[0239]已顯示白蛋白融合技術是延長凝固因子的半衰期的非常吸引人的技術，因為人類白蛋白是豐富的血漿蛋白，并且其不會觸發免疫系統。在本研究中，在逾700個重復的rlX-FP暴露之后，在17個研究受試者中沒有超敏反應或沒有形成FIX的抑制物或rIX-FP的抗體。 [0240] rIX-FP在出血事件的治療中是非常有效的，在95%的時間在單一劑量之后達到了止血，且所有出血均用一個或兩個劑量有效治療。這有利地相當于利用BeneFIX"進行的治療，已報告其在臨床試驗中在先前治療國的患者中以單一劑量有效治療了81 %的出血（ BeneF 丨 X? Package Insert .2011 No vember 可見于：//labeli ng .pfizer. com/ showlabeling.aspx?id = 492)。雖然用以治療出血的rIX-FP的范圍較大，所用的rIX-FP的劑量和需要達到止血的治療的數目之間無明顯關聯。為治療任何出血事件，對所有預防受試者分配了高劑量的rIX-FP。因為對于每一位預防患者預防和治療劑量是相同的（為患者方便），所選擇的劑量由治療醫師決定。按需受試者用28IU/kg的平均劑量(與預防受試者中所用的rIX-FP劑量相比少50%)來治療出血，并具有相似的成功率，且按需受試者中97.3% 的出血用單一劑量的rIX-FP來治療。用62IU/kg的平均劑量對預防受試者進行了出血治療，且93.6 %的出血用單一劑量的r IX-FP進行了治療。所分配的治療出血的r IX-FP劑量中的差異可能是多重因素的結果，包括預防治療狀況，患者的出血表型和本地護理標準，但較低劑量的r IX-FP對于治療出血事件同樣有效。
[0241] 在研究期間，所有13名預防受試者對于11個月的rIX-FP預防維持了每周治療間隔。具有優良的治療依從性，大部分受試者按計劃應用了其處方劑量。當每周接受1次、2次或3次的血漿來源的或重組的FIX的預防時，每周預防的這些受試者的年度出血率小于其先前的出血率。在研究期間，6名受試者未報告自發性出血事件，其中5名在研究開始之前的12 個月期間無自發性出血事件。在研究開始之前未接受預防治療的有3位受試者;與按需治療時所報告的年度出血率相比較，這些受試者的年度出血率降低了 83%。顯著地，該3名受試者中的1名在研究過程中無自發性出血性事件。雖然這是非常小的樣品量，從rIX-FP的按需到每周預防治療顯著地降低了這些受試者的出血率。
[0242] 該概念研究的證據表明了利用由連接凝固FIX與白蛋白的重組融合蛋白（rIX-FP) 所提供的延長的半衰期，較不頻繁的預防治療方案是可能的。此外，rIX-FP為患有終生的、衰弱性出血疾病的患者提供了有效的按需治療。安全性特征將使rIX-FP成為血友病B患者的長期預防的優良選擇。
[0243] 實施例2:在血友病B受試者中進行的重組凝固因子IX白蛋白融合蛋白（rIX-FP)的 3b期開放標示的、多中心、安全性和效力拓展研究
[0244] 1.研究概述
[0245] 開發了評估rIX-FP的長期安全性和效力的前瞻性、開放標示的研究以在血友病B 受試者中對出血事件預防治療。該研究將包括，但不限于，登記入我們先前的II/III期和 III期臨床研究的研究受試者。此外，可能登記入先前未完成CSL-資助的rIX-FP導入研究的需要重大非急診手術的受試者。在該研究末期，預期在所有CSL資助的rlX-FP研究中的登記過程中，來自導入研究的受試者具有累積的至少100個rIX-FP暴露天。
[0246] 該拓展研究由近3年的預防治療期組成，期間受試者將施用rIX-FP作為常規預防。在初始的6個月期間，受試者將接受rIX-FP的預防治療，利用以下治療間隔：
[0247] ?分支1:每7天、每10天或每14天一次
[0248] ?分支2:每7天一次
[0249] ?分支3:每7天一次
[0250] 在起始6個月期間之后，所有受試者將接受每7天、每10天、每14天或每21天一次施用的rIX-FP的預防治療，再持續約30個月。轉移到21天治療間隔的受試者必須2 18歲。首次轉移為21天治療間隔的任何受試者必須已經完成了 14天治療間隔的6個月的預防治療，且必須經歷了 l〇〇IU/kg的單一rIX-FP劑量的初始PK評估期。在研究期間，受試者可能在研究者考慮下或CSL要求下進行另外的rIX-FP PK評估。
[0251] 接受重大非急診手術的分支3中的受試者將經歷初始的PK評估（100IU/kg rlX-FP)以確定增量回收和FIX活性。然后這些受試者將完成手術亞組研究，然后他們可開始預防治療期。
[0252] 利用21天治療間隔的預防治療將僅可用于2 18歲的、已完成具有14天治療間隔的至少6個月預防治療的受試者。若受試者未從21天治療間隔受益，他們將在研究者的考慮下在任何時間轉移至7、10或14天間隔。
[0253] 該研究將記錄目的治療群體中所有關鍵的安全性因素，包括免疫原性、血栓性、超敏性和其他AE。
[0254] 因此，對于登記入本研究的受試者，研究的相關受益風險評估是可接受的。
[0255] 2.研究目標和終點
[0256] 2.1主要目標和終點
[0257] 2.1.1主要目標
[0258] 本研究的主要目標是在患有嚴重血友病B的受試者中按通過針對FIX的抑制物的新事件所測量的評估rIX-FP的安全性。
[0259] 2.1.2主要終點
[0260] 在近3年的該拓展研究參與之后，產生針對FIX的抑制物的受試者的總數。
[0261] 2.2次級目標和終點
[0262] 2.2.1次級目標
[0263] 本研究的次級目標是：
[0264] ?評估以不同的治療間隔施用時rIX-FP常規預防的效力。
[0265] ?比較2種不同的治療間隔的rIX-FP常規預防的效力，并與按需治療相比。
[0266] ?進一步評估rIX-FP的安全性。
[0267] 2.2.2次級終點
[0268] ?因治療間隔導致的自發性治療的出血的總治療出血的年度出血率(ABR)。
[0269] ?對于來自導入II/III期研究分支2的受試者，將該拓展的研究中的14天的常規預防治療間隔和以下之間的自發的經治療的出血的ABR進行比較：
[0270] ?在導入研究期間僅按需治療。
[0271] ?在導入研究和該拓展研究期間以7天治療間隔的先前的常規預防治療。
[0272] ?常規預防期間rlX-FP的消耗，表示為每受試者每月IU/kg。 _] 2.3探索性目標和終點
[0274] 2.3.1探索性目標
[0275] 另外，本研究的探索性目標包括：
[0276] ?在長達3年的時間，當以不同的治療間隔用于常規預防時，進一步評估rlX-FP的效力。
[0277] ?評估100IU/kg的劑量的rIX-FP的PK特征。
[0278] ?描述來自導入III期研究的兒童受試者在1年隨訪后的QoL。
[0279] 3.研究設計
[0280] 3.1研究設計和基本原理
[0281] 該多中心、開放標示的3b期研究將在血友病B的受試者中研究rIX-FP用于出血事件的常規預防和按需治療的長期安全性和效力。若受試者已經完成Π /ΙΙΙ期或III期研究，或任何其他CSL資助的rIX-FP研究并符合全部其他合格中選標準，則受試者將合格進入研究。此外，先前未完成CSL資助的rIX-FP導入研究的受試者若需要重大非急診手術并符合全部其他合格中選標準則可合格進入研究中。
[0282] 3.1.1常規預防：前6個月
[0283]分支1:來自全部導入研究的受試者
[0284] 在前6個月期間，分支1中的受試者將施用rIX-FP作為常規預防，由研究者確定利用與導入研究中相同的治療間隔或利用7天、10天或14天的不同的治療間隔。所施用的rlX-FP的劑量(35到75IU/kg)將基于受試者先前對rIX-FP治療的反應和/或FIX低谷活性(參見章節4.1.1)和章節3.2.1.3中的劑量指南。
[0285] 分支 2
[0286] 來自導入II/III期分支2的受試者，具有2 26周的7天治療間隔的^乂4?預防治療經歷
[0287] 在前6個月期間，組中的受試者將施用rIX_FP(75IU/kg)作為常規預防，利用14天的治療間隔。
[0288] 分支 3
[0289] 完成手術亞組研究之后，分支3中的受試者可開始主研究中的預防治療期。在前6 個月期間，受試者將利用7天間隔施用rIX-FP作為預防。所施用的rIX-FP的劑量(35-50IU/ kg)將基于受試者的FIX低谷活性(參見章節4.1.1)。
[0290] 3.1.2常規預防:6-36個月
[0291] 完成初始6個月治療期之后，在研究的其余的時間，所有受試者（即，分支1、2和3) 將利用7天、10天或14天的治療間隔施用rIX-FP作為常規預防。來自導入II/III期分支2的受試者，在前6個月期間利用了7天治療間隔，將轉換為14天治療間隔，持續至少6個月。
[0292] 從研究的6個月到36個月，受試者可使用相同的治療間隔或他們可在接下來的6個月隨訪的任何時間經向研究者咨詢而改變治療間隔（參見章節3.2.1.2)。所施用的rIX-FP 的劑量將在35IU/kg和75IU/kg之間（參見章節4.1.1)。
[0293] 2 18歲的受試者還可以100IU/kg的劑量利用21天治療間隔使用rIX-FP作為常規預防。〈18歲的受試者不允許使用21天治療間隔。
[0294] 首次轉移為21天治療間隔的任何受試者必須已經完成了 14天治療間隔的6個月的預防治療，且必須經歷了l〇〇IU/kg rIX-FP的PK評估。
[0295] 3 · 1 · 3rIX-FP( 100IU/kg)的藥代動力學評估
[0296] 若受試者1)在分支3中或2)打算首次開始利用21天治療間隔施用rIX-FP作為常規預防，則他們必須利用單次注射rIX-FP(100IU/kg)進行PK評估。PK評估應該在對于目前市售的FIX產物(分支3)至少4天的清除期或對于rIX-FP至少14天的清除期之后進行。在施用 rIX-FP之前、完成注射之后30分鐘（評估高峰FIX活性水平和增量回收）和注射后的特定的時間點收集用于PK評估的樣品。
[0297] 根據研究者的考慮或CSL的要求，或在差效力或懷疑形成抑制物的事件中（不限于此），研究者還可選擇在開始利用rIX-FP進行外科預防（對于來自導入研究的受試者）之前在選擇的時間點完成50、75或100IU/kg(視需要)rIX-FP的PK評估。
[0298] 3.2劑量和給藥方案
[0299] 3.2.1常規預防治療
[0300] 3.2.1.1rIX-FP 治療間隔
[0301]在研究的前6個月期間，受試者或他們的護理者將利用以下的治療間隔施用rlX-FP作為常規預防。
[0302] ?分支1:7天、10天或14天
[0303] ?分支2:7或14天
[0304] ?分支3:7天
[0305] 對于分支1中的受試者，在研究的開始，將基于受試者先前的經歷（即，導入研究期間）和受試者偏好由研究者選擇治療間隔。
[0306] 對于分支2中的受試者，治療間隔將基于其在導入研究中的預防治療的持續事件；在導入研究期間完成了至少26周預防治療的受試者將分配14天治療間隔，在導入研究期間未完成至少26周預防治療的受試者將分配7天治療間隔。分支2中開始7天治療間隔并完成了總共（即，導入研究和本研究期間）至少26周的預防治療的受試者，將然后轉換為14天治療間隔，持續至少6個月。
[0307] 完成手術亞組研究之后，分支3中的受試者可開始主研究中的預防治療期。在前6 個月期間，該組中的受試者將施用rIX-FP作為常規預防，利用7天的治療間隔。所施用的 rIX-FP的劑量(35-50IU/kg)將基于受試者的FIX低谷活性(參見章節4.1.1)。在初始6個月時間的末期，受試者可利用其目前的治療來維持，或他們可轉換為7天、10天或14天治療間隔。2 18歲的受試者還可在完成至少6個月的14天預防方案和10011]/1^^乂4??1(評估期之后轉換為21天治療間隔（參見章節3.1.3)。
[0308] 3.2.1.2改變11乂+?治療間隔
[0309] 在每6個月的治療期中，除非研究者認為受試者安全所需，治療間隔不應該改變。在每6個月的時間的末期（即，在6個月、12個月、18個月、24個月和30個月隨訪就診），研究者可選擇基于其效力/安全性的評價、受試者治療順應性和/或受試者偏好來改變治療間隔。
[0310] 3.2.1.3rIX-FP 劑量
[0311] 用于常規預防所施用的rlX-FP的劑量將基于受試者的先前經歷（即，導入研究期間）和/或目標FIX活性低谷水平（目標FIX活性水平>2%，但最佳地，在5和15%之間）。除非對于給定受試者的較高劑量經CSL批準，用于常規預防的rlX-FP的最大劑量將是利用7天治療間隔的對受試者為每次注射50IU/kg，和利用10天或14天治療間隔的對于受試者為每次注射75IU/kg(表ehrIX-FP的劑量將是利用21天治療間隔的對受試者為每次注射100IU/kg (表6)。對于所有治療間隔，在每月CSL批準的情況下，28天期間用于常規預防施用的rlX-FP 的總劑量不超過250IU/kg。
[0312]表6預防性治療的劑量指南
[0314] 1. 10天治療間隔可基于每10天一次或每月3次（即，每月第1天、第11天和第21天）的計劃。
[0315] 2.如果第7天FIX活性低谷水平〈5%則高于5011]/1^加^4?劑量是可接受的，且較高的低谷水平是預防自發性出血所必需。
[0316] 4.給藥和施用
[0317] 4.1給藥和施用
[0318] 研究者(或代表)將遵循本研究方案中所列的程序僅向本研究所包括的受試者或其護理者施用或分配rIX-FP。受試者或其護理者或有資格的研究人員將施用作為彈丸IV注射的 rIX-FP。
[0319] 當進行劑量計算時，如果可能，總實際單位（即，作為每處方劑量的)可四舍或五入成目標滿的小瓶(作為實際IU)，但最終劑量需要在處方劑量的10%內。rIX-FP的劑量基于 eCRF中記錄的受試者最近的體重。
[0320] 4.1.1用于預防治療的劑量的調整
[0321]預防所需的rlX-FP劑量將基于受試者先前的經歷和/或目標FIX活性。下式將用于基于高峰所需的FIX活性計算劑量：
[0323] 用于常規預防的目標低谷FIX活性高于2%，但最佳地，高于基線5%至15%。
[0324] 5 ·藥代動力學和藥效動力學
[0325] 5.1藥代動力學分析
[0326] 5.1.1低谷因子IX活性水平
[0327] 在研究期間，在每個重要出血事件(若可行)和特定的隨訪就診采集血液樣品用于評估低谷FIX活性水平。
[0328] 5 · 1 · 2rIX_FP的藥代動力學評估
[0329] 此外，首次利用21天治療間隔開始常規預防治療的受試者和分支3中的受試者將利用r IX-FP (100 IU/kg)的單次注射進行PK評估。對于該PK評估，在注射之后的以下時間點 (需要的或可選的)采集用于測量FIX活性的血液樣品：
[0330] · 30 ±5分鐘
[0331] · 72±24小時（SP，3±1 天）
[0332] · 168±24 小時（SP，7±1 天）
[0333] · 336±24小時（SP，14±1 天）
[0334] · 504±24小時（SP，21±1 天）
[0335] 若在PK評估期過程中，受試者經歷了出血事件，無論是否治療該出血事件，則將不再采集作為PK評價的部分的血液樣品。PK可以或可不必進行重復。
[0336] 根據研究者的考慮或CSL的要求，或在差效力或懷疑形成抑制物的事件中（不限于此），或在重大手術之前，還可評價50、75或100IU/kg rIX-FP(伴隨所選擇的時間點）的PK評估。
[0337] 將報告增量回收和FIX活性。若認為恰當，可計算另外的PK參數(例如，AUC，t1/2)。
[0338] 實施例3:在血友病B受試者中以21天給藥間隔進行的重組凝固因子IX白蛋白融合蛋白（rIX-FP)的3b期研究
[0339] 2 18歲的受試者還可以達100IU/kg的劑量利用21天治療間隔使用rIX-FP作為常規預防。起初，他們必須在至少14天的rIX-FP清除期之后經歷利用rIX-FP(100IU/kg)的單次注射進行的PK評估期。
[0340]為參與21天治療方案，必須符合以下的標準：
[0341] 1.受試者至少18歲。
[0342] 2.在II/III期或III期研究中以14天治療間隔方案完成了至少6個月的rIX-FP常規預防。
[0343] 3.完成了 100IU/kg rIX-FP的21天藥代動力學評估。
[0344] 另外，研究者應當在改變間隔治療之前評價以下：
[0345] 1.效力和安全性
[0346] 2.受試者治療順應性
[0347] 3.受試者偏好
[0348]因此，對于21天治療方案合格的受試者將已經進行了至少一年的常規預防（導入研究中至少6個月的7天治療間隔，和導入研究中或3001研究中14天治療間隔）。在受試者能夠轉換到較長的治療間隔之前將完成l〇〇IU/kg rIX-FP的PK，允許在以該劑量起始預防之前評估受試者的21天低谷水平。
[0349] 觀察到具有凝集因子水平>lIU/dl(>l%)的中度血友病患者罕有經歷自發性出血，并且更好地保持了關節功能，從而構想了預防。因此，維持FIX活性水平高于1%的預防方案被視為FIX替代治療的替代效力評價。基于來自兩個完成的rIX-FP臨床研究的PK數據的PK建模表明了在施用100IU/kg rIX-FP后21天，68%的研究受試者可能具有高于基線2% 的FIX活性，95 %的受試者可能具有高于基線的1 %的FIX活性，還參見圖7。
[0350] 表7:對于不同的rIX-FP給藥方案預測的PK值
[0352] Cft^/最小=最大或最小的FIX活性水平
[0353] 與PK建模一致，在完成的II/III期研究之一中，兩名研究受試者在超過14天后參與了50IU/kg的rIX-FP PK評價；一名受試者在地19天具有高于基線2.1 %的FIX活性水平 (rIX-FP之前的FIX活性），另一受試者在50IU/kg rIX-FP注射后第21天具有高于基線1.7% 的FIX活性水平。
[0354] 理想地是大部分血友病患者在100IU/kg rIX-FP注射后第21天具有高于1%的低谷水平，且他們可作為21天預防方案的候選者。然而，最佳治療方案必須與臨床結果（比如臨床反應，受試者的體力活動、出血頻率、關節狀況、生活質量或想要具有更高的低谷)相結合，這可能是選擇治療間隔是最重要的決定因素。
[0355] 利用大約5位血友病患者進行了 100IU/kg rIX-FP給藥方案的研究。在0小時、0.5 小時、72小時（3天）、168小時(7天）、336小時（14天)和504小時(21天)后測量了FIX活性(IU/ dL % )。預防性方案顯示了在1001U/kg rIX-FP注射后第21天至少4.1 %的FIX活性。結果總結于以下表8中。
[0356] 表8:100IU/kg rIX-FP給藥方案的FIX活性（IU/dL%)
[0357]
[0358] 平均=基于測量的值和參與者數目的平均值，SD =標準偏差，N=患者數
[0359] 圖8顯示了FIX活性值（IU/dL%)隨時間推移的圖。圖9顯示了這些值與當應用 50IU/kg rix-FP給藥方案和當應用50IU/kg rFIX( BeneFiX?)時的對應的值的比較。
[0360] 3b期研究目的為在參與兩個III期登記研究或任何其他CSL資助的rix-FP導入研究的受試者中用于常規預防的rIX-FP的長期安全性和效力。在該研究末期，預期在所有CSL 資助的rIX-FP研究中的登記過程中，受試者具有累積的至少100個rIX-FP暴露天(ED)。我們想要允許包括患者及其醫師可選擇的方案的更多的靈活的預防方案。
[0361] 實施例4:群體PK建模
[0362]基于來自先前臨床試驗的PK數據，在血友病B受試者中進行了重組因子IX白蛋白融合蛋白的群體藥代動力學分析以在血友病B受試者中表征群體PK，以鑒定可變性和PK可變性的可能的決定因素(人口統計和臨床相關變量），以模擬不同的給藥方案的穩態FIX活性-時間譜。
[0363] 進行了模擬以確定在25IU/kg、50IU/kg或75IU/kg的單次劑量之后FIX活性維持在高于1 %、3%和5%的低谷水平多久。結果總結于表9a。
[0364] 表9a:外源FIX活性維持在高于1、3和5%的模擬持續時間
[0365]
[0366] 關于多種給藥方案的模擬的穩態低谷外源FIX活性水平總結于表9b。
[0367] 表9b:模擬的低谷外源FIX活性的總結
[0368]
[0369] 術語平均值指基于所有數據所計算的中值。括號中的值為5%和95%界限。
[0370] 表9c:給藥指南
[0372] 1. 10天治療間隔可基于每10天一次或每月3次（即，每月第1天、第11天和第21天）的計劃。
[0373] 2.如果第7天FIX活性低谷水平〈5%則高于4011]/1^的^乂4?劑量是可接受的，且較高的低谷水平是預防自發性出血所必需。
[0374] 實施例5:在血友病B受試者中的重組凝固因子IX白蛋白融合蛋白（rIX-FP)的II/ III期臨床研究中觀察到的FIX活性水平
[0375] 該II/III期研究是開放標示的研究以評估rlX-FP的效力、藥代動力學和安全性，其被開發用于在具有先天性因子IX(FIX)缺陷(血友病B)的患者中進行出血事件的預防(研究的分支2)和治療。該研究由以下組成:少于1個月的篩查期、14天藥代動力學(PK)評估期，然后是約14個月的rlX-FP的安全性和效力評估期。
[0376] 在研究的開始評估了 rlX-FP的完全PK。此外，在研究開始時，在受試者的亞組中評估了先前的FIX產物(血漿來源的或重組的）的藥代動力學(PK)。圖11顯示了研究的流程圖，包括研究分支、預防和按需分支。
[0377] 預防受試者(分支1):
[0378]約40個受試者開始了 14個月的預防治療期，其包括兩半，和接受rlX-FP的一個或兩個治療方案的受試者。受試者起始利用35-50IU/kg rlX-FP的預防劑量來治療，如方案中所說明的，將劑量調節至高達最大75IU/kg，目的是維持劑量見高于1 %的低谷FIX活性水平。在研究的第一段(26-30周)維持了 7天的治療間隔。在研究的第二半，一部分受試者轉換為預防治療方案，治療間隔為10天或14天，持續至少30周，劑量為75IU/kg rlX-FP。
[0379] II期/III期的結果表明了rIX-FP的優良的安全性特征。無受試者形成FIX抑制物、 rIX-FP抗體或CH0宿主細胞蛋白抗體。僅在7.9 %受試者中報告了不利反應，未見過敏反應。總結，rIX-FP對于控制和預防出血事件、常規預防和手術期間預防是有效的。
[0380] 通過利用本發明的rix-FP，當比較先前Fix(BeneF丨X⑧）的每月劑量時，每月的 FIX消耗降低了，參見表10。當應用50IU/kg rIX-FP的10天或14天給藥間隔時，每月消耗甚至進一步降低了，這表明了本發明的rIX-FP的高度穩定性。
[0381] 表10:利用如表8、9和10中所展示的rIX-FP的劑量以7天、10天或14天的治療間隔每月對rix-FP的消耗。與先前的Fix(BeneFlX?)的每月消耗水平相比較
[0383] IQR:四分位數間距。平均值指通過將每月的rIX-FP消耗值相加并除以患者數計算的平均數值，而中值意為一半研究受試者具有較高的每月rIX-FP消耗，而一半研究受試者具有較低的每月rIX-FP消耗。
[0384] 按需受試者(分支2):
[0385] 約25名按需受試者登記入本研究，本研究由以下組成:一個月篩查期、約26周的按需治療(僅在出血事件后接受rIX-FP)，然后是rIX-FP的預防性每周治療。將按需治療的年度出血率與預防治療相比較。在該研究過程中，每4±1周受試者就診于研究中心以進行包括FIX活性水平檢驗的評價。因此，我們能夠貫穿本研究收集FIX活性水平。
[0386] 大部分按需受試者每月需要一次以上的治療（由于出血）。然而，按需受試者中的兩名在治療之間比一個月更長，使得可能在自先前rlX-FP治療的28天檢驗FIX活性(表11)。 [0387] 表11基線的FIX活性和第28天的FIX活性
[0389]觀察到具有凝集因子水平>lIU/dl(>l%)的中度血友病患者罕有經歷自發性出血，并且更好地保持了關節功能，從而構想了預防。因此，維持FIX活性水平(血漿水平)高于 1 %的預防方案是FIX替代治療的目標。該初始數據表明了在血友病受試者中在rlX-FP注射后第28天，高于50或100IU/kg的rlX-FP的劑量可能足以證明高于基線1%的FIX活性，這暗示了每月的給藥間隔可能是可行的。
[0390]進行了基于來自完成的rlX-FP II/III期臨床研究的PK數據的PK建模，并將其與基于可用的ALPR0LIX?動力學數據的對應的PK建模數據相比較。
[0391] 基于來自完成的rlX-FP II/III期臨床研究的PK數據的PK建模表明了利用 33.33IU/kg rlX-FP的每周給藥間隔，50%的研究受試者具有高于基線的10%FIX活性的低谷，參見圖12A(左圖）。基于ALPR0LIX?PK動力學數據進行了類似的PK建模。當應用50IU/kg ALPR0LIX?的每周給藥間隔時，50 %的研究受試者具有高于基線2 %的FIX活性的低谷，參見圖12A(右圖）。
[0392] 基于來自完成的rIX-FP II/III期臨床研究的PK數據的另一項PK建模表明了利用 50IU/kg rlX-FP的10天給藥間隔，50%的研究受試者具有高于基線的7.5%FIX活性的低谷，參見圖12B(左圖）。基于ALPR0LIX?PK動力學數據進行了類似的PK建模。當應用100IU/kg ALPR0LIX?的每10天給藥間隔時，50 %的研究受試者具有高于基線2 %的FIX活性的低谷，參見圖12B(右圖）。
[0393] 基于來自完成的rIX-FP II/III期臨床研究的PK數據的另一項PK建模表明了利用 75.0IU/kg的14天給藥間隔，50%的研究受試者具有高于基線的5%FIX活性的低谷，參見圖 12C(左圖）。基于ALPR0LIX?PK動力學數據進行了類似的PK建模。當應用100IU/kg ALPR0LIX?的每10天給藥間隔時，50 %的研究受試者具有高于基線2 %的FIX活性的低谷，參見圖12C(右圖）。
[0394] 實施例6:在將50IU/kg的rlX-FP或rIX-Fc(Alprolix?)施用于人類受試者之后，來源于自人類血漿中獲得的rlX-FP或rIX-F C(Alpr〇lixTM)的濃度衰退數據的PK參數
[0395] 約28名受試者注射了 50 IU/kg劑量的r IX-FP。測量了隨時間推移人類血漿中的 r IX-FP活性。分析了 r IX-FP的衰退動力學，從其中確定了表12中所示的藥代動力學參數。特別是，表12展示了藥代動力學參數的算術平均值和對應的變異系數(CV)。
[0396] 表12中顯示的rIX-Fc(Alprolix?)藥代動力學參數源自22個患者的研究，如 Alprolix? FDA處方信息中所公開。
[0397] 表12:rIX-FP和rIX-Fc(Alprolix?)的藥代動力學參數的比較
[0398]
[0399] 縮寫:AUCinf = FIX活性時間曲線下面積;tl/2 =消除半衰期;CL/BW=體重調整的清除;增量回收=定義為所施用的每IU/kg，血漿中IU/dl增加，Vss/BW =體重調整的穩態分布的體積，MRT =平均停留時間，N=人受試者的近似數目
[0400] 根據以上數據，與rIX-Fc(ALPROLIX?)相比，rIX-FP具有高3.8倍的AUCO-inf，約降低3.7倍的CL/BW，約高26 %的增量回收，約低3.2倍的分布體積和增加約19 %的藥物平均停留時間。這些PK值表明了本發明的因子IX融合蛋白（rIX-FP)的增高的活性和穩定性。
【主權項】
1. 一種用于在受試者中預防出血的方法中的融合蛋白，包括： a) 因子IX(FIX)部分，和 b) 半衰期增強多肽(HLEP) 其中將所述融合蛋白以約每周一次的給藥間隔以約25-75IU/kg的劑量施用于受試者。2. 如用于權利要求1所述用途的融合蛋白，其中所述劑量為約35-75IU/kg。3. 如用于權利要求1或2所述用途的融合蛋白，其中所述劑量為約35-55IU/kg。4. 如用于權利要求1-3中任一項所述用途的融合蛋白，其中所述劑量為約35-50IU/kg。5. 如用于權利要求1所述用途的融合蛋白，其中所述劑量為約25-50IU/kg。6. 如用于權利要求1或5所述用途的融合蛋白，其中所述劑量為約25-40IU/kg。7. 如用于權利要求1-5中任一項所述用途的融合蛋白，其中所述劑量為約50IU/kg。8. 如用于權利要求1-5中任一項所述用途的融合蛋白，其中所述劑量為約45IU/kg。9. 如用于權利要求1-6中任一項所述用途的融合蛋白，其中所述劑量為約40IU/kg。10. 如用于權利要求1-6中任一項所述用途的融合蛋白，其中所述劑量為約35IU/kg。11. 如用于權利要求1所述用途的融合蛋白，其中所述劑量為約25IU/kg。12. 如用于權利要求1-11中任一項所述用途的融合蛋白，其中所述給藥間隔為約每6-8 天一次。13. 如用于權利要求1-12中任一項所述用途的融合蛋白，其中所述給藥間隔為約每7天一次。14. 如用于權利要求1-13中任一項所述用途的融合蛋白，其中對于整個給藥間隔，所述 FIX的血漿水平維持了高于基線至少約1 %的低谷。15. 如用于權利要求14所述用途的融合蛋白，其中對于整個給藥間隔，所述FIX的血漿水平維持了高于基線至少約2%的低谷。16. 如用于權利要求14所述用途的融合蛋白，其中對于整個給藥間隔，所述FIX的血漿水平維持了高于基線5%和15%之間的低谷。17. -種用于在受試者中預防出血的方法中的融合蛋白，包括： a) 因子IX(FIX)部分，和 b) 半衰期增強多肽(HLEP) 其中將所述融合蛋白以約每8-11天一次的給藥間隔以約50-95IU/kg的劑量施用于受試者。18. 如用于權利要求17所述用途的融合蛋白，其中所述劑量為約50-75IU/kg。19. 如用于權利要求17或18所述用途的融合蛋白，其中所述劑量為約75IU/kg。20. 如用于權利要求17或18所述用途的融合蛋白，其中所述劑量為約50IU/kg。21. 如用于權利要求17-20中任一項所述用途的融合蛋白，其中所述給藥間隔為約每10 天一次。22. -種用于在受試者中預防出血的方法中的融合蛋白，包括： a) 因子IX(FIX)部分，和 b) 半衰期增強多肽(HLEP) 其中將所述融合蛋白以約每兩周一次的給藥間隔以約50_95IU/kg的劑量施用于受試者。23. 如用于權利要求22所述用途的融合蛋白，其中所述劑量為約65-85IU/kg。24. 如用于權利要求22或23所述用途的融合蛋白，其中所述劑量為約60-80IU/kg。25. 如用于權利要求22-24中任一項所述用途的融合蛋白，其中所述劑量為約70-80IU/ kg〇26. 如用于權利要求22所述用途的融合蛋白，其中所述劑量為約50-75IU/kg。27. 如用于權利要求22-26中任一項所述用途的融合蛋白，其中所述劑量為約75IU/kg。28. 如用于權利要求22或26所述用途的融合蛋白，其中所述劑量為約50IU/kg。29. 如用于權利要求22-28中任一項所述用途的融合蛋白，其中所述給藥間隔為約每 12-16 天一次。30. 如用于權利要求22-29中任一項所述用途的融合蛋白，其中所述給藥間隔為約每14 天一次。31. -種用于在受試者中預防出血的方法中的融合蛋白，包括： a) 因子IX(FIX)部分，和 b) 半衰期增強多肽(HLEP) 其中將所述融合蛋白以約每三周或更長時間一次的給藥間隔以至少約90_250IU/kg的劑量施用于受試者。32. 如用于權利要求31所述用途的融合蛋白，其中所述劑量為約90-150IU/kg。33. 如用于權利要求31或32所述用途的融合蛋白，其中所述劑量為約95-110IU/kg。34. 如用于權利要求31-33中任一項所述用途的融合蛋白，其中所述劑量為約95-105IU/kg〇35. 如用于權利要求31-34中任一項所述用途的融合蛋白，其中所述劑量為約100IU/ kg〇36. 如用于權利要求35所述用途的融合蛋白，其中對于整個給藥間隔，所述FIX的血漿水平維持了高于基線至少約2-4%的低谷。37. 如用于權利要求35或36所述用途的融合蛋白，其中對于整個給藥間隔，所述FIX的血漿水平維持了高于基線至少約4%的低谷。38. 如用于權利要求31-37中任一項所述用途的融合蛋白，其中所述給藥間隔為約每 19-23 天一次。39. 如用于權利要求31-38中任一項所述用途的融合蛋白，其中所述給藥間隔為約每21 天一次。40. 如用于權利要求31所述用途的融合蛋白，其中所述給藥間隔為約每月一次。41. 如用于權利要求40所述用途的融合蛋白，其中所述劑量為約140-200IU/kg。42. 如用于權利要求40或41所述用途的融合蛋白，其中所述劑量為約140-160IU/kg。43. 如用于權利要求40-42中任一項所述用途的融合蛋白，其中所述劑量為約150IU/ kg〇44. 如用于權利要求40-43中任一項所述用途的融合蛋白，其中所述給藥間隔為約每28 天一次。45. 如用于前述權利要求中任一項所述用途的融合蛋白，其中所述半衰期增強多肽 (HLEP)是白蛋白（FP)或無抗原結合區的免疫球蛋白（例如，Fc)。46. 如用于前述權利要求中任一項所述用途的融合蛋白，其中所述半衰期增強多肽 (HLEP)是白蛋白（FP)。47. 如用于前述權利要求中任一項所述用途的融合蛋白，其中所述因子IX(FIX)部分經由肽接頭與半衰期增強多肽(HLEP)連接。48. 如用于權利要求47所述用途的融合蛋白，其中所述肽接頭是可裂解的。49. 如用于權利要求48所述用途的融合蛋白，其中所述肽接頭可通過參與凝固的蛋白酶或由凝固酶激活的蛋白酶裂解。50. 如用于權利要求48或49所述用途的融合蛋白，其中所述接頭可通過FIXa和/或通過 FVIIa/組織因子(TF)裂解。51. 如用于權利要求46-50中任一項所述用途的融合蛋白，其中所述接頭包括選自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的序列。52. 如用于權利要求46-51中任一項所述用途的融合蛋白，其中所述融合蛋白的序列具有SEQ ID NO: 1中所示的序列。53. 如用于權利要求46-51中任一項所述用途的融合蛋白，其中所述融合蛋白的序列與 SEQ ID NO: 1中所示的序列具有至少70%同一性。54. 如用于前述權利要求中任一項所述用途的融合蛋白，其中所述受試者是人。55. 如用于權利要求54所述用途的融合蛋白，其中所述人罹患血友病B。56. 如用于前述權利要求中任一項所述用途的融合蛋白，其中所述方法包含預防給藥方案。57. 如用于前述權利要求中任一項所述用途的融合蛋白，其中所述劑量是靜脈內施用的。58. -種將因子IX(FIX)施用于需要其的受試者的方法，包括以約每周或更長時間一次的給藥間隔向受試者施用約25-75IU/kg的劑量的融合蛋白，所述融合蛋白包括： a) 因子IX(FIX)部分，和 b) 半衰期增強多肽(HLEP)。59. 如權利要求58所述的方法，其中所述劑量為約35-75IU/kg。60. 如權利要求59所述的方法，其中所述劑量為約35-55IU/kg。61. 如權利要求60所述的方法，其中所述劑量為約35-50IU/kg。62. 如權利要求58所述的方法，其中所述劑量為約25-50IU/kg。63. 如權利要求62所述的方法，其中所述劑量為約25-40IU/kg。64. 如權利要求62所述的方法，其中所述劑量為約50IU/kg。65. 如權利要求62所述的方法，其中所述劑量為約45IU/kg。66. 如權利要求63所述的方法，其中所述劑量為約40IU/kg。67. 如權利要求63所述的方法，其中所述劑量為約35IU/kg。68. 如權利要求58所述的方法，其中所述劑量為約25IU/kg。69. 如權利要求58-68中任一項所述的方法，其中所述給藥間隔為約每6-8天一次。70. 如權利要求69所述的方法，其中所述給藥間隔為約每7天一次。71. 如用于權利要求58-70中任一項所述的方法，其中對于整個給藥間隔，所述FIX的血漿水平維持了高于基線至少約1 %的低谷。72. 如用于權利要求71所述的方法，其中對于整個給藥間隔，所述FIX的血漿水平維持了高于基線至少約2%的低谷。73. 如用于權利要求72所述的方法，其中對于整個給藥間隔，所述FIX的血漿水平維持了高于基線5%和15%之間的低谷。74. -種將因子IX(FIX)施用于需要其的受試者的方法，包括以約每8-11天一次的給藥間隔向受試者施用約50-95IU/kg的劑量的融合蛋白，所述融合蛋白包括： a) 因子IX(FIX)部分，和 b) 半衰期增強多肽(HLEP)。75. 如權利要求74所述的方法，其中所述劑量為約50-75IU/kg。76. 如權利要求75所述的方法，其中所述劑量為約75IU/kg。77. 如權利要求74-76中任一項所述的方法，其中所述給藥間隔為約每10天一次。78. -種將因子IX(FIX)施用于需要其的受試者的方法，包括以約每兩周或更長時間一次的給藥間隔向受試者施用約50-95IU/kg的劑量的融合蛋白，所述融合蛋白包括： a) 因子IX(FIX)部分，和 b) 半衰期增強多肽(HLEP)。79. 如權利要求78所述的方法，其中所述劑量為約65-85IU/kg。80. 如權利要求79所述的方法，其中所述劑量為約60-80IU/kg。81. 如權利要求78所述的方法，其中所述劑量為約70-80IU/kg。82. 如權利要求78所述的方法，其中所述劑量為約50-75IU/kg。83. 如權利要求81或82所述的方法，其中所述劑量為約75IU/kg。84. 如權利要求82所述的方法，其中所述劑量為約50IU/kg。85. 如權利要求78-84中任一項所述的方法，其中所述給藥間隔為約每12-16天一次。86. 如權利要求85所述的方法，其中所述給藥間隔為約每14天一次。87. -種將因子IX(FIX)施用于需要其的受試者的方法，包括以約每3周或更長時間一次的給藥間隔向受試者施用約90-250IU/kg的劑量的融合蛋白，所述融合蛋白包括： a) 因子IX(FIX)部分，和 b) 半衰期增強多肽(HLEP)。88. 如權利要求87所述的方法，其中所述劑量為約90-150IU/kg。89. 如權利要求88所述的方法，其中所述劑量為約95-110IU/kg。90. 如權利要求89所述的方法，其中所述劑量為約95-105IU/kg。91. 如權利要求90所述的方法，其中所述劑量為約100IU/kg。92. 如權利要求91所述的方法，其中對于整個給藥間隔，所述FIX的血漿水平維持了高于基線至少約2-4%的低谷。93. 如權利要求91或92所述的方法，其中對于整個給藥間隔，所述FIX的血漿水平維持了高于基線至少約4%的低谷。94. 如權利要求87-93中任一項所述的方法，其中所述給藥間隔為約每19-23天一次。95. 如權利要求94所述的方法，其中所述給藥間隔為約每21天一次。96. 如權利要求87所述的方法，其中所述給藥間隔為約每月一次。97. 如權利要求96所述的方法，其中所述劑量為約140-200IU/kg。98. 如權利要求97所述的方法，其中所述劑量為約140-160IU/kg。99. 如權利要求98所述的方法，其中所述劑量為約150IU/kg。100. 如權利要求96-99中任一項所述的方法，其中所述給藥間隔為約每28天一次。101. 如權利要求58-100中任一項所述的方法，其中所述半衰期增強多肽(HLEP)是白蛋白（FP)或無抗原結合區的免疫球蛋白（例如，Fc)。102. 如權利要求58-101中任一項所述的方法，其中所述半衰期增強多肽(HLEP)是白蛋白(FP)。103. 如權利要求58-102中任一項所述的方法，其中所述因子IX(FIX)部分經由肽接頭與半衰期增強多肽(HLEP)連接。104. 如權利要求103所述的方法，其中所述肽接頭是可裂解的。105. 如權利要求104所述的方法，其中所述肽接頭可通過參與凝固的蛋白酶或由凝固酶激活的蛋白酶裂解。106. 如權利要求105所述的方法，其中所述接頭可通過FIXa和/或通過FVIIa/組織因子 (TF)裂解。107. 如權利要求104所述的方法，其中所述接頭包括選自SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:3的序列。108. 如權利要求104所述的方法，其中所述融合蛋白的序列具有SEQ ID NO: 1中所示的序列。109. 如權利要求104所述的方法，其中所述融合蛋白的序列與SEQ ID NO: 1中所示的序列具有至少70 %同一性。110. 如權利要求58-109中任一項所述的方法，其中所述受試者是人。111. 如權利要求110所述的方法，其中所述人罹患血友病B。112. 如權利要求58-111中任一項所述的方法，其中所述治療包含預防給藥方案。113. 如權利要求112所述的方法，其中所述劑量是靜脈內施用的。114. 如用于權利要求1-57中任一項所述用途的融合蛋白或如權利要求58-113中任一項所述的方法，其中所述融合蛋白以約100-400IU/ml的濃度來提供用于施用。115. 如權利要求114所述的融合蛋白或方法，其中所述融合蛋白以約100、200或400IU/ ml的濃度來提供用于施用。
【文檔編號】C12N15/09GK105848669SQ201480070479
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2014年12月1日
【發明人】I·雅各布斯, D·本森-肯尼迪, C·沃格特
【申請人】杰特有限公司

完整(zheng)全部詳細技術資料下(xia)載