針對胞內勞森菌和豬圓環病毒2型的疫苗的制作方法【專利摘要】本發明涉及包含滅活全細胞胞內勞森菌細菌和豬圓環病毒2型(PCV2)ORF2蛋白質組合的疫苗，用于通過該疫苗的皮內施用而保護豬對抗胞內勞森菌和PCV2的感染。本發明還涉及保護豬對抗胞內勞森菌細菌和PCV2感染的方法。【專利說明】針對胞內勞森菌和豬圓環病毒2型的疫苗[0001]本發明的一般領域[0002]本發明一般性地涉及豬健康領域。豬易感許多致病性微生物。感染的控制通常是通過飼養場所和飼料的管理，用藥物(如抗病毒藥和抗生素）治療，或使用疫苗的預防性治療而完成的。[0003]本發明的目的[0004]對于用于豬健康管理的方便，安全和有效的手段有持續的需求。[0005]發明概述[0006]為了滿足本發明的目的，設計了用于抗各種導致疾病的微生物感染的豬的組合保護的新疫苗，所述疫苗包括滅活全細胞胞內勞森菌細菌（Lawsoniaintracellularisbactria)和豬圓環病毒2型(PCV2)0RF2蛋白的組合。由于它們對豬健康的負面影響，PCV2和胞內勞森菌都導致巨大的經濟損失。雖然藥物和疫苗是已知的并且可商購的以治療PCV2和/或勞森菌感染，但仍存在著對以安全和方便的方式提供良好保護的新方式的持續需求。已經描述了抗PCV2和勞森菌感染的組合疫苗，但是不可商購的。實際上，并不是所有的設計或建議的抗原組合，尤其不是每個和各種施用方式，都可獲得安全和有效的組合疫苗。事實上，關于組合疫苗的安全和效力總存在不確定性水平，特別是當施用方案被改變時。[0007]歐洲藥品評估局(EMEA)的獸藥產品委員會在其出版物"指南:對于組合獸藥產品要求（Noteforguidance：requirementsforcombinedveterinaryproducts)''（EMEA，2000年，CVMP/IWP/52/97-FINAL)中，宣稱(第2/6頁）"組合疫苗的開發并不簡單。每個組合應該在質量，安全性和有效性方面分別地開發和研究"。該委員會還指出，對于良好組合疫苗的探索通常包括在組合疫苗中各個成分之間的相容性，包括例如防腐劑，賦形劑和穩定劑，滅活劑和佐劑。在第3頁首段，指出"在組合疫苗中，多于一種成分的存在可以經常引起相互作用，導致對個別成分減弱或增加的反應，相比于當特定成分被單獨施用時......這種相互作用往往本質上是免疫學的，但也可以是通過對免疫系統具有較少直接效應的其它因素引起的"，并且還有"當佐劑被用于增加對組合疫苗的免疫應答時，可出現特殊的問題"。[0008]美國衛生和人類服務部，食品和藥品管理局，生物制品評價和研究中心(DepartmentofHealthandHumanServices,FoodandDrugAdministration,CenterforBiologiesEvaluationandResearch)在1997年4月發布了"行業指南，對組合疫苗可預防疾病的評價：生產，測試和臨床研究"（GuidanceforIndustry，fortheevaluationofcombinationvaccinesforpreventablediseases：Production,TestingandClinicalStudies"，在指南中指出（第3頁，"成分的相容性（CompatibilityofComponents)"）"實驗顯示組合的單價疫苗可能產生新的組合，其比所期望的具有較低的安全性或效力。有時滅活疫苗的成分可以對一個或多個活性成分起相反作用"，表明尤其是滅活疫苗可負面影響活疫苗的效力，如例如當活的百日咳疫苗和滅活脊髓灰質炎病毒組合時發生，其導致疫苗具有降低的百日咳效力。這表明當相比于個別疫苗時，在疫苗中任何其它成分可能使最終產品的安全性和效力復雜化。[0009]世界衛生組織(WHO)發布了名為"疫苗安全基礎"的電子學習課程，在模塊2中考慮了組合疫苗。這個模塊開始于"特許的組合疫苗在被國家當局批準之前進行充分的測試以確保產品是安全，有效和質量合格的。"它也指出"對于所有的組合，制造商必須因此評估每個抗原成分的效力，當結合以誘導免疫時所述疫苗成分的有效性，可能回復到毒性的風險，和與其他疫苗成分的反應。"[0010]在這個電子課程的第53頁，WHO報道"施用途徑是通過其將疫苗(或藥物)與身體接觸的途徑。這是免疫成功的關鍵因素。物質必須從進入的部位輸送到希望其發揮作用的身體部位。然而，為了這個目的使用人體的運輸機制，并非是不重要的。"[0011]加利福尼亞健康服務部門計劃免疫科（CaliforniaDepartmentofHealthServices7ImmunizationBranch)^-^[：Twww.cdc.gov/vaccines/pubs/pinkbook/downloads/appendices/d/vacc_admin.pdf)。涉及施用部位的是在第7頁，第1全段中宣稱"對于每個疫苗的推薦途徑和部位是基于臨床試驗，實際經驗和理論考慮的。該信息包括在每個疫苗的制造商產品信息中。在疫苗施用中使用5種途徑。偏離推薦途徑可降低疫苗的效力或增加局部的不良反應。"第14頁唯一獲得美國許可的皮內疫苗寫到"FluzoneIntradermal是美國許可的僅有的通過皮內途徑施用的疫苗。它僅被批準在18至64歲的人群中使用。此Fluzone制劑與滅活流感疫苗肌內制劑(TIV)是不同的。其它的TIV制劑不應當通過皮內途徑施用。"[0012]總之，特定抗原和施用部位的任意組合并不簡單，并需要實驗來確定安全性和有效性。[0013]本發明，除了疫苗本身，還涉及用于保護豬對抗胞內勞森菌細菌和PCV2感染的方法，包括在皮內施用所述疫苗，并且涉及構建這種疫苗的方法。[0014]定義[0015]疫苗是保護對抗(疫苗接種后)致病性微生物感染的構成。[0016]保護對抗致病性微生物感染表示在接種宿主中預防或降低通過微生物本身的感染，或預防或減少由感染產生的(亞)臨床疾病，通常通過干擾微生物本身，例如通過抗體。[0017]包含滅活全細胞細菌作為抗原的組合物，包括衍生自活的、全細胞細菌的滅活的抗原構成。這不排除該細菌細胞(至少部分)在滅活過程中破裂，或者說，滅活全細胞的提取物或勻漿物實際上是作為本發明意義上的"包含滅活全細胞細菌疫苗"的抗原提供。滅活全細胞胞內勞森菌是例如W02009/144088和W097/20050中已知的。[0018]PCV20RF2蛋白質是豬圓環病毒2型衣殼蛋白。PCV2的0RF2編碼約28kDa的蛋白質。所有PCV-2分離株的0RF2共享91-100%的核苷酸序列同一性和90-100%推斷的氨基酸序列同一性(Fenaux等人，J.Clin.Micorbiol.，38(7),2494-2503，2000年K0RF2蛋白質可以例如是重組表達的，例如在桿狀病毒表達系統中，如在W02007/028823，W02007/094893或W02008/076915中所描述的。[0019]疫苗的皮內施用意味著足夠量的疫苗沉積于真皮內，導致與用相同疫苗和其體積肌內施用顯著不同的免疫應答（特別是：當在如在實施例3中所概述設置的測試中使用Wilcoxon秩和檢驗時，p值應小于0.10,優選小于0.05)。幾個裝置是可商購的用于皮內接種，例如，在Vaccine，2012年1月11日；30(3):523-38中描述的IDAL?vaccinator(MSDAnimalHealth)，Pulse50MicroDose(脈沖無針系統（PulseNeedleFreeSystems))或其他裝置(具體見表1，第525頁："用于液體和固體制劑施用的不同裝置概述(Anoverviewofdifferentdevicesforliquidandsolidformulationadministration)''）。[0020]用于在保護中使用的疫苗的單次注射施用意味著為了獲得保護性免疫，接種并不需要第二次施用加強。在一個兩次注射方案中，第一(初始的）疫苗接種典型地從第一次施用6周內加強，通常是從第一次施用3周內或甚至2周內，而可以理解只有在第二(加強)施用后才可能獲得保護性免疫。[0021]藥學上可接受的載體是生物相容的介質，即經過施用后介質在受試動物中不誘導顯著的不良反應，能夠在疫苗施用后呈遞抗原給宿主動物免疫系統。這樣的載體可以是含有水和/或任何其它生物相容性溶劑的液體，也可以是固體，如通常用于獲得凍干疫苗的固體(基于糖和/或蛋白質）。[0022]發明的實施方案[0023]在一個實施方案中，疫苗用于在單次注射施用后對豬的保護。有利地發現，即使在單次注射施用疫苗后豬也被保護對抗兩種病原體。這個實施方案不排除進行后續接種，例如在第一次疫苗接種6至12個月后接種以延續保護水平。這個后續接種不同于初始-加強的疫苗接種方案中的加強接種，其中保護僅被認為是在加強接種后獲得。在初始-加強的方案中，兩次接種通常分隔2-3周進行。[0024]在一個實施方案中，疫苗包含佐劑。我們發現佐劑，其通常用于改善滅活抗原的免疫反應，當施用疫苗至真皮內（其不良反應已知的部位)時，不會負面干擾勞森菌或PCV2抗原，也不過度增加對其它抗原的反應性，盡管WHO在其疫苗安全基礎課程(見上文)課程第1頁最后2行(小節"組合疫苗"）中明確警告這種類型的干擾和反應性。在進一步的實施方案中，佐劑包含非生物可降解的油，如例如可以從ExxonMobil?得到的飽和烴油(Marcol?52)〇[0025]在一個實施方案中，疫苗進一步包括滅活的豬肺炎支原體（mycoplasmahyopneumoniae，Mhyo)抗原，優選Mhyo菌苗。這已證明獲得了對抗三種主要豬病原的方便、安全和有效的疫苗。[0026]在又一個實施方案中，疫苗包含每劑量1X109滅活的胞內勞森菌細菌，即滅活的胞內勞森菌抗原以這樣的載量，所述載量使得所述疫苗每劑量包含對應于1X1〇9胞內勞森菌細菌的胞內勞森菌抗原。更高的抗原載量，未在本實施方案中排除的，可以積極地影響保護的水平和免疫期。[0027]在一個實施方案中，勞森菌細菌是在添加細菌到組合物中之前被冷凍干燥，例如含有水性組合物或乳液的PCV20RF2，以構成疫苗。[0028]用同樣的方法，在構建用于皮內施用疫苗的方法中，所述方法包括:組合滅活的全細胞胞內勞森菌和豬圓環病毒(PCV2)0RF2蛋白質與藥學上可接受的載體，所述滅活的全細胞胞內勞森菌可以是冷凍干燥的形式，并且加入到包含載體和PCV20RF2蛋白質的液體制劑中，通常在施用前1小時加入。[0029]本發明將使用下面的實施例和附圖作進一步的解釋。實施例[0030]實施例1是一個實驗，其表明單劑量的皮內接種可以提供抗豬圓環病毒2型感染的23周免疫。[0031]實施例2是另一個實驗，用PCV2ID-次接種方式表明接種是安全的并且導致保護性滴度。[0032]實施例3是在皮內和肌內接種之間的直接比較。[0033]實施例4描述了用組合的皮內接種的實驗。[0034]實施例5描述了組合疫苗，各種抗原劑量和各種佐劑的實驗。[0035]實施例6描述了組合疫苗的進一步實驗。[0036]圖1在免疫期研究中的血清學[0037]圖2在血清，糞便和器官中的病毒載量[0038]圖3平均體溫[0039]圖4平均總PCV2IgAb結果[0040]圖5平均PCV2IgMAb結果[0041]圖6在持續研究中抗體的滴度[0042]圖7在器官中的病毒載量[0043]圖8在器官中的病毒載量[0044]實施例1[0045]實驗設計[0046]具有抗PCV2抗體的10頭母豬的后代被用于這項研究。一窩仔豬被劃分為2組每組15頭動物。在3周齡，組1的仔豬在頸部的右側用0.2ml包括重組表達的豬圓環病毒2型的0RF2蛋白質的疫苗進行皮內接種(對于蛋白質的提供，參見W02007/028823)，使用市售的皮內注射裝置IDAL?(售自MSDAnimalHealth，Boxmeer，荷蘭），而組2未被接種并且作為對照組。每天觀察所有研究動物的臨床表征。在疫苗接種時，9，17，19和21周后，收集所有動物的血液樣品。在接種23周后，使用鼻內施用野生型PCV2攻擊病毒株感染攻擊每頭動物。[0047]在攻擊前1天和攻擊1，2和3周后，收集血清樣品和糞便拭子并且通過定量PCR檢查PCV2病毒核酸。另外的，檢查血清樣本的PCV2抗體。[0048]攻擊3周以后，所有動物進行尸檢并且腹股溝淋巴結，扁桃體和肺組織被取樣用于測定PCV2病毒抗原和核酸。[0049]使用的疫苗是作為水包油型乳液提供的，其包含5%v/v的礦物油Marcol?52(Exxon)，0.30%w/v的乙酸維生素E和0.32%的吐溫80(吐溫80;SigmaAldrich)，注射用水和每0.2毫升的2000AUPCV2蛋白。該AU單位是基于PerkinElmer的AlphaLISA測試而計算的。對于這個測試，聚苯乙烯微量滴定板的孔中填充有含有PCV20RF2抗原的測試樣品的連續稀釋液和參照標準品的的連續稀釋液。[0050]這些稀釋液與受體珠(包被有針對PCV20RF2的單克隆抗體），和生物素標記的也針對PCV20RF2的第二抗體一起孵育。然后通過與鏈霉親和素包被的供體珠一起孵育和化學發光檢測定量結合第二抗體的數量。參照標準品使得可以商購的疫苗Porcilis?PCV被設置為每(2毫升)劑量包含5000AU。[0051]實驗步驟[0052]每日觀察[0053]所有豬每天觀察疾病的臨床表征。觀察結果包括全身反應，其包括食欲不振，傾向躺下，精神萎靡或嗜睡，發抖，毛發直立，水腫(特別是眼睛周圍），嘔吐，腹瀉和呼吸困難。[0054]血液采樣[0055]在接種疫苗前，9，17，19和21周后收集血液樣品。在攻擊前1天，和攻擊后7，13和19天收集血液樣品。這是在所有豬上單個進行的[0056]糞便擦拭[0057]在攻擊前1天，和攻擊后7、13和18天，從所有動物收集糞拭子，每個動物使用一個干燥的拭子。使用標準程序收集拭子到含有抗生素的培養基中。在培養基中擦拭材料的懸浮液通過離心而澄清，等分并且儲存在<-18°C下直至進一步的應用。[0058]血清學[0059]使用標準ELISA程序，檢測所有的血清樣本的抗PCV2抗體。簡而言之，連續稀釋的血清樣品在包被有桿狀病毒表達的PCV20RF2抗原的微量滴定板中孵育。除去血清后，將所有孔用固定量的生物素標記的PCV2特異性單克隆抗體孵育。然后用過氧化物酶綴合的鏈霉親核素孵育結合的MoAb，隨后進行發色檢測。滴度表示為log2滴度。[0060]尸檢檢查[0061]在實驗結束時，所有動物通過擊暈后放血而被安樂死。在尸檢期間，打開動物，原位檢查內臟，要特別注意以下器官:肺，腹股溝和腸系膜淋巴結，扁桃體，胸腺，脾臟，肝臟和腎臟。在此之后，來自扁桃體，肺(肺葉附件），和腹股溝淋巴結的樣品被移除而用于快速冷凍并且用于后期的通過定量PCR(qPCR)的分析。[0062]定量PCR[0063]在所有血清和糞便拭子，和在扁桃體，肺和腹股溝淋巴結的10%組織勻漿上實施定量PCR(qPCR)。簡而言之，使用商業試劑盒從樣品中提取DNA。通過聚合酶鏈反應(PCR)定量每個樣品中的PCV2基因組DNA，所述PCR反應使用引物和一個PCV2特異性的雙重標記的水解探針。特定熒光超過閾值的循環數是與一組含有已知量的包含PCV2質粒的樣品的循環數相關。結果表示為loglO拷貝AU反應混合物(loglOc/yl)。[0064]結果[0065]在實驗開始時，發現所有的動物是健康的。在對照組中，發現一只動物在接種6周后(wpv)死亡。兩只接種疫苗的動物有輕微的局部問題，即輕微的動感功能障礙(一條腿僵硬）。考慮到是小問題，沒有治療這些動物。在接種的動物中沒有顯示出任何疾病或全身反應，如高熱，減少的食物攝入，過敏性休克或嘔吐。[0066]血清學的結果顯示在圖1中。很顯然，接種疫苗的動物似乎維持到約4.01og2水平的抗-PCV2滴度，而在對照動物中滴度降低到檢測限以下。在攻擊后(接種23周后，在26周齡），在接種組中滴度小幅上漲。在對照組中滴度上升到相同的水平。[0067]定量PCR的結果顯示在圖2A，2B和2C("dpc"=攻擊后的天數）中。似乎接種的動物，在接種疫苗23周后被保護免于PCV2感染的攻擊，如在血清，淋巴器官和肺中PCV2核酸的顯著減少所示。此外，該疫苗能減少病毒脫落，如通過在至少23周的抗PCV2的糞便拭子上的病毒載量的顯著減少所證明。這是在具有大約Hog2的循環抗體滴度的野生動物中進行，所述滴度被認為是中等的水平。[0068]實施例2[0069]實驗設計[0070]來自一個產仔批次的一批共46個仔豬被分配到4個治療組:2個接種組每組13頭仔豬和2個對照組每組10頭仔豬。當仔豬是大約2周齡時，組1按照上述實施例1所示被接種，當仔豬是大約3周齡時，組2被接種。用單劑量疫苗在頸部的右側皮內接種仔豬。組3(對照組2周齡的動物)和組4(對照組3周齡的動物)未被接種。在接種疫苗當天，接種2,3和4周后收集所有動物的血清樣品。在接種前1天，接種當天和接種后4小時以及接種1，2,3,4天后測量溫度。[0071]實驗步驟[0072]在接種前，觀察仔豬的一般健康。在Τ=_1天，T=0天的接種后0和4小時，和在接種后Τ=1，2，3，4天，測量所有仔豬的體溫。[0073]在接種當天和接種2,3和4周后收集血液樣品。根據標準程序，對所有豬分別進行。不加入抗凝血劑收集血液樣品。血清從凝結的血液樣品中制備并且等分試樣裝填并且保存于-20°C下直至分析。[0074]根據在上文實施例1("血清學"）所示，測試總PCV2的Ig抗體和PCV2IgM抗體ELISA，除了在IgM抗體ELISA的情況下，用IgM抗體包被該平板，然后用PCV20RF2抗原孵育，在用固定量的生物素標記的PCV2特異性單克隆抗體孵育之前。[0075]結果[0076]在實驗開始時，發現所有的動物是健康的。體溫的平均結果顯示在圖3中。在2和3周齡動物之間的體溫平均增加沒有看到差異(最大平均增加是在〇.〇_〇.3°C之間）。另外，在1組和2組中動物個體體溫的最大增加是可以與在兩個對照組中動物個體的最大溫度增加相當。[0077]總PCV2Ig抗體ELISA[0078]總PCV2Ig抗體反應的平均結果概述在圖4中。在接種時，2周齡的接種仔豬相比于3周齡的接種仔豬具有較高的(最可能母體來源的)PCV2抗體滴度。接種的動物表現出比對照動物顯著較高的滴度增加。[0079]PCV2IgM抗體ELISA[0080]PCV2IgM抗體反應的平均結果顯示在圖5中。在接種時所有動物呈現出IgM抗體陰性。接種后，3周齡的動物相比于2周齡的動物具有相當更快和更高的IgM抗體反應。對照動物在整個研究中保持陰性。[0081]基于這些結果，可以得出結論，在2和3周齡仔豬的單一劑量皮內接種導致了可接受的安全性和良好的血清學反應。可以獲得與另一個實驗相當的結果(數據未顯示），其中循環抗體滴度的起始水平甚至更高，即高達9.41og2，這被認為是在中等范圍的高端。[0082]實施例3[0083]實驗設計[0084]總共30頭仔豬被分配到3個治療組，每組30頭。按照上文實施例1所述用單劑量疫苗皮內接種組1的仔豬。在相同位置(在頸部）以相同劑量，用單劑量的相同疫苗肌內接種組2的仔豬，并且組3的仔豬未經處理。在接種當天，接種3和5周后收集所有動物的血清樣本。[0085]實驗步驟[0086]在接種前，根據標準程序，觀察仔豬的一般健康。根據按照上文實施例2所述的程序進行總抗PCV2抗體和PCV20RF2特異性IgM抗體的血液以及血清學取樣。[0087]結果[0088]在研究開始發現所有的動物是健康的。血清學的結果概述在表1(滴度表示為log2)中。在接種疫苗時，平均抗體滴度是較高的。接種疫苗之后，沒有動物表現出PCV2抗體滴度的增加。在接種3和5周后，可以觀察到ID組比頂組具有較高的平均PCV2抗體滴度。[0089]抗PCV2IgM血清學的結果概述在表2(滴度表示為log2)中。在接種3周后，ID組的抗PCV21gM抗體滴度顯著高于頂組和對照組。[0090]表1:平均抗體的結果[0093]表2:抗PCV2的IgM抗體的平均結果[0095]當使用Wilcoxon秩和檢驗時，對于ID組相比于IM組的IgM應答差異的p值是0.0001。[0096]實施例4[0097]具有抗PCV2抗體的幾頭母豬的后代可以用于這項研究。一窩仔豬18頭動物被劃分為3組。在3周齡，根據上文實施例1所述皮內接種組1和組2的仔豬。根據制造商的說明在頸部的另一側，組2的動物在相同的時間用市售疫苗滅活Mhyo疫苗P〇rcilis?MHyoIDOnce(包含Mhyo菌苗）進行皮內接種。組3(對照組）的動物保持未處理。每日觀察所有的研究動物。在接種疫苗時和每隔一周的時間直至動物被送去屠宰(23-25周齡)收集血清樣品。檢查這些樣品的PCV2抗體。[0098]實驗程序是按照上文實施例1所述的。獲得的血清學顯示在圖6中。從該圖中可以清楚地看到抗PCV2滴度在根據實施例1所述的實驗中確定的41og2水平以上維持的很好，并且被發現是保護性的。在疫苗之間沒有負干擾的指示。[0099]重復這個實驗以檢查抗致命的豬肺炎支原體的保護。對于這個重復實驗，使用了60頭仔豬。40頭動物在18-24天齡接種Mhyo疫苗并且這些動物中的20頭也接種PCV疫苗。20頭動物未接種疫苗并且作為攻擊對照。接種后三周，用致命性豬肺炎支原體菌株感染所有動物，并且攻擊后3周所有動物都進行尸檢研究肺損傷。在各組之間比較肺損傷評分(LLS)。[0100]用P〇rcilis?MHyoIDOnce接種的組的LLS是顯著低于那些對照組（p<0.05，Dunr/s檢驗）。在已經用P〇rcilis?MHyoIDOnce單獨或與PCV疫苗聯用接種的組之間沒有顯著差異。因此可以得出結論，將組合的疫苗接種對用P〇rcilis?MHyoIDOnce獲得的免疫沒有負面影響。[0101]實施例5[0102]總共八支疫苗配制成含有PCV20RF2蛋白質（250至6000AU/0.2毫升），豬肺炎支原體(與P〇rcilis?MHyoIDOnce具有相同的水平)和胞內勞森菌抗原(參見W020089/127684，實施例2的滅活全細胞抗原：以每0.2毫升大約IX109個細胞的水平）。該疫苗含有不同的佐劑。一些疫苗使用現有的包含生物可降解油的佐劑DiluvacForte(MSDAniamlHealth，Boxmeer，荷蘭;所謂的"DF"）。其它使用的佐劑制劑根據上文實施例1所述(被稱為"X-solve12"），或具有與X-solve12相同成分配制成的佐劑，但是以X-solve12的一半的濃度(被稱為1-8〇1￥66"）或2.5倍濃度(被稱為1-8〇1￥630"）。所得疫苗分別如下(11^〇和胞內勞森菌抗原沒有被列舉;每劑量的含量）：[0103]第1組：2000AUPCV2/X_solve30[0104]第2組：250AUPCV2/X-solve12[0105]第3組：500AUPCV2/X_solve12[0106]第4組：2000AUPCV2/X_solve12[0107]第5組：2000AUPCV2/X_solve6[0108]第6組：500AUPCV2/DF[0109]第7組：2000AUPCV2/DF[0110]第8組：6000AUPCV2/DF[0111]8頭母豬的后代被用于本研究。仔豬具有抗PCV2的中等（中等水平)母體來源抗體(MDA)(平均:6.71og2)。在3/4周齡，使用IDAL?疫苗接種器，單劑量皮內接種組1至8的仔豬。組9的仔豬維持未接種。接種7周后，所有動物被運送到攻擊裝置。一天后用PCV2攻擊菌株感染攻擊所有的動物。所有仔豬每天觀察臨床表征。[0112]通過觸診監測局部反應，在接種當天開始并且在接種后每兩天直到接種20天后。[0113]在接種當天和接種后3周，攻擊前1天，攻擊后1和2周以及尸檢時，收集所有動物的血液樣品。從每只動物取的血清樣品用于抗PCV2和豬肺炎支原體抗體測試。在尸檢期間，腸系膜和腹股溝淋巴結，扁桃體和肺被取樣用于PCV2核酸定量。[0114]實驗程序與根據上文實施例2所述相同。在接種時PCV2的IgM抗體應答低于所有組的檢測水平(低于2.01og2)。接種3周后，對于2000AUPCV2/X-slove30疫苗的PVC抗體的滴度最高，8卩201(^2<^-8〇1￥612組，包括每劑量250-，500-和200(^1]?(^2抗原分別具有9，16和191og2的滴度。接受2000AU/X-sl〇Ve6疫苗的組具有151og2的滴度。每劑量包含500-，2000-和6000AUPCV2抗原的DF組分別具有8，14和161og2的滴度。對照具有低于檢測水平的滴度。[0115]在這項研究中，全身和局部反應進行了評估。沒有觀察到歸因于疫苗接種的全身反應。至于局部效應而言，不多于3頭接種疫苗的動物（已經分別接受每劑量疫苗X-solve12500和2000AU，或DF6000AUPCV2)具有輕微運動的問題，與在對照動物中數目相同。為此，這些反應可合理地被認為是與疫苗接種不相關的。對于其他局部反應，用X-solve接種的許多動物（約60-100%之間）顯示出局部反應，腫脹的平均尺寸是小于3厘米，即在1-2厘米之間，并且腫脹在2-6天內消失。使用DF，只有約30%的動物表現為局部腫脹，平均大小小于ο.5厘米，并且它們在一天內消失。[0116]在圖7和8中，器官的病毒載量(平均)針對不同的疫苗進行描繪。似乎所有疫苗都能夠實質上(在這些情況下至少3個數量級)降低在相關的器官中的病毒載量。[0117]在這項研究中似乎使用的所有佐劑均是安全的，誘導抗PCV2的IgM應答，并且能治療動物對抗致病性豬圓環病毒2型的感染。在不同抗原之間沒有發現負干擾。勞森菌血清學(未顯示）顯示出良好的抗體應答，在此基礎上可以相信獲得了抗胞內勞森菌感染的保護。為了證實這一點，進行包括使用致病性胞內勞森菌攻擊的下一個實驗(見實施例6)。[0118]實施例6[0119]為了證實動物被保護抗胞內勞森菌的攻擊，具有不同數量佐劑X-solve的疫苗制劑，如實施例5中所描述的，被新鮮配制用于各種攻擊實驗。這些疫苗的基礎是含有PCV20RF2蛋白質的PCV2疫苗。第一疫苗被配制在如實施例5所示的X-solve30中。第二疫苗被配制在X-solve12中，其中勞森菌抗原是通過在施用前30分鐘內添加冷凍干燥的滅活勞森菌細胞(實施例5所用的相同抗原)到即用的PCV2疫苗中而引入。在這兩個疫苗中PCV20RF2蛋白質的最終濃度為2000AU/0.2毫升。勞森菌抗原的濃度與用于實施例5中所述實驗相同（每〇.2毫升約1X109細胞）。所得疫苗如下：[0120]1:2000AUPCV2/勞森菌/X-solve30[0121]2:2000AUPCV2/勞森菌/X-solve12[0122]使用疫苗1號(X-solve30)進行第一項研究。使用39頭豬，分別分配為19頭和20頭豬的2組。兩組在3周齡時用0.2ml疫苗通過如實施例1中所示在頸部皮內接種而免疫接種。第一組用上文所述的疫苗1號接種，第二組用沒有勞森菌抗原的相同疫苗接種。這個組作為勞森菌攻擊的對照。所有動物均在22周齡被攻擊。未發現不可接受的安全問題。關于平均日增重(在攻擊后14-21天期間），回腸評分(攻擊后3周；，得分與內勞森感染存在導致的回腸病變的存在成比例）和PPE發病率的結果顯示在表3中。統計學差異值(雙側檢驗，p<0.05;用于ADWG的協方差分析測試，用于回腸評分累積logit模型和用于PPE發病率的Fischer's精確檢驗)都是用星號表示的。[0123]表3[0125]使用疫苗2號(X-solve12)進行第二項研究。使用50頭豬，分為2組，每組25頭豬。一組在3周齡時用上文指示的2號疫苗接種，通過如實施例1中所示用0.2ml疫苗該在頸部皮內接種。第二組未被接種并且作為對照。所有動物均在24周齡被攻擊。關于平均日增重(在攻擊后13-20天期間），回腸評分(攻擊后3周;得分與內勞森感染存在導致的回腸病變的存在成比例）和PPE發病率的結果顯示在表4中。統計學差異值(雙側檢驗，p<0.05;用于ADWG的協方差分析測試，用于回腸評分的累積logit模型和對PPE發病率的Fischer's精確檢驗）都是用星號表示的。在測試期間，由于特定的，非疫苗相關的問題，每一組中的1個試驗動物不得不被安樂死。[0126]表4[0128]結果表明，用包含PCV20RF2蛋白和滅活胞內勞森菌細菌的組合疫苗的動物皮內接種提供了對抗致病性胞內勞森菌感染的保護。此外，在配制前勞森菌抗原的凍干似乎對效力沒有負面影響。【主權項】1.包含滅活全細胞胞內勞森菌細菌和豬圓環病毒2型（PCV2)0RF2蛋白質組合的疫苗，用于通過所述疫苗的皮內施用而保護豬對抗胞內勞森菌(Lawsoniaintracellularis)和PCV2的感染的用途。2.用于根據權利要求1中用途的疫苗，其特征在于所述應用是在單次注射施用后用于豬的保護。3.用于根據前述任一項權利要求中用途的疫苗，其特征在于所述疫苗包含佐劑。4.用于根據權利要求3中用途的疫苗，其特征在于所述佐劑包括非生物可降解的油。5.用于根據前述任一項權利要求中用途的疫苗，其特征在于所述疫苗進一步包含滅活的豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae)(Mhyo)抗原。6.用于根據權利要求5中用途的疫苗，其特征在于所述滅活的豬肺炎支原體抗原包括Mhyo菌苗。7.用于根據前述任一項權利要求中用途的疫苗，其特征在于所述疫苗包含每劑量IX1〇9滅活的胞內勞森菌細菌。8.用于根據前述任一項權利要求中用途的疫苗，其特征在于所述胞內勞森菌細菌是在添加細菌到組合物中以構成疫苗之前是冷凍干燥的。9.保護豬對抗胞內勞森菌細菌和PCV2感染的方法，包括施用包含滅活全細胞胞內勞森菌細菌和豬圓環病毒2型(PCV2)0RF2蛋白質組合的疫苗到動物真皮內。10.根據權利要求9的方法，其特征在于所述方法在疫苗單次注射施用后會導致保護。11.一種構建用于皮內施用疫苗的方法，其特征在于所述方法包括組合滅活全細胞胞內勞森菌細菌和豬圓環病毒2型(PCV2)0RF2蛋白質與藥學上可接受的載體。12.根據權利要求11的方法，其特征在于滅活的全細胞胞內勞森菌細菌是冷凍干燥的形式，并且加入到包含載體和PCV20RF2蛋白質的液體制劑中。【文檔編號】A61P31/04GK105848676SQ201480066508【公開日】2016年8月10日【申請日】2014年12月2日【發明人】A·A·C·賈科布斯,V·發欽格,M·斯諾,M·H·維特韋里伊特【申請人】英特維特國際股份有限公司