三七總皂苷在制備直接抗丙型肝炎病毒藥物中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于醫藥領域，具體設及=屯總皂巧在制藥領域中的新用途。
【背景技術】
[0002] 丙型肝炎病毒（HCV)引起的丙型肝炎是嚴重危害人類健康的感染性疾病，該疾病 感染發病率高，慢性化率高、無疫苗可預防、病程遷延進展，迄今仍是世界性的醫學難題和 社會的沉重經濟負擔。目前治療慢性丙型肝炎（CHC)普遍采用的是抗病毒療法[干擾素 (IFN) +利己韋林]，療效偏低，特別是對我國主要的流行型HCV2a療效差，持續病毒學應答 率（SVR)僅約50 - 60%，且干擾素和利己韋林的不良反應也對治療劑量及療程產生影響。 直接抗病毒藥物值AA)的出現為治療CHC提供了更多選擇，但DAA的臨床使用經驗有限，一 些問題如對藥物的耐受性、聯合使用及耐藥性、價格昂貴等問題使其并不能立即廣泛應用 于臨床。
[0003] 傳統中醫藥已普遍應用于CM：的治療，目前在臨床上應用的中藥和中成藥頗多， 在保肝、抗病毒方面均取得了一定的效果，也為CHC的治療提供了更多選擇。臨床正在使用 的苦參素就是從天然植物苦豆子中提取的單體氧化苦參堿，在慢性乙型肝炎和CM：的臨床 使用過程中已經取得公認的療效。
[0004]S屯為五加科多年生草本植物，S屯總皂巧（Panaxnotoglnsengsaponins，PNS) 是S屯的主要活性成分。近年來對PNS藥理活性的研究很多，已證實其在中樞神經系統、屯、 腦血管系統、血液系統、免疫系統W及抗纖維化、抗衰老、抗腫瘤等方面均具有廣泛生理活 性。中醫學認為慢性肝炎的致病原因乃濕熱疫毒留滯血脈，聚于肝體，導致肝郁，進而脾虛 或肝腎陰虛，最終導致氣滯血疲、疲血阻絡。=屯總皂巧可W通過活血化疲，通脈活絡來改 善留滯血脈，肝腎陰虛，進而達到氣血流楊。立屯總皂巧在防護肝損傷、抗肝纖維化方面的 重要作用得到了進一步證實。太永日等用=屯總皂巧治療病毒性肝炎高膽紅素血癥病人 【太永日，崔偉哲屯總皂巧治療病毒性肝炎高膽紅素血癥35例療效觀察[J].臨床肝膽 病雜志，1999,15(3) :184】；熊磊等發現=屯總皂巧抗肝纖維化作用可能是通過抑制肝星狀 細胞增殖及細胞內外I型膠原生成來實現的（熊磊，劉平.S屯皂巧對肝星狀細胞及膠原 生成的影響[J].中西醫肝病雜志，1999,9(3) :19);李哲等用造成大鼠離體灌流肝損傷模 型，并觀察了PNS對該模型的影響，表明PNS能明顯增加血管流量，改善肝臟微循環，減輕肝 損傷（李哲.S屯總皂巧對大鼠離體灌流巧的影響[J].云南中醫學院學報，1993,16似： 11);余萬桂用紅外無創傷檢測S屯能顯著改善肝臟缺血缺氧，保護肝細胞。治療病毒性肝 炎不一定是直接抗丙型肝炎病毒，至今未發現=屯皂巧直接用于制備抗HCV病毒藥物方面 的報道。

【發明內容】
陽〇化]本發明的目的是提供=屯總皂巧在制備直接抗丙型肝炎病毒藥物中的應用。
[0006] 本專利申請人進行了體外抗HCV活性測試，結果表明S屯總皂巧能明顯抗HCV的 復制，且無細胞毒性。具體說，本發明利用化h7. 5. 1細胞系及HCV細胞培養病毒（HCVcc)，W利己韋林和干擾素作為陽性對照，對=屯皂巧進行了體外抗HCV活性評價，結果表明=屯 總皂巧具有明顯抗HCV病毒活性且無細胞毒性。
[0007] 本發明所說制備藥物的含義是=屯總皂巧可W與任合藥劑學上可接受的輔料制 成制劑，例如可W制成任何常規口服劑型：散劑、顆粒劑、片劑、膠囊劑、丸劑、溶液劑、懸浮 液、糖漿、口腔含片、舌下含片等。
[0008] 本發明使用的S屯總皂巧可采用W下方法制備，但不限于此：
[0009] 取=屯生藥材，加入水、生物酶提取，醇沉淀或澄清劑澄清，上清液濃縮一定濃度 后上大孔樹脂進一步分離，有機溶劑洗脫，收集洗脫液離子交換樹脂脫色，收集洗脫液，濃 縮、干燥即得。
[0010] 為更好地理解本發明，下面通過利用化h7. 5. 1細胞系及HCV細胞培養病毒 (HCVcc)，W干擾素作為陽性對照，對=屯皂巧進行體外抗HCV活性、細胞毒性進行評價，來 說明=屯總皂巧的新用途，即=屯總皂巧在制備直接抗丙型肝炎病毒藥物中的應用。
[0011] 實驗：S屯總皂巧體外抗丙型肝炎病毒（HCV)
[0012] S屯皂巧的制備：取S屯粗粉末200g，加水1500ml，加入適量生物酶，調抑后，置 水浴酶解提取，提取液備用。殘渣用第一次生藥重量5倍量的水提兩次，合并=次提取液， 加入澄清劑靜置絮凝，離屯、分離，澄清液減壓濃縮，上D101型樹脂，先用水洗脫至無Molish 反應，再用乙醇洗脫至無皂巧反應，乙醇洗脫液經陰離子交換樹脂脫色，濃縮、噴霧干燥得 S屯總皂巧。
[0013] 采用上述方法制備=屯總皂巧樣品1、2、3,制備條件及總皂巧含量如表1所示：
[0014] 表1S屯總皂巧樣品1、2、3制備條件及總皂巧含量 陽(T[i
[0016] 樣品及處理：稱取適量藥物溶解在100%的DMS0中，制備成lOOmg/ml的儲存液； 0. 22ym濾膜過濾除菌，用DMS0依次稀釋7個梯度。
[0017] 細胞和病毒：人肝癌細胞株化h7. 5. 1使用DMEM培養基，添加10%FBS和1%雙 抗，在5%C02,37°C條件下培養；HCV細胞培養病毒（HCVcc)由包含2a亞型的HCV全基因組 J6/JFH- 1質粒經體外轉錄為RNA后轉染化h7. 5. 1細胞，經培養后得到的高毒力、高感染 力的HCV病毒液。 陽0化]藥物抗肥V活性檢測：取對數生長期的Huh7. 5. 1細胞，W1. 5X104cells/well鋪于96孔板，貼壁5小時后，加入水梯度稀釋藥物，5倍稀釋，6個稀釋度，每個梯度設=個 重復孔，同時加入病毒，設細胞對照、病毒對照、抗HCV陽性對照（干擾素）、水對照，終體積 200yL/wel1。將培養板置于37°C、5 %C〇2培養箱進行培養，72后收集上清3000rmp/min離 屯、lOmin，分別取lOOul澄清上清提取的病毒RNA，利用巧光定量PCR技術進行HCVRNA拷 貝數定量檢測。w空白對照孔的病毒載量為對照，分別計算不同濃度藥物的抑制率（％ )， 最后采用GraphPadPrisms軟件計算藥物ECw(半數效應濃度，抑制細胞中HCV病毒載量 50%的藥物濃度）的值，并繪制量一效曲線圖。
[0019]MTT法檢測藥物細胞毒性：取對數生長期的Huh7. 5. 1細胞，W1X104cells/well 細胞鋪于96孔板，貼壁化后，加入2yLDMS0 -De梯度稀釋的藥物，10倍稀釋，6個稀釋度， 每個梯度設=個重復孔，同時設置空白對照（只含培養基）、細胞對照、DMS0 -De對照及抗 HCV陽性藥物利己韋林對照，終體積200yL/well。將培養板置于37°C5%C〇2培養箱進行 培養。7化后，于實驗孔加入20yL的5mg/血MTT溶液，37°C5% %解育4小時。棄去上 清，加入150yL/well的DMS0 -的，振蕩溶解lOmin后，于酶標儀上測定0〇49。的值，W空白 對照孔的0D值為對照，分別計算不同濃度藥物的抑制率（％)，最后采用GraphPadPrisms 軟件計算藥物CCw(CCw:細胞生長抑制50%所需的藥物濃度）的值，并繪制量一效曲線圖。
[0020] 實驗結果；
[0021]按上述方法，對利己韋林及上述=屯總皂巧樣品1、2、3進行及體外抗HCV活性實 驗，其細胞毒性（CCJ及活性巧CJ如表2所示。
[0022] 表2S屯當皂巧抗肥V活性
[0023]
[0024]S屯總皂巧1、2、3樣品具有明顯抗HCV病毒活性，且無細胞毒性，毒副作用遠遠優 于利己韋林。
[00巧]本發明的有益效果：首次提供了 =屯總皂巧在制備直接抗丙型肝炎病毒藥物中的 應用。 【具體實施方式】 陽0%] 實施例：取S屯粗粉末200g，加水1500ml，調PH= 5. 5,加入適量a-淀粉酶，充 分攬拌，置60°C水浴酶解提取化，提取液備用。殘渣用第一次生藥重量5倍量的水提兩次， 合并=次提取液，加入ZTC1+1天然澄清劑絮凝，過濾，濾液減壓濃縮至1/2體積，濾過，濾液 上D101型樹脂，先用水洗脫至無Molish反應，再用70%的乙醇洗脫至無皂巧反應，乙醇洗 脫液經陰離子交換樹脂脫色，濃縮、噴霧干燥得=屯總皂巧。取所得=屯總皂巧加適量賦形 劑按片劑常規方法制成每片重量為lOOmg或50mg的片劑，該片劑為直接抗丙型肝炎病毒的 藥物，用于治療丙型肝炎。
【主權項】
1. 三七總皂苷在制備直接抗丙型肝炎病毒藥物中的應用。2. 如權利要求1所述的應用，其特征在于三七總皂苷可以與任合藥劑學上可接受的輔 料制成制劑。
【專利摘要】三七總皂苷在制備直接抗丙型肝炎病毒藥物中的應用，屬于醫藥領域。采用體外細胞水平的方法進行了三七總皂苷抗HCV活性和毒性測試，結果表明，三七總皂苷具有良好的抗HCV活性，并且毒性低，明顯優于對照組，臨床用藥安全。本發明首次提供了三七總皂苷在制備直接抗丙型肝炎病毒藥物中的應用，有望開發出直接抗丙型肝炎病毒的藥物。
【IPC分類】A61P31/14, A61K36/258
【公開號】CN105147753
【申請號】CN201510695240
【發明人】何嚴萍, 馮悅, 楊軍鋒, 夏雪山, 姚赟, 李聰, 王月平
【申請人】云南大學, 昆明理工大學
【公開日】2015年12月16日
【申請日】2015年10月23日