一種溶瘤病毒制劑及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種溶瘤病毒制劑及其制備方法，尤其涉及一種溶瘤病毒制劑及其制備方法。
【背景技術】
[0002]惡性腫瘤作為一種嚴重威脅人類生命健康的疾病，近年來尋找有效、毒副作用小的治療方法已成為醫學研宄的重中之重。依據以毒攻毒的原理，利用病毒來殺滅腫瘤細胞，是腫瘤治療的一種理想策略，然而這一策略卻面臨兩方面問題，即如何使病毒選擇性地到達腫瘤部位，以及如何使病毒逃過機體免疫系統的攻擊。
[0003]病毒DNA或RNA與蛋白質及其它生物分子一起組裝形成病毒顆粒，后者如能夠感染腫瘤細胞，并在腫瘤細胞中大量復制，產生新的病毒顆粒，最終導致腫瘤細胞裂解，此即所謂的溶瘤病毒，即具有復制能力的腫瘤殺傷型病毒。然而，溶瘤病毒作為異己成分，一旦進入機體便會受到機體的免疫排斥，特別是抗病毒抗體的產生，通過對病毒的清除，從而限制溶瘤病毒的抗瘤作用。另外，游離的溶瘤病毒容易進入正常組織，不但削弱了病毒對腫瘤細胞的有效殺傷效果，而且會對正常組織造成損傷，引發毒副作用。

【發明內容】

[0004]本發明提供了一種溶瘤病毒制劑，溶瘤病毒作為治療有效組分由凋亡的腫瘤細胞獲得的細胞囊泡所包裹，可以作為一種靶向生物制劑用于腫瘤疾病的治療，有效提升溶瘤病毒的殺瘤效應，及降低對機體的毒副作用。
[0005]本發明提供了一種溶瘤病毒制劑的制備方法，實現了將作為治療有效成分的溶瘤病毒包裹到源自凋亡腫瘤細胞的細胞囊泡中，并成功收集了細胞囊泡包裹溶瘤病毒后形成微顆粒，即本發明的溶瘤病毒制劑。
[0006]本發明提供了一種溶瘤病毒制劑，是一種以溶瘤病毒感染腫瘤細胞并使之凋亡而產生的細胞囊泡為載體，包裹溶瘤病毒而形成的制劑。
[0007]本發明提供的溶瘤病毒制劑由細胞囊泡包裹溶瘤病毒而形成，其作為一種靶向生物制劑，更利于溶瘤病毒達到腫瘤治療部位，提高殺瘤效應，同時利用腫瘤細胞自身來源的細胞囊泡將溶瘤病毒包裹其中，使溶瘤病毒逃避機體免疫系統的攻擊。
[0008]作為本領域的基礎知識，細胞在受到凋亡信號或者刺激信號刺激時，局部細胞膜結構發生改變，向外膨起并包裹細胞內容物形成囊泡結構而被釋放到細胞外，其直徑界于100-1000納米(nm)，即本發明所述的“細胞囊泡(microparticles)”。另外，細胞在凋亡時，還可以釋放直徑在1-3微米(μπι)的凋亡小體(apoptotic body)，以及直徑在30-100納米的外排體(exosome)。凋亡小體或外排體與細胞囊泡，存在顯著差別，不包括在本發明內。正由于腫瘤細胞在凋亡過程中會產生凋亡小體、外排體等，本發明的方案需要以特定的步驟和條件才能獲得細胞囊泡包裹溶瘤病毒后形成的所述溶瘤病毒制劑。
[0009]本案申請人曾公開了一種利用來自凋亡腫瘤細胞的細胞囊泡包裹化療藥物提供能夠實現靶向給藥的藥物制劑，具體看參見CN102302784A。本發明方案與囊泡包裹化療藥物有不同的設計和應用特點。化療藥物在進入腫瘤細胞后，通過物理空間包裹的原理，被凋亡腫瘤細胞釋放的細胞囊泡所包裹形成裝載化療藥物的微顆粒制劑。本發明方案中，溶瘤病毒進入腫瘤細胞后，借助腫瘤細胞內的氨基酸、核苷酸、脂類分子等原料物質，進行大量的生物合成，在此過程中，病毒處于活性狀態，具有活動復制的能力，可以與腫瘤細胞的細胞骨架或者細胞膜進行相互作用，最終導致腫瘤細胞釋放小泡，形成其中包裹溶瘤病毒的細胞顆粒，也可稱微顆粒。與包裹化療藥物不同的是，溶瘤病毒與腫瘤細胞的數量需要達到合適的比例才利于得到能發揮治療功效的微顆粒制劑，即，溶瘤病毒過少會達不到復制的效果，溶瘤病毒過多則會導致腫瘤細胞死亡，進而導致釋放的細胞囊泡量急劇減少。除此之夕卜，化療藥物作為小分子物質，其粒徑通常小于lnm，而病毒的直徑可處于50-200nm之間，細胞囊泡的直徑則介于10-1OOOnm之間，因而細胞囊泡在釋放的過程中能否包裹病毒并不能通過其能夠包裹化療藥物而簡單推出，并且只有當病毒在腫瘤細胞內復制到一定數量的時候，才會讓細胞囊泡包裹病毒的幾率增大和數量增多。故而細胞囊泡包裹病毒與細胞囊泡包裹化療藥物相比，需要考慮病毒的生物復制和病毒的粒徑大小的因素。
[0010]本發明提供的方案中，為了得到細胞囊泡對溶瘤病毒有效包裹的微顆粒，制備體系中溶瘤病毒與腫瘤細胞的比例最好介于1:1至20:1之間。進一步的，所述比例可以是
10:1ο
[0011]本發明提供的一種溶瘤病毒制劑的制備方法，包括使溶瘤病毒與腫瘤細胞以1:1至20:1比例混合以感染腫瘤細胞，在37°C和5%氧含量條件下，培養被感染的腫瘤細胞并使之凋亡，在48-72小時時間內，收集凋亡腫瘤細胞釋放的微顆粒，所述微顆粒即為細胞囊泡包裹溶瘤病毒后形成的所述溶瘤病毒制劑。在本申請的方案中，溶瘤病毒與腫瘤細胞的比例指的是數量比。
[0012]本發明方案所使用的溶瘤病毒可以為商購獲得的任何溶瘤病毒。例如，所述溶瘤病毒為溶瘤腺病毒。腺病毒為感染人的常見病毒，其免疫原性強，能夠被機體的免疫系統快速清除，并且腺病毒不整合到基因組DNA分子中，不導致基因組DNA突變，因此使用此種病毒具有非常好的安全性。
[0013]進一步的，所述腫瘤細胞包括卵巢癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、結腸癌、肝癌、胰腺癌或前列腺癌等。
[0014]本發明的方案中，對于微顆粒的收集可使用超速離心機在低溫條件下或室溫條件下進行分離。在具體實施方案中，可以通過離心機，在低溫條件下(4°C左右)，以1000-50000g的離心力，收集微顆粒。例如，可以在不大于5000g的離心力去除腫瘤細胞及其碎片，以10000g-50000g的離心力收集獲得的沉淀即為所述微顆粒。更進一步的，可以在不大于5000g的離心力下去除腫瘤細胞及其碎片，在1000g的離心力下收集獲得的沉淀即為所述微顆粒。
[0015]本發明提供的一種溶瘤病毒制劑，包括源自凋亡腫瘤細胞的細胞囊泡和被包裹在所述細胞囊泡內作為有效成分的溶瘤病毒，所述溶瘤病毒制劑根據所述任一方法制成。
[0016]本發明提供的所述溶瘤病毒制劑由于采用了上述來自凋亡腫瘤細胞的細胞囊泡作為包裹溶瘤病毒的載體，成為一種微顆粒。相較于游離的溶瘤病毒，包裹在細胞囊泡內的溶瘤病毒不能被免疫系統所識別，從而能夠安全、有效到達腫瘤部位。一般的游離溶瘤病毒是通過細胞膜上特殊受體分子的介導而進入細胞內，但一些腫瘤細胞本身不表達該受體或者主動下調該受體表達，則可以逃避溶瘤病毒的入侵。而在本申請的方案中，由于采用的來源于腫瘤細胞的細胞囊泡極其容易與腫瘤細胞的細胞膜融合，反而介導了其包裹的溶瘤病毒進入腫瘤細胞。
[0017]在本發明的方案中，由所述細胞囊泡包裹所述溶瘤病毒所形成的溶瘤病毒制劑的粒度為100?1000納米。
[0018]可以看出，本發明所采用的包裹溶瘤病毒的細胞囊泡因為尺寸遠大于正常組織毛細血管的通透性(5-10nm)，而不能穿過正常毛細血管而進入正常組織，避免了現有技術中由于直接注射游離溶瘤病毒而對機體其他正常組織的毒副作用。
[0019]可以理解，本發明提供了一種獲得靶向溶瘤病毒制劑的新的思路和方案，該靶向溶瘤病毒制劑可以針對不同類型的臨床惡性腫瘤，例如:卵巢癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、結腸癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌等，用于包裹溶瘤病毒的細胞囊泡(載體)則最好是來自與患者罹患的腫瘤同種類型的腫瘤細胞或者能讓溶瘤病毒進行復制的其它類型細胞。
[0020]本發明所述的溶瘤病毒感染腫瘤細胞并使腫瘤細胞凋亡，可以按照本領域技術人員公知的判斷標準，例如觀察腫瘤細胞縮小、變暗，即可認為其已經凋亡。
[0021]在本發明提供的方案中，在使溶瘤病毒感染腫瘤細胞之前還包括對所述腫瘤細胞進行培養。上述細胞的培養方法可采用本領域常規的培養方法進行培養。
[0022]本領域技術人員可以按照常規方法制成溶瘤病毒制劑，尤其是注射制劑，例如，將收集到的微顆粒用生理鹽水懸浮后制成注射液。
[0023]本發明的所述溶瘤病毒制劑可以為單位制劑。所述單位制劑為滿足一次給藥所需有效成分的制劑，如一單位(針)針劑等。患者一次施用所需的藥物的量可以方便地通過計算患者的體重和該患者一次用藥所需單位體重劑量的乘積得到。例如，在制備藥物的過程中，一般認為成人體重為50-70kg，所以最初可以通過實驗動物與人的單位體重劑量之間的等效劑量換算關系來確定用藥量。例如，可以根據FDA、SFDA等藥品管理機構提出的指導意見，也可參考(黃繼漢等，“藥理試驗中動物間和動物與人體間