在線 檢測洗脫液紫外吸光度，檢測波長為203nm，收集主含人參皂苷Rd的洗脫液，回收溶媒并濃 縮、減壓干燥，即得。
[0052] 采用HPLC法測定，人參皂苷Rd含量為67 %。
[0053] 實施例4:三七提取物的制備
[0054] 1)取三七藥材加濃度為80%乙醇提取，將提取液回收乙醇，得含固形物15%的 二七提取液；
[0055] 2)三七提取液脫脂后，經D型大孔樹脂純化，用水：95%乙醇按梯度洗脫法洗去除 Rd外的三七三醇苷類成分以及多數三七二醇苷類成分，再單獨以70~95 %乙醇洗脫以人 參皂苷Rd為主的皂苷類成分，收集洗脫液并脫色后，回收溶媒后，濃縮，減壓干燥，制成干 燥品；
[0056] 3)干燥品加濃度為99. 9%乙醇溶解，用25 y m濾膜濾去不溶物，然后經過單分散 聚合硅膠層析柱吸附后，用水；濃度為99. 9%乙醇按梯度洗脫法洗脫純化，用紫外檢測器 在線檢測洗脫液紫外吸光度，檢測波長為203nm，收集主含人參皂苷Rd的洗脫液，回收溶媒 并濃縮、減壓干燥，即得。
[0057] 本發明三七提取物采用HPLC法測定，人參皂苷Rd含量為80 %。
[0058] 實施例5:本發明片劑
[0059] 取實施例1三七提取物，加入輔料微晶纖維素、羥丙基纖維素、羧甲基淀粉鈉混合 均勻，用60%乙醇制軟材，過20目篩制粒，干燥，整粒，加入潤滑劑滑石粉、硬脂酸鎂混合均 勻，壓片，制成片劑，即得三七片劑。
[0060] 采用HPLC法測定，人參皂苷Rd含量為26 %。
[0061] 實施例6 :本發明顆粒劑
[0062] 取實施例2三七提取物，加入輔料淀粉、蔗糖粉混合均勻，用60%乙醇制軟材，過 20目篩制粒，干燥，整粒，分裝，制成顆粒劑，即得三七顆粒劑。
[0063] 采用HPLC法測定，人參皂苷Rd含量為45 %。
[0064] 實施例7 :本發明錠劑
[0065] 取實施例3三七提取物，加入粘結劑糯米粉、蜂蜜和少量的水，攪拌混合均勻，搓 條，分割，按規定重量及形狀搓捏成型，干燥，制得錠劑，即得三七錠劑。
[0066] 采用HPLC法測定，人參皂苷Rd含量為58 %。
[0067] 實施例8 :本發明注射劑
[0068] 取實施例4三七提取物，用注射用水溶解，活性炭處理，過濾，灌封，冷凍干燥，制 得凍干注射劑，即得二七凍干粉劑。
[0069] 采用HPLC法測定，人參皂苷Rd含量為82 %。
[0070] 對比例1 :人參皂苷的制備（參考2010版《中國藥典》一部人參總皂苷的制法）
[0071] 1)取人參，切得厚片，加水煎煮二次，第一次2小時，第二次1. 5小時，煎濾濾過，合 并濾液，通過D101型大孔吸附樹脂柱，水洗脫至無色，再用60%乙醇洗脫，收集60%乙醇洗 脫液，濾液濃縮至相對密度為1. 06-1. 08 (80°C )的清膏，干燥，粉碎，即得人參總皂苷。
[0072] 藥效實驗：
[0073]1三七提取物對小膠質細胞細胞活力的影響
[0074]1. 1實驗材料
[0075] 實驗藥物：本發明實施例4
[0076] 細胞及試劑：小膠質細胞株BV-2 (北京協和醫科大學）；胰蛋白酶、DMEM培養基、 胎牛血清（Gibco, USA) ;T25細胞培養瓶，96孔、48孔、12孔細胞培養板（corning);-氧化 氮檢測試劑盒（碧云天）；Cell Counting Kit-8 (DOJINDO, Japan，簡稱 CCK-8) ;LPS (碧云 天）
[0077] 儀器設備：C02恒溫培養箱（THERMO, F0RMA3111型，美國）；倒置相差顯微鏡 (Nikon，TE200,日本）；低溫高速離心機（BECKMAN，64R型，美國）；定量PCR儀（ABI，7500 型，美國）；DU-800 紫外分光光度計（DNA/Protein Analyzer，BECKMAN，美國）；PCR1000〇
[0078]1. 2實驗分組
[0079] 實驗1組：本發明實施例4三七提取物0. 01g/L ;
[0080] 實驗2組：本發明實施例4三七提取物0. 00lg/L ;
[0081] 實驗3組：本發明實施例4三七提取物0. 000lg/L;
[0082] 對照組：培養過程不加本發明三七提取物。
[0083] 1. 3實驗方法
[0084] 在BV-2細胞中分別加入實驗1 一 3組三七提取物培養24h后，棄去上清液，加入 CCK-8,繼續孵育0. 5h，于450nm波長處測定吸光度。
[0085] 1.4實驗結果見表1
[0086] 表1三七提取物對小膠質細胞細胞活力的影響
[0087]
[0088] 表1結果顯示，實驗1 一 3組與對照組相比，組間沒有統計學差異。表明本發明對 小膠質細胞活力無影響，不引起小膠質細胞死亡，沒有神經毒性。
[0089] 2三七提取物對小膠質細胞分泌炎性介質的影響
[0090] 2. 1實驗材料
[0091] 本發明實施例4三七提取物、對比例1人參皂苷。
[0092] 2. 2實驗分組
[0093] 實驗1組：本發明實施例4三七提取物0. 0lg/L加LPS;
[0094] 實驗2組：本發明實施例4三七提取物0. 00lg/L加LPS;
[0095] 實驗3組：本發明實施例4三七提取物0. 000lg/L加LPS;
[0096] 實驗4組：對比例1人參皂苷0? 01g/L加LPS;
[0097] 實驗5組：對比例1人參皂苷0. 00lg/L加LPS;
[0098] 實驗6組：對比例1人參皂苷0. 000lg/L加LPS;
[0099] 正常對照組；
[0100] LPS組。
[0101] 2. 3實驗方法
[0102] 完全DMEM培養基培養小鼠小膠質細胞系BV-2及原代培養的大鼠小膠質細胞。調 整細胞濃度為1 X 105/mL，接種到48孔培養板內過夜，加入本發明實施例4三七提取物及對 比例1人參皂苷，終濃度分別為0. 〇lg/L，0. 001g/L，0. 0001g/L，預孵育0. 5h，然后加入內毒 素（LPS，終濃度0. 1 y g/mL)進行刺激。用Greiss法檢測NO的濃度。
[0103] 2. 4實驗結果見表2。
[0104] 表2對小膠質細胞分泌炎性介質的影響
[0105]
[0106] 注：與LPS組相比，*P〈0. 01 ;與同等濃度的人參皂苷相比，#P〈0. 01。
[0107] 表2結果顯示：本發明實驗1-5組與LPS組相比，有顯著的統計學差異；本發明實 驗1-3組分別與實驗4-6組相比，有顯著的統計學差異。表明在達到一定濃度后人參皂苷 及三七提取物干預能明顯抑制LPS引起的神經毒性物質NO釋放。同時表明，同等濃度條件 下，采用本發明方法制備的三七提取物比人參皂苷效果更為顯著。
[0108] 3 討論
[0109] 在研宄中發現，本發明對小膠質細胞活力無影響，不引起小膠質細胞死亡，沒有神 經毒性。在達到一定濃度后，三七提取物干預能明顯抑制LPS引起的神經毒性物質NO釋放。 提示本發明對多發性硬化、肌萎縮性脊髓側索硬化癥、艾滋病癡呆癥、瘋牛病等疾病有較佳 的治療效果，對于臨床治療小膠質細胞介導疾病藥物的開發研宄及臨床治療都具有參考意 義。
[0110] 總體實驗效果顯示，本發明可有效治療小膠質細胞介導疾病，實驗中藥物用量 0? 01g/L、0. 001g/L、0. 0001g/L分別相當于臨床治療時人體用量的100mg/kg、10mg/kg、 lmg/kg治療效果，最優為用量0. 01g/L，藥效結果提示，當三七提取物中人參皂苷Rd含量為 30%以上、治療用量為10-100mg/kg時，三七提取物能顯示出顯著的治療小膠質細胞介導 疾病效果。
[0111] 雖然，上文中已經用一般性說明、【具體實施方式】及試驗，對本發明作了詳盡的描 述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見 的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的 范圍。
【主權項】
1. 三七在制備預防和/或治療小膠質細胞介導疾病藥物的新用途。2. 三七提取物在制備預防和/或治療小膠質細胞介導疾病藥物的新用途。3. 根據權利要求2所述用途，其特征在于：所述的三七提取物為三七醇提物。4. 根據權利要求2所述用途，所述三七提取物中人參皂苷Rd含量不低于30%。5. 根據權利要求4所述用途，其特征在于所述三七提取物通過以下步驟制備而得： 1) 取三七藥材加水或體積百分比濃度為25~96%的乙醇提取，將提取液回收乙醇，得 二七提取液； 2) 三七提取液脫脂后，經D型大孔樹脂純化后，濃縮，減壓干燥，制成干燥品； 3) 干燥品加體積百分比濃度為95.0%以上的乙醇溶解，濾去不溶物，然后經過單分 散聚合硅膠層析柱吸附洗脫純化，用紫外檢測器在線檢測洗脫液紫外吸光度，檢測波長為 203nm，收集主含人參皂苷Rd的洗脫液，回收溶媒并濃縮、減壓干燥，即得。6. 根據權利要求5所述用途，其特征在于：所述步驟1)中所得三七提取液含固形物 5 - 25%〇7. 根據權利要求5所述用途，其特征在于：所述的步驟2)經D型大孔樹脂純化時，用 水：95%乙醇按梯度洗脫法洗去除Rd外的三七三醇苷類成分以及多數三七二醇苷類成分， 再單獨以70~95%乙醇洗脫以人參皂苷Rd為主的皂苷類成分，收集洗脫液并脫色后，回收 溶媒。8. 根據權利要求5所述用途，其特征在于：所述的步驟3)濾去不溶物是采用1~50 y m 濾膜過濾。9. 根據權利要求5所述用途，其特征在于：所述的步驟3)經單分散聚合硅膠層析柱吸 附后，洗脫純化是用水：95. 0%~99. 9%乙醇按梯度洗脫法洗脫純化。10. 根據權利要求5所述用途，其特征在于：所述的紫外檢測器在線檢測采用的檢測波 長為203nm。11. 根據權利要求1-8任一項所述用途，其特征在于：其中所述藥物每日劑量以人參皂 苷Rd計為10~100 mg/kg體重。12. 根據權利要求1-10任一項所述的用途，其特征在于：所述小膠質細胞介導疾病包 括多發性硬化、肌萎縮性脊髓側索硬化癥、艾滋病癡呆癥、瘋牛病。13. 三七提取物與醫藥學上可接受的載體配合制成在制備治療和/或預防小膠質細胞 介導疾病藥物方面的新用途。
【專利摘要】本發明涉及三七及三七提取物的新用途，即三七及三七提取物在制備治療小膠質細胞介導疾病藥物的新用途，特別是三七提取物中人參皂苷Rd含量不低于30％的藥物制劑在制備治療小膠質細胞介導疾病藥物的新用途。
【IPC分類】A61P25/00, A61P31/12, A61P25/28, A61K36/258
【公開號】CN104958334
【申請號】CN201510391812
【發明人】許淑清, 王少峽, 黃宇聲, 胡利民, 李釗文, 郭虹, 劉冠萍, 孟凡英, 鄭志遠, 張栩顏
【申請人】廣西梧州制藥（集團）股份有限公司
【公開日】2015年10月7日
【申請日】2015年7月7日