一種單增李斯特菌培養基的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及檢驗微生物培養領域，具體設及一種用于適合于單增李斯特菌的培養 基。
【背景技術】
[0002] 李斯特菌(也稱李氏桿菌)為革蘭氏陽性短桿菌，目前國際上公認的李斯特菌共有 屯個菌株，其中單增李斯特菌化.mono^tohenes，LM)是唯一能引起人類疾病的。LM是一種 人畜共患病的病原菌。它能引起人、畜的李氏特菌病，感染后主要表現為敗血癥、腦膜炎和 單核細胞增多。LM為兼性厭氧、無芽胞，一般不形成芙膜，但在營養豐富的環境中可形成芙 膜。LM培養最適培養溫度為35--37°C，在抑弱堿性(PH9.6)、氧分壓低、二氧化碳張力高的條 件下該菌生長良好。
[0003] 雖然LM的營養要求不高，但由于LM的兼性厭氧和苛養性質，如樣本中混有雜菌，且 抑中性、常規空氣條件下培養時，則會發生因需氧雜菌生長過快而很快覆蓋了培養基，單增 李斯特菌無法生長，結果延誤診療時間。除此之外，LM在pH中性、常規空氣狀態下培養時，其 生長速度較慢，一般要48~7化才會有陽性菌落生長，脈液或者糞便樣品則往往還要樣品先 轉種于增菌培養液(EB)中培養2地，然后取增菌液劃線接種培養4她，方能有陽性菌落生長。 由于上述苛養性質，導致臨床對于疑似LM要求保留樣本7d，W防止漏診。但上述時間（7化） 限制了 LM培養結果在臨床診斷上的應用價值。

【發明內容】

[0004] 本發明的技術任務是針對W上現有技術的不足，提供一種配制簡單、檢出率高的 單增李斯特菌培養基。
[0005] 本發明解決其技術問題的技術方案是:一種單增李斯特菌的培養基，其特征為，每 1L培養基原料中含有蛋白腺6~lOg;牛肉膏3~6g;酵母浸膏2~5g;玉米淀粉2~3g，瓊脂10 ~12g;氯化鋼5~5.5g;憐酸二氨鋼1~3g;多粘菌素0.001~0.005g;桿菌膚0.001~ 0. 〇〇3g;光谷甘膚0.1~0.5g;無菌抗凝羊血20~30g;余量為滅菌去離子水。
[0006] 上述培養基的制備方法為:稱取酵母浸膏、牛肉膏、蛋白腺、瓊脂、葡萄糖、氯化鋼、 憐酸二氨鋼，混勻滅菌去離子水溶解，210°C，滅菌15min，冷卻到45°C，加入滅菌葡萄糖酸 鋒；滅菌光谷甘膚；滅菌多粘菌素；滅菌桿菌膚;無菌抗凝羊血混勻，滅菌去離子水定容到 1000ml后分裝。
[0007] 本發明與現有技術相比較，具有檢出可靠、單增李斯特菌分離率高的特點。配方特 點如下： 1、基礎培養基:所述的牛肉膏、蛋白腺、玉米淀粉提供碳源、氮源，酵母浸膏富含蛋白 質、氨基酸、多膚、核巧酸、維生素、生長因子、微量元素等營養成分，為單增李斯特菌的繁殖 和生長提供均衡的營養元素;氯化鋼維持均衡的滲透壓;瓊脂為培養基的凝固劑;憐酸二氨 鋼為緩沖劑;無菌抗凝羊血提供能量環境； 2、 抑菌劑:多粘菌素抑制革蘭氏陰性菌的生長;桿菌膚(Bacitracin),實驗室研究表明 桿菌膚可W抑制革蘭陽性和陰性球菌、肺炎雙球菌、葡萄球菌、淋球菌、腦膜炎雙球菌等雜 菌的生長，但該濃度下由于對李斯特菌屬無抗菌抑菌作用，因此提高了 LM的分離率； 3、 生長因子:通過實驗將同一 LM菌株接種到2個MMA培養基上，其中一個MMA培養基添加 0.01%滅菌光谷甘膚，于37°C、PH7.0、空氣氣氛下培養，48小時后觀察菌株，發現添加光谷甘 膚的MMA培養基有小的疑似菌落，鑒定后為LM，沒有添加光谷甘膚的MMA培養基未發現LM疑 似菌落，其原因可能在于光谷甘膚可W降低氧化還原電勢，有利于細胞生長、分化； 4、 特殊營養劑：葡萄糖酸鋒為營養劑，發明人發現，在培養基中加入一定濃度的鋒離 子，目標菌LM的生長狀態好于對照組，因此推論鋒離子有助于該菌的生長;而丫 -徑基精氨 酸為激活劑，可W促進單增李斯特菌對礦物質的攝取。
【具體實施方式】
[0008] W下結合實際情況，對本發明的【具體實施方式】作詳細說明。
[0009] 實施例1，每1L培養基原料中含有:蛋白腺6g;牛肉膏6g;酵母浸膏2g;玉米淀粉3g， 瓊脂lOg;氯化鋼5g;憐酸二氨鋼3g;多粘菌素0.00 Ig;桿菌膚0.003g;光谷甘膚0.5g;無菌抗 凝羊血20g;余量為滅菌去離子水。上述培養基的制備方法為:稱取蛋白腺、牛肉膏、酵母浸 膏、玉米淀粉、瓊脂、氯化鋼、憐酸二氨鋼，混勻后去離子水溶解，210°C滅菌15min，冷卻到45 °C，加入滅菌多粘菌素;滅菌桿菌膚;滅菌光谷甘膚;無菌抗凝羊血混勻，滅菌去離子水定容 到1L后分裝。
[0010] 實施例2,每1L培養基原料中含有:蛋白腺8g;牛肉膏4g;酵母浸膏3g;玉米淀粉2g， 瓊脂1 Ig;氯化鋼5.5g;憐酸二氨鋼Ig;多粘菌素0.003g;桿菌膚0.002g;葡萄糖酸鋒0.02g; 丫 -?基精氨酸0.1 g;無菌抗凝羊血25g;余量為滅菌去離子水。上述培養基的制備方法為： 稱取蛋白腺、牛肉膏、酵母浸膏、玉米淀粉、瓊脂、氯化鋼、憐酸二氨鋼，混勻后去離子水溶 解，210°C滅菌15min，冷卻到45°C，加入滅菌多粘菌素;滅菌桿菌膚;滅菌葡萄糖酸鋒;滅菌 丫-徑基精氨酸;無菌抗凝羊血混勻，滅菌去離子水定容到1L后分裝。
[0011] 實施例3,每1L培養基原料中含有：蛋白腺lOg;牛肉膏3g;酵母浸膏5g;玉米淀粉 2g，瓊脂12g;氯化鋼5g;憐酸二氨鋼2g;多粘菌素0.005g;桿菌膚0.0 Olg;光谷甘膚0.1 g;葡 萄糖酸鋒O.Olg; 丫 -徑基精氨酸〇.〇5g;無菌抗凝羊血30g;余量為滅菌去離子水。上述培養 基的制備方法為:稱取蛋白腺、牛肉膏、酵母浸膏、玉米淀粉、瓊脂、氯化鋼、憐酸二氨鋼，混 勻后去離子水溶解，210°C滅菌15min，冷卻到45°C，加入滅菌多粘菌素;滅菌桿菌膚;滅菌光 谷甘膚;滅菌葡萄糖酸鋒;滅菌丫 -徑基精氨酸;無菌抗凝羊血混勻，滅菌去離子水定容到1L 后分裝。
[0012] 本發明所得單增李斯特菌培養基具有檢出可靠、單增李斯特菌分離率高的特點， 為臨床資料充分證明，有關資料如下。
[001引 1對象與方法。
[0014] 1.1培養基制備:實驗組共設I、II、IIΙΞ個實驗組，分別使用實施例1、實施例2、 實施例3所得培養基，對照組為李氏菌選擇性培養基(MMA)，其成分(g/L):膜蛋白腺5.0;多 價腺5.0;牛肉浸粉3.0;葡萄糖1.0;氯化鋼5.0;憐酸氨二鋼1.0;甘氨酸10.0;氯化裡0.5;苯 乙醇2.5;瓊脂15.0;蒸饋水定容為1L，分裝傾入無菌平皿備用。
[0015] 1.2菌株來源及菌懸液的制備:LM標準菌株由市疾控中屯、菌種保藏室提供，常規 復蘇增菌分純后制成100 CFU/ml的LM菌懸液。
[0016] 1.3糞便樣本處理:取20份糞便樣本懸浮液2ml，分別加入LM菌懸液2ml，混勻。
[0017] 1.4接種及培養:分別取LM菌懸液和處理后的糞便樣本，各自用接種環分區劃線 接種于實驗I組、實驗II組、實驗III組和對照組培養基。35°C下，大氣環境保溫培養，觀察菌 落生長特征，分別于4她和96h，挑取細小菌落進行涂片，革蘭氏染色，顯微鏡鏡檢及氧化氨 酶實驗，行菌屬鑒定及巧光定量PCR檢測。其中菌屬鑒定陽性判斷標準依從《臨床微生物學 診斷與圖解》。
[001引2結果： 2.1 LM菌懸液培養結果比較:培養4化及
9化陽性檢出情況見下表，_ ' 上述結果可W看出，培養4她后，各實驗組與對照組陽性檢出率比較均具有明顯差異(P <0.05)，而96h時，各組間陽性檢出率差異無統計學意義(P〉0.05)。
[0019] 2.2 LM菌懸液處理后的糞便樣本培養結果比較:培養4她及9加陽性檢出情況見下 表，_
' 上述結果可W看出，混有雜菌的LM樣本，培養4她后，各實驗組與對照組陽性檢出率比' 較均具有極其顯著的差異(P<〇.01)，9化時，各實驗組陽性檢出率高于對照組，但差異無統 計學意義(P〉〇.〇5)。
[0020] 3.結論:本發明的培養基用于可W提高大氣培養環境下早期陽性分離率，從而縮 短確診時間。尤其是對于糞便等含有雜菌的樣本，可W緩解雜菌對于單增李斯特菌陽性生 長的不良影響，增加分離率。
【主權項】
1. 一種單增李斯特菌培養基，其特征在于，每1L培養基原料中含有蛋白胨6~log;牛肉 膏3~6g;酵母浸膏2~5g;玉米淀粉2~3g，瓊脂10~12g;氯化鈉5~5.5g;磷酸二氫鈉1~ 3g;多粘菌素0.001~0.005g;桿菌肽0.001~0.003g;光谷甘肽0.1~0.5g;無菌抗凝羊血20 ~30g;余量為滅菌去離子水。
【專利摘要】本發明公開了一種單增李斯特菌培養基，屬于檢驗微生物培養領域，其特征在于，每1L培養基原料中含有蛋白胨6～10g；牛肉膏3～6g；酵母浸膏2～5g；玉米淀粉2~3g，瓊脂10～12g；氯化鈉？5～5.5g；磷酸二氫鈉1～3g；多粘菌素0.001～0.005g；桿菌肽0.001～0.003g；光谷甘肽0.1～0.5g；無菌抗凝羊血20～30g；余量為滅菌去離子水。本發明與現有技術相比較，具有早期陽性分離率高的特點。
【IPC分類】C12N1/20, C12R1/01
【公開號】CN105505837
【申請號】CN201610080033
【發明人】李志友, 孫麗華
【申請人】李志友
【公開日】2016年4月20日
【申請日】2016年2月5日