一種長雙歧桿菌蛋白質用于提升單核增生李斯特菌對抗生素敏感性的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及微生物技術領域，具體涉及一種長雙歧桿菌蛋白質用于提升單核增生 李斯特菌對抗生素敏感性的應用。
【背景技術】
[0002] 雙歧桿菌作為腸道益生菌廣為人知，近年來針對其腸道益生作用研究發現，雙歧 桿菌的某些代謝產物能夠抑制其他微生物在腸道內壁的定植，進而降低病原微生物的侵害 風險。該特征目前已經成為篩選雙歧桿菌菌種、研發功能性益生菌菌劑的重要依據。
[0003] 現有技術研究發現，雙歧桿菌對其他微生物定植于腸道內壁的抑制機制主要是通 過分泌有機酸降低腸道pH值，調節腸道微生態環境，同時分泌胞外酶從而影響致病菌或細 菌毒素的黏附位點及其特異性受體。此外，近年來有學者認為，由雙歧桿菌自身黏附于腸道 所引發的占位效應和空間位阻效應可能是阻礙致病菌黏附和入侵的一個重要因素。黏附蛋 白作為雙歧桿菌黏附并定植于胃腸道上皮的重要因子，其物質基礎、代謝特性在現有技術 中尚無明確結論，
[0004] 盡管現有技術中曾報道部分具有粘附性的雙歧桿菌表達蛋白，但其是否就是菌體 定植于腸道內壁的功能性物質尚不明確;此外，在明確獲得一種雙歧桿菌粘附蛋白的基礎 上，為實現進一步的應用，其表達量、純化效率應當得到優化;再次，針對雙歧桿菌粘附蛋 白，應當進一步研究其生物學特性，從而為該粘附蛋白的其他用途奠定基礎。
[0005] 長雙歧桿菌(Bifidobacterium Iongum)是雙歧桿菌屬的一種，屬革蘭氏陽性、無 芽孢、不運動、厭氧性桿菌，廣泛存在于人體尤其嬰兒的腸道中，屬于藥品、微生態菌劑制備 領域的常規菌種之一。

【發明內容】

[0006] 本發明旨在針對現有技術的技術缺陷，提供一種長雙歧桿菌蛋白質用于提升單核 增生李斯特菌對抗生素敏感性的應用，以解決現有技術中長雙歧桿菌蛋白質應用范圍存在 局限性的技術問題。
[0007] 本發明要解決的另一技術問題是單核增生李斯特菌對抗生素的敏感性有待提升。
[0008] 為實現以上技術目的，本發明采用以下技術方案：
[0009] 一種長雙歧桿菌蛋白質，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0010] -種上述長雙歧桿菌蛋白質的制備方法，包括以下步驟：
[0011] 1)制備長雙歧桿菌蛋白質的重組大腸桿菌表達菌株；
[0012] 2)取步驟1)所述長雙歧桿菌蛋白質的重組大腸桿菌表達菌株進行培養，至培養液 0D600nm為0.6~0.9時加入誘導劑IPTG至終濃度為0.8~1.2mM，而后于35~39°C、震蕩條件 下誘導培養4~5h;
[0013] 3)收集菌體、破碎、收集上清；
[0014] 4)取步驟3)上清液，利用GST親和層析純化，收集洗脫液后超濾濃縮，脫鹽，干燥， 即得到所述長雙歧桿菌蛋白質。
[0015] 作為優選，步驟3)所述的破碎是將菌體重懸于PBS緩沖液后，在冰浴條件下超聲破 碎20~30次，每次破碎的持續時間為2~4s，每2次破碎之間的時間間隔為4~6s。
[0016] 作為優選，步驟4)具體包括以下操作：
[0017] a)取緩沖液A，以2.5~3.5mL/min的流速平衡谷胱甘肽瓊脂糖樹脂柱；
[0018] b)取步驟2)上清液，以1~2mL/min的流速上樣；
[0019] c)取緩沖液B，以0.8~1.2mL/min的流速洗脫，收集洗脫峰處溶液即為洗脫液；
[0020] d)取洗脫液超濾濃縮，而后過脫鹽柱，再利用純水以2.5~3.5mL/min的流速洗脫， 收集洗脫峰處溶液即為第二洗脫液，而后冷凍干燥，即得到所述長雙歧桿菌蛋白質；
[0021] 其中所述緩沖液A是含有1.5~2.5mM EDTA的PBS緩沖液；
[0022] 所述緩沖液B是含有1.5~2.5mM EDTA、15~25mM谷胱甘肽的PBS緩沖液;進一步優 選的，步驟a)中用于平衡谷胱甘肽瓊脂糖樹脂柱的緩沖液A用量為25~35mL，更優的是 30mL〇
[0023]作為優選，步驟1)中所述的震蕩是150~200r/min轉速的搖床培養，更優的是 180r/min轉速的搖床培養。
[0024]氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示的蛋白質用于提升單核增生李斯特菌對抗生素敏 感性的應用;進一步優選的，是上述長雙歧桿菌蛋白質作為抗生素抑菌增效劑的應用。
[0025] 作為優選，所述抗生素是β-內酰胺類抗生素;進一步優選的，所述β-內酰胺類抗生 素可以是氨芐青霉素、青霉素 G或頭孢霉素。
[0026] 作為優選，所述抗生素是氨基糖苷類抗生素;進一步優選的，所述氨基糖苷類抗生 素是卡那霉素。
[0027] 作為優選，所述抗生素是酰胺醇類抗生素;進一步優選的，所述酰胺醇類抗生素是 氯霉素。
[0028] 作為優選，所述應用是利用含有濃度為45~55yg/mL的、氨基酸序列為SEQ ID NO: 1的蛋白質溶液，以接觸方式處理單核增生李斯特菌;進一步優選的，被處理單核增生李斯 特菌在所述蛋白質溶液中的濃度是IO 6CFUAiL;進一步優選的，所述處理時間是1.5~2.5h。
[0029] 在以上技術方案中，所述敏感性是指微生物受抗生素抑制的程度，所述提升微生 物對抗生素敏感性，是指利用含有本發明長雙歧桿菌蛋白質的介質孵育微生物后，被處理 微生物在抗生素作用下抑菌效果更為顯著。所述長雙歧桿菌蛋白質，是說明自然環境下該 蛋白來源于長雙歧桿菌，而并不構成對該蛋白質技術特征的限定作用;在本發明中，該蛋白 質的技術特征僅由其序列限定。所述長雙歧桿菌蛋白質的重組大腸桿菌表達菌株，是指整 合有本發明長雙歧桿菌天然表達基因的重組大腸桿菌;其制備方法通常包括長雙歧桿菌總 DNA的提取，目的基因的擴增，擴增產物的純化，目的基因及載體的酶切、連接，重組載體向 大腸桿菌中的導入，重組子的篩選等步驟;實際制備方法可依據本領域的一般技術常識進 行適應性設計。
[0030] 如前文所述，本發明可用于提升微生物對抗生素的敏感性。但利用本發明長雙歧 桿菌蛋白質處理后的物質并不必然予以抗生素處理，當予以抗生素處理時，其處理方法可 采用以下方案:氨芐青霉素作用濃度為1~50yg/mL;青霉素 G作用濃度為1~50yg/mL;頭孢 霉素作用濃度為1~50yg/mL;卡那霉素作用濃度為1~25yg/mL;氯霉素作用濃度為1~25μ g/mL〇
[0031] 本發明提供了一種來源于長雙歧桿菌的粘附蛋白，并明確了其氨基酸序列；在此 基礎上基于遺傳工程技術獲得了一株該蛋白的表達菌株，并針對菌株及粘附蛋白的特性從 誘導表達、層析純化、超濾濃縮等方面進行創新性設計，進而獲得了上述粘附蛋白的高效制 備方法。進一步的，實驗發現該粘附蛋白不僅能夠粘附于腸上皮細胞，而且具有提升微生物 抗生素敏感性的作用，基于這種有益的發現，確定了該蛋白作為抗生素抑菌增效劑的用途， 從而擴展了其用途范圍，同時提供了一種提升微生物藥敏性的新途徑。本發明基于嚴謹的 實驗手段獲得了突出的技術效果，具有廣闊的應用前景。
【附圖說明】
[0032] 圖1是本發明實施例1中長雙歧桿菌特異性蛋白AIP2的表達純化電泳檢測圖；圖中 泳道M是Protein Marker(12-80kDa);泳道1是E.coli pGEX-4T-l表達產物（對照）；泳道2是 純化后的AIP2蛋白；泳道3是E.coli pGEX-4T-AIP2融合蛋白表達產物。
[0033] 圖2是本發明實施例5中長雙歧桿菌特異性蛋白AIP2提升3種常見食源性致病菌對 氨芐青霉素敏感性的實驗結果圖；圖中A部分是長雙歧桿菌特異性蛋白AIP2對單核增生李 斯特菌的作用結果;B部分是長雙歧桿菌特異性蛋白AIP2對大腸桿菌0157:H7的作用結果;C 部分是長雙歧桿菌特異性蛋白AIP2對鼠傷寒沙門氏菌的作用結果。
[0034] 圖3是本發明實施例6中長雙歧桿菌特異性蛋白AIP2提升3種常見食源性致病菌對 青霉素 G、頭孢霉素、卡那霉素、氯霉素敏感性的實驗結果圖。
【具體實施方式】
[0035] 以下將對本發明的【具體實施方式】進行詳細描述。為了避免過多不必要的細節，在 以下實施例中對屬于公知的結構或功能將不進行詳細描述。
[0036] 以下實施例中所使用的近似性語言可用于定量表述，表明在不改變基本功能的情 況下可允許數量有一定的變動。因此，用"大約"、"左右"等語言所修正的數值不限于該準確 數值本身。在一些實施例中，"大約"表示允許其修正的數值在正負百分之十（10%)的范圍 內變化，比如，"大約100"表示的可以是90至IjllO之間的任何數值。此外，在"大約第一數值