到有更 大的E75最大二聚體應答的趨勢(2.0±0.2%vs.l.4±0.2%;p = 0.07)。
[0059] 圖6顯示了 GP2II期試驗中患者的體內免疫應答。在GP2肽組(PG)中，從接種前水平 到接種后水平，對GP2的DTH反應中值顯著增加（I.0±0.8cm至18.0±3. Icm;p〈0.0001)，而 在對照佐劑組(AG)中，則具有較低的程度(0.0± 1.0 cm至0.5 ± 3.3cm;p〈0.01)。相較于AG， 在PG中接種后DTH顯著更大（18.0±3.1cm vs 0.5±3.3cm，p = 0.002)〇
[0060] 詳細說明
[0061] 將多種涉及本發明方法和其它方面的術語用于本說明書和權利要求通篇。除非另 有指明，否則以本領域普通含義給出該術語。對于其他特別定義的術語，以與此處提供的定 義相一致的方式來解釋。
[0062] 術語"預防"的各種形式指通過任何客觀或主觀參數(包括放射學的或身體檢查的 結果）所測量，在臨床緩解的患者中預先阻止或延緩乳腺癌復發（recurrence)/復發 (relapse)的任何成功或該成功的任何象征。
[0063] "有效量"或"治療有效量"在此互換使用，并且指如在此所描述的對于實現特定生 物學結果有效的化合物、物質或組合物的量，該生物學結果例如但不限于在此公開、描述或 示例的生物學結果。該結果可以包括但不限于由適于本領域的任何方法所測定的乳腺癌的 預防，并且更具體地，復發乳腺癌的預防，例如受試者中復發的預防。最佳治療量指實現最 佳治療結果的劑量、方案和加強劑的使用。
[0064] "可藥用的"指鑒于組合物、制劑、穩定性、患者接受以及生物可利用性的角度，從 藥學/毒理學觀點講，患者可接受的那些特性和/或物質，以及從物理/化學觀點講，對從事 制造的藥劑師而言可接受的那些特性和/或物質。"可藥用載體"指不干擾活性成分的生物 活性的效力并且對于其給予的宿主沒有毒性的介質。
[0065] "保護性免疫"或"保護性免疫應答"意指受試者建立了對于抗原如在此描述和示 例的乳腺癌抗原的免疫原性組分的活性免疫應答，以致在隨后暴露于該抗原時，受試者的 免疫系統能夠靶向并破壞表達該抗原的細胞，從而減少受試者癌癥復發的發病率和死亡 率。本發明上下文中的保護性免疫優選由T淋巴細胞所賦予，但不排除其它。
[0066] "預存免疫"被定義為至少0.3%肽特異性二聚體水平。可以使用標準測定，例如本 申請中描述的HLA-A2免疫球蛋白二聚體測定，來測量肽特異性二聚體水平。
[0067] 術語"約"當在此用于指可測值例如量、持續時間等時意指包含與該特定值有土 20%或±10%，更優選±5%，甚至更優選±1 %，且還更優選±0.1 %的變化，該變化對于進 行所公開的方法是適當的。
[0068] "肽"指任何包括通過肽鍵或修飾肽鍵（即肽電子等排體)相互連接的兩個或多個 氨基酸。多肽指短鏈(通常稱作肽、寡肽或寡聚物)和較長鏈(通常稱作蛋白質）。多肽可以含 有除20種基因編碼的氨基酸以外的氨基酸。多肽包括通過天然加工(例如翻譯后加工)或通 過本領域眾所周知的化學修飾技術所修飾的氨基酸序列。此種修飾在基礎課本中被充分地 描述并且在專著以及很多的研究文獻中被更加詳細地描述。修飾可以在多肽的任何位置發 生，包括肽骨架、氨基酸側鏈以及氨基或羧基末端。應理解的是在給定多肽的若干位點處， 可以以相同或不同程度存在相同類型的修飾。給定多肽也可以含有許多類型的修飾。作為 遍在蛋白化的結果，多肽可以分支，并且他們可以是帶有或不帶有分支的環形。環形、分支 以及分支的環形多肽可以由天然翻譯后加工或者可以由合成方法所產生。修飾包括乙酰 化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黃素共價結合、血紅素部分的共價結合、核苷酸或核苷酸 衍生物的共價結合、脂或脂衍生物的共價結合、磷脂酰肌醇的共價結合、交聯、環化、二硫鍵 形成、去甲基化、共價交聯的形成、胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ-羧化、糖基 化、GPI錨形成、羥化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、異戊二烯化、外 消旋化、硒化(s e I enoy I at i on )、硫酸化、轉運RNA介導的氨基酸向蛋白質的添加例如精氨酰 化(arginylation)，和遍在蛋白化。
[0069] "加強劑"指給予患者以增強、延長或維持保護性免疫以及克服由調節T細胞介導 的T細胞應答下調的劑量免疫原。
[0070] "無乳腺癌"或者"無疾病"或者NED(無疾病證據)意指患者處于由目前標準護理療 法的治療所引起的臨床緩解。對于同義使用的"緩解"或"臨床緩解"，其意指根據臨床診斷， 乳腺癌的臨床體征、放射學體征以及癥狀已經顯著減少或者完全消失，盡管癌細胞仍舊可 能存在于體內。因此，認為緩解包括部分和完全緩解。殘留癌細胞的存在可以通過諸如CTC (循環腫瘤細胞)檢測法來計算并且可以預測復發。
[0071 ] "復發(Relapse)" 或"復發(recurrence)" 或"再現(resurgence)" 在此互換使用， 并且指在一段時間的改善或緩解后，乳腺癌的復發的放射照相診斷，或者復發的體征和癥 狀。
[0072]乳腺癌是世界范圍女性主要的健康關注。迄今嘗試的乳腺癌疫苗效力有限，尤其 是對于預防在標準治療過程后減輕的患者的復發。如本申請所討論的，確定了給予HER2/ neu原癌基因的肽GP2(SEQ ID NO: 2)可以誘導有效的體內免疫應答，所述應答已知與無疾 病患者中降低的乳腺癌復發率相關。GP2肽與MHC HLA-A2相關，并且因此可以誘導具有HLA-A2單元型的患者中的保護性免疫。HLA-A2單元型已經顯示為卵巢癌（Gamzatova等人， Gynecol 0ncol(2006)103:145-50)和前列腺癌（Hueman等人，Clin Cancer Res(2005)ll: 7470-79;De Petris等人，Med 0ncol(2004)21:49-52)中的陰性預測因子，并且這一發現可 能也擴展至乳腺癌。因此，HLA-A2+患者似乎表現為減輕后癌癥復發的更高的風險。但是，意 外證明包含GP2+GM-CSF的疫苗組合物有效誘導HLA-A2+患者中的強力的體內免疫應答，所 述患者已知與較之HLA-A2-對照患者更低的乳腺癌復發風險和更長的無疾病存活相關。此 外，令人驚訝地發現用GP2 (亞優勢表位)和GM-CSF治療的患者表現出較之包含E75 (免疫優 勢表位)和GM-CSF的疫苗組合物更強力的DTH應答。值得注意的是，這些結果并非通過組合 GP2與另一表位(例如E75)來產生多表位疫苗而獲得的，而是用單表位（即GP2)疫苗來獲得 的。此外，基于初步的數據，表明了GP2也可以誘導具有HLA-A3單元型的患者中的保護性免 疫。
[0073]由于GP2衍生自HER2/neu蛋白質，人們將預期過量表達HER2/neu的患者將較之那 些具有低至中等HER2/neu表達的患者表現出對于基于GP2的疫苗更好的應答。例如，另一種 基于HER2/neu的療法，曲妥珠單抗（Herceptil^Genentech Inc. ,South San Francisco, CA)僅僅被認為用于HER2/neu過表達（IHC 3+或FISH 2 2.0)，結陽性(NP)轉移性乳腺癌患 者，并且在具有低至中等的HER2/neu表達的患者中表現出非常有限的活性。但是，出人意料 地觀察到具有低至中等水平的HER2/neu表達的患者經歷了針對GP2的強力的免疫應答，強 度類似于在過量表達HER2/neu的患者中的GP2誘導的應答。
[0074]因此，本發明的一個方案涉及誘導針對乳腺癌復發(relapse或recurrence)的保 護性免疫的疫苗組合物。另一實施方案提供了誘導及維持針對乳腺癌的保護性免疫的方 法，并且更具體的針對復發的乳腺癌。一些方面，本方法包括向受試者給予有效量的包括藥 學有效的載體、具有SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的多肽以及任選地免疫佐劑(例如GM-CSF) 的組合物。SEQ ID NO: 2的變體包括具有如美國專利公開號NO. 20050169934(其以其整體通 過參考并入本文)所描述的具有修飾的氨基酸側鏈的那些，其適于在本申請的疫苗組合物 和方法中使用。
[0075]此外，已經鑒定了在密碼子655處的天然存在的多態性（異亮氨酸至纈氨酸的取 代），其產生具有序列IVSAVVGIL(SEQ ID N0:4)的多態型GP2肽(Papewalis等人，Nucleic Acid Res. (1991)19:5452)。這一多態型GP2肽也適合用于本申請的疫苗組合物和方法。類 似地，一些小組已經調查了在GP2肽的多個位點上引入的單一、兩個和三個氨基酸取代，所 述位點包括錨定殘基(第2位和第9位），并且發現某些氨基酸取代導致GP2與HLA-A2的增加 的結合（Tanaka等人，Int J Cancer(2001 )94:540-44;Kuhns等人，J Biol Chem( 1999)274: 36422-427;Sharma等人 J Biol Chem(2001 )276:21443-449，這些參考均在此以其整體通 過引用并入本文）。因此，本領域的技術人員將理解可以對GP2進行某些取代(特別是在錨定 殘基上），而不負面影響其誘導保護性免疫應答的能力。在一個實施方案中，除了在增加 GP2 肽對HLA-A2分子的親和力的殘基處的取代外，GP2肽包含SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:4的氨 基酸序列。優選地，取代發生在GP2的一個或兩個錨定殘基處(第2和第9位）。更優選地，取代 包含在第2位的異亮氨酸至亮氨酸的取代和/或在第9位的亮氨酸至纈氨酸的取代。在另一 個實施方案中，除了在下述殘基處的取代外，GP2肽包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的氨基 酸序列，與包含SEQ ID NO: 2的野生型GP2肽對HLA-2分子的親和力相比，所述取代不影響 GP2肽對HLA-A2分子的親和力。用于測試GP2和HLA-A2的結合親和力的測定是本領域已知 的，并且包括例如Sharma等人J Biol Chem(2001 )276:21443-449中公開的T2細胞表面集 合測定。
[0076] 在一個方面，GP2肽的氨基酸殘基不超過9、10、11、12、13、14或15個。在一個實施方 案中，GP2肽的氨基酸殘基不超過9個。優選地，具有不超過9個氨基酸的GP2肽是SEQ ID NO: 2或SEQ ID N0:4,或具有在第2位和/或第9位處的取代的SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:4的突 變形式。
[0077]受試者可以是任何動物，并且優選哺乳動物例如人、小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠、兔、 貓、狗、猴、牛、馬、豬等。最優選人。高度優選的方面，人對于HLA-A2單元型是陽性的。其它優 選的方面，人類對于人HER2/neu的表達是陽性的，優選包括具有低和/或中度表達HER2/neu 的腫瘤的人類，以及作為HER2/neu的過表達者的人類。
[0078]此外，我們的小組以前證明了曲妥珠單抗和GP2肽刺激的離體CTL之間可能的協同 作用。用曲妥珠單抗預處理乳腺癌細胞，然后將其與GP2-肽誘導的CTL孵育，在三個腫瘤細 胞系中，產生了較之用曲妥珠單抗或GP2-特異性CTL單獨處理而言增強的細胞毒性 (Mittendorf EA等人,Annals of Surgical 0ncology(2006)13(8) :1085-1098)。鑒于本申 請中公開的用GP2的實驗結果，這些發現表明在曲妥珠單抗治療期間同時GP2接種可能是有 效的組合免疫療法。
[0079] 可以根據適于本領域的任何方法以凍干或液體制劑來配制疫苗組合物。液體形式 制劑的非限制性實例包括溶液、懸劑、糖漿劑、衆液和乳劑。適合的液體載體包括任何適合 的有機或無機溶劑，例如水、醇、鹽水溶液、緩沖的鹽水溶液、生理鹽水溶液、葡萄糖溶液、丙 二醇水溶液等，優選無菌形式。
[0080] 可以以中性或鹽形式配制疫苗組合物。可藥用的鹽包括酸加成鹽（由活性多肽的 游離氨基形成）、及由無機酸(例如鹽酸或磷酸)或者有機酸(例如乙酸、草酸、酒石酸、苦杏 仁酸)等形成。由游離羧基形成的鹽也可以源自無機堿例如鈉、鉀、銨、鈣、或者鐵的氫氧化 物，以及如異丙胺、三甲基胺、2_乙氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等的有機堿。
[0081] 優選配制疫苗組合物用于接種或注射受試者。對于注射，本發明的疫苗組合物可 以配制為水性溶液如水或醇，或者生理上相容的緩沖液如Hank's溶液、Ringer's溶液或生 理鹽水緩沖液。該溶液可以含有配方劑如懸劑、防腐劑、穩定劑和/或分散劑。可以以固體形 式制劑來制備注射制劑，該固體制劑旨在于例如使用前通過