抗單核細胞增生性李斯特菌溶血素單抗與應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種抗單核細胞增生性李斯特菌溶血素單抗，其輕鏈和重鏈可變區基因和由所述基因編碼的多肽和蛋白質，還公開了上述單抗在制備李斯特菌診斷試劑和治療性藥物中的應用。本發明人通過釣取單核細胞增生性李斯特菌溶血素基因，構建原核表達載體，并在大腸桿菌中成功表達。免疫小鼠制備了抗單核細胞增生性李斯特菌溶血素單抗雜交瘤細胞，并從中克隆了抗體輕、重鏈可變區基因。基于上述已克隆到的單抗3C11輕、重鏈可變區基因，可構建和表達多種小分子基因工程抗體，如單鏈抗體、單域抗體、嵌合抗體、Fab抗體、抗體融合蛋白等，制備用于李斯特菌檢測、診斷和治療性藥物。
【專利說明】抗單核細胞增生性李斯特菌溶血素單抗與應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種抗單核細胞增生性李斯特菌溶血素單抗，還涉及該單抗的制備方法及其應用。
【背景技術】 [0002]單核細胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes, LM)為革蘭陽性兼性厭氧菌，是李斯特菌屬中致病性最強的一種細菌，也是重要的食源性病原菌，能引起人獸共患李斯特菌病。LM對多種畜禽均有較高的致死率，人類感染后的主要表現為腦膜炎、流產及中樞神經系統感染。LM能使嬰幼兒、懷孕婦女和免疫耐受病人的感染死亡率可高達20%~30%。近年來，LM在美國、加拿大、德國、瑞士、意大利等國多次暴發流行，食源性病人也日益增多。由于LM引起的食物中毒危害日益嚴重，國內外給予極大關注。對該病建立快速、靈敏、準確的檢測方法是有效防治本病、診斷病原菌和保證食品衛生安全的重要手段，也是非常必要的。
[0003]李斯特菌溶血素(Iisteriolysin 0，簡稱LL0)是LM特有的毒力因子，它通過溶解細胞吞噬體膜而使LM逃離吞噬體。根據GenBank在對不同株LM溶血素基因的同源性分析可知，至少有97%核苷酸和99%的氨基酸是一致的。在其他類型的李斯特菌中沒有該毒素,這也是建立基于LLO單抗的ELISA檢測方法的基礎。

【發明內容】

[0004]為了提供一種有效的LM檢測方法，本發明公開了ー種抗單核細胞增生性李斯特菌溶血素單抗。該單抗的輕、重鏈可變區基因分別如序列表中序列1、2所示，輕、重鏈可變區和CDR區氣基酸序列分別如序列表中序列3、4所不。
[0005]單核李斯特菌溶血素單抗3C11輕鏈可變區基因測序結果320bp，見序列表中序列I，如下所示:
[0006]SEQ ID N0.1:
[0007]GTTCTCACCCAATCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAAAAGGTCACCATGACCTGCAGGGC
[0008]CAGCTCAAGTGTGAGTTCCACTTTCTTGCACTGGTTCCAGCAGAAGTCAGGTGCCTCCCCCAAACTCT
[0009]GGATTTATAGCACATCCAACTTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACC
[0010]TCTTACTCTCTCACAATCAGCAGTGTGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTACAG[0011 ] CGGTTATCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAACG
[0012]單核李斯特菌溶血素單抗3C11重鏈可變區基因測序結果342bp，見序列表中序列2，如下所示:
[0013]SEQ ID N0.2:
[0014]GCTGCAGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGAGGATCCATGAAACTCTCCTGTGTAGCCTCTG
[0015]GATTAACTTTCAGTAGCTACTGGATGTCTTGGGTCCGCCAGTCTCCAGAGAAGGGGCTTCAGTGGGTT
[0016]GCTGAAATTAGATTGAAATCTGATAATTATGCAACACATTATGCGGAGTCTGTGAAAGGGAAGTTTAC[0017]CATCTCAAGAGATGATTCCAGAGGTCGTCTCTACCTGCAAATGAACAACTTAAGAGCTGAAGACACTG
[0018]GAATTTATTACTGTACGACATTACTACGGCTACCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCT
[0019]GC
[0020]序列3:
[0021]SEQ ID N0.3根據Kabat數據庫確定輕鏈可變區序列和⑶R區3C11 LV
[0022]VLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSSTFLHWF
[0023]QQKSGASPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSY
[0024]SLTISSVEAEDAATYYCQQYSGYPFTFGSGTKLEI
[0025]K R
[0026]序列 4.[0027]SEQ ID N0.4根據Kabat數據庫確定重鏈可變區序列和⑶R區3C11 HV
[0028]LQESGGGLVQPGGSMKLSCVASGLTFSSYWMSWVR
[0029]QSPEKGLQWVAEIRLKSDNYATHYAESVKGKFTIS
[0030]RDDSRGRLYLQMNNLRAEDTGIYYCTTLLRLPYffG
[0031]QGTLVTVSA
[0032]序列5.[0033]SEQ ID N0.5單核李斯特菌溶血素單抗3C11輕鏈可變區互補決定區氨基酸序列
[0034]CDRl RASSSVSSTFLH
[0035]序列6.[0036]SEQID N0.6單核李斯特菌溶血素單抗3C11輕鏈可變區互補決定區氨基酸序列
[0037]CDR2 STSNLAS
[0038]序列7.[0039]SEQ ID N0.7單核李斯特菌溶血素單抗3C11輕鏈可變區互補決定區氨基酸序列
[0040]CDR3 QQYSGYPFT
[0041]序列8.[0042]SEQ ID N0.8單核李斯特菌溶血素單抗3C11重鏈可變區互補決定區氨基酸序列
[0043]CDRl T F S S Y W Met S
[0044]序列9.[0045]SEQ ID N0.9單核李斯特菌溶血素單抗3C11重鏈可變區互補決定區氨基酸序列
[0046]CDR2 EIRLKSDNYATHYAESVKG
[0047]序列10.[0048]SEQ ID N0.10單核李斯特菌溶血素單抗3C11重鏈可變區互補決定區氨基酸序列
[0049]CDR3 LLRLPY
[0050]本發明所述單抗的制備方法包括以下內容:
[0051](I)單核細胞增生性李斯特菌溶血素在大腸桿菌中的高效表達
[0052]用一對單核細胞增生性李斯特菌溶血`素基因特異性引物從單核李斯特菌基因組DNA中釣取溶血素基因(圖1.)，酶切鑒定后構建pET-30a (+) -LLO融合表達載體(圖2.)，然后轉化大腸桿菌BL21 (DE3)，IPTG誘導表達(圖3.)，并用鎳離子金屬螯合柱進行純化(圖4.)，表達產物行SDS-PAGE鑒定。[0053](2)抗單核細胞增生性李斯特菌溶血素單克隆抗體雜交瘤細胞株的構建和篩選
[0054]用重組單核細胞增生性李斯特菌溶血素免疫BALB/C小鼠，獲得針對單核李斯特菌溶血素的單克隆抗體，篩選親和力較高的單克隆抗體。于Balb/c小鼠腹腔接種雜交瘤細胞誘生腹水，Protein A Sepharose CL 4B親和柱純化,紫外分光光度計測A28(lmi/A26(lmi值，并計算蛋白濃度。對雜交瘤細胞3C11進行了染色體核型分析，融合后的雜交瘤細胞染色體數目為90-120條(圖5.)。用雙相瓊脂擴散實驗證明3C11雜交瘤細胞所分泌的免疫球蛋白亞型為IgGl。
[0055](3)抗單核細胞增生性李斯特菌溶血素單抗的Western-blot鑒定及相對親和力測定
[0056]將LM和rLLO經120g/L還原SDS-PAGE并轉移至硝酸纖維素膜上，封閉后滴加雜交瘤細胞培養上清，DAB顯色后，觀察結果(圖6.)。
[0057]用0.2 ii g/mL rLLO包被ELISA板并封閉。將Protein A純化的6株抗LLO的單克隆抗體(mAb)用PBS稀釋成不同的濃度后，加入到ELISA板中，37°C溫育后加入HRP-GAM，TMB底物顯色后測定吸光度(A)值(圖7.)。
[0058](4)抗單核細胞增生性李斯特菌溶血素單抗雜交瘤細胞3C11輕、重鏈基因的釣取取對數生長期的中和性單抗3C11細胞，用TRIzoI提取RNA(圖8)，經RT-PCR，用兩對特異性引物PHsl，PHs2 ;PLsl、PLs2釣取抗體的輕重鏈基因(圖9)。常規法連接入PGEM Teasy載體，轉化感受態細菌JM109，于固體LB平板37°C孵箱12~18小時后挑取單個菌落，提取質粒PCR鑒定后進行DNA測序分析。
[0059](5)抗單核細胞增生性李斯特菌溶血素單抗3C11輕、重鏈可變區基因序列和氨基酸序列的確定
[0060]用www.expasy.0rR在線軟件將核—酸序列翻譯為其編碼的氨基酸序列，根據Kabat數據庫確定輕鏈可變區序列(SEQ ID N0.3)和重鏈可變區序列(SEQID N0.4)。根據Kabat數據庫確定輕鏈可變區序列中的互補決定區CDRl (SEQ IDN0.5)、CDR2 (SEQ ID N0.6)和CDR3(SEQ ID N0.7)。重鏈可變區序列中的互補決定區CDRl (SEQ ID N0.8)、CDR2 (SEQID N0.9)和 CDR3 (SEQ ID N0.10)。
[0061]本發明還公開了上述抗單核細胞增生性李斯特菌溶血素單抗的應用。利用本發明所述的單抗，可以用于檢測單核細胞增生性李斯特菌。方法如下:用另ー株抗單核細胞增生性李斯特菌溶血素單抗包被ELISA板，與抗單核細胞增生性李斯特菌溶血素單抗3C11-HRP配伍，建立了單核細胞增生性李斯特菌ELISA檢測法。(圖10-12)。
[0062]本發明人應用ー套設計的引物從培養的單核增生性李斯特菌中成功釣取了其溶血素基因，并構建了單核細胞增生性李斯特菌溶血素原核表達載體，并在大腸桿菌中成功表達。免疫小鼠制備了抗單核細胞增生性李斯特菌溶血素單抗3C11雜交瘤細胞，獲得其特異性單抗，并從中克隆了抗體輕、重鏈可變區基因。所得單抗的輕鏈和重鏈可變區基因可編碼正確的小鼠抗體可變區。基于上述已克隆到的單抗3C11輕、重鏈可變區基因，可構建和表達多種小分子基因工程抗體，如單鏈抗體、單域抗體、嵌合抗體、Fab抗體、抗體融合蛋白等，制備用于李斯特菌檢測、診斷和治療性藥物。同時，本發明建立了基于重組溶血素單抗的單核李斯菌ELISA檢測方法，該方法使用簡便、特異性好，具有廣闊的應用前景，為單核李斯特菌特異性診斷奠定了基礎。【專利附圖】

【附圖說明】
[0063]圖1.單核細胞增生性李斯特菌溶血素基因釣取的PCR結果
[0064]左Marker，從上往下分子量依次為2.0kb, 1.0kb，750bp，500bp，250bp 和 IOObp ;右為目的基因。
[0065]圖2?重組質粒的酶切及PCR鑒定結果
[0066]從左到右依次為空載體酶切、BamH I+Xho I雙酶切、PCR產物及marker, Marker,從上往下分子量依次為 2.0kb, 1.0kb, 750bp, 500bp, 250bp 和 lOObp。
[0067]圖3.融合蛋白表達的12% SDS-PAGE鑒定結果
[0068]從左到右依次為上清、沉淀及蛋白質marker ,從上往下分子量依次為94KD、66.2KD、45KD、35KD 和 26KD。
[0069]圖4.融合蛋白表達的鎳離子親和層析純化結果
[0070]從左到右依次為115mmol/L-500mmol/L咪唑洗脫,最后為蛋白質Marker,從上往下分子量依次為 94KD、66.2KD、45KD、35KD 和 26KD。
[0071]圖5.雜交瘤細胞染色體核型分析結果
[0072]圖6.單抗的Western-Blot鑒定結果
[0073]1.2.3.4.均為重組蛋白，5.6.7為LM菌體裂解物。結果顯示3個抗體與菌體和重組蛋白均有反應，說明重組蛋白是菌體的重要組成本分，具有相同的生物學活性。 [0074]圖7.5株單抗的相對親和カ測定
[0075]經用不同濃度(0.25、0.5、1.0、2.0和5mg/L)rLL0包被后，加入不同濃度的5株mAb，用ELISA反復檢測，確認5株McAb的相對親和力依次為:McAb3 > McAbll > McAb4 >McAb 2 > McAb 7 >。
[0076]圖8.單核細胞增生性李斯特菌溶血素單抗3C11雜交瘤細胞RNA提取結果
[0077]圖9.單核細胞增生性李斯特菌溶血素單抗3C11雜交瘤細胞輕重鏈基因的PCR結果I為輕鏈基因；2為DL2000 ；3為重鏈基因。基因大小大約為660bp
[0078]圖10.檢測單核李斯特桿菌溶血素的的雙抗體夾心ELISA。
[0079]ELISA對rLLO的最低檢出濃度為1.95ng/mL。
[0080]圖11.檢測單核李斯特桿菌的雙抗體夾心ELISA。
[0081]ELISA對單核李斯特桿菌的最低檢出濃度為5.2X 108/し
[0082]圖12.ELISA方法的特異性實驗
[0083]本檢測方法與金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、短小棒狀桿菌、蠟樣芽孢桿菌、糞腸球菌、屎腸球菌等細菌均沒有交叉反應。
【具體實施方式】
[0084]通過參閱下述實施例可以更容易地了解本發明的內容，這些實施例只是為進一歩說明，并不意味著限定本發明的范圍。
[0085]實施例一李斯特菌溶血素在大腸桿菌中的高效表達
[0086]一、材料:大腸桿菌JM109、BL21(DE3)和PET_30a(+)載體由本實驗室保存；單核細胞增生性李斯特菌購自廣東醫藥研究所。質粒提取試劑盒和DNA純化試劑盒購自Promega公司;限制性內切酶BamH I和Xho I購自NEB公司；Taq酶、Pryobest酶、dNTPs和T4 DNA連接酶購自TaKaRa公司；鎳離子親和層析柱購自Invitrogen公司。
[0087]二、方法結果:
[0088]1.分析載體PET30a(+)和LLO的基因序列，運用計算機輔助設計的RNA 二級結構預測和偏性密碼子計算等手段設計引物。引物序列如下:
[0089]Ps:5 ‘-CGGGATCCGGTGGTGGTCCACCAGCATCTCCGCCTGC-3，，
[0090]Pa: 5 ’ -CCGCTCGAGATCTACACTATTACTATATTTCGGATAAA-3，。 [0091]采用IOOul 反應體系:2ul 模板，6ul dNTP (2.5mM stock)，IOul Buffer (IOX)，IulPrimer I, Iul Primer 2,0.5ul (5unit/ul)聚合酶(Takara Ex Taq), 79.5ul ddH20。
[0092]反應程序:95°C5min，94°C 45S，60°C 45S，72°C 2min，72°C lOmin，反應循環數為30。PCR產物用DNA片段純化試劑盒回收。將載體pET30a(+)和PCR擴增產物分別用BamHI和Xho I雙酶切并回收。連接并轉化感受態細菌。挑取單克隆，對質粒DNA進行PCR及BamH I和Xho I雙酶切鑒定后測序(圖1和圖2)。
[0093]2.rLLO在BL21菌中的融合表達及SDS-PAGE電泳
[0094]挑取鑒定正確的克隆，活化后接種含100mg/L氨卞青霉素的LB培養液中，37°C，160rpm培養至OD 600nm約0.4，轉入20°C并加入終濃度為0.5mmol/L的IPTG，繼續振蕩培養8h。超聲后用上清和沉淀行SDS-PAGE電泳(圖3)。
[0095]3.rLLO的鎳離子親和層析純化
[0096]用IOmMTris-HCl (pH8.0)溶液平衡鎳柱，約100ml，用含0.5M氯化鈉的IOmMTris-HCl (pH8.0)溶液平衡鎳柱，約50ml，用含8M尿素，0.5M氯化鈉的IOmMTris-HCl (pH8.0)溶液平衡鎳柱，約50ml。稀釋樣品上樣，樣品需要事先加入氯化鈉，終濃度為0.5M。上樣結束后，用含8M尿素，0.5M氯化鈉的IOmMTris-HCl (pH8.0)溶液洗柱。分別用含15mM咪唑、60mM咪唑、500mM咪唑的IOmMTris-HCl (pH8.0)(含8M尿素、0.5M氯化鈉)溶液洗脫，分別收集蛋白峰，行SDS-PAGE電泳(圖4)。
[0097]通過本部分的工作，實現了單核細胞增生性李斯特菌溶血素蛋白在大腸桿菌中的高效表達，為單抗的制備奠定了基礎。
[0098]實施例二抗單核細胞增生性李斯特菌溶血素單克隆抗體雜交瘤細胞株的構建和篩選
[0099]一、材料:HT、HAT、PEG1500購自SIGMA公司；18~20g Balb/c小鼠由軍事醫學科學院實驗動物中心提供；新生小牛血清購自北京元亨圣馬生物技術研究所；HRP(RZ ^ 3.1)及四甲基聯苯胺(TMB)為Sigma公司產品；HRP標記的羊抗小鼠抗體(GAM-HRP)由本室制備；Protein A層析柱購自Invitrogen公司。
[0100]二、方法結果:
[0101]1.Balb/c小鼠免疫選用4-6周齡的雌性Balb/c小鼠(軍事醫學科學院實驗動物中心提供)6只，用IOOiig rLLO腹股溝皮下免疫，第一針加福氏完全佐劑(Sigma)，第2針加福氏不完全佐劑(Sigma)，每3周免疫I次，共免疫3次。第3次免疫后尾靜脈采血，間接ELISA檢測抗體產生情況，融合前3天，以IOOyg rLLO腹腔加強免疫一次，第3天融合。
[0102]2.細胞融合將免疫的小鼠摘眼球后脫頸處死，無菌摘取小鼠脾細胞，按常規方法進行細胞融合。具體方法:①將免疫的小鼠摘眼球放血后脫頸處死，75%酒精浸泡3min，無菌取出脾臟，用200目鋼網研磨單個細胞懸液，無血清RPMI1640(Gibco)洗兩次并記數收集對數生長期的SP2/0細胞(ATCC引進，本實驗室保存)，用無血清RPMI 1640洗兩次并記數；③按SP2/0細胞:脾細胞=I: 5的比例混合兩種細胞，用RPMI 1640洗I次，棄盡上清，輕輕將細胞打散；@在Imin時間里緩慢加入Iml 50% PEG (MW 1500)溶液，置 37 °C 水浴 Imin ；⑤在 lmin、2min、2min、5min 時間內加無血清 RPMI1640lml、5ml、10ml、10ml !⑥800r/min離心7min,棄上清，盡可能輕輕將細胞懸起加含20% FCS的HAT(Sigma)-RPMI 1640培養液，調整細胞濃度為2X 106/ml，混勻后，滴加在鋪有滋養細胞(IX IO4細胞/孔)96孔培養板(Gibco)中，100 iil/孔，37。。5% CO2孵箱中培養。
[0103]3.間接ELISA篩選抗rLLO單克隆抗體雜交瘤細胞(I)用10 y g/mL rLLO包被ELISA板，于4°C過夜并封閉。依次加入待測細胞培養上清液(37°C lh，PBST洗板4次)，及I: 500 稀釋的 50 ii L HRP-GAM(37°C 45min，PBST 洗板 4 次)。以 TMB(Sigma)底物顯色后，于450nm波長測定A值。
[0104]4.雜交瘤細胞克隆化間接ELISA法篩選為陽性的細胞克隆再反復亞克隆，直到所有雜交瘤細胞培養上清檢測為100%陽性。雜交瘤細胞的克隆化用有限稀釋法:(I)在克隆化的當天或前I天制備滋養細胞:脫頸處理昆明小鼠，75%酒精浸泡消毒皮膚，無菌剝離腹部皮膚，注射器抽取5mL 1640培養液注入小鼠腹腔，反復沖洗后吸出腹腔洗液，用20%胎牛血清(北京元亨圣馬生物技術研究所)1640培養液稀釋后滴入96孔板，每孔約0.1ml0
(2)取少許待作克隆化的雜交瘤細胞移至另ー無菌試管中，并準確計數。(3)有限稀釋法進行亞克隆。(4)將培養板置于5% C02，37°C孵箱中培養，5天左右在顯微鏡下可觀察到細胞克隆。適時換液，檢測，取陽性單克隆細胞株進行擴大培養，及時凍存細胞株。
[0105]5.雜交瘤細胞的染色體核型分析在對數生長期的雜交瘤細胞中加入秋水仙素，終濃度為0.02 u g/mL,在孵箱中繼續培養4小時后收集細胞，經低滲裂解(加入預溫至37°C的0.075M KCL 8mL，輕輕打勻·，37°C 30-40分鐘)、預固定(甲醇:冰醋酸=3: I新鮮配制，輕輕打勻，離心棄上清)和3次固定(第1次固定:加入6mL固定液，輕輕打勻，室溫30分鐘，離心棄上清；第2次固定:加入6mL固定液，輕輕打勻，室溫15分鐘，離心棄上清；第3次固定:加入6mL固定液，輕輕打勻，室溫15分鐘，離心棄上清)處理后用少量固定液制備細胞懸液，滴于冰水浸泡的玻片上，文火烘干后10% Giemsa染色15-20分鐘，水洗鏡檢(圖5)。
[0106]6.雜交瘤細胞免疫球蛋白亞型的確定用羊抗鼠IgGl、IgG2a、IgG2b和IgG3，就雜交瘤細胞濃縮后的培養上清作雙相瓊脂擴散實驗，證明3C11雜交瘤細胞所分泌的免疫球蛋白亞型為IgGl。
[0107]通過本部分工作，篩選到了包括本專利保護的3C11在內的5株針對rLLO的單克隆抗體。雜交瘤細胞3C11染色體數目平均為102條，所分泌的免疫球蛋白亞型為IgGl。
[0108]實施例三抗單核細胞增生性李斯特菌溶血素單抗的Western-blot鑒定及相對親和カ測定
[0109]一、材料:
[0110]二、方法結果:
[0111]1.動物體內誘生單核細胞增生性李斯特菌溶血素單抗3C11接種雜交瘤細胞前10天，先給Balb/c小鼠(さ，8~12周)腹腔注射0.5ml液體石臘油。收集對數生長期的雜交瘤細胞，1500r/min離心7min，棄上清，生理鹽水洗2次，最后將細胞濃度調整為4X IO6/ml，每只小鼠腹腔注射0.5ml。7~10天后，可見小鼠腹部明顯膨大，碘酒和酒精棉球消毒腹部皮膚，抽取腹水。將抽取的腹水3000r/min離心lOmin，收集上清，加等量甘油，-20°C凍存備用。
[0112]2.抗單核細胞增生性李斯特菌溶血素單抗的Western-blot鑒定
[0113]將LM和rLLO經120g/L還原SDS-PAGE并轉移至硝酸纖維素膜上，濕轉膜，冰浴，恒流100V，75min。滴加含50g/L奶粉的PBS于4°C封閉過夜，用含0.5mL/LTween-20的PBS洗膜3次。滴加雜交瘤細胞培養上清(37°C結合lh，PBST洗膜3次，再用含0.5mL/L Tween-20的TBS洗滌3次)及HRP-GAM IgG(37°C結合lh，洗膜3次)以DAB顯色后，觀察結果(圖6)。
[0114]3.抗單核細胞增生性李斯特菌溶血素單抗相對親和力測定
[0115]用0.2 ii g/mL rLLO包被ELISA板并封閉。將Protein A純化的6株抗LLO的單克隆抗體(mAb)用PBS稀釋成不同的濃度后，加入到ELISA板中。于37°C溫育Ih后，用PBST洗板4次，再加入50 ii L I: 500 HRP-GAM于37°C溫育45min，PBST洗板4次，以TMB底物顯色后，于波長450nm測定吸光度(A)值(圖7)。
[0116]通過本本分工作，證明本專利保護的3C11特異性針對單核李斯特菌的溶血素蛋白，同時具有較高的親和力。
[0117]實施例四抗單核細胞增生性李斯特菌溶血素單抗雜交瘤細胞3C11輕、重鏈基因的釣取
[0118]1.取對數生長期的中和性單抗3C11細胞5X IO6-1O7個，離心去除上清，將細胞均勻彈起。加入lml TRIzol (Invitrogen)反復吹打使細胞充分裂解,振蕩5分鐘后,加入0.2ml氯仿，振蕩15秒，室溫放置2-3分鐘`，2_8°C 12000r/min，離心15分鐘，取上清于另ー新管中，加500 ill異丙醇混勻后室溫放置10分鐘，2-8°C 12000r/min離心10分鐘。75%こ醇洗滌沉淀，干燥后，用20 無RNA酶的去離子水溶解沉淀(圖9)。
[0119]2.取含 I Ug 總 RNA 的溶液，依次加入 AMV 5 X 緩沖液 4 yl，Oligo (dT) (500ng/U 1)0.5u 1,2.5mmol/L dNTP2 u 1，Rnasin (50U/u 1)0.5 u I，去離子水補至 20 u 1、反轉錄酶2-5U，42°C延伸I小時。95°C變性5分鐘，置冰浴中，產物為cDNA第一鏈。用2對特異性引物PHsl、PHal和PLs 1、PLal，在20iU PCR反應體系中，分別加入反轉錄產物2 yl，Taq酶IOXbuffer 2u 1，上下游引物各I U 1,2.5mmol/L dNTP I U 1，加Taq酶1-2U，去離子水補至20iil。95°C變性2分鐘，循環參數為:94°C I分鐘，55°C I分鐘，72°C I分鐘，共30個循環，72°C后延伸10分鐘(圖10)。
[0120]3.用分離出欲回收的DNA片段，在長波紫外光下切下含目的DNA片段的膠塊，放入離心管中，加入三倍膠體積的化膠液，55°C水浴完全溶解膠塊。用DNA片段純化試劑盒(0MEGA生物科技公司)回收DNA片段并將純化的DNA片段在水溶液里，將回收的PCR產物在T4DNA連接酶緩沖液中按2:1的比例(摩爾比)和載體PGEMTeasy (Promega公司)混合后，加入0.5U的T4DNA連接酶(New EnglandBiolabs)于16°C連接過夜，連接反應的總體積為10 u L0
[0121]4.取連接液lOiil，加入200iil感受態細菌JM109中并輕柔混勻，冰浴30分鐘，42°C水浴熱休克90秒，迅速轉入冰浴2分鐘，加800 u I LB培養基，轉入37°C恒溫搖床，以150轉/分鐘的速度搖動45分鐘，4000r/min離心I分鐘，棄去800 U I上清，取沉淀涂布于含Amp (終濃度為100 u g/ml)的固體LB平板，將平板倒置于37°C孵箱12~18小吋。
[0122]5.在上述平板中挑取單個克隆，接種于含氨卞青霉素(lOOiig/mL)的LB培養基中。37°C恒溫搖床170rpm,震蕩培養過夜。取3mL菌液加入1.5mL Eppendorf管中，1000Orpm離心lmin，棄上清。將沉淀菌體重懸于IOOii L溶液I中，加新鮮配制的溶液II 200 u L,輕緩地上下顛倒數次，至液體變清澈為止。隨后，再加入150 u L溶液III，輕柔地上下顛倒數次使液體混勻，此時出現大量白色絮狀沉淀。4°C，12000rpm離心5min，取上清加至另ーEppendorf管中，加入等體積的Tris-HCl飽和酹,劇烈震蕩后，12000rpm離心5min,將上層水相移至一新管中。再加入500 ii L氯仿，重新抽提一次。其后，小心吸取上層水相，移至一新管中，加2倍體積的無水こ醇混勻，于_20°C放置3h。4°C，12000rpm離心lOmin，棄上清，用70%こ醇洗沉淀2次，室溫干燥20min，以40 y L無菌雙蒸水溶解，進行DNA測序分析。
[0123]6.使用的引物序列如下:
[0124]PHsl:5，-AGG TCC AGC TTC TCG AGT CAGG-3，22
[0125]PHs2:5，-AGG TCC AAC TGC TCG AGT CTGG-3，22
[0126]PLsl:5，-CCA GTT CCG AGC TCCAGA TGA CCC AGT CTC CA-3，32
[0127]PLal:5，-GCG CCG TCT AGA ATT AAC ACT CAT TCC TGT TGAA-3，34
[0128]構建了含有單核李斯特菌溶血素單抗雜交瘤細胞株3C11輕、重鏈基因的載體，經測序分析、序列比對為小鼠免疫球蛋白輕、重鏈基因(SEQ ID N0.USEQ IDN0.2)。
[0129]實施例五抗單核細 胞增生性李斯特菌溶血素單抗3C11輕、重鏈可變區基因序列和氨基酸序列的確定
[0130]用www.expasy.0rg在線軟件將核—酸序列翻譯為其編碼的氨基酸序列。根據Kabat數據庫確定輕鏈可變區序列(SEQ ID N0.3)和重鏈可變區序列(SEQ IDN0.4)。根據Kabat數據庫確定輕鏈可變區序列中的互補決定區CDRl (SEQ IDN0.5)、CDR2 (SEQ ID N0.6)和CDR3(SEQ ID N0.7)。重鏈可變區序列中的互補決定區CDRl (SEQ ID N0.8)、CDR2 (SEQID N0.9)和 CDR3 (SEQID N0.10)。
[0131]實施例六基于抗單核細胞增生性李斯特菌溶血素單抗的檢測法
[0132]1.用0.2mg/L McAb7包被ELISA板，于4°C過夜并封閉。同時加入PBS稀釋的不同濃度的 rLL0，37°C lh，PBST 洗板 4 次，加入 50iiL I: I 600 McAbll-HRP (37°C 45min,PBST洗板4次)，以TMB底物顯色后，于波長450nm測定A值(圖10)。
[0133]2.包被及封閉好的ELISA板中加入PBS稀釋的不同濃度單核李斯特菌37°C lh，PBST 洗板 4 次，加入 50 ii L I: I 600 McAbll-HRP (37°C 45min，PBST 洗板 4 次)，以 TMB 底物顯色后，于波長450nm測定A值。
[0134]3.包被及封閉好的ELISA板中加入0.5M的金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、短小棒狀桿菌、蠟樣芽孢桿菌、糞腸球菌、屎腸球菌等細菌和單核李斯特菌37°C lh, PBST洗板4次，加入 50iiL I: 1600 McAbll-HRP(37°C45min，PBST洗板4 次)，以 TMB底物顯色后，于波長450nm測定A值(圖11，圖12)。本部分工作建立了檢測單核李斯特桿菌及其溶血素的雙抗體夾心ELISA。對rLLO的最低檢出濃度為1.95ng/mL，對單核李斯特桿菌的最低檢出濃度為5.2 X IOVlo本檢測方法與金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、短小棒狀桿菌、蠟樣芽孢桿菌、糞腸球菌、屎腸球菌等細菌均沒有交叉反應。
【權利要求】
1.一種抗單核細胞增生性李斯特菌溶血素的單克隆抗體，其特征在于輕、重鏈可變區編碼基因的核苷酸序列分別如序列表中序列1、2所示。
2.根據權利要求1所述單克隆抗體，其特征在于輕、重鏈可變區和CDR區氨基酸序列分別如序列表中序列3、4所示。
3.根據權利要求1所述單克隆抗體，其中輕鏈可變區互補決定區氨基酸序列如序列表中序列5、序列6或序列7所示。
4.根據權利要求1所述單克隆抗體，其中重鏈可變區互補決定區氨基酸序列如序列表中序列8、序列9或序列10所示。
5.權利要求1-4中任一所述的單克隆抗體在制備李斯特菌檢測、診斷試劑或治療藥物中的應用。
6.根據權利要求5所述應用，其中李斯特菌檢測、診斷方法為ELISA。
7.根據權利要求6所述應用，其中李斯特菌治療藥物為根據單克隆抗體輕、重鏈可變區基因，構建表達的小分子基因工程抗體。
8.根據權利要求7所述應用，其中小分子基因工程抗體為單鏈抗體、單域抗體、嵌合抗體、Fab抗體或抗體融合蛋白 。
【文檔編號】C07K16/12GK103588875SQ201210509271
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2012年12月3日 優先權日:2012年12月3日
【發明者】郭建巍, 秦力維 申請人:中國人民解放軍海軍總醫院