本發明屬(shu)于(yu)醫(yi)藥(yao)技術領域，涉及(ji)到一(yi)種(zhong)具有抗(kang)丙型肝炎(yan)病(bing)毒(du)作用(yong)的新型藥(yao)物組合物；具體(ti)來說(shuo)，該藥(yao)物組合物包(bao)含(han)丙型肝炎(yan)病(bing)毒(du)NS5B聚合酶抑制劑以及(ji)一(yi)種(zhong)NS3/4A絲氨酸蛋白酶抑制劑和(he)/或一(yi)種(zhong)NS5A抑制劑。
背景技術：
丙型肝(gan)(gan)(gan)炎是(shi)由丙型肝(gan)(gan)(gan)炎病(bing)毒(du)(HCV)引起(qi)的慢(man)性(xing)肝(gan)(gan)(gan)病(bing)。HCV在侵染肝(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)胞后，逃避(bi)宿主免疫監視并(bing)利用(yong)脂質代謝過(guo)程維持自身復制，引發慢(man)性(xing)感(gan)(gan)(gan)染；同時導致肝(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)胞物質能量代謝紊亂(luan)，最終進(jin)展(zhan)為脂肪肝(gan)(gan)(gan)、肝(gan)(gan)(gan)硬化甚至原發性(xing)肝(gan)(gan)(gan)癌。慢(man)性(xing)丙肝(gan)(gan)(gan)發病(bing)率高(gao)(gao)，慢(man)性(xing)化程度高(gao)(gao)，危害(hai)性(xing)高(gao)(gao)，已成為全球性(xing)的公共衛生問題(ti)；在中國，HCV感(gan)(gan)(gan)染者(zhe)高(gao)(gao)達2500萬例，針對這樣一種高(gao)(gao)危感(gan)(gan)(gan)染，卻仍存在認知率低(di)、就診率低(di)、治(zhi)療率低(di)的窘境。
值得注意的(de)是，丙肝(gan)患者(zhe)若能及時接(jie)受(shou)規范的(de)抗病毒(du)治(zhi)(zhi)(zhi)療(liao)(liao)，可(ke)以實現(xian)治(zhi)(zhi)(zhi)愈。對于(yu)少部(bu)分進(jin)行治(zhi)(zhi)(zhi)療(liao)(liao)的(de)感染者(zhe)來(lai)說，可(ke)選擇(ze)的(de)抗病毒(du)治(zhi)(zhi)(zhi)療(liao)(liao)方案(an)仍(reng)有(you)長效干擾素聯合使(shi)用(yong)(yong)利巴韋林，該療(liao)(liao)法(fa)給藥依(yi)從性(xing)差，產生局部(bu)、全(quan)身甚至(zhi)精神上的(de)副作用(yong)(yong)。此外，半數以上的(de)患者(zhe)在聯合治(zhi)(zhi)(zhi)療(liao)(liao)后并不能夠完全(quan)治(zhi)(zhi)(zhi)愈，且需要承擔高昂(ang)的(de)治(zhi)(zhi)(zhi)療(liao)(liao)費用(yong)(yong)。而與之對比的(de)是，自NS3/4A蛋(dan)白酶(mei)抑(yi)制(zhi)劑Telaprevir和(he)Boceprevir上市(shi)以來(lai)，抑(yi)制(zhi)HCV生命周(zhou)期中的(de)關(guan)鍵(jian)蛋(dan)白進(jin)行抗病毒(du)治(zhi)(zhi)(zhi)療(liao)(liao)的(de)研究成為領域內的(de)熱點(dian)。許多直(zhi)接(jie)作用(yong)(yong)于(yu)關(guan)鍵(jian)蛋(dan)白的(de)抗HCV藥物(wu)(DAAs)如(ru)NS3/4A絲氨(an)酸(suan)蛋(dan)白酶(mei)抑(yi)制(zhi)劑、NS5A抑(yi)制(zhi)劑、NS5B聚合酶(mei)抑(yi)制(zhi)劑均已成功上市(shi)，并實現(xian)無(wu)干擾素全(quan)口(kou)服(fu)治(zhi)(zhi)(zhi)愈HCV。然而，現(xian)有(you)的(de)藥物(wu)治(zhi)(zhi)(zhi)療(liao)(liao)手(shou)段仍(reng)存(cun)在治(zhi)(zhi)(zhi)療(liao)(liao)周(zhou)期長、藥物(wu)劑量大(da)的(de)缺(que)點(dian)，且藥物(wu)價(jia)格昂(ang)貴(gui)。因此，亟需開發新的(de)抗HCV藥物(wu)以滿(man)足臨床需求。
HCV具(ju)有(you)(you)(you)至(zhi)少六種基(ji)(ji)因亞型(xing)，每種亞型(xing)對(dui)藥(yao)物的(de)(de)敏(min)感(gan)程度(du)不同(tong)(tong)；HCV高度(du)變異，進(jin)一(yi)步導(dao)致相(xiang)同(tong)(tong)亞型(xing)在(zai)(zai)不同(tong)(tong)個體間仍(reng)存在(zai)(zai)治(zhi)療差異甚至(zhi)藥(yao)物抵抗，因此(ci)尋找對(dui)全基(ji)(ji)因型(xing)有(you)(you)(you)效(xiao)，且耐藥(yao)屏障高的(de)(de)HCV抑(yi)(yi)制劑意(yi)義重大(da)(da)。目前(qian)，應(ying)用(yong)(yong)于臨床(chuang)或處(chu)于臨床(chuang)試驗階段的(de)(de)NS3/4A絲氨酸蛋白酶(mei)抑(yi)(yi)制劑主要有(you)(you)(you)Telaprevir、Boceprevir、Danoprevir、Simeprevir、Asunaprevir、Paritaprevir以及(ji)(ji)Grazoprevir；NS5A抑(yi)(yi)制劑主要有(you)(you)(you)Daclatasvir、Ledipasvir、Ombitasvir以及(ji)(ji)Elbasvir；這兩類(lei)抑(yi)(yi)制劑在(zai)(zai)臨床(chuang)應(ying)用(yong)(yong)中(zhong)均極易誘(you)發耐藥(yao)HCV的(de)(de)出現(xian)(xian)，導(dao)致療效(xiao)大(da)(da)大(da)(da)降低(di)。在(zai)(zai)中(zhong)國專利(li)(li)申請(qing)201110174871.1“2′-脫氧-2′-氟-2′-甲基(ji)(ji)核(he)苷(gan)(gan)衍生(sheng)物及(ji)(ji)其制備方法與在(zai)(zai)制藥(yao)中(zhong)的(de)(de)用(yong)(yong)途”中(zhong)，公開(kai)了一(yi)系列具(ju)有(you)(you)(you)抗HCV作用(yong)(yong)的(de)(de)核(he)苷(gan)(gan)類(lei)NS5B聚(ju)合酶(mei)抑(yi)(yi)制劑。雖然(ran)該專利(li)(li)中(zhong)涉及(ji)(ji)的(de)(de)化(hua)合物與現(xian)(xian)有(you)(you)(you) 同(tong)(tong)類(lei)藥(yao)物Sofosbuvir相(xiang)比，能夠對(dui)耐藥(yao)HCV產生(sheng)較強的(de)(de)抑(yi)(yi)制活性，但單獨應(ying)用(yong)(yong)這類(lei)藥(yao)物仍(reng)存在(zai)(zai)抗病毒活性低(di)，潛(qian)在(zai)(zai)的(de)(de)病毒耐藥(yao)風險(xian)大(da)(da)等缺點，無(wu)法滿(man)足治(zhi)療需求。
解決以上問(wen)題最好的(de)(de)策略是(shi)針對不同作用(yong)(yong)靶(ba)點，進(jin)(jin)行抑(yi)(yi)制(zhi)(zhi)劑(ji)間的(de)(de)聯合(he)(he)給藥(yao)(yao)。而以藥(yao)(yao)物(wu)組(zu)合(he)(he)物(wu)的(de)(de)形式進(jin)(jin)行聯合(he)(he)用(yong)(yong)藥(yao)(yao)能(neng)夠在(zai)簡化給藥(yao)(yao)方(fang)式，提(ti)(ti)高給藥(yao)(yao)依從性(xing)的(de)(de)同時，克服(fu)各組(zu)分單獨用(yong)(yong)藥(yao)(yao)的(de)(de)不足并(bing)進(jin)(jin)一步提(ti)(ti)高藥(yao)(yao)效。目前，FDA已(yi)批準上市(shi)的(de)(de)藥(yao)(yao)物(wu)組(zu)合(he)(he)物(wu)僅(jin)有(you)(you)Gilead公(gong)司的(de)(de)Harvoni與AbbVie公(gong)司的(de)(de)Viekira Pak。其(qi)中(zhong)，Harvoni是(shi)核(he)苷類NS5B聚合(he)(he)酶(mei)抑(yi)(yi)制(zhi)(zhi)劑(ji)Sofosbuvir與NS5A抑(yi)(yi)制(zhi)(zhi)劑(ji)Ledipasvir的(de)(de)固(gu)(gu)定(ding)劑(ji)量組(zu)合(he)(he)物(wu)，而Viekira Pak是(shi)NS3/4A絲氨(an)酸(suan)蛋白(bai)(bai)酶(mei)抑(yi)(yi)制(zhi)(zhi)劑(ji)Paritaprevir與NS5A抑(yi)(yi)制(zhi)(zhi)劑(ji)Ombitasvir的(de)(de)固(gu)(gu)定(ding)劑(ji)量組(zu)合(he)(he)物(wu)，但(dan)同時需要加服(fu)非核(he)苷類NS5B聚合(he)(he)酶(mei)抑(yi)(yi)制(zhi)(zhi)劑(ji)Dasabuvir。而核(he)苷類NS5B聚合(he)(he)酶(mei)抑(yi)(yi)制(zhi)(zhi)劑(ji)和NS3/4A絲氨(an)酸(suan)蛋白(bai)(bai)酶(mei)抑(yi)(yi)制(zhi)(zhi)劑(ji)構成(cheng)的(de)(de)藥(yao)(yao)物(wu)組(zu)合(he)(he)物(wu)以及NS5B聚合(he)(he)酶(mei)抑(yi)(yi)制(zhi)(zhi)劑(ji)、NS3/4A絲氨(an)酸(suan)蛋白(bai)(bai)酶(mei)抑(yi)(yi)制(zhi)(zhi)劑(ji)和NS5A抑(yi)(yi)制(zhi)(zhi)劑(ji)構成(cheng)的(de)(de)藥(yao)(yao)物(wu)組(zu)合(he)(he)物(wu)，目前均未(wei)有(you)(you)成(cheng)功上市(shi)的(de)(de)案例。
技術實現要素：
為(wei)了克服現有(you)(you)藥(yao)(yao)物(wu)的不足，本發明提(ti)出一種新的藥(yao)(yao)物(wu)組合物(wu)，能有(you)(you)效地起到抗HCV作用，減(jian)少現有(you)(you)藥(yao)(yao)物(wu)的給藥(yao)(yao)劑量，縮短治療周期，降低(di)病毒耐藥(yao)(yao)風險，以獲(huo)得(de)更好的臨床(chuang)療效。
為實(shi)現(xian)發(fa)明(ming)目(mu)的(de)(de)，本發(fa)明(ming)提供了一種(zhong)更為安全有效的(de)(de)治療慢(man)性丙型(xing)肝炎(yan)的(de)(de)新型(xing)給藥(yao)方案。該技(ji)術方案涉及(ji)一種(zhong)藥(yao)物組合物，其中包含核苷(gan)類NS5B聚合酶(mei)抑(yi)制(zhi)劑以(yi)及(ji)一種(zhong)NS3/4A絲氨(an)酸(suan)蛋白酶(mei)抑(yi)制(zhi)劑和(he)/或一種(zhong)NS5A抑(yi)制(zhi)劑以(yi)及(ji)藥(yao)學上可接(jie)受的(de)(de)載體(ti)。
上述藥物組合物中，所述的(de)核苷類(lei)NS5B聚合酶抑制劑為(S)-2-(((S)-(((2R，3R，4R，5R)-5-(4-正(zheng)丁酰(xian)(xian)(xian)氨(an)(an)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)-2-氧代(dai)嘧(mi)啶(ding)-1(2H)-基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji))-4-氟(fu)(fu)-3-羥(qian)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)-4-甲(jia)(jia)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)-四(si)氫呋(fu)喃-2-基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji))甲(jia)(jia)氧基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji))(苯(ben)氧基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji))磷(lin)(lin)酰(xian)(xian)(xian)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji))氨(an)(an)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji))丙(bing)(bing)(bing)酸異丙(bing)(bing)(bing)酯(zhi)I-1、(S)-2-(((S)-(((2R，3R，4R，5R)-5-(4-正(zheng)戊酰(xian)(xian)(xian)氨(an)(an)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)-2-氧代(dai)嘧(mi)啶(ding)-1(2H)-基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji))-4-氟(fu)(fu)-3-羥(qian)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)-4-甲(jia)(jia)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)-四(si)氫呋(fu)喃-2-基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji))甲(jia)(jia)氧基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji))(苯(ben)氧基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji))磷(lin)(lin)酰(xian)(xian)(xian)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji))氨(an)(an)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji))丙(bing)(bing)(bing)酸異丙(bing)(bing)(bing)酯(zhi)I-2、(S)-2-(((S)-(((2R，3R，4R，5R)-5-(4-正(zheng)己(ji)酰(xian)(xian)(xian)氨(an)(an)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)-2-氧代(dai)嘧(mi)啶(ding)-1(2H)-基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji))-4-氟(fu)(fu)-3-羥(qian)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)-4-甲(jia)(jia)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)-四(si)氫呋(fu)喃-2-基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji))甲(jia)(jia)氧基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji))(苯(ben)氧基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji))磷(lin)(lin)酰(xian)(xian)(xian)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji))氨(an)(an)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji))丙(bing)(bing)(bing)酸異丙(bing)(bing)(bing)酯(zhi)I-3或(S)-2-(((S)-(((2R，3R，4R，5R)-5-(4-正(zheng)己(ji)酰(xian)(xian)(xian)氨(an)(an)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)-2-氧代(dai)嘧(mi)啶(ding)-1(2H)-基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji))-4-氟(fu)(fu)-3-羥(qian)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)-4-甲(jia)(jia)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji)-四(si)氫呋(fu)喃-2-基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji))甲(jia)(jia)氧基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji))(苯(ben)氧基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji))磷(lin)(lin)酰(xian)(xian)(xian)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji))氨(an)(an)基(ji)(ji)(ji)(ji)(ji))丙(bing)(bing)(bing)酸異丙(bing)(bing)(bing)酯(zhi)I-4，其(qi)結構如下所示(shi)；
其(qi)中優(you)選(xuan)NS5B聚合酶(mei)抑制劑(ji)為(wei)I-1。
上述藥物組合物中，所述的NS3/4A絲氨酸蛋白酶(mei)抑制劑為Telaprevir、Boceprevir、Danoprevir、Simeprevir、Asunaprevir、Paritaprevir或Grazoprevir，其結(jie)構(gou)如下(xia)所示：
其中(zhong)，優選NS3/4A絲(si)氨酸蛋白酶(mei)抑制劑為(wei)Simeprevir。
上述的藥物組合物中，所(suo)述的NS5A抑制(zhi)劑為(wei)Daclatasvir、Ledipasvir、Ombitasvir或(huo)Elbasvir，其(qi)結構(gou)如下(xia)所(suo)示：
其中，優選NS5A抑(yi)制(zhi)劑為(wei)Daclatasvir。
上(shang)述(shu)藥物組合(he)物中，NS5B抑制(zhi)劑I與NS3/4A抑制(zhi)劑的濃(nong)度配比為(wei)1∶(1/5000～100)；優選為(wei)1∶(1/2000～10)；更(geng)優選為(wei)1∶(1/600～1)。
上(shang)述(shu)藥(yao)物組合物中，NS5B抑(yi)制劑I與NS5A抑(yi)制劑的濃度配比(bi)為1∶(1/50000～10)；優選為1∶(1/20000～1)；更優選為1∶(1/6000～0.1)。
上述藥物組合物中，NS5B抑(yi)制(zhi)劑I與(yu)NS3/4A抑(yi)制(zhi)劑及NS5A抑(yi)制(zhi)劑的濃度配(pei)比為(wei)1∶(1/5000～100)∶(1/50000～10)；優(you)選為(wei)1∶(1/2000～10)∶(1/20000～1)；更(geng)優(you)選為(wei)1∶(1/600～1)∶(1/6000～0.1)。
上(shang)述藥(yao)物組(zu)合(he)物中，優選NS5B抑制劑I-1與Simeprevir的濃度配比為(wei)(wei)(wei)1∶(1/5000～100)；優選為(wei)(wei)(wei)1∶(1/2000～10)；更(geng)優選為(wei)(wei)(wei)1∶(1/600～1)。
上(shang)述(shu)藥物(wu)組合物(wu)中，優選(xuan)NS5B抑制(zhi)劑I-1與Daclatasvir的濃度(du)配比為(wei)(wei)1∶(1/50000～10)；優選(xuan)為(wei)(wei)1∶(1/20000～1)；更優選(xuan)為(wei)(wei)1∶(1/6000～0.1)。
上述藥物組合物中(zhong)，優選(xuan)NS5B抑制劑I-1與Simeprevir及Daclatasvir的濃度配比為1∶(1/5000～100)∶(1/50000～10)；優選(xuan)為1∶(1/2000～10)∶(1/20000～1)；更(geng)優選(xuan)為1∶(1/600～1)∶(1/6000～0.1)。
本發明還(huan)提供上述藥物(wu)組(zu)合物(wu)在制備抗丙型(xing)肝炎(yan)藥物(wu)中的(de)(de)用途。將上述濃度(du)配比換算為質量配比后，混勻各組(zu)分藥物(wu)并直(zhi)接(jie)(jie)或(huo)間接(jie)(jie)加入藥學上可接(jie)(jie)受的(de)(de)載體，通過(guo)本領域技術人員熟知的(de)(de)操作(zuo)手段制成片劑、膠囊、顆粒(li)劑、散(san)劑、糖(tang)漿劑、口服液或(huo)注射(she)劑。
令人(ren)驚(jing)奇(qi)的是，本發明所涉及(ji)的藥物(wu)組合物(wu)具(ju)有明顯優勢，主(zhu)要體現在以下幾個方面：
本發(fa)明首次提供了含有核(he)苷類NS5B抑制劑I的新型藥物組合物給(gei)藥方(fang)案。
本(ben)發(fa)明的技術方案實現(xian)了不可(ke)預見的抗(kang)病毒(du)效果：HCV復(fu)制子(zi)細胞水(shui)平(ping)顯示，核(he)苷類(lei)NS5B抑制劑I與NS3/4A抑制劑或NS5A抑制劑組合后(hou)，均表現(xian)出(chu)意想(xiang)不到的協同(tong)作用；而在現(xian)有藥物(wu)組合物(wu)中，并(bing)不存在明顯的協同(tong)作用。
NS5B抑(yi)制(zhi)劑(ji)I與NS3/4A抑(yi)制(zhi)劑(ji)及NS5A抑(yi)制(zhi)劑(ji)聯合用(yong)藥，與各組分(fen)(fen)中任(ren)一組分(fen)(fen)單(dan)獨給藥或任(ren)兩組分(fen)(fen)聯合給藥相比，能夠顯著提(ti)高抗病毒效果，且大大降(jiang)低用(yong)藥劑(ji)量。
變異(yi)型HCV復制(zhi)(zhi)子(zi)細胞活(huo)性顯示(shi)，本發(fa)明(ming)提供(gong)的(de)藥物組合(he)物對變異(yi)型HCV能夠產生有效的(de)抑制(zhi)(zhi)作(zuo)用，保持(chi)較高的(de)抗病(bing)毒水平。這提示(shi)本發(fa)明(ming)能夠有效防(fang)止(zhi)臨(lin)床應(ying)用中多(duo)種耐藥變異(yi)型HCV的(de)出現(xian)。
附圖說明
圖1藥物組合物耐藥性(xing)質的測(ce)試
具體實施方式
為了更(geng)好的理解(jie)并驗證本(ben)發明(ming)的可靠(kao)性，下面(mian)通(tong)過具體實施例(li)進行詳細(xi)解(jie)釋(shi)，但不以任何(he)形(xing)式限(xian)制本(ben)發明(ming)。
實施例1 NS5B抑制(zhi)劑I與NS3/4A抑制(zhi)劑或NS5A抑制(zhi)劑的聯合用(yong)藥
藥品：NS5B抑制劑I-1、Simeprevir、Daclatasvir。
細胞模型：1b基(ji)因型HCV亞基(ji)因組復(fu)制子(zi)細胞系統(Conl cells)。
實驗步驟：
1.共孵育：將(jiang)復制子細胞(bao)接種到96孔(kong)板中(zhong)，每孔(kong)8000個細胞(bao)；在(zai)不同濃(nong)度(du)(du)的化合(he)物I-1中(zhong)(0、25、50、100、200、400、800、1600nM)，加(jia)入不同濃(nong)度(du)(du)的Simeprevir(0、3、6、12、24nM)或Daclatasvir(0、0.02、0.04、0.08、0.16nM)，每組化合(he)物雙復孔(kong)檢測，DMSO終(zhong)濃(nong)度(du)(du)為0.5％；二氧化碳培養(yang)箱培養(yang)72小時(藥物組合(he)物中(zhong)各(ge)組分濃(nong)度(du)(du)見(jian)表1)。
2.向(xiang)每孔細(xi)胞中加入細(xi)胞活力檢(jian)測試劑，檢(jian)測細(xi)胞活力。隨后向(xiang)細(xi)胞中加入熒光(guang)素酶底物Bright-Glo，5分鐘后用化學發(fa)光(guang)檢(jian)測系統檢(jian)測熒光(guang)素酶表達(da)水平，進(jin)而得到復制子抑制活性百分比。
3.利用(yong)Compusyn軟(ruan)件，計算聯用(yong)指數(Combination Index，CI)，并通(tong)過CI值評價藥物組(zu)合物的聯用(yong)效果。
實驗結果
1.各組化合物均未表(biao)現(xian)出(chu)細胞毒性。
2-抗病毒活性及協同作用評價如(ru)表1-4所示：
表1 不同濃(nong)度的I-1及(ji)Simeprevir聯(lian)合用藥對HCV的抑(yi)制活(huo)性化合物I-1(nM)
表2 I-1與Simeprevir聯合用藥中(zhong)，不(bu)同濃度配比的CI值
表3 不同(tong)濃(nong)度的I-1及Daclatasvir聯合用(yong)藥(yao)對HCV的抑制(zhi)活性化合物I-1(nM)
表4 I-1與Daclatasvir聯合用(yong)藥(yao)中，不同濃度(du)配比的CI值
表(biao)格內記載的(de)數(shu)據為藥(yao)物組(zu)(zu)合物在(zai)不同濃度下(xia)對HCV亞基因組(zu)(zu)復制(zhi)子(zi)的(de)抑制(zhi)率。利用(yong)Compusyn軟件(jian)對實驗數(shu)據進行處理，得到不同濃度配(pei)比下(xia)，I-1與(yu)Simeprevir或Daclatasvir的(de)聯用(yong)指數(shu)(CI)。當(dang)CI＞1時，藥(yao)物組(zu)(zu)分存(cun)(cun)在(zai)拮抗作(zuo)用(yong)；當(dang)CI＝1時，兩種(zhong)藥(yao)物組(zu)(zu)分呈(cheng)現加和作(zuo)用(yong)；而當(dang)CI＜1時，藥(yao)物組(zu)(zu)分存(cun)(cun)在(zai)協同作(zuo)用(yong)。通過(guo)表(biao)2和表(biao)4可以(yi)明(ming)顯看(kan)出，在(zai)不同濃度配(pei)比下(xia)，I-1與(yu)Simeprevir呈(cheng)現出不同程度的(de)協同作(zuo)用(yong)；而與(yu)Daclatasvir呈(cheng)現較(jiao)強的(de)協同作(zuo)用(yong)。
實(shi)驗結(jie)果(guo)(guo)充分說明(ming)，本(ben)發(fa)(fa)明(ming)提供的(de)新型藥物(wu)組合物(wu)中，NS5B聚合酶抑制劑(ji)(ji)(ji)與NS3/4A絲氨酸蛋(dan)白酶抑制劑(ji)(ji)(ji)或NS5A抑制劑(ji)(ji)(ji)均能夠(gou)起(qi)到(dao)協同作用(yong)；組合物(wu)聯合用(yong)藥，均表現出很強的(de)抗病毒效(xiao)果(guo)(guo)；這一實(shi)驗確證了本(ben)發(fa)(fa)明(ming)技術方案的(de)合理(li)性，并有希望在臨床應用(yong)中減少現有藥物(wu)的(de)給藥劑(ji)(ji)(ji)量，增強抗HCV活性，以(yi)獲得(de)更(geng)好的(de)療效(xiao)。
實施例2 NS5B抑制(zhi)(zhi)(zhi)劑(ji)I與NS3/4A抑制(zhi)(zhi)(zhi)劑(ji)及NS5A抑制(zhi)(zhi)(zhi)劑(ji)的(de)聯合用藥
藥品：NS5B抑制(zhi)劑I-1、Simeprevir、Daclatasvir。
細胞模(mo)型(xing)：1b基(ji)因型(xing)HCV亞基(ji)因組復制(zhi)子細胞系統(Conl cells)。
實驗步驟：
1.藥(yao)(yao)物(wu)(wu)(wu)組合(he)(he)物(wu)(wu)(wu)溶(rong)(rong)(rong)液(ye)的(de)(de)配(pei)(pei)(pei)制：NS5B抑(yi)制劑(ji)I-1、Simeprevir及(ji)Daclatasvir的(de)(de)濃度配(pei)(pei)(pei)比(bi)為(wei)1∶0.015∶0.000075，配(pei)(pei)(pei)制藥(yao)(yao)物(wu)(wu)(wu)組合(he)(he)物(wu)(wu)(wu)溶(rong)(rong)(rong)液(ye)S1；NS5B抑(yi)制劑(ji)I-1、Simeprevir及(ji)Daclatasvir的(de)(de)濃度配(pei)(pei)(pei)比(bi)為(wei)1∶0.015∶0.00015，配(pei)(pei)(pei)制藥(yao)(yao)物(wu)(wu)(wu)組合(he)(he)物(wu)(wu)(wu)溶(rong)(rong)(rong)液(ye)S2；NS5B抑(yi)制劑(ji)I-1、Simeprevir及(ji) Daclatasvir的(de)(de)濃度配(pei)(pei)(pei)比(bi)為(wei)1∶0.0075∶0.000075，配(pei)(pei)(pei)制藥(yao)(yao)物(wu)(wu)(wu)組合(he)(he)物(wu)(wu)(wu)溶(rong)(rong)(rong)液(ye)S3；Simeprevir及(ji)Daclatasvir的(de)(de)濃度配(pei)(pei)(pei)比(bi)為(wei)200∶1，配(pei)(pei)(pei)制藥(yao)(yao)物(wu)(wu)(wu)組合(he)(he)物(wu)(wu)(wu)溶(rong)(rong)(rong)液(ye)S4；其(qi)中(zhong)(zhong)，S1-3中(zhong)(zhong)NS5B抑(yi)制劑(ji)I-1的(de)(de)起始濃度為(wei)10μM，S4中(zhong)(zhong)Simeprevir的(de)(de)起始濃度為(wei)10μM。
2.共(gong)孵(fu)育：將復制子細(xi)胞(bao)接種(zhong)到96孔板中，每孔8000個細(xi)胞(bao)；將不同(tong)濃(nong)度(du)配比的藥物(wu)(wu)組合(he)物(wu)(wu)S1-4按(an)3倍(bei)濃(nong)度(du)梯度(du)稀釋后，與細(xi)胞(bao)共(gong)孵(fu)育，雙復孔檢測，DMSO終(zhong)濃(nong)度(du)為(wei)0.5％；二氧化碳(tan)培養(yang)箱培養(yang)72小(xiao)時。
3.向(xiang)每孔細胞中(zhong)加入(ru)細胞活力(li)檢(jian)(jian)測(ce)試劑，檢(jian)(jian)測(ce)細胞活力(li)。隨(sui)后(hou)向(xiang)細胞中(zhong)加入(ru)熒光素酶底(di)物Bright-Glo，5分鐘后(hou)用化(hua)學(xue)發光檢(jian)(jian)測(ce)系統檢(jian)(jian)測(ce)熒光素酶的表達水平，進而(er)得(de)到(dao)藥物組合物S1-4對HCV復制子的抑制曲(qu)線。
實驗結果
1.各組(zu)化合物(wu)均未表現出細胞毒性。
2.抗病毒活性如表5所示：I-1、Simeprevir、Daclatasvir各自的EC50、EC90、EC95、EC99如表6所示。
表5 I-1與Simeprevir及Daclatasvir的聯合用(yong)藥
表6 I-1、Simeprevir及Daclatasvir的抗(kang)HCV活性
首先，在S1的抑制曲線中，選取I-1、Simeprevir及Daclatasvir EC50附近的濃度配比Com A，以及高于其EC50兩倍的濃度配比Com D；在S2的抑制曲線中，選取Daclatasvir的濃度為其 EC50兩倍時的濃度配比Com B；在S3的抑制曲線中，選取I-1與Daclatasvir的濃度均為其EC50兩倍時的濃度配比Com C；選取S4的抑制曲線中，各組分藥物單獨用藥時EC50附近的濃度配比Com E，以及高于各組分藥物EC50兩倍的(de)(de)濃(nong)度配比Com F。各濃(nong)度配比詳見表5Com A-F，通過比較(jiao)不同濃(nong)度配比對(dui)HCV的(de)(de)抑制率來評價(jia)本發明(ming)藥物組合(he)物的(de)(de)抗HCV效(xiao)果。
實驗結果顯示，Com A對HCV復(fu)制子的(de)抑(yi)制率達到82.91％，Com E的(de)抑(yi)制率為(wei)73.14％，而三者單獨給(gei)(gei)藥抑(yi)制率僅在50％左右。這(zhe)說(shuo)明在給(gei)(gei)藥濃(nong)度相(xiang)同的(de)情況下，聯(lian)合給(gei)(gei)藥的(de)抗HCV作用遠遠強(qiang)于單獨給(gei)(gei)藥的(de)效果。
其次，Com B對HCV抑制率達到91.06％，與單獨給藥時的EC90相比，各組分聯合用藥時的給藥濃度明顯降低；同樣的，Com C對HCV抑制率大于95％，各組分濃度卻遠遠小于其EC95。這(zhe)兩組(zu)數據均說明在起到相(xiang)同(tong)抗HCV作用效果的前提下(xia)，藥物(wu)組(zu)合(he)物(wu)能夠顯(xian)著降(jiang)低給藥濃度(劑(ji)量)。
當三組分濃度均提高至EC50的兩倍后，Com D的抑(yi)制(zhi)率高達99.5％，而雙組份Com F抑(yi)制(zhi)率僅(jin)為89.55％，這進一步證實(shi)了藥物組合(he)(he)物能夠(gou)顯著降低(di)給(gei)藥濃(nong)度(du)；此外更(geng)提示本發明在藥物組合(he)(he)物中(zhong)加(jia)入核苷(gan)類NS5B抑(yi)制(zhi)劑I能夠(gou)改善抗病毒效果。
以上實(shi)驗令人驚奇的證(zheng)明(ming)了本(ben)發明(ming)涉及的藥(yao)物(wu)(wu)組(zu)合(he)物(wu)(wu)，即NS5B抑制劑(ji)I、NS3/4A抑制劑(ji)及NS5A抑制劑(ji)聯合(he)用藥(yao)，與各組(zu)分中任(ren)一組(zu)分單獨給藥(yao)或任(ren)兩組(zu)分聯合(he)給藥(yao)相比，能夠顯著提高抗病毒效(xiao)(xiao)果，且大大降(jiang)低(di)用藥(yao)劑(ji)量，效(xiao)(xiao)果遠遠優于已(yi)知藥(yao)物(wu)(wu)組(zu)合(he)。
實施例3藥物組合物耐藥性質的測試(shi)
藥品：NS5B抑制劑I-1、Simeprevir、Daclatasvir。
細胞(bao)模型(xing)：變異(yi)(yi)型(xing)HCV亞(ya)基(ji)因組復(fu)制(zhi)(zhi)子(zi)細胞(bao)系統。包(bao)括S282TNS5B變異(yi)(yi)型(xing)復(fu)制(zhi)(zhi)子(zi)、R155K NS3/4A變異(yi)(yi)型(xing)復(fu)制(zhi)(zhi)子(zi)、Q80K NS3/4A變異(yi)(yi)型(xing)復(fu)制(zhi)(zhi)子(zi)、Y93H NS5A變異(yi)(yi)型(xing)復(fu)制(zhi)(zhi)子(zi)。
實驗步驟：
1.藥(yao)物(wu)(wu)組合(he)(he)物(wu)(wu)溶(rong)液(ye)的(de)配制(zhi)：藥(yao)物(wu)(wu)組合(he)(he)物(wu)(wu)溶(rong)液(ye)S1與藥(yao)物(wu)(wu)組合(he)(he)物(wu)(wu)溶(rong)液(ye)S4比(bi)例與實施例2中(zhong)相同；NS5B抑制(zhi)劑I-1與Simeprevir的(de)濃(nong)度配比(bi)為1∶0.015，配制(zhi)藥(yao)物(wu)(wu)組合(he)(he)物(wu)(wu)溶(rong)液(ye)S5；NS5B抑制(zhi)劑I-1與Daclatasvir的(de)濃(nong)度配比(bi)為1∶0.000075，配制(zhi)藥(yao)物(wu)(wu)組合(he)(he)物(wu)(wu)溶(rong)液(ye)S6；其中(zhong)，S1、5、6中(zhong)NS5B抑制(zhi)劑I-1的(de)起始(shi)濃(nong)度為10μM，S4中(zhong)Simeprevir的(de)起始(shi)濃(nong)度為10μM。
2.共孵(fu)育(yu)：將野生型(xing)及(ji)變異型(xing)復(fu)制(zhi)子(zi)細胞接種到96孔板(ban)中(zhong)，每孔8000個細胞；將藥(yao)物(wu)或藥(yao)物(wu)組合物(wu)S1、S4-6三倍濃度稀釋(shi)，分別與(yu)兩(liang)類復(fu)制(zhi)子(zi)細胞共孵(fu)育(yu)，雙復(fu)孔檢測，DMSO終(zhong)濃度為(wei)0.5％；二氧化碳培(pei)養箱(xiang)培(pei)養72小時；
3.向每孔細胞中加入細胞活力檢測試劑，檢測細胞活力。隨后向細胞中加入熒光素酶底 物Bright-Glo，5分鐘后用化學發光檢測系統檢測熒光素酶表達水平，計算得到半數有效濃度EC50及Fold Change值，其中野生型復制子抑制活性為ECWT，變異型復制子抑制活性為ECMut，Fold Change＝ECMut/ECWT；
3.用(yong)Fold Change衡(heng)量變異(yi)型(xing)HCV對藥物(wu)(wu)(wu)(wu)或藥物(wu)(wu)(wu)(wu)組合(he)物(wu)(wu)(wu)(wu)的敏感(gan)程度(du)。當Fold Change＞1.2時可認為HCV對藥物(wu)(wu)(wu)(wu)的敏感(gan)程度(du)降低，出現耐藥現象(xiang)。
實驗結果如圖1所示：
由圖1可(ke)知(zhi)，各組分單獨(du)給藥時(shi)，I-1對(dui)S282T NS5B變(bian)(bian)異(yi)型復(fu)(fu)制(zhi)子(zi)的(de)(de)(de)抑制(zhi)活(huo)性(xing)有所降(jiang)低(di)(di)；Simeprevir對(dui)R155KNS3/4A變(bian)(bian)異(yi)型及Q80KNS3/4A變(bian)(bian)異(yi)型復(fu)(fu)制(zhi)子(zi)的(de)(de)(de)抑制(zhi)活(huo)性(xing)出現(xian)明(ming)顯(xian)降(jiang)低(di)(di)；Daclatasvir對(dui)Y93H NS5A變(bian)(bian)異(yi)型復(fu)(fu)制(zhi)子(zi)的(de)(de)(de)抑制(zhi)活(huo)性(xing)也呈現(xian)明(ming)顯(xian)降(jiang)低(di)(di)。
藥物組(zu)合物Com A對(dui)所選的(de)4種變(bian)異(yi)型HCV均有理想的(de)抑制活性；而與之相比，R155K、Q80K、Y93H變(bian)異(yi)型HCV對(dui)僅(jin)含有Simeprevir及Daclatasvir的(de)組(zu)合物Com E仍(reng)產(chan)生一定程(cheng)度的(de)耐藥。
以上實驗證實了本(ben)發明所涉(she)及(ji)的藥物組合(he)(he)物能(neng)夠(gou)對野生型(xing)及(ji)多種變異型(xing)HCV產生良(liang)好的抑制作用；該實驗提示應用該藥物組合(he)(he)物能(neng)夠(gou)有效防止耐藥病毒的產生。
實施例4 片劑
將上(shang)表配方(fang)的粉末(mo)混合，通過壓(ya)片(pian)(pian)(pian)機(ji)壓(ya)片(pian)(pian)(pian)，制成每片(pian)(pian)(pian)1200mg的片(pian)(pian)(pian)劑。該片(pian)(pian)(pian)劑可以根據需(xu)要進行(xing)薄膜包(bao)(bao)衣或包(bao)(bao)糖衣。
實施例5 片劑
將上表配方的粉末混合，通過壓片(pian)機壓片(pian)，制成每片(pian)1200mg的片(pian)劑。該片(pian)劑可以根據需要(yao)進行(xing)薄(bo)膜(mo)包衣或包糖衣。
實施例6 片劑
將上(shang)表配方的粉(fen)末混(hun)合，通過壓(ya)片(pian)機壓(ya)片(pian)，制(zhi)成每片(pian)1200mg的片(pian)劑。該片(pian)劑可以根據需要進行薄膜包衣或包糖衣。