本(ben)發明屬于生物醫藥技術領域，具(ju)體涉及一種判(pan)斷鼻咽癌放療敏感(gan)性的分(fen)子標志物及應用(yong)。

背景技術：

肉堿棕櫚酰轉移酶CPT1A(carnitine palmitoyltransferase 1A)是細胞(bao)代謝(xie)途徑中參(can)與脂(zhi)肪酸(suan)β氧(yang)(yang)化(hua)(hua)的(de)(de)(de)關鍵酶，定位于(yu)線粒體(ti)(ti)外膜。其生(sheng)(sheng)理功能是以(yi)肉堿為載體(ti)(ti)，將(jiang)脂(zhi)酰輔酶A轉化(hua)(hua)為脂(zhi)酰肉堿和(he)輔酶A，促進(jin)細胞(bao)漿中的(de)(de)(de)脂(zhi)肪酸(suan)進(jin)入線粒體(ti)(ti)基(ji)質進(jin)行β氧(yang)(yang)化(hua)(hua)分解，最終(zhong)生(sheng)(sheng)成乙酰輔酶A，為生(sheng)(sheng)物(wu)合成及(ji)ATP的(de)(de)(de)產(chan)生(sheng)(sheng)提(ti)供(gong)原料。新近(jin)研究(jiu)表明，前列腺癌(ai)、膠質瘤(liu)、白血病干細胞(bao)、MYC高表達的(de)(de)(de)三陰性(xing)乳腺癌(ai)以(yi)及(ji)氧(yang)(yang)化(hua)(hua)磷酸(suan)化(hua)(hua)活(huo)躍的(de)(de)(de)彌散性(xing)大B細胞(bao)淋(lin)巴瘤(liu)中脂(zhi)肪酸(suan)β氧(yang)(yang)化(hua)(hua)異常活(huo)化(hua)(hua)。腫瘤(liu)細胞(bao)依賴脂(zhi)肪酸(suan)β氧(yang)(yang)化(hua)(hua)代謝(xie)提(ti)供(gong)的(de)(de)(de)NADPH、ATP抵抗氧(yang)(yang)化(hua)(hua)應激或(huo)氧(yang)(yang)、葡萄糖(tang)缺乏等(deng)代謝(xie)應激，促進(jin)腫瘤(liu)細胞(bao)的(de)(de)(de)增殖和(he)存活(huo)。

Etomoxir(ETO)是(shi)FDA批準的(de)(de)(de)CPT1靶向抑(yi)(yi)(yi)制劑，通過增(zeng)加(jia)脂肪細(xi)(xi)(xi)胞對(dui)胰(yi)島素的(de)(de)(de)敏感性(xing)、抑(yi)(yi)(yi)制肝細(xi)(xi)(xi)胞的(de)(de)(de)糖(tang)異生(sheng)而(er)降低(di)血糖(tang)，目前(qian)已應用于2型糖(tang)尿病(bing)的(de)(de)(de)臨(lin)床治(zhi)療。近年的(de)(de)(de)研究表明(ming)，etomoxir在(zai)腫(zhong)瘤的(de)(de)(de)治(zhi)療中發揮(hui)重(zhong)要作用。在(zai)三陰(yin)性(xing)乳腺(xian)癌(ai)(ai)和(he)前(qian)列腺(xian)癌(ai)(ai)中，etomoxir可以抑(yi)(yi)(yi)制裸(luo)鼠移植(zhi)瘤的(de)(de)(de)增(zeng)殖。在(zai)急性(xing)粒細(xi)(xi)(xi)胞白血病(bing)中，etomoxir能(neng)誘導白血病(bing)細(xi)(xi)(xi)胞凋亡，增(zeng)加(jia)靜息性(xing)白血病(bing)祖細(xi)(xi)(xi)胞對(dui)化療藥物阿糖(tang)胞嘧啶的(de)(de)(de)敏感性(xing)。Etomoxir能(neng)抑(yi)(yi)(yi)制肝癌(ai)(ai)中干(gan)細(xi)(xi)(xi)胞的(de)(de)(de)干(gan)性(xing)，增(zeng)加(jia)肝癌(ai)(ai)干(gan)細(xi)(xi)(xi)胞對(dui)靶向藥物索拉菲尼的(de)(de)(de)敏感性(xing)。以上研究提示(shi)，CPT1的(de)(de)(de)靶向抑(yi)(yi)(yi)制劑etomoxir在(zai)腫(zhong)瘤治(zhi)療中具(ju)有潛在(zai)價值。

鼻(bi)咽(yan)癌(ai)是人群高(gao)發的(de)(de)(de)腫(zhong)瘤，放療(liao)(liao)是治(zhi)療(liao)(liao)鼻(bi)咽(yan)癌(ai)的(de)(de)(de)主要手段，但約20％的(de)(de)(de)鼻(bi)咽(yan)癌(ai)患者(zhe)仍(reng)出(chu)現局部復發或轉移(yi)的(de)(de)(de)情況(kuang)，并且成為患者(zhe)死亡(wang)的(de)(de)(de)主要原因。因此，發現鼻(bi)咽(yan)癌(ai)治(zhi)療(liao)(liao)的(de)(de)(de)分子靶標(biao)，研究靶向治(zhi)療(liao)(liao)方法(fa)，增加腫(zhong)瘤對(dui)放療(liao)(liao)的(de)(de)(de)敏感性，是降低鼻(bi)咽(yan)癌(ai)患者(zhe)死亡(wang)率的(de)(de)(de)重要策(ce)略。

技術實現要素：

本(ben)發明的目的在于確(que)定CPT1A可(ke)(ke)作為判斷(duan)鼻(bi)咽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)癌(ai)(ai)放(fang)(fang)療敏感性(xing)的分子標志(zhi)(zhi)物(wu)，etomoxir(ETO)作為CPT1A靶向(xiang)抑制(zhi)(zhi)(zhi)劑(ji)可(ke)(ke)應用(yong)(yong)于鼻(bi)咽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)癌(ai)(ai)的治(zhi)(zhi)療，etomoxir通過誘(you)導(dao)(dao)鼻(bi)咽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)癌(ai)(ai)放(fang)(fang)療抵(di)抗細胞(bao)(bao)凋(diao)亡(wang)，增加腫瘤細胞(bao)(bao)對(dui)放(fang)(fang)療的敏感性(xing)，提高治(zhi)(zhi)療效果(guo)。因此(ci)，分子標志(zhi)(zhi)物(wu)CPT1A可(ke)(ke)用(yong)(yong)于制(zhi)(zhi)(zhi)備鼻(bi)咽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)癌(ai)(ai)放(fang)(fang)療增敏治(zhi)(zhi)療藥(yao)(yao)物(wu)、制(zhi)(zhi)(zhi)備抑制(zhi)(zhi)(zhi)鼻(bi)咽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)癌(ai)(ai)放(fang)(fang)療抵(di)抗細胞(bao)(bao)脂(zhi)(zhi)肪酸代藥(yao)(yao)物(wu)、制(zhi)(zhi)(zhi)備誘(you)導(dao)(dao)鼻(bi)咽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)癌(ai)(ai)放(fang)(fang)療抵(di)抗細胞(bao)(bao)凋(diao)亡(wang)藥(yao)(yao)物(wu)。分子標志(zhi)(zhi)物(wu)CPT1A的靶向(xiang)抑制(zhi)(zhi)(zhi)劑(ji)etomoxir可(ke)(ke)用(yong)(yong)于制(zhi)(zhi)(zhi)備鼻(bi)咽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)癌(ai)(ai)放(fang)(fang)療增敏治(zhi)(zhi)療藥(yao)(yao)物(wu)、制(zhi)(zhi)(zhi)備抑制(zhi)(zhi)(zhi)鼻(bi)咽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)癌(ai)(ai)放(fang)(fang)療抵(di)抗細胞(bao)(bao)脂(zhi)(zhi)肪酸代藥(yao)(yao)物(wu)、制(zhi)(zhi)(zhi)備誘(you)導(dao)(dao)鼻(bi)咽(yan)(yan)(yan)(yan)(yan)癌(ai)(ai)放(fang)(fang)療抵(di)抗細胞(bao)(bao)凋(diao)亡(wang)藥(yao)(yao)物(wu)。

下面對本發明作進一步(bu)說明：

本發(fa)明以(yi)鼻(bi)咽癌放療(liao)(liao)抵抗(kang)細(xi)胞為(wei)主(zhu)要的體外研究模(mo)型，發(fa)現CPT1A的mRNA、蛋白表(biao)達和酶活性水(shui)(shui)平在放療(liao)(liao)抵抗(kang)細(xi)胞中顯著(zhu)增高(gao)。TCGA數據庫(ku)顯示(shi)CPT1A的mRNA水(shui)(shui)平增高(gao)降(jiang)低頭頸部鱗癌患者的總生存期，鼻(bi)咽癌組織芯片(pian)顯示(shi)CPT1A蛋白高(gao)表(biao)達降(jiang)低放射(she)治療(liao)(liao)后鼻(bi)咽癌患者的總生存期。說明CPT1A可作為(wei)分(fen)子標志物(wu)用于評價鼻(bi)咽癌對放射(she)治療(liao)(liao)是否敏感。

本發(fa)(fa)明發(fa)(fa)現(xian)CPT1A介(jie)導的(de)脂肪酸β氧(yang)化在放療抵(di)(di)抗(kang)細胞(bao)(bao)中異(yi)常活(huo)化，表現(xian)為脂肪酸氧(yang)化活(huo)性增加(jia)，ATP和NADPH含(han)量增加(jia)。Etomoxir處理鼻咽癌放療抵(di)(di)抗(kang)細胞(bao)(bao)，用細胞(bao)(bao)內(nei)ATP含(han)量、NADPH含(han)量評價etomoxir對(dui)細胞(bao)(bao)代(dai)謝(xie)的(de)影響，用JC-1熒光(guang)染料(liao)檢(jian)測(ce)etomoxir對(dui)細胞(bao)(bao)線粒體(ti)(ti)膜電位(wei)的(de)影響，用Annexin-V熒光(guang)染料(liao)研究etomoxir對(dui)細胞(bao)(bao)凋亡的(de)影響。研究發(fa)(fa)現(xian)，etomoxir能抑制鼻咽癌放療抵(di)(di)抗(kang)細胞(bao)(bao)的(de)ATP、NADPH含(han)量，降低線粒體(ti)(ti)膜電位(wei)，增加(jia)細胞(bao)(bao)凋亡。

發明人以臨床(chuang)常用(yong)(yong)(yong)的(de)放(fang)(fang)(fang)(fang)療(liao)增(zeng)敏(min)劑順鉑(bo)(Cisplatin)為陽性對(dui)照，用(yong)(yong)(yong)克隆(long)形成實驗(yan)評(ping)價etomoxir對(dui)鼻(bi)咽(yan)癌(ai)細(xi)胞(bao)(bao)放(fang)(fang)(fang)(fang)療(liao)抗(kang)(kang)性的(de)影(ying)響。研究發現，etomoxir與放(fang)(fang)(fang)(fang)療(liao)聯用(yong)(yong)(yong)組對(dui)放(fang)(fang)(fang)(fang)療(liao)抵抗(kang)(kang)細(xi)胞(bao)(bao)克隆(long)形成能力的(de)抑(yi)制(zhi)作用(yong)(yong)(yong)明顯高于順鉑(bo)與放(fang)(fang)(fang)(fang)療(liao)聯用(yong)(yong)(yong)組。用(yong)(yong)(yong)鼻(bi)咽(yan)癌(ai)放(fang)(fang)(fang)(fang)療(liao)抵抗(kang)(kang)細(xi)胞(bao)(bao)構建裸鼠移植(zhi)瘤(liu)模(mo)型證(zheng)實與單獨放(fang)(fang)(fang)(fang)療(liao)相比，etomoxir與放(fang)(fang)(fang)(fang)療(liao)聯用(yong)(yong)(yong)能顯著(zhu)抑(yi)制(zhi)瘤(liu)體生長，增(zeng)加腫瘤(liu)細(xi)胞(bao)(bao)凋亡(wang)。本發明通過(guo)體外和體內(nei)實驗(yan)證(zheng)明，etomoxir抑(yi)制(zhi)鼻(bi)咽(yan)癌(ai)放(fang)(fang)(fang)(fang)療(liao)抵抗(kang)(kang)細(xi)胞(bao)(bao)的(de)脂肪酸β氧化，增(zeng)加放(fang)(fang)(fang)(fang)療(liao)抵抗(kang)(kang)細(xi)胞(bao)(bao)對(dui)放(fang)(fang)(fang)(fang)療(liao)的(de)敏(min)感性，可(ke)作為靶向(xiang)藥物應用(yong)(yong)(yong)于鼻(bi)咽(yan)癌(ai)放(fang)(fang)(fang)(fang)射(she)治療(liao)。

附圖說明

圖1：

A顯示鼻咽癌放療抵抗細胞CNE2-IR、HK1-IR中CPT1A mRNA水平高于放療敏感(gan)細胞CNE2、HK1；

B顯示(shi)鼻咽癌放療抵抗(kang)細胞(bao)CNE2-IR、HK1-IR中CPT1A蛋白(bai)表達水(shui)平高于放療敏(min)感(gan)細胞(bao)CNE2、HK1；

C顯示鼻咽癌放療抵(di)抗(kang)細胞CNE2-IR、HK1-IR中CPT1A酶活性水平(ping)高于(yu)放療敏(min)感細胞CNE2、HK1。

圖2：

A顯(xian)示(shi)CPT1A mRNA水平增高降低頭頸部鱗癌患者的總生存期(qi)；

B顯示CPT1A蛋(dan)白(bai)表(biao)達水平(ping)增高降低放療后鼻咽癌患者的總生存期；

圖3：

A顯示CNE2-IR細胞脂肪酸β氧化能力增強；

B顯示etomoxir降低(di)CNE2-IR、HK1-IR細(xi)胞的ATP含量(liang)；

C顯示etomoxir降低CNE2-IR、HK1-IR細胞的NADPH含量(liang)；

圖4：

A顯示etomoxir降低CNE2-IR、HK1-IR細(xi)胞的線粒體(ti)膜電(dian)位；

B顯示etomoxir增加CNE2-IR、HK1-IR細胞的凋亡水平(ping)；

圖(tu)5：顯(xian)示etomoxir單獨或與(yu)放療(liao)聯用(yong)明(ming)顯(xian)降低CNE2-IR、HK1-IR細胞的存活分數；

圖6：

A顯示(shi)etomoxir單獨或etomoxir與放療(liao)聯合處理明顯降(jiang)低(di)CNE2-IR裸鼠移(yi)植瘤的生長速率；

B顯示etomoxir單(dan)獨或(huo)etomoxir與放療聯合處理明顯降低CNE2-IR裸(luo)鼠移植瘤的體積(ji)和(he)重量。

具體實施方式

本發明(ming)所(suo)用鼻咽(yan)癌細(xi)胞(bao)(bao)(bao)系CNE2細(xi)胞(bao)(bao)(bao)為中(zhong)國(guo)醫學(xue)(xue)科(ke)學(xue)(xue)院(yuan)(yuan)腫瘤研(yan)究所(suo)建(jian)(jian)系，CNE2-IR是以CNE2為母細(xi)胞(bao)(bao)(bao)經(jing)過總(zong)劑量為80Gy照射(she)建(jian)(jian)立(li)的放療(liao)抵抗細(xi)胞(bao)(bao)(bao)，為湘雅醫院(yuan)(yuan)耳(er)鼻喉科(ke)建(jian)(jian)系。HK1細(xi)胞(bao)(bao)(bao)為香(xiang)港伊麗莎(sha)白醫院(yuan)(yuan)放射(she)與腫瘤科(ke)所(suo)建(jian)(jian)，HK1-IR是以HK1為母細(xi)胞(bao)(bao)(bao)經(jing)過總(zong)劑量為60Gy照射(she)建(jian)(jian)立(li)的放療(liao)抵抗細(xi)胞(bao)(bao)(bao)，為中(zhong)南大學(xue)(xue)腫瘤研(yan)究所(suo)建(jian)(jian)系。

實施例1.鼻咽癌放療抵抗(kang)細胞(bao)中CPT1A mRNA、蛋白(bai)表達(da)和(he)酶活(huo)性水平增加

A CPT1A的mRNA反(fan)映基因的轉(zhuan)錄(lu)水平(ping)。

實(shi)驗方法：鼻(bi)咽癌細胞在6孔板中培養，至80～90％融(rong)合時，抽提細胞RNA，再(zai)進行逆轉錄和定量PCR，檢測CPT1A的mRNA水平。

實驗結果(guo)：如(ru)圖1A所示，CNE2-IR、HK1-IR細胞中(zhong)CPT1A的mRNA水平高(gao)于(yu)CNE2、HK1細胞。

B CPT1A的(de)蛋白表達反映基因的(de)翻譯(yi)水平(ping)。

實驗方(fang)法：鼻咽癌細胞在6孔板中培養，至80～90％融合時(shi)，抽提細胞蛋白，用Western Blot檢測CPT1A的蛋白表(biao)達(da)水平。

實驗結果：如(ru)圖1B所示，CNE2-IR、HK1-IR細(xi)胞(bao)中CPT1A蛋白表達(da)水平高于CNE2、HK1細(xi)胞(bao)。

C CPT1A是(shi)脂肪酸β氧化的(de)關(guan)鍵酶(mei)，酶(mei)活性是(shi)CPT1A發揮生物學功(gong)能(neng)的(de)關(guan)鍵。

實(shi)驗(yan)方法：鼻咽癌細胞(bao)在6孔板(ban)中(zhong)培養。實(shi)驗(yan)分組(zu)為(wei)vehicle組(zu)和ETO。待細胞(bao)長至80～90％融合(he)后(hou)(hou)，加ETO(40μM)2h后(hou)(hou)，抽提(ti)細胞(bao)總蛋(dan)白(bai)。取100μl蛋(dan)白(bai)裂解(jie)液，加入(ru)50μl DTNB顯色劑，用(yong)酶(mei)標儀檢(jian)測(ce)405nm波長的(de)吸(xi)光(guang)度值，記為(wei)blank。再向上述體系中(zhong)加入(ru)終濃度為(wei)5mM的(de)L-肉堿和100μM的(de)棕櫚酰輔酶(mei)A，作為(wei)CPT1酶(mei)促反應的(de)底物，37℃孵(fu)育20min后(hou)(hou)，檢(jian)測(ce)吸(xi)光(guang)度值，用(yong)所得值減去blank即為(wei)檢(jian)測(ce)結果(guo)，再用(yong)蛋(dan)白(bai)濃度進行歸一處理即得到(dao)最終結果(guo)。

實驗結果：如圖(tu)1C所示，CNE2-IR、HK1-IR細(xi)胞中CPT1A酶活性顯著高于CNE2、HK1細(xi)胞。

實施例2.CPT1A高表(biao)達與頭頸部鱗癌或鼻咽癌患者預后(hou)不良呈正相關

A現已(yi)有多種(zhong)腫瘤樣本庫(ku)公開(kai)數據供研究者分析(xi)(xi)。申請人(ren)調(diao)取TCGA數據庫(ku)中CPT1A mRNA水平及(ji)頭頸(jing)部鱗(lin)癌(ai)患者的總生存(cun)期與數據，進行分析(xi)(xi)統(tong)計。

實驗方(fang)法：查詢TCGA數(shu)據(ju)(ju)庫(ku)(ku)，數(shu)據(ju)(ju)庫(ku)(ku)包含(han)287例頭頸部鱗癌樣(yang)本，其中有預(yu)后信息的為283例。采用mantel-cox函數(shu)分(fen)(fen)析283例樣(yang)本中CPT1A mRNA水平與總生存(cun)期生存(cun)期數(shu)據(ju)(ju)，繪(hui)制Kaplan-Meier生存(cun)期曲線，并進行統計學分(fen)(fen)析。

實驗結(jie)果(guo)：如(ru)圖(tu)2A所(suo)示，CPT1A高表達(da)降低頭(tou)頸部(bu)鱗癌患者(zhe)的總生(sheng)存期，風險值(zhi)為1.63(95％CI＝1.091-2.383)，結(jie)果(guo)具有統(tong)計學差(cha)異(P＝0.0165)。

B在48例鼻咽(yan)癌(ai)組(zu)織樣本中(zhong)，用免疫組(zu)化方法檢(jian)測CPT1A的(de)表(biao)達情況，用存活曲線表(biao)示CPT1A表(biao)達量(liang)與鼻咽(yan)癌(ai)患者預(yu)后的(de)相關性。48例鼻咽(yan)癌(ai)病例均(jun)經過Co60放(fang)射治療，病理分(fen)型均(jun)為(wei)未分(fen)化磷狀(zhuang)上皮癌(ai)。

實驗方法如下：將組織芯片在60℃恒溫箱中烘烤30分鐘，然后置于二甲苯中浸泡5分鐘，更換新鮮二甲苯后浸泡5分鐘，再依次放入無水乙醇、95％乙醇、80％乙醇、70％乙醇中各浸泡5分鐘，蒸餾水洗滌3分鐘。然后將芯片置于0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH6.0)中，放入微波爐內高火加熱置沸騰5min，然后改用中高火繼續加熱15分鐘。PBS洗5分鐘×2次，在3％H₂O₂中(zhong)室溫(wen)靜置10分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)鐘(zhong)(zhong)(zhong)，PBS洗(xi)5分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)鐘(zhong)(zhong)(zhong)×2次。5％驢血(xue)清封(feng)閉(bi)30分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)鐘(zhong)(zhong)(zhong)后(hou)(hou)，滴加一抗，稀釋(shi)比例為1:500，4℃濕盒過夜。37℃復溫(wen)45分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)鐘(zhong)(zhong)(zhong)，PBS洗(xi)5分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)鐘(zhong)(zhong)(zhong)×3次，滴加二抗40～50μL，室溫(wen)靜置1小時(shi)，PBS洗(xi)5分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)鐘(zhong)(zhong)(zhong)×3次，將DAB原(yuan)液按1:200稀釋(shi)，顯(xian)色20-40秒(在顯(xian)微鏡下掌(zhang)握(wo)染(ran)色程度)，自來水沖(chong)洗(xi)10分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)鐘(zhong)(zhong)(zhong)，蘇木(mu)素復染(ran)10～20分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)鐘(zhong)(zhong)(zhong)(在顯(xian)微鏡下掌(zhang)握(wo)染(ran)色程度)，自來水沖(chong)洗(xi)10～15分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)鐘(zhong)(zhong)(zhong)，干燥(zao)，中(zhong)性樹(shu)脂(zhi)封(feng)片后(hou)(hou)閱片。免疫組化評分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)參(can)考許(xu)良中(zhong)的判(pan)斷(duan)標(biao)準(zhun):根據著色的強弱(ruo)程度評分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen):無著色0分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen),淡黃(huang)色1分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen),棕(zong)(zong)黃(huang)色2分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen),棕(zong)(zong)褐色3分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)；同時(shi)按陽性細(xi)胞所占的百(bai)分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)比計(ji)分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen):陽性細(xi)胞率≤10％為1分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen),陽性細(xi)胞率>10％且(qie)≤50％為2分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen),陽性細(xi)胞率>50％且(qie)≤75％為3分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen),陽性細(xi)胞率>75％為4分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)。利(li)用(yong)(yong)SPSS 16.0軟件分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)析(xi)(xi)免疫組織化學結果，相關性分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)析(xi)(xi)采用(yong)(yong)Spearman法，用(yong)(yong)Log-rank計(ji)算p值得出統計(ji)學差異。采用(yong)(yong)mantel-cox函數(shu)分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)析(xi)(xi)樣本(ben)中(zhong)CPT1A蛋白水平(ping)與總生存期(qi)生存期(qi)數(shu)據，繪制Kaplan-Meier生存期(qi)曲線，并進行統計(ji)學分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)析(xi)(xi)。

實驗結果(guo)：如圖2B所示，取48例鼻(bi)咽(yan)癌(ai)腫(zhong)瘤組(zu)織CPT1A表(biao)達量的中位數，將樣本分為CPT1A低表(biao)達和高表(biao)達兩組(zu)。CPT1A高表(biao)達降低鼻(bi)咽(yan)癌(ai)患者(zhe)的總生(sheng)存期，風險值為0.396(95％CI＝0.157-0.996)，結果(guo)具有統計學差異(P＝0.019)。

實施例3.放療抵抗細胞系(xi)脂肪酸β氧化(hua)能力(li)增強

A由于CPT1A的(de)代(dai)謝底物為棕櫚酸(suan)，細胞(bao)氧化棕櫚酸(suan)需要消耗氧氣(qi)。采用(yong)seahorse代(dai)謝分(fen)析儀，在向(xiang)細胞(bao)內添(tian)加棕櫚酸(suan)后，檢測CNE2和CNE2-IR細胞(bao)的(de)耗氧率(lv)，即可反應細胞(bao)的(de)脂肪酸(suan)β氧化效(xiao)率(lv)。

實驗方法：將細胞接種于seahorse儀器專用24孔培養板，37℃培養，保證第二天單層鋪滿。同時將電極板浸沒于水化液，置于37℃無二氧化碳培養箱內孵育過夜。第二天，將細胞培養基換成饑餓培養基(DMEM，0.5mM葡萄糖，1.0mM谷氨酰胺，0.5mM肉堿，1％FBS)，培養4小時后，將培養基換成上機液(111mM NaCl，4.7mM KCl，2.0mM MgSO₄，1.2mM Na₂HPO₄，2.5mM葡萄糖、0.5mM肉堿(jian)、5mM HEPES)，繼(ji)續培養45分鐘。上機前(qian)20分鐘將(jiang)電極水化板放入儀器(qi)校準。上機前(qian)，向每種細胞(bao)中分別加入BSA或BSA-棕櫚酸(suan)后，將(jiang)培養板放入儀器(qi)。選擇脂肪酸(suan)β氧化程序檢測氧消耗率。將(jiang)所得(de)數值用對應細胞(bao)的蛋白濃(nong)度進行(xing)歸一得(de)到最終(zhong)結果。

實(shi)驗結(jie)(jie)果(guo)：如圖3A所(suo)示，以BSA為對照(zhao)組，比較(jiao)加(jia)入棕(zong)櫚(lv)酸(suan)的(de)BSA-棕(zong)櫚(lv)酸(suan)組的(de)氧(yang)(yang)耗率(lv)是否增加(jia)。結(jie)(jie)果(guo)發現CNE2-IR細(xi)(xi)胞在加(jia)入棕(zong)櫚(lv)酸(suan)的(de)條件下氧(yang)(yang)耗率(lv)增加(jia)，而CNE2無明顯變化，提(ti)示CNE2-IR細(xi)(xi)胞的(de)脂肪酸(suan)β氧(yang)(yang)化效率(lv)高于CNE2細(xi)(xi)胞。

B脂(zhi)肪酸(suan)β氧(yang)化終產(chan)物乙酰輔酶A進入三羧酸(suan)循環，并偶聯線粒(li)體氧(yang)化磷酸(suan)化生成ATP。因此細(xi)胞內ATP水平是評價脂(zhi)肪酸(suan)β氧(yang)化活性的間接指(zhi)標。用etomoxir單(dan)獨或(huo)聯合4Gy放療處理細(xi)胞，研究etomoxir對鼻(bi)咽(yan)癌放療抵抗(kang)細(xi)胞ATP含量的影響。

實驗方法：提前一天將細胞種于96孔板中，細胞數不少于8×10³個/孔。實驗分(fen)組為：未處理(li)組(vehicle)、4Gy放(fang)(fang)療(liao)單獨(du)處理(li)組、ETO單獨(du)處理(li)組和ETO與(yu)4Gy放(fang)(fang)療(liao)聯用組。第二天加etomoxir(40μM)2h后(hou)，給(gei)予4Gy放(fang)(fang)療(liao)。24小(xiao)時(shi)后(hou)，檢(jian)測前將(jiang)試劑盒(Perkin Elmer,6016947)溫育(yu)至37℃。棄培養基(ji)，向細胞中(zhong)加入100μl新(xin)鮮培養基(ji)，再加入50μl裂解液(ye)，放(fang)(fang)在(zai)震蕩(dang)器上700rpm裂解5分(fen)鐘。然后(hou)每孔加入50μl反應(ying)(ying)底物，700rpm震蕩(dang)裂解5分(fen)鐘。最后(hou)將(jiang)孔板(ban)避光(guang)(guang)放(fang)(fang)置10分(fen)鐘，將(jiang)96孔板(ban)中(zhong)的(de)(de)反應(ying)(ying)體系加底部透(tou)光(guang)(guang)的(de)(de)白板(ban)中(zhong)，在(zai)酶標儀上選擇化學發光(guang)(guang)法(fa)程(cheng)序進行檢(jian)測。所得熒光(guang)(guang)值用對應(ying)(ying)孔的(de)(de)蛋(dan)白濃度進行歸一(yi)，得到最終(zhong)結果(guo)。

實驗(yan)結果：如圖(tu)3B所示，ETO單獨或聯合(he)4Gy放療(liao)處理均能降低(di)CNE2-IR、HK1-IR細(xi)胞(bao)的(de)ATP含(han)量，但ETO對CNE2、HK1細(xi)胞(bao)的(de)ATP水平無(wu)明顯(xian)影響。

C脂肪(fang)酸(suan)(suan)β氧(yang)化(hua)終產物乙酰輔酶A進(jin)入三羧酸(suan)(suan)循環后，經異(yi)檸(ning)檬酸(suan)(suan)脫氫酶或(huo)蘋果酸(suan)(suan)脫氫酶代謝生成NADPH。細胞(bao)內NADPH含量是評價脂肪(fang)酸(suan)(suan)β氧(yang)化(hua)活(huo)性的(de)間接指標。用(yong)etomoxir單獨或(huo)聯合4Gy放(fang)療處理細胞(bao)，研究etomoxir對鼻咽癌放(fang)療抵(di)抗細胞(bao)NADPH含量的(de)影響。

實驗方法：提前一天將細胞種于12孔板中，細胞數不少于1.5×10⁴個/孔(kong)。實驗分(fen)組(zu)為：未處理組(zu)(vehicle)、4Gy放療(liao)單獨(du)處理組(zu)、ETO單獨(du)處理組(zu)和(he)ETO與4Gy放療(liao)聯用(yong)(yong)(yong)組(zu)。第二天(tian)加etomoxir(40μM)2h后(hou)，給(gei)予(yu)4Gy放療(liao)。24小時后(hou)，用(yong)(yong)(yong)NADPH定量檢(jian)測試劑盒檢(jian)測(Biovision,#K37-100)。胰酶(mei)消化細胞(bao)，收集(ji)細胞(bao)沉淀(dian)，加入(ru)50μl蛋白裂解液，冰上(shang)放置10分(fen)鐘(zhong)，10000g離心10分(fen)鐘(zhong)。取(qu)上(shang)清，60℃孵育(yu)30分(fen)鐘(zhong)。然(ran)后(hou)向每(mei)孔(kong)中加入(ru)98μl反(fan)應緩沖液和(he)2μl反(fan)應酶(mei)。室溫孵育(yu)5分(fen)鐘(zhong)后(hou)，加入(ru)5μl顯色劑，繼(ji)續室溫孵育(yu)20分(fen)鐘(zhong)。在酶(mei)標儀(yi)上(shang)用(yong)(yong)(yong)450nm波長檢(jian)測吸光度值(zhi)(zhi)。所得(de)(de)熒光值(zhi)(zhi)用(yong)(yong)(yong)對(dui)應孔(kong)的蛋白濃(nong)度進行(xing)歸一，得(de)(de)到最終結果。

實(shi)驗結果：如圖3C所示(shi)，ETO單獨或聯合4Gy放療處理均能降(jiang)低CNE2-IR、HK1-IR細(xi)胞的(de)NADPH含量，但ETO對(dui)CNE2、HK1細(xi)胞的(de)NADPH水平無明顯影響(xiang)。

實施例4.Etomoxir降低(di)鼻咽癌放療抵抗細胞的線粒體膜電位，增(zeng)加放療抵抗細胞的凋亡(wang)水(shui)平

A線(xian)粒體(ti)(ti)膜通透性的改(gai)變是凋(diao)亡的重要早期事件，表現為線(xian)粒體(ti)(ti)跨膜電(dian)位降低。JC-1熒光染料在正常(chang)細胞(bao)(bao)中(zhong)以多聚(ju)體(ti)(ti)形(xing)式聚(ju)集于線(xian)粒體(ti)(ti)并顯(xian)紅色(se)熒光。在凋(diao)亡細胞(bao)(bao)中(zhong)，由于線(xian)粒體(ti)(ti)膜電(dian)位降低，JC-1染料在線(xian)粒體(ti)(ti)的聚(ju)集減少，以單(dan)體(ti)(ti)形(xing)式存在于細胞(bao)(bao)漿并顯(xian)綠(lv)色(se)熒光。因此，JC-1染料紅色(se)熒光與綠(lv)色(se)熒光強(qiang)度的比值反映線(xian)粒體(ti)(ti)膜電(dian)位高(gao)低。

實驗方法：提前一天將細胞種于12孔板中，細胞數不少于1.5×10⁴個/孔。實(shi)驗(yan)分組(zu)(zu)為：未處理組(zu)(zu)(vehicle)、4Gy放療單(dan)(dan)獨處理組(zu)(zu)、ETO單(dan)(dan)獨處理組(zu)(zu)和ETO與4Gy放療聯用組(zu)(zu)。第二天加(jia)etomoxir(40μM)2h后(hou)，給予4Gy放療。24小時后(hou)，胰酶(mei)消化(hua)細(xi)胞(bao)，收集細(xi)胞(bao)沉淀(dian)。向細(xi)胞(bao)中加(jia)入用1XPBS配置的JC-1染料，終(zhong)濃度為1-5μM。37℃避光孵育30分鐘后(hou)，用流式細(xi)胞(bao)儀檢測熒光強(qiang)度。

實(shi)驗結果(guo)：如圖4A所示(shi)，ETO單獨或聯(lian)合4Gy放療處理均(jun)能降低CNE2-IR、HK1-IR細(xi)胞(bao)的線粒(li)體膜電位，但ETO對CNE2、HK1細(xi)胞(bao)的線粒(li)體膜電位無明顯(xian)影響。

B細(xi)胞(bao)凋(diao)亡的標志性改變是(shi)(shi)磷(lin)酯(zhi)酰絲氨酸從細(xi)胞(bao)膜內轉移到細(xi)胞(bao)膜外(wai)。Annexin V是(shi)(shi)一種(zhong)磷(lin)脂(zhi)結合蛋白，與磷(lin)酯(zhi)酰絲氨酸高度親和，與暴露(lu)在細(xi)胞(bao)膜外(wai)的磷(lin)酯(zhi)酰絲氨酸結合，指示(shi)凋(diao)亡的發生(sheng)。zVAD是(shi)(shi)泛caspase抑制劑，用于抑制凋(diao)亡。

實驗方法：提前一天將細胞種于12孔板中，細胞數不少于1.5×10⁴個/孔。實驗(yan)分組(zu)(zu)為：未處(chu)理(li)組(zu)(zu)(vehicle)、4Gy放(fang)(fang)療(liao)單獨處(chu)理(li)組(zu)(zu)、ETO單獨處(chu)理(li)組(zu)(zu)、ETO與(yu)4Gy放(fang)(fang)療(liao)聯用(yong)組(zu)(zu)、ETO與(yu)4Gy放(fang)(fang)療(liao)聯用(yong)組(zu)(zu)加(jia)(jia)zVAD組(zu)(zu)。第二(er)天加(jia)(jia)etomoxir(40μM)2h后，給予4Gy放(fang)(fang)療(liao)。24小時(shi)后，胰酶消化(hua)細(xi)(xi)胞(bao)，收(shou)集細(xi)(xi)胞(bao)沉(chen)淀。向細(xi)(xi)胞(bao)中加(jia)(jia)入(ru)用(yong)Annexin V-FITC染(ran)料(凱基生物，KGF001)，稀釋比例為1:100。室溫(wen)避(bi)光(guang)孵育20分鐘后，用(yong)流式細(xi)(xi)胞(bao)儀檢測綠色熒光(guang)強度。

實(shi)驗結果：如圖4B所示(shi)，ETO單獨或聯(lian)合4Gy放療處理均能(neng)增加CNE2-IR、HK1-IR細(xi)胞的凋亡(wang)水平，并能(neng)被凋亡(wang)抑(yi)制劑zVAD逆轉。ETO對CNE2、HK1細(xi)胞的凋亡(wang)無明顯影(ying)響。

實施例5.Etomoxir增加放療抵抗細胞對放療的敏(min)感性

平板集落形成(cheng)實驗是評價(jia)細胞(bao)放(fang)療抵(di)抗能力的金標(biao)準，其結(jie)果用(yong)存活分數或存活曲線表示。以(yi)臨床(chuang)上常用(yong)的與(yu)放(fang)療聯用(yong)的化療藥物順鉑(Cisplatin)為(wei)陽性對照，在4Gy放(fang)療條件下，評價(jia)etomoxir對鼻咽癌細胞(bao)放(fang)療抵(di)抗能力的影(ying)響。

實驗方法：將細(xi)胞(bao)種于6孔板，2000個/孔，細(xi)胞(bao)呈單(dan)克隆(long)分(fen)布。實驗分(fen)組(zu)為：未(wei)處理組(zu)(vehicle)、4Gy放(fang)療(liao)(liao)單(dan)獨(du)處理組(zu)、ETO單(dan)獨(du)處理組(zu)和(he)ETO與4Gy放(fang)療(liao)(liao)聯用(yong)(yong)組(zu)。第二天加etomoxir(80μM)2h后，給予4Gy放(fang)療(liao)(liao)。待單(dan)個細(xi)胞(bao)生長至細(xi)胞(bao)數(shu)(shu)大于等于50的集(ji)落，約(yue)10-14天，用(yong)(yong)1XPBS洗(xi)細(xi)胞(bao)兩(liang)遍，再用(yong)(yong)甲(jia)醇固定10分(fen)鐘(zhong)。然后，用(yong)(yong)結晶紫染色15分(fen)鐘(zhong)。流水沖洗(xi)，晾干(gan)后，掃描培養板，用(yong)(yong)Image J計(ji)數(shu)(shu)染色集(ji)落。根據以(yi)下公式，計(ji)算細(xi)胞(bao)存活(huo)分(fen)數(shu)(shu)：

克隆形(xing)成率＝克隆數(shu)/接種的細胞(bao)數(shu)

存(cun)活分數＝受照(zhao)射細(xi)胞的克(ke)隆形(xing)成率/對照(zhao)細(xi)胞的克(ke)隆形(xing)成率

實驗結果(guo)：如圖(tu)5所示，放療(liao)(liao)(liao)抵抗細(xi)胞(bao)(bao)(bao)在4Gy放療(liao)(liao)(liao)后存(cun)活分(fen)數明(ming)顯(xian)高于(yu)放療(liao)(liao)(liao)敏感(gan)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)，說(shuo)明(ming)CNE2-IR和(he)HK1-IR細(xi)胞(bao)(bao)(bao)具(ju)有放療(liao)(liao)(liao)抵抗能(neng)(neng)力(li)。順(shun)鉑(bo)能(neng)(neng)降(jiang)低(di)四種鼻咽癌(ai)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)的存(cun)活分(fen)數，但CNE2-IR和(he)HK1-IR細(xi)胞(bao)(bao)(bao)對順(shun)鉑(bo)的敏感(gan)程度(du)低(di)于(yu)CNE2和(he)HK1。而與(yu)順(shun)鉑(bo)相比(bi)，ETO能(neng)(neng)更明(ming)顯(xian)地降(jiang)低(di)CNE2-IR和(he)HK1-IR細(xi)胞(bao)(bao)(bao)的存(cun)活分(fen)數。以順(shun)鉑(bo)作為放療(liao)(liao)(liao)增敏的陽性(xing)對照藥物，以上(shang)結果(guo)說(shuo)明(ming)，ETO聯用(yong)放療(liao)(liao)(liao)比(bi)順(shun)鉑(bo)聯用(yong)放療(liao)(liao)(liao)能(neng)(neng)更有效地抑制放療(liao)(liao)(liao)抵抗細(xi)胞(bao)(bao)(bao)的存(cun)活。

實施例6.Etomoxir增加(jia)CNE2-IR細胞(bao)裸鼠(shu)移植瘤對放療的敏感性，表現為(wei)瘤體生長速率(lv)減(jian)慢和瘤體體積減(jian)小

本實驗用鼻咽癌放療(liao)抵抗(kang)細胞(bao)系CNE2-IR構建裸(luo)鼠移植瘤模型，用體內實驗驗證etomoxir的放療(liao)增敏作用。

實驗方法：4周齡免疫缺陷小鼠Bclb共16只購自中南大學動物學部，經本室飼養一周后，將5x10⁶個CNE2-IR細胞，以100μl生理鹽水懸浮后，接種于裸鼠右側背部。待裸鼠成瘤并且瘤體體積約為130mm³時，將裸鼠(shu)分成4組，每組4只，分別為(wei)對(dui)照組、放(fang)療組、etomoxir治療組和(he)放(fang)療與etomoxir聯用組。第(di)一(yi)次放(fang)療或(huo)給(gei)藥的時間記為(wei)第(di)一(yi)天。

對照組(zu)：從第一(yi)天(tian)開始，隔天(tian)腹腔注射(she)100μl生理鹽水，維持3周(zhou)；

放療組：從(cong)第一天開始，隔天腹腔注射100μl生(sheng)理鹽水，維(wei)持3周。并(bing)且在第1、3,、7、9天分(fen)別給予2Gy放療；

Etomoxir治(zhi)療組：從第一天開始，隔天腹(fu)腔注射(she)100μl etomoxir，按50mg/kg劑量給藥，維(wei)持3周；

放(fang)(fang)療與etomoxir聯用組：在(zai)同上(shang)etomoxir治(zhi)療組基礎上(shang)，在(zai)腹腔注射etomoxir后(hou)2h給予放(fang)(fang)療，放(fang)(fang)療方(fang)案同放(fang)(fang)療組。

從(cong)分組(zu)后第一天開始(shi)測量(liang)(liang)(liang)裸鼠體(ti)(ti)重(zhong)及(ji)瘤體(ti)(ti)體(ti)(ti)積，隔天測量(liang)(liang)(liang)一次(ci)，3周后二(er)氧(yang)化碳(tan)窒息處死小鼠，剝離瘤體(ti)(ti)，并稱量(liang)(liang)(liang)瘤體(ti)(ti)重(zhong)量(liang)(liang)(liang)。

實驗結果：

如(ru)圖6A所示(shi)，單獨(du)放(fang)療、Etomoxir治(zhi)療均能(neng)抑制裸鼠移植瘤生長。Etomoxir與放(fang)療聯(lian)用對裸鼠移植瘤的生長抑制作用最明顯。

如圖6B所示，單獨放療(liao)、Etomoxir治療(liao)均(jun)能減少裸(luo)鼠(shu)移(yi)植瘤的體積(ji)(ji)和重量(liang)(liang)。Etomoxir與放療(liao)聯用對裸(luo)鼠(shu)移(yi)植瘤的體積(ji)(ji)和重量(liang)(liang)的抑制作用最明顯；

以上結果說明(ming)etomoxir能(neng)增(zeng)加(jia)放(fang)(fang)療抵(di)抗的移植瘤模型對放(fang)(fang)射治療的敏感性。