專利名稱：用于改變植物中酶和乙酰輔酶a水平的材料和方法
技術領域：
本發明涉及乙酰輔酶A合成酶(ACS)、質體丙酮酸脫氫酶(pPDH)、ATP檸檬酸裂合酶(ACL)、擬南芥丙酮酸脫羧酶(PDC)、和擬南芥醛脫氫酶(ALDH)的核酸和氨基酸序列。本發明還涉及一種重組載體，包含(i)一條編碼上述酶之一的核酸序列，(ii)其反義序列或(iii)其核酶，被這樣的載體轉化的細胞，這些酶的抗體，在酶或乙酰輔酶A水平，或產生乙酰輔酶A的能力上已被改變的一種植物細胞，一種植物組織、一種植物器官或一種植物，和產生這樣的植物細胞、植物組織、植物器官或植物的方法。另外，本發明涉及一種重組載體，包含(i)編碼PDC、pPDH的E1α亞基、pPDH的E1β亞基、pPDH的E2亞基、線粒體丙酮酸脫氫酶(mtPDH)或醛脫氫酶(ALDH)的核酸的反義序列，或(ii)一種能切開編碼PDC、E1αpPDH、E1βpPDH、E2pPDH、mtPDH或ALDH的RNA分子的核酶。
背景技術：
ACS和pPDH是兩種負責在植物的質體，如葉綠體中產生乙酰輔酶A的酶。ACS如下產生乙酰輔酶A乙酸+ATP+CoASH→乙酰-CoA+AMP+PPi，其中ATP代表三磷酸腺苷，CoASH代表輔酶A，乙酰-CoA代表乙酰輔酶A，AMP代表一磷酸腺苷，和PPi代表無機焦磷酸，和其中乙酸包括從乙醛和NAD+轉化成乙酸和NADH得到的乙酸，其中乙醛又是來自丙酮酸分解，其釋放CO2。pPDH如下產生乙酰CoA丙酮酸+CoASH+NAD+→乙酰-CoA+CO2+NADH，其中NAD+代表煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，而NADH代表NAD+的還原形式，其中丙酮酸來自糖酵解。糖酵解涉及糖磷酸酯(來自淀粉、光合作用或丙糖的輸入，和來自細胞液的己糖磷酸酯)轉化成丙酮酸。
已進行了各種對植物(如菠菜、蓖麻、大麥和蕓苔)胚胎和葉子中酶相對活性的研究(見，Kang和Rawsthrorne，植物雜志，6795-805(1994)；Miernyk和Dennis，實驗植物學雜志，34712-718(1983)；Smith等，植物生理學，981233-1238(1992)；Liedvogel和Bauerle，Planta169481-489(1986)；Murphy和Leech，FEBS Letter 77164-168(1977)；Roughan等，生物化學雜志158593-601(1976)；Roughan等，生物化學雜志，184565-569(1978)；Roughan等，生物化學雜志184193-202(1979)；Spinger和Heise，Planta177417-421(1989)；Schulze-Siebert和Schultz，植物生理學841233-1237(1987)；和Heintze等，植物生理學931121-1127(1990))。這些研究提示，乙酸是葉綠體中脂肪酸合成的優選底物，而丙酮酸是胚胎質體中脂肪酸合成的優選底物。
乙酰輔酶A還涉及脂肪酸的生物合成，即，膜脂、脂肪和蠟的基礎結構單元的合成。在線粒體中由mtPDH進行類似的反應。
ACS廣泛發現于植物質體中，并由光調節(Sauer和Heise，Z.Naturforsch38c399-404(1983))。ACS量在菠菜、豌豆和莧菜葉綠體之間是相當恒定的；玉米葉綠體中約20％多。已知部分純化的該酶是完全DTT依賴性的，提示了其體內活性受鐵氧還蛋白/硫氧還蛋白系統的調節(Zeiher和Randall，植物生理學，96382-389(1991))。還有一些乙酰輔酶A的弱反饋抑制。該酶還需要高pH，以及對高ATP(Mg2+-ATP)/ADP比率的依賴性(Sauer和Heise(1983)，見上)。ACS反應必須是底物飽和的，因為菠菜(Sauer和Heise(1983)，見上；Zeiher和Randall(1991)，見上；和Treede和Heise，Z.turforsch40c496-502(1985))，豌豆(Treede和Heise(1985)，見上)，莧菜(Roughan和Ohlrogge，生物化學年鑒21677-82(1994))和土豆(Roughan和Stumpf，農業生物化學生物物理學140158-173(1970))中乙酸的Km值在0.02和0.10mM之間，而估計細胞乙酸的濃度是約1.0mM(Kuhn等，農業生物化學生物物理學209441-450(1981))。
pPDH看來與mtPDH具有相同的一般結構，由丙酮酸脫氫酶組分(E1α和E1β)，乙酰轉移酶組分(E2)，和脫氫硫辛酰胺脫氫酶(E3)亞基構成。pPDH的分子量和其輔因子要求也和mtPDH相似，雖然對NAD+和TPP的親和力有些不同(Camp和Randall，植物生理學77571-577(1985)；Miernyk等(1983)，見上；和Conner等，Planta200195-202(1996))。比起mtPDH，對乙酰輔酶A較不敏感的pPDH具有約8.0的最佳pH，并且達到最大活性需要約10mM的Mg2+。雖然mtPDH的活性受復雜的激酶/磷酸酶系統控制(該系統磷酸化E1α亞基，從而使其滅活)，但pPDH不受該調控。然而，pPDH強烈的受到NADH/NAD+比率的調節，并受光中等調節。受ATP、NADPH、脂肪乙酰輔酶A和糖酵解中間產物輕微調控(Camp等，生物化學生物物理學學報933269-275(1988)；和Qi等，實驗植物學雜志471889-1896(1996))。
PDH活性隨組織不同而變化，而mtPDH活性差別15倍，pPDH活性差別6倍(Lernmark和Gardestrom，植物生理學1061633-1638(1994))。pPDH/mtPDH在植物之間也不同，小麥葉的葉綠體中比線粒體中活性高6.5倍，豌豆線粒體中比葉綠體中活性高6.7倍。雖然與小麥比較，豌豆中葉綠體比線粒體PDH活性的比例小，葉綠體與線粒體PDH絕對量幾乎一樣大。
ACL是一種負責產生乙酰輔酶A的酶。ACL如下產生乙酰輔酶A檸檬酸+ATP+CoASH→乙酰-CoA+草酰乙酸+ADP+Pi，其中ADP代表二磷酸腺苷，而Pi代表正磷酸，而其中檸檬酸是線粒體TCA循環中產生的。已發現ACL的活性與蔓菁的發育種子(Brassica napusL.)(Ratledge等，脂類32(1)7-12(1997))和發育中的大豆上清液(Glycinemax L.Merr.，var.Harosoy 63)子葉勻漿(Nelson等，植物生理學，5569-72(1975))中的脂質的積累有關。還在發芽的蓖麻子胚乳組織粗抽提物中發現了ACL(Ricinus communis cv.Hale)并發現在4-5日齡的幼苗中活性最大(Fritsch等，植物生理學63687-691(1979))。
PDC是一種負責從丙酮酸產生乙醛的細胞液酶。PDC如下產生從丙酮酸產生乙醛丙酮酸→乙醛+CO2.
這樣產生的乙醛可能受到ALDH的作用。
ALDH負責從乙醛產生乙酸。ALDH如下從乙醛產生乙酸
乙醛+NAD++H2O→乙酸+NADH++H+.
這樣產生的乙酸然后可進入質體，在其中它可通過ACS的作用轉化成乙酰輔酶A。
ACH是一種已知存在于酵母中，并據信存在于植物線粒體中的酶。據信ACH從存在于線粒體中的乙酰輔酶A庫中產生乙酸。這樣產生的乙酸據信從線粒體中釋放入胞質溶膠。然后胞質溶膠中的乙酸可進入質體，其中它可通過ACS的作用被轉化成乙酰輔酶A。
乙酰輔酶A是許多植物化學物質的共同前體，這些化學物質具有各種各樣生物功能，并代表農業上可更新的，富含能量的產物(如脂肪、油、蠟、異戊二烯化合物和生物塑料(如聚羥基丁酸酯))或影響農業生產(如類黃酮、類芪(stibenoid)、異戊二烯化合物和丙二酰衍生物)(Goodwin和Mercer，植物生物化學介紹，第二版，Pergamon Press，New York(1988))。這些植物化學物質是由乙酰輔酶A的羧化作用或連續縮合合成的。
乙酰輔酶A的羧化(通過中間產物丙二酰輔酶A)導致脂肪酸(如膜、油、角質層、木栓質和表皮質)，類黃酮(如色素、植物抗毒素和植物保護劑)、類芪(如植物保護劑和藥物)、吖啶酮、丙二酸和各種丙二酰衍生物(氨基環丙烷羧酸、D-氨基酸、類黃酮和殺蟲劑)的生物合成。脂肪酸是所有細胞膜的結構單元。另外，在生物合成植物油、角質層、表皮質和木栓質的發育調控過程中，使用了脂肪酸。大部分植物油是三酰基甘油。類黃酮是一組水溶性酚化合物，作為色素具有廣泛的生物作用，而且它們在植物對生物和非生物壓力(如，干旱、真菌和細菌病原體，和鹽壓力)的反應中聚集。認為類芪在植物防御機制中起作用。吖啶酮是一類生物堿，具有廣譜的抗菌、抗擬軟體動物和抗病毒活性。在植物中存在許多丙二酰衍生物，包括D-氨基酸，類黃酮和殺蟲劑等異型生物質。乙烯前體，氨基環丙烷羧酸的丙二酸化，可影響激素乙烯的產生。
乙酰輔酶A的縮合(通過中間產物乙酰乙酰輔酶A和HMG CoA)導致異戊二烯化合物的生物合成。異戊二烯化合物的例子包括甾醇、植物抗毒素、脫落酸、赤霉素、八氫番茄素、β-胡蘿卜素、植醇、天然橡膠、植物保護劑和藥物。異戊二烯化合物還是許多香精油和香料的重要組分。
另外，對生物技術工業振奮的是，乙酰乙酰輔酶A是從轉基因植物產生一種新的農業產物，稱為聚羥基丙酸酯(PHB，一種生物塑料)的前體。目前的研究指出，轉基因生物塑料的生產可能受到乙酰輔酶A供應的限制(Nawrath等，PNAS USA 9112760-12764(1994))。
利用乙酰輔酶A作為前體的途徑是在空間和時間上分隔的。所有細胞合成脂肪酸和甾醇是為了膜的生物合成。大部分其它乙酰輔酶A-衍生的植物化學物質的積聚是高度細胞特異性的，而且在發育的具體階段，或對具體環境信號的反應中發生在特異的亞細胞區室中。例如，乙酰輔酶A是質體中從頭合成脂肪酸(產生18-碳脂肪酸)必需的。18-碳脂肪酸延伸到20碳或更長的脂肪酸需要細胞液乙酰輔酶A庫。在細胞液中，為了生物合成異戊二烯化合物、類黃酮、或幾種(如不是全部)丙二酸衍生物，也需要乙酰輔酶A。另外，質體中脂肪酸的合成在含油種子的三酰基甘油沉積過程中，以及在最大膜形成，如前質體轉化成葉綠體過程中應是最大化的。
因此，綜上所述，仍然需要改變參與乙酰輔酶A產生的酶水平和因此植物中的乙酰輔酶A水平的材料和方法。因此，本發明的一個目的是提供這樣的材料和方法。本發明的這些和其它目的，以及優點，和其它發明特征，通過下文描述，本領域普通技術人員將會明白。
發明簡述在一個實施例中，本發明提供了分離或純化的核酸分子。一種分離或純化的核酸分子編碼一種植物質體ACS，如從擬南芥中分離的質體ACS，及其含有至少約20個核苷酸的連續片段。優選的，編碼ACS的核酸分子是(i)DNA，并包含SEQ ID NO1或編碼SEQ ID NO2的序列，(ii)RNA，并包含由SEQ ID NO1編碼的序列或編碼SEQ ID NO2的序列，或(iii)一條核酸分子，其在嚴格條件下能與上述兩核酸的任何一條雜交。還提供了一條分離或純化的核酸分子，它編碼修飾的ACS，及其含有至少約20個核苷酸的連續片段。
對此，本發明還提供了一種分離或純化的核酸分子，它編碼植物pPDH的E3亞基(E3pPDH)，如從擬南芥分離而得的核酸分子，及其包含至少約20個核苷酸的連續片段。優選的，編碼E3pPDH的核酸分子是(i)DNA，并包含SEQ ID NO27(E3-1pPDH)或SEQ ID NO29(E3-2pPDH)或編碼SEQ ID NO28(E3-1pPDH)或SEQ ID NO30(E3-2pPDH)的序列，(ii)RNA，并包含由SEQ ID NO27或SEQ ID NO29編碼的序列或編碼SEQID NO28或SEQ ID NO30的序列，或(iii)一條核酸分子，其在嚴格條件下能與前述兩核酸分子的任何一條雜交。還提供了一條分離或純化的核酸分子，它編碼修飾的pPDH E3亞基，及其包含至少約20個核苷酸的連續片段。
另一種分離或純化的核酸分子編碼植物ACL的A亞基(ACL-A)，例如從擬南芥分離得的核酸分子，及其包含至少約20個核苷酸的連續片段。優選的，該編碼ACL-A的核苷酸是(i)DNA，并包含SEQ ID NO7或編碼SEQ ID NO8的序列，(ii)RNA，并包含由SEQ ID NO7編碼的序列，或編碼SEQ ID NO8的序列，或(iii)一條核酸分子，其在嚴格條件下能與上述兩核酸分子之一雜交。還提供了一條分離或純化的核酸分子，它編碼ACL的修飾的A亞基及其包含至少約20個核苷酸的連續片段。
對此，本發明還提供了一種編碼植物ACL的B亞基(ACL-B)的分離或純化的核酸分子，例如從擬南芥分離得的該核酸分子，及其包含至少約20個核苷酸的連續片段。優選的，該編碼ACL-B的核苷酸是(i)DNA，并包含SEQ ID NO9(ACL-B1)或SEQ ID NO11(ACL-B2)或編碼SEQ ID NO10(ACL-B1)或SEQ IDNO12(ACL-B2)的序列，(ii)RNA，并包含由SEQ ID NO9或SEQ ID NO11編碼的序列，或編碼SEQ ID NO10或SEQ ID NO12的序列，或(iii)一條核酸分子，其在嚴格條件下能與上述兩核酸分子之一雜交。還提供了一條分離或純化的核酸分子，它編碼ACL的修飾的B亞基及其包含至少約20個核苷酸的連續片段。
本發明還提供了一種分離和純化的核酸分子，它包含SEQ ID NO15或SEQID NO17的核苷酸序列，或編碼SEQ ID NO16或SEQ ID NO18的氨基酸序列。
同樣的，一種分離和純化的核酸分子，包含SEQ ID NO21的核苷酸序列，或編碼SEQ ID NO22的氨基酸序列，及上述兩核酸分子之一的各包含至少約20個核苷酸的連續片段，或能與前述核苷酸任意一種在嚴格條件下雜交的核酸分子。
同樣的，一種分離和純化的核酸分子，包含SEQ ID NO25的核苷酸序列，或編碼SEQ ID NO26的氨基酸序列，及上述兩核酸分子之一的各包含至少約20個核苷酸的連續片段，或能與前述核苷酸任意一種在嚴格條件下雜交的核酸分子。
在另一個實施例中，本發明還提供了一種載體，它包含如上所述的一條核酸分子，一種包含這樣的載體的宿主細胞，以及這樣的宿主細胞產生的多肽。還提供了多個載體，它們包含或編碼一條反義序列或一種核酶，該反義序列能與編碼質體ACS、pPDH的E1α亞基、pPDH的E1β亞基、pPDH的E2亞基、pPDH的E3亞基、ACL的A亞基、ACL的B亞基、PDC、ACH、mtPDH或ALDH的RNA分子雜交，而該核酶能切割這些RNA分子，以及提供含有這樣的載體的宿主細胞。另外，提供了反義分子、核酶和抗體。
在另一個實施例中，本發明提供了一種改變植物細胞、植物組織、植物器官或植物中的酶水平的方法。該方法包含使植物細胞、植物組織、植物器官或植物與一載體接觸，該載體包含一種核酸分子，其選自(i)編碼一種酶，或如果該酶是由亞基構成的，則編碼酶的亞基，這些酶選自質體ACS、pPDH、ACL、丙酮酸脫羧酶、乙酰輔酶A水解酶、線粒體丙酮酸脫氫酶，(ii)一條核酸分子，它包含或編碼一條由(i)的基因轉錄而得的RNA分子的反義分子，和(iii)一條核酸分子，它包含或編碼針對從(i)的基因轉錄而得的RNA分子的核酶。該包含核酸分子(i)的載體能提高或降低植物細胞、植物組織、植物器官或植物中的酶水平，而包含或編碼(ii)或(iii)的核酸分子的載體能降低植物細胞、植物組織、植物器官或植物中的酶水平。優選的，該酶的改變導致植物細胞、植物組織、植物器官或植物中乙酰輔酶A水平的改變。因此，本發明還提供了一種植物細胞、植物組織、植物器官和植物，其中乙酰輔酶A的水平已根據該方法被改變。
附圖簡述

圖1描述了ACS的cDNA[SEQ ID NO1]和氨基酸[SEQ ID NO2]序列。
圖2描述了pPDH的E1α亞基的cDNA[SEQ ID NO3]和氨基酸[SEQ ID NO4]序列。
圖3描述了pPDH的E1β-1亞基的cDNA[SEQ ID NO5]和氨基酸[SEQ ID NO6]序列。
圖4描述了ACL的A亞基的cDNA[SEQ ID NO7]和氨基酸[SEQ ID NO8]序列。
圖5描述了ACL的B-1亞基的cDNA[SEQ ID NO9]和氨基酸[SEQ ID NO10]序列。
圖6描述了ACL的B-2亞基的cDNA[SEQ ID NO11]和氨基酸[SEQ ID NO12]序列。
圖7描述了pPDH的E1β-2亞基的cDNA[SEQ ID NO13]和氨基酸[SEQ IDNO14]序列。
圖8A描述了擬南芥的PDC-1的cDNA序列[SEQ ID NO15]。
圖8B描述了擬南芥的PDC-1的氨基酸序列[SEQ ID NO16]。
圖9A描述了擬南芥的PDC-2的cDNA序列[SEQ ID NO17]。
圖9B描述了擬南芥的PDC-2的氨基酸序列[SEQ ID NO18]。
圖10A描述了擬南芥的ALDH-1的cDNA序列[SEQ ID NO19]。
圖10B描述了擬南芥的ALDH-1的氨基酸序列[SEQ ID NO20]。
圖11A描述了擬南芥的ALDH-2的cDNA序列[SEQ ID NO21]。
圖11B描述了擬南芥的ALDH-2的氨基酸序列[SEQ ID NO22]。
圖12A描述了擬南芥的ALDH-3的cDNA序列[SEQ ID NO23]。
圖12B描述了擬南芥的ALDH-3的氨基酸序列[SEQ ID NO24]。
圖13描述了擬南芥的ALDH-4的cDNA[SEQ ID NO25]和氨基酸[SEQ IDNO26]序列。
圖14描述了擬南芥的pPDH的E3-1亞基的cDNA[SEQ ID NO27]和氨基酸[SEQ ID NO28]序列。
圖15描述了擬南芥的pPDH的E3-2亞基的cDNA[SEQ ID NO29]和氨基酸[SEQ ID NO30]序列。
發明詳述在一個實施例中，本發明提供了分離或純化的核酸分子。“分離的”指從其天然環境中取出核酸。“純化的”指一種不論從天然取出的(包括基因組DNA和mRNA)還是合成的(包括cDNA)，和/或在實驗室條件下經過擴增的給定核酸，純度已提高，其中“純度”是相對術語，不是“絕對純度”。“核酸分子”將包含一種DNA或RNA的多聚物，即，一種多核苷酸，其可以是單鏈或雙鏈的，而且可含有非天然或改變的核苷酸。
一種分離或純化的核酸分子編碼植物ACS，如從擬南芥分離得到的，及其包含至少約20個核苷酸的連續片段。優選的，編碼ACS的核酸分子是(i)DNA，并包含SEQ ID NO1或編碼SEQ ID NO2的序列，(ii)RNA，并包含由SEQ IDNO1編碼的序列或編碼SEQ ID NO2的序列，或(iii)一條核酸分子，其在嚴格條件下與上述兩條核酸的任何一條雜交。還提供了一條分離或純化的核酸分子，它編碼包含一個或多個插入、缺失和/或取代的修飾的ACS，及其包含至少約20個核苷酸的連續片段。理想的，該修飾的ACS與對應的未修飾ACS(例如包含SEQ ID NO2的)的功能相同。優選的，如用標記乙酸體外試驗測定的該修飾ACS將以對應的(包含SEQ ID NO2等的)未修飾ACS的至少約50％，更優選的至少約75％，和最優選的至少約90％，把乙酸轉化成乙酰輔酶A。本文所用的詞語“標記的”指任何檢測方法，如放射性同位素。
編碼擬南芥ACS的cDNA編碼了一個76.7kDa的蛋白質。擬南芥的ACS與大腸桿菌和酵母的相似，含有兩個同工型。擬南芥DNA的DNA印跡分析表明，ACS是單拷貝基因。擬南芥的ACS序列與酵母的ACS序列有56％相似性和48％相同性，與大腸桿菌ACS序列有66％相似性和58％相同性。ACS序列可從GenBank以登錄號AF036618獲得。
本發明提供的另一種分離或純化的核酸分子編碼植物pPDH的E1α亞基(E1αpPDH)，如從擬南芥分離得到的，及其包含至少約20個核苷酸的連續片段(也見Johnston等，BBA1321200-206(1997))。優選的，編碼pPDH E1α的核酸分子是(i)DNA，并包含SEQ ID NO3或編碼SEQ ID NO4的序列，(ii)RNA，并包含由SEQ ID NO3編碼的序列或編碼SEQ ID NO4的序列，或(iii)一條核酸分子，其在嚴格條件下與上述兩核酸任何一條雜交。還提供了一條分離或純化的核酸分子，編碼包含一個或多個插入、缺失和/或取代的修飾的E1αpPDH亞基，及其包含至少約20個核苷酸的連續片段。理想的，該修飾的E1αpPDH亞基與對應的未修飾E1αpPDH(例如包含SEQ ID NO4的)的功能相同。優選的，該修飾的植物pPDH的E1αpPDH亞基和剩余的pPDH的未修飾亞基一起，與對應的未修飾pPDH功能相同。優選的，如用標記丙酮酸體外試驗測定的那樣，該修飾pPDH將以對應的(包含SEQ ID NO4等的)未修飾E1α亞基的至少約50％，更優選的至少約75％，和最優選的至少約90％，把丙酮酸轉化成乙酰輔酶A。
編碼擬南芥pPDH的E1α亞基的cDNA編碼了一個47kDa的蛋白質。E1α亞基與紫菜(Porphyra purpurea)葉綠體的相似。擬南芥DNA的DNA印跡分析表明，E1α是單拷貝基因。擬南芥的E1α序列與紫菜的E1α亞基的E1α亞基序列有61％相同性。
對此，本發明還提供了一種分離或純化的核酸分子編碼植物pPDH的E1β亞基(E1βpPDH)，如從擬南芥分離得到的，及其包含至少約20個核苷酸的連續片段(也見Johnston等，(1997)見上)。優選的，編碼E1βpPDH的核酸分子是(i)DNA，并包含SEQ ID NO5(E1β-1pPDH)或SEQ ID NO13(E1β-2pPDH)或編碼SEQ ID NO6或SEQ ID NO14的序列，(ii)RNA，并包含由SEQ ID NO5或SEQ ID NO13編碼的序列或編碼SEQ ID NO6或SEQ ID NO14的序列，或(iii)一條核酸分子，其在嚴格條件下與上述兩核酸任何一條雜交。還提供了一條分離或純化的核酸分子，編碼包含一個或多個插入、缺失和/或取代的修飾的E1βpPDH亞基，及其包含至少約20個核苷酸的連續片段。理想的，該修飾的E1βpPDH亞基與對應的未修飾E1βpPDH(例如包含SEQ ID NO6或SEQID NO14的)亞基的功能相同。優選的，植物pPDH的該修飾的E1βpPDH亞基和剩余的pPDH的未修飾亞基一起，與對應的未修飾pPDH功能相同。優選的，如用標記丙酮酸體外試驗測定的那樣，該修飾的pPDH將以對應的(包含SEQ IDNO6或SEQ ID NO14等的E1β亞基的)未修飾pPDH的至少約50％，更優選的至少約75％，和最優選的至少約90％，把丙酮酸轉化成乙酰輔酶A。
pPDH的E1β亞基是由至少兩條擬南芥基因，稱為E1β-1和E1β-2(在氨基酸水平有95％相同性)。編碼的擬南芥pPDH的E1β-1亞基的cDNA編碼了一個44kDa的蛋白質。擬南芥pPDH的E1β-1亞基與紫菜的pPDH有78％相似性和70％相同性，與mtPDH的E1β亞基有52％相似性和41％相同性。
對此，本發明還提供了一種分離或純化的核酸分子編碼植物pPDH的E3亞基(E3 pPDH)，如從擬南芥分離得到的，及其包含至少約20個核苷酸的連續片段。優選的，編碼E3 pPDH的核酸分子是(i)DNA，并包含SEQ ID NO27(E3-1pPDH)或SEQ ID NO29(E3-2pPDH)或編碼SEQ ID NO28(E3-1pPDH)或SEQID NO30(E3-2pPDH)的序列，(ii)RNA，并包含由SEQ ID NO27或SEQ ID NO29編碼的序列或編碼SEQ ID NO28或SEQ ID NO30的序列，或(iii)一條核酸分子，其在嚴格條件下能與上述兩核酸分子任何一條雜交。還提供了一種分離或純化的核酸分子，編碼包含一個或多個插入、缺失和/或取代的修飾的E3pPDH亞基，及其包含至少約20個核苷酸的連續片段。理想的，該修飾的E3pPDH亞基與對應的未修飾E3pPDH(例如包含SEQ ID NO28或SEQ ID NO30的)亞基功能相同。優選的，植物pPDH的該修飾的E3pPDH亞基和剩余的pPDH的未修飾亞基一起，與對應的未修飾pPDH功能相同。優選的，如用標記的丙酮酸體外試驗測定的那樣，該修飾的pPDH將以對應的(包含SEQ ID NO28或SEQ ID NO30等的E3亞基的)未修飾pPDH的至少約50％，更優選的至少約75％，和最優選的至少約90％，把丙酮酸轉化成乙酰輔酶A。
另一種分離或純化的核酸分子編碼植物ACL的A亞基(ACL-A)，例如從擬南芥分離得的，及其包含至少約20個核苷酸的連續片段。優選的，該編碼ACL-A的核苷酸是(i)DNA，并包含SEQ ID NO7或編碼SEQ ID NO8的序列，(ii)RNA，并包含由SEQ ID NO7的序列，或編碼SEQ ID NO8的序列，或(iii)一條核酸分子，其在嚴格條件下與上述兩核酸任何一條雜交。還提供了一條分離或純化的核酸分子，編碼包含一個或多個插入、缺失和/或取代的植物ACL的修飾的A亞基，及其包含至少約20個核苷酸的連續片段。理想的，該修飾的ACL-A亞基與對應的未修飾ACL-A(例如包含SEQ ID NO8的)的功能相同。優選的，如用標記的檸檬酸體外試驗測定的那樣，該修飾的ACL將以對應的(包含SEQ ID NO8的A亞基的)未修飾ACL的至少約50％，更優選的至少約75％，和最優選的至少約90％，把檸檬酸轉化成乙酰輔酶A。
在此，本發明還提供了一種分離或純化的核酸分子編碼植物ACL的B亞基(ACL-B)，例如從擬南芥分離得的，及其包含至少約20個核苷酸的連續片段。優選的，該編碼ACL-B的核酸分子是(i)DNA，并包含SEQ ID NO9(ACL-B1)或SEQ ID NO11(ACL-B2)或編碼SEQ ID NO10或SEQ ID NO12的序列，(ii)RNA，并包含由SEQ ID NO9或SEQ ID NO11編碼的序列，或編碼SEQ IDNO10或SEQ ID NO12的序列，或(iii)一條核酸分子，其在嚴格條件下與上述兩核酸任何一條雜交。還提供了一種分離或純化的核酸分子，編碼包含一個或多個插入、缺失和/或取代的植物ACL的修飾的B亞基，及其包含至少約20個核苷酸的連續片段。理想的，該修飾的ACL-B亞基與對應的未修飾ACL-B(例如包含SEQ ID NO10或SEQ ID NO12的)的功能相同。優選的，如用標記的檸檬酸體外試驗測定的那樣，該修飾的ACL將以對應的(包含SEQ IDNO10或SEQ ID NO12的B亞基的)未修飾ACL的至少約50％，更優選的至少約75％，和最優選的至少約90％，把檸檬酸轉化成乙酰輔酶A。
ACL也由擬南芥中的小基因家族編碼。編碼擬南芥ACL-A的cDNA編碼了一個45kDa蛋白，而編碼擬南芥ACL-B的cDNA編碼了一個70kDa蛋白。ACL-A由至少兩個擬南芥中稱為ACL-A1和ACL-A2的基因編碼。ACL-B由至少兩個擬南芥中稱為ACL-B1和ACL-B2的基因編碼。擬南芥的ACL與人和大鼠的有50％相似性。
本發明還提供了一種分離和純化的核酸分子，包含SEQ ID NO15或SEQ IDNO17的核苷酸序列，或編碼SEQ ID NO16或SEQ ID NO18的氨基酸序列。
類似的，一種分離和純化的核酸分子，包含SEQ ID NO21的核苷酸序列，或編碼SEQ ID NO22的氨基酸序列，及上述兩核酸分子之一的各含有至少約20個核苷酸的連續片段，或能與前述核苷酸之一在嚴格條件下雜交的核酸分子。
本發明還提供了另一種分離或純化的核酸分子，編碼植物ACH。這樣的核酸分子，包括其長度至少約20個核苷酸的連續片段，可根據實施例9從植物中分離出來。
根據上文，本領域普通技術人員知道如何在給定的核酸分子中產生插入、缺失和/或取代。還根據上文，“與…功能相同”指修飾酶具有未修飾酶的酶活性特征。換言之，它作用于同一底物并產生同一產物。然而修飾的酶根據本發明的需要，可比未修飾酶活性大或小。
可從任何植物來源分離得到編碼ACS、pPDH和ACL的核酸分子。合適的植物來源包括但不限于擬南芥、紫花苜蓿(soybean alfalfa)、玉米、小麥、高粱、大麥、稻、燕麥、黑麥、大豆、油菜籽、canola、棉花、紅花、花生、棕櫚、高粱、向日葵、甜菜、各種蔬菜和水果作物，如黃瓜、番茄、辣椒等。
對于上述分離或純化的核酸分子，優選一個和多個取代不導致酶的氨基酸改變。另外和優選的是一個或多個取代導致一個氨基酸被另一個大小、形狀和電荷接近相等的氨基酸所取代。
還對于上述分離和純化的核酸分子，一個“至少約20個氨基酸的該分離或純化的核酸分子的連續片段，其中可被鑒定成衍生自”某給定核酸分子的該片段是一個編碼一氨基酸分子的連續片段，該氨基酸分子執行了對應的完整氨基酸分子相同的功能。例如，一個編碼植物ACS的分離和純化的核酸分子的片段，可以是編碼ACS的核酸分子的連續片段，其編碼能在ATP和CoASH存在下將乙酸轉化成乙酰輔酶A的氨基酸分子，但不需要是對應的完整氨基酸分子。
對上述分離或純化的核酸分子也可以作“序列相同性百分數”特性分析。對此，將上述某給定的核酸分子與編碼對應基因的核酸分子(即參照序列)通過將核酸序列在比較窗口上最佳排列來比較，其中對于兩條序列的最佳排列，在比較窗口內的多核苷酸序列部分可包含(如與不包含添加或缺失的參照序列作比較)添加或缺失(即缺口)。確定兩條序列中相同核酸堿基的位置數，即匹配的位置數，除以比較窗中總位置數，結果乘以100，來計算得到序列相同性百分數。可通過計算機化實施已知算法(如Wisconsin遺傳學軟件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，遺傳學計算機組(GCG)，575Science Dr.，Madison，WI，或從生物技術信息國家中心可得到的BlastN和BlastX，Bethesda，MD)，或通過觀察來進行用于比較的最佳序列排列。序列一般采用BESTFIT或BlastN用默認參數進行比較。
“基本序列相同性”指某給定核酸分子至少75％，優選80％，和更優選的至少90％，和最優選的至少95％與某給定參照序列是相同的。通常，考慮兩條多肽是基本相同的條件是，如果多肽的至少40％、優選至少60％、更優選至少90％，和最優選至少95％氨基酸是相同的，或代表某給定參照序列的氨基酸的保守性替換。
另一個多肽序列基本相同的指標是，如果兩個分子能在嚴格條件下彼此選擇性雜交。詞組“與…選擇性雜交”指當異源DNA和/或RNA的制備物中存在靶序列時，某單鏈核酸探針與某單鏈靶DNA或互補序列的RNA序列選擇性結合。嚴格條件是序列依賴性的，而且在不同環境下是不同的。一般嚴格條件選自在限定離子強度和pH下，比特異性序列的熱解鏈溫度(Tm)低20℃。Tm是(在限定離子強度和pH下)50％靶序列與完全匹配的探針雜交的溫度。
根據上文，“嚴格條件”優選允許從約25％-5％錯配，更優選從15％-5％錯配，和最優選從約10％-5％錯配。“在最不適度的嚴格條件下”優選允許約40％-15％錯配，更優選約30％-15％錯配，和最優選的約20％-15％錯配。“低嚴格條件”優選允許約60％-35％錯配，更優選約50％-35％錯配，和最優選約40％-35％錯配。對于前面的錯配范圍，解鏈溫度每降低1℃，相應有1％錯配。
然而本領域技術人員將會理解，由于基因密碼子的簡并性，兩條多核苷酸序列在核酸水平可以是基本不同的，但可編碼基本相似(如不相同)的氨基酸序列。本發明將包含這樣的多核苷酸序列。
關于本發明的方法，可全部或部分(即，作為片段)使用上述核酸分子，以及下文所述的其它核酸分子，用本領域已知的常規方法來鑒定和分離其它植物和非植物(如酵母和細菌)的對應基因，用于本發明方法中。例如，可根據本領域熟知方法將這些分子或其片段用于染色體步行(walking)、基因組扣除，其中需要得到含有靶基因缺失的細胞株(Strauss和Ausubel，PNAS USA871889-1893(1990)；和Sun等，植物細胞4119-128(1992))，轉位子(Chuck等，植物細胞5371-378(1993)；Dean等，植物雜志269-81(1992)；Grevelding等，PNAS USA 8996085-6089(1992)；Swinburne等，植物細胞4583-595(1992)；Fedoroff和Smith，植物雜志3273-289(1993)；和Tsay等，科學260342-344(1993))和T-DNA標記(Feldmann，植物雜志171-82(1991)；Feldmann等，科學2431351-1354(1989)；Herman等，植物細胞111051-1055(1989)；Konz等，EMBO J 91337-346(1989)；和Kieber等，細胞72427-441(1993))，和異源探針選擇技術中。雖然T-DNA標記、染色體步行或異源探針選擇可鑒定推測含有感興趣基因的DNA片段，但必須通過基因互補或其它方法確認該DNA片段。
在另一個實施例中，本發明還提供了一個載體，包含如上所述的核酸分子。可將如上所述的核酸分子克隆入任何合適的載體，用于轉化或轉染任何合適宿主。載體的選擇和構建它們的方法是本領域技術人員公知的，而且在一般技術文獻中(一般見，“重組DNA部分D”酶學方法，153卷，Wu和Grossman編，Academic Press(1987))。理想的，該載體包含調控序列，例如轉錄和翻譯起始和終止密碼子，它們對要引入載體的宿主類型(例如，細菌、真菌、植物或動物)是特異的，同時要考慮該載體是DNA還是RNA是合適的。優選的，該載體包含對宿主的屬是特異性的調控序列。最優選的，該載體包含對宿主的種是特異性的調控序列。
可制備環狀或線狀的載體構建物，以含有如上所述的完整核酸序列或其一部分，連接于在原核或真核宿主細胞中能發揮功能的復制系統。復制系統可衍生自ColE1、2mμ質體、λ、SV40、牛乳頭瘤病毒等。
除了復制系統和插入的核酸，該構建物可包含一個或多個標記基因，其允許選擇轉化或轉染的宿主。標記基因包括殺菌劑抗性，如對抗生素、重金屬等的抗性，營養缺陷型宿主中的互補，來提供原養型等。
合適的載體包括那些設計成用于增殖和擴增，或用于表達，或兩者的載體。一種優選的克隆載體選自pUC系列，pBluescript系列(Stratagene，Lajolla，CA)，pET系列(Novagen，Madison，WI)，pGEX系列(Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)，和pEX系列(Clonetech，Palo Alto，CA)。也可使用噬菌體載體，如λGT10、λGT11、λZapII(Stratagene)、λEMBL4和λNM1149。植物表達載體的例子包括pBI101、pBI101.2、pBI101.3、pBI121和pBIN19(Clonetech，Palo Alto，CA)。動物表達載體的例子包括pEUK-C1、pMAM和pMAMneo(Clonetech)。
植物表達載體可包含一種天然或非天然啟動子，它可操作性連接于編碼如上所述的ACS、pPDH或ACL的核酸分子。啟動子的選擇，如強、弱、可誘導、組織特異性和發育特異性在本領域技術人員所知的范圍內。相似的，如上所述核酸分子與啟動子的結合也在本領域技術人員所知的范圍內。
表達載體還可任選的在啟動子和編碼序列之間包含一轉運肽序列。對于那些在線粒體或質體中正常表達的基因，優選分別包含線粒體或質體轉運肽的表達載體。已知許多植物基因產物含有轉運肽序列。例如，核酮糖二磷酸羧化酶的小亞基、鐵氧還蛋白、葉綠素a/b結合蛋白等，包含轉運肽序列。這些轉運肽序列可被分離/合成，并用于本發明的表達載體。不管編碼轉運肽的DNA片段來源，它應包含一個翻譯起始密碼子和一條能被宿主植物細胞的細胞器或植物識別，并在其中起作用的氨基酸序列。
本發明不僅提供了包含上述核酸分子的載體，還提供了一種載體，包含或編碼一條與切割RNA分子的核酶雜交的反義序列，所述RNA分子編碼植物質體乙酰輔酶A合成酶、植物質體丙酮酸脫氫酶的E1α亞基，植物質體脫氫酶的E1β亞基、植物質體丙酮酸脫氫酶的E2亞基、植物質體丙酮酸脫氫酶的E3亞基、植物ATP-檸檬酸裂合酶的A亞基、植物ATP-檸檬酸裂合酶的B亞基、植物丙酮酸脫羧酶、植物乙酰輔酶A水解酶、植物線粒體丙酮酸脫氫酶和植物醛脫氫酶。本發明還提供反義分子(其優選長度至少約20個核苷酸)和核酶，其優選包含至少約20個與該核酶活性部位兩側的靶序列互補的連續核苷酸。
根據上文，本發明提供了一種包含上述載體的宿主細胞。另外，本發明提供了由包含上述載體的宿主細胞產生的多肽。
合適的宿主包括大腸桿菌、芽胞桿菌、銅綠假單胞菌、釀酒酵母和黑曲霉。大腸桿菌，特別是大腸桿菌TB-1、TG-2、DH5α、XL-Blue MRF’(Stratagene)、SA2821和Y1090是優選的宿主。更優選的宿主是XL-Blue MRF’或TG02。
除上述外，本發明還提供了對ACS、pPDHE1α和E1β、和ACL A和B的多克隆抗體。這些多克隆抗體可根據實施例2、4和6或其它本領域已知的其它方法產生。
在另一個實施例中，本發明提供了一種改變植物細胞、植物組織、植物器官或植物中酶水平的方法。該方法包括使植物細胞、植物組織、植物器官或植物與包含核酸分子的載體接觸，該核酸分子選自(i)一種基因，其編碼以下的酶，或如果這些酶由亞基構成，則編碼酶的亞基，這些酶選自質體乙酰輔酶A合成酶、質體丙酮酸脫氫酶、ATP-檸檬酸裂合酶、丙酮酸脫羧酶、乙酰輔酶A水解酶、線粒體丙酮酸脫氫酶和醛脫氫酶的酶亞基，(ii)一條核酸分子，包含或編碼從(i)的基因轉錄而得的RNA分子的反義分子，和(iii)一條核酸分子，它包含針對從(i)的基因轉錄而得的RNA分子的核酶。包含(i)核酸分子的載體能提高植物細胞、植物組織、植物器官或植物中的酶水平，而包含(ii)或(iii)核酸分子的該載體能降低植物細胞、植物組織、植物器官或植物中的酶水平。優選的，酶的改變導致植物細胞、植物組織、植物器官或植物中乙酰輔酶A水平的改變。因此，本發明還提供了一種植物細胞、植物組織、植物器官和植物，其中乙酰輔酶A的水平已按照該方法被改變。
優選，本發明方法中所用的核酸分子是上述或下述核酸之一。對此，對應于上述植物核酸分子但分離自動物、細菌或酵母源的核酸分子，可用于本發明的方法，來提高植物細胞、植物組織、植物器官和植物中的酶水平，如果在動物、細菌或酵母基因組序列含有可能在植物中不被正確加工的內含子的情況下使用cDNA序列。另外，改變cDNA序列，使其含有在植物物種中比在動物、細菌或酵母中優選的密碼子序列可能是必須的。然而，對于在本發明方法中使用的反義或核酶序列的范圍而言，使用分離自與其中酶水平待改變的植物細胞、植物組織、植物器官和植物的同一來源植物的核酸分子是有好處的。
可根據本領域已知方法獲得用于本發明方法的編碼PDC的分離或純化的核酸分子。一條編碼玉米PDC1的cDNA克隆可從GenBank以登錄號X177555(基因組DNA X59546)得到。玉米的PDC-22的部分克隆Z21721和L11312和PDC-3的部分克隆Z21722和L11313也可從GenBank得到。本文圖7-9B列出的SEQ IDNOS15-18提供了擬南芥PDC-1和PDC-2的cDNA和推導的氨基酸序列。另外，可使用編碼已被一個或多個插入、缺失和/或取代修飾的PDC(其中編碼的PDC與未修飾的PDC功能相同)的分離或純化的核酸分子。優選的，如用標記丙酮酸體外試驗測定的那樣，該修飾的PDC將以未修飾PDC的至少約50％，更優選的至少約75％，和最優選的至少約90％，把丙酮酸轉化成乙醛。
可根據本領域已知方法獲得用于本發明方法的編碼pPDH的E2亞基的分離或純化的核酸分子。一條編碼E2 pPDH的cDNA克隆可從Mooney等，Biochemistry Department，University of Missouri(Mooney等，植物生理學120443-451(1999))得到。另外，可使用編碼已被一個或多個插入、缺失和/或取代修飾的E2pPDH亞基(其中編碼的pPDH的E2亞基與未修飾的pPDH的E2亞基功能相同)的分離或純化的核酸分子。優選的，如用標記丙酮酸體外試驗測定的那樣，包含pPDH修飾的E2亞基的pPDHPDC將以包含未修飾的E2亞基的pPDH的至少約50％，更優選的至少約75％，和最優選的至少約90％，把丙酮酸轉化成乙醛輔酶A。
可根據本領域已知方法從植物中分離用于本發明方法中使用釀酒酵母ACH基因(Genbank登錄號M31036；Lee等，生物化學雜志2657413-7418(1990))的分離或純化的編碼ACH的核酸分子。例如，現存釀酒酵母突變子(Lee等，生物化學生物物理學學報1297(1)105-109(1996)；和Minet等，植物雜志2417-422(1992))可能與質體(其可在酵母中復制和表達這些基因)中表達擬南芥cDNA的文庫互補(見例如Wang等，植物分子生物學311093-1104(1996))。選出能與該酵母突變體互補，并恢復野生型生長能力的克隆。另外，可通過純化ACH至均一，并獲得部分N-末端序列分析來獲得一克隆。然后將該序列分析反向翻譯成DNA序列。然后用該DNA序列篩選擬南芥cDNA文庫，尋找含有ACH的cDNA的克隆。
可根據本領域已知方法獲得用于本發明方法的編碼mtPDH的分離或純化的核酸分子。mtPDH包含4個亞基。在Luethy等，基因164(2)251-254(1995)中描述了編碼擬南芥mtPDH的E1α亞基的cDNA克隆。該cDNA克隆包含1435個堿基對，其中有一個1167個堿基對的開放閱讀框，編碼一條含389個氨基酸的43.0kD的多肽(pI7.1)。擬南芥的E1α亞基和其它真核序列在氨基酸水平上有47-51％的相同性。在Luethy等，生物化學生物物理學學報1187(1)95-98(1994)中描述了編碼擬南芥mtPDH的E1β亞基的cDNA克隆。該cDNA克隆包含1320個堿基對，其中有一個1089個堿基對的開放閱讀框編碼分子量為39，190Da，等電點4.9的363個氨基酸的一個多肽。在其氨基端存在29個氨基酸的推定的線粒體尋靶序列。在Guan等，生物化學雜志270(10)5412-5417(1995)中描述了編碼擬南芥mtPDH的E2亞基(二氫硫辛酰胺乙酰轉移酶)的cDNA。該cDNA克隆是2.2kb。可在本發明方法中使用這些序列。
另外，一條分離或純化的核酸分子，它編碼mtPDH的E1α、E1β或E2亞基(其分別與Luethy等的mtPDH的E1α或E1β亞基，或Guan等的mtPDH的E2亞基有一個或多個插入、缺失和/或取代的差異)，其中修飾的E1α、E1β或E2亞基，和其它未修飾的Leuthy等或Guan等的mtPDH亞基一起，與未修飾的mtPDH功能相同。優選的，如存在標記的丙酮酸體外試驗所測定的那樣，該修飾的亞基與其它未修飾亞基一起，將以包含Leuthy等和Guan等公開的亞基的未修飾mtPDH的至少約70％，優選至少75％，更優選的至少約85％，和最優選的至少約90％，把丙酮酸轉化成乙酰輔酶A。
可根據美國專利號5,684,242(‘242專利)的方法獲得用于本發明方法的，編碼ALDH的分離或純化的核酸分子。‘242專利公開了如SEQ ID NO1的ALDH的核酸序列，和如SEQ ID NO2的對應氨基酸序列。本文提供了如圖10A-13的SEQ ID NOS19-26的擬南芥ALDH-1、ALDH-2、ALDH-3和ALDH-4的cDNA和推導的氨基酸序列。另外，可使用本文列出的一種分離或純化的核酸分子，其編碼與‘242專利的ALDH或本文列出的擬南芥ALDH序列不同的有一個或多個插入、缺失和/或取代的ALDH，其中編碼的ALDH與前述ALDH功能相同。優選的，如存在標記的乙醛體外試驗所測定的那樣，該修飾的ALDH將以未修飾的ALDH的至少約70％，優選至少75％，更優選的至少約85％，和最優選的至少約90％，把乙醛轉化成乙酸。
用于本發明方法的優選載體確定了如上的特征。類似的包含編碼如上所述PDC、E2pPDH、ACH、ALDH或mtPDH的核酸的載體也是優選的。可將這些載體用任何合適方法引入植物。例如，可用載體轉化組織培養物中的細胞。該方法特別對類似玉米的植物是有用的。另一方面，優選用膿桿菌介導的浸潤方法轉化擬南芥(見例如Chang等，植物雜志5(4)551-558(1994)；Katavic等，分子通用遺傳學245(3)363-370(1994)；和http//www.bio.net80/hypermail/ARABIDOPSIS/9707/0015.html)。
如果需要提高某種給定基因的表達，優選通過引入一種基因，其編碼以下的酶，或如果該酶由亞基構成，則編碼酶的亞基，這些酶選自質體乙酰輔酶A合成酶、質體丙酮酸脫氫酶、ATP-檸檬酸裂合酶、醛脫氫酶、線粒體丙酮酸脫氫酶、丙酮酸脫羧酶和乙酰輔酶A水解酶。優選將該基因通過一載體方法引入。優選將該基因的多個額外拷貝引入植物細胞、植物組織、植物器官或植物，或將包含一個強啟動子、如CaMV35S啟動子的載體引入植物細胞、植物組織、植物器官或植物，使基因以更高的速率表達，從而產生更多mRNA，其被翻譯成更多編碼的酶。理想的，含有亞基的酶的表達是通過提高所有亞基的表達來提高的。包含亞基的酶的表達可因減少單個亞基的表達而減少。
對此，如果需要在給定組織中表達，可在載體中使用組織特異性啟動子。組織特異性啟動子和增強子的例子包括Guerineau，分子生物學方法491-32(1995)；Meisel等，Gent.Eng.19183-199(1997)；和Edwards等，遺傳學年度綜述24275-303(1990)描述的那些。類似的，可在載體中使用器官特異性的啟動子。還可使用發育特異性啟動子和可誘導啟動子，例如Grunder等，歐洲生物化學雜志220(1)247-255(1994)；Caddick等，國家生物技術16(2)177-180(1998)；Moore等，PNAS USA95(1)376-381(1998)；和Mett等，PNASUSA90(10)4567-4571(1993)所描述的那些。蘋果酸合成酶和異檸檬酸裂合酶植物啟動子是發育特異性啟動子的例子。Napin、云扁豆蛋白、油質蛋白、大豆球蛋白、十字花科球蛋白(cruciferin)和β-共大豆球蛋白(betaconglycinin)是種子儲藏蛋白啟動子的例子。可用于需要在宿主植物達到成熟后表達某給定基因的情況中的可誘導啟動子包括溫度敏感型調控元件，熱休克啟動子，壓力應答啟動子和可化學誘導的啟動子。
如果需要減少某給定基因的表達，優選通過引入一核酸分子，該分子包含(就RNA載體而言)或編碼(就DNA載體而言)一個上述基因轉錄的RNA分子的反義核酸分子，或一條核酸分子，它包含對上述基因轉錄的RNA分子的核酶(見例如，Senior，Biotech.Genet.Eng.Rev1579-119(1998)；Bird等，Biotech.Genet.Eng.Rev9207-227(1991)；Matzke等，遺傳學趨勢11(1)1-3(1995)；Baulcombe，植物分子生物學32(1-2)79-88(1996)；Castanatto等，Crit.Rev.Eukaryot.Gene Exp.2(4)331-357(1992)；和Rossi，生物技術趨勢13(8)301-306(1995))。在反義技術中，可將來自所需植物基因的核酸區段克隆并可操作性的與啟動子序列連接，從而可轉錄RNA的反義鏈。例如，可將CaMV的35S啟動子與編碼某給定酶的cDNA融合，但是與正常的朝向相反。
在反義抑制中引入的核酸序列一般是與內源基因或要抑制的基因至少一部分基本相同，優選至少約20個連續的核苷酸相同，但不必完全相同。因此，可設計該載體，使抑制效應作用于顯示與靶基因同源或基本同源的基因家族中的其它蛋白質。引入的序列相對于初級轉錄產物或完全加工的mRNA也不需要是全長的。對較短序列的使用一般可用更高的同源性來補償。另外，引入的序列不必具有相同的內含子或外顯子模式，而且非編碼區段的同源性將同樣有效。
然后，使植物細胞、植物組織、植物器官或植物和該構建物接觸，產生RNA的反義鏈。在植物細胞中，已顯示反義RNA抑制了基因表達(見例如，Sheehy等，PNAS USA 858805-8809(1988)；和Hiatt等，美國專利號4,801,340)。可將得到的重組基因用農桿菌介導的轉化轉化入擬南芥。可在轉化植物中，采用測量某給定酶的存在和/或活性的標準方法，確認對給定基因表達的抑制。對此，指出一些植物如擬南芥含有兩種基因(即“共生同源基因”)編碼一給定酶，如ACL、PDC和ALDH是重要的。在這些情況下，理想的是用反義RNA減少給定基因的表達，因為共生同源基因產生序列幾乎相同的mRNA(如ACL、PDC和ALDHmRNA的情況)，而且一個反義RNA分子就能降低，甚至封閉兩種共生同源基因的表達，這取決于所用的反義分子。
已報道核酶能用作抑制內源植物基因表達的工具。可以設計核酶，其能特異性與靶RNA實質配對，并在特定位置切開磷酸二酯骨架，從而從功能上滅活靶RNA。在進行該切割時，核酶本身不改變，因此能回收并切割其它分子，使其成為一真正的酶。在反義RNA中包含核酶序列賦予它們RNA切割活性，從而提高構建物的活性。在Haseloff等，自然334585-591(1988)中描述了靶RNA特異性核酶的設計和使用。優選的，核酶含有至少約20個連續核苷酸。
用于使植物細胞、植物組織、植物器官或植物與載體接觸，從而使載體被單獨或作為植物組織、植物器官或植物的一部分被植物細胞攝取，并在其中表達的技術是本領域已知的。這樣的方法涉及例如植物組織培養技術。本文中“接觸”指，使細胞、組織、器官或植物與載體接觸，其方式使載體能進入細胞，并在其中表達。
植物細胞、植物組織、植物器官或植物可以任何合適方法與載體接觸，包括直接轉化，如聚乙二醇沉淀(Paszkowski等，EMBO J32717-2722(1984))，細胞轟擊，即，使DNA附著于金屬顆粒，將它們轟入穿過植物細胞壁(Fromm等，生物/技術8833-839(1990)；Gordon-Kamm等，植物細胞2603-618(1990)；和Klein等，自然32770-73(1987))。外源DNA可通過將核酸(編碼與乙酰輔酶A產生有關的基因)插入農桿菌的Ti質體，引入雙子葉植物細胞中，并加入合適組分來促進轉化(Horsch等，科學223496-498(1984)；Fraley等，PNAS USA 804803(1983)；和DeBlock等，EMBO J31681-1689(1984))。將外源DNA引入植物和/或其組成細胞的亞組中的其它技術也是可行的，包括電穿孔(Fromm等，PNAS USA 825824(1995)，顯微注射，原生質體介導的基因轉移，和碳化硅晶體—介導的基因轉移。在基因工程新聞14(4)1，3和24頁討論了這些不同技術，而且是本領域已知的。見例如Weising等，遺傳學年度綜述22421-477(1988))。
可培養由上述轉化技術衍生而來的轉化植物細胞，產生完整植物，其擁有所要的轉化表型。在Evans等，原生質體分離和培養，植物細胞培養手冊，MacMillan Publishing Co.，New York，pp.124-176(1983)；和Binding，植物再生，植物原生質體，CRC Press，Boca Raton，pp.21-73(1985)中描述了從培養的原生質體中再生植物。也可以從植物胼胝體、外植體、其器官或部分獲得再生植物。一般在Klee等，植物生理學年度綜述38467-486(1987)中描述了這樣的再生技術。
本領域普通技術人員將理解，在表達盒被穩定摻入轉基因植物并被確認可操作后，可通過性交將其引入其它植物。可采用多種標準繁殖技術的一種，視要交配的物種而定。
另一種降低乙酰輔酶A水平的方法是共抑制。見例如，Que等，發育遺傳學22(1)100-109(1998)和Smyth，現有生物學7(12)R793-R795(1997)。
另外，可用本領域熟知的反相遺傳學系統來產生和分離下調的或無能的突變體。一種這樣的系統，玉米的Trait Utility Sysytem，(TUSC)是基于其它生物體的成功系統(Ballinger等，PNAS USA869402-9406(1989)；Kaiser等，PNAS USA 871686-1690(1990)；和Rushforth等，分子細胞生物學13902-910(1993))。該系統的中心特征是鑒定感興趣的DNA序列中Mu轉座子插入物，來預測至少這些插入等位基因中的一些將是突變子。為了在玉米中發展該系統，從大量突變體轉座子原種中收集DNA，然后將其自授粉增殖，來產生F2子代。為了找到特定的DNA序列中的Mu轉座子插入物，通過PCR，用基因特異性引物和與Mu轉座子反向重復序列退火的引物，來篩選收集的DNA樣品。預計僅在模板DNA來自在靶基因內含有Mu轉座子插入物的植物，才會產生PCR產物。一旦鑒定到這種DNA樣品，篩選對應植物的F2子代的轉座子插入物等位基因。通過TUSC程序(Bensen等，植物細胞775-84(1995))已獲得了an1基因的轉座子插入突變。該系統可用于其它植物物種，有時可根據本領域技術人員的知識和技術，按需修改。
可用T-DNA插入誘變在上述基因之一中產生插入突變，從而對給定基因的表達起反作用。理論上，為了在任何給定基因中95％可能得到插入，需要約100,000個獨立的T-DNA插入物(McKinnet，植物雜志8(4)613-622(1995)；和Forsthoefel等，Aust.J.Plant Physiol.19353-366(1992))。現在，有12,000個這樣的T-DNA標記的種系已是公眾可得的(http//aims.cps.msu.edu/aims)。其它T-DNA標記的植物種系正在產生，和制作可以得到。對此，Monsanto(St.Louis，MO)最近收集了T-DNA標記種系，報道它們含有90,000-150,000T-DNA插入物。T-DNA標記的植物種系可用PCR篩選。例如，對于T-DNA的一端可設計一種引物，對于感興趣的基因可設計另一種引物，可將兩種引物用于PCR。如果未獲得PCR產物，那么在感興趣基因中沒有插入物。相反，如果獲得了PCR產物，那么在感興趣的基因中有插入物。然而，插入突變常常產生無能等位基因，其可能是致死的。另外，如果有一種以上的基因編碼一種給定酶，那么這些基因之一的突變將不會導致該基因編碼的酶表達減少。
另一種減少給定基因表達的方法是使用抑制上述基因之一的表達，或抑制上述基因之一編碼的酶活性的化合物。例如，已知葡萄糖抑制PDC。
除以上所述，可用基因置換技術來增加或減少給定基因的表達。基因置換技術是基于同源重組(見，Schnable等，植物生物學的現有觀點1123(1998))。可通過誘變(例如插入、缺失、重復或置換)操縱感興趣的酶的核酸，來增強或減弱酶功能。可將改變的序列引入基因組，通過同源重組替換存在的(如野生型)基因(Puchta和Hohn，植物科學趨勢1340(1996)；Kempin等，自然389802(1997))。
還除以上所述外，可用細胞器重新靶向(re-targeting)來增加或減少與乙酰輔酶A產生有關的給定基因的表達。例如，可通過除去上述基因之一的細胞器靶向序列，并用新的細胞器靶向序列置換，來改變該基因(見例如，Roesler等，植物生理學113(1)75-81(1997)，以將細胞質酶重新靶向于質體；Moloney等，Biotechnol.Genet.Eng.Rev 14321-336(1997)；deCatro Silva等，植物分子生物學30(4)769-780(1996)；和Cline等，細胞發育生物學年度綜述121-26(1996))。然后將該改變的序列通過標準轉化程序引入植物基因組。
可用標記底物體外測量給定酶的活性。可通過培育整個葉綠體、葉綠體抽提物或葉抽提物和標記乙酸、輔酶A、ATP和Mg，以及將等份的反應混合物轉移到Whatman No.1DE81濾紙片上，如Roughan等，分析生物化學21677-82(1994)所述，體外快速方便的測定ACS活性。然后洗滌濾紙片，除去未反應的乙酸。用閃爍計數測定與紙定量結合的乙酰輔酶A。如需要，可進一步如Zeiher等，植物生理學96382-389(1991)所述純化ACS，用于體外試驗。
根據上述方法減弱pPDH預期將導致質體乙酰輔酶A庫的減少，預計其反過來影響脂肪酸的從頭生物合成，即18碳脂肪酸的合成。由于植物油聚集的減少，這將最易于觀察。
預期細胞質ACL的減少將導致乙酰輔酶A庫的減少，預計其反過來影響長鏈脂肪酸和類黃酮的生物合成。由于植物膜顏色的變淡(由于減少的類黃酮)，植物地面部分的角質層沉積減少，和植物油中20-和22-碳脂肪酸的減少(由于18-碳脂肪酸延伸的減少)這最易于觀察。
預期減少PDC、ALDH和/或ACS將影響輔酶A庫。已知ALDH減少會影響植物花粉發育(見美國專利號5,684,242)。
通過對產生乙酰輔酶A的基因表達的作用測定和體內產生的乙酰輔酶A庫的測定，可確定某產生乙酰輔酶A的途徑是否影響另一產生乙酰輔酶A的途徑。例如，使用一種轉基因植物，可確定某產生乙酰輔酶A的酶的減少是否會引起其它基因表達的補償性變化。由于顯微陣列芯片技術已建立并可得到(DeRisi等，科學278680-686(1997))，可測定某基因改變對擬南芥所有克隆基因的表達的影響。可進行代謝法放射示蹤研究來測量體內不同乙酰輔酶A庫的產生。在這些研究中，向完整組織提供放射性標記的前體，當該前體被代謝時，監測放射性標記。通過比較野生型植物和產生乙酰輔酶A的酶之一活性減弱的植物，可確定不同乙酰輔酶A庫的來源以及某給定的產生乙酰輔酶A的酶減少的影響。
除了用于對植物中乙酰輔酶A產生，包括對乙酰輔酶A產生所需酶編碼基因表達的空間和時間模式的研究外，上述方法也可用于產生植物，來產生乙酰輔酶A衍生的植物化學物質。該方法可用于改變植物(包括野生型和突變型植物，如紫花苜蓿、玉米、小麥、高粱、大麥、稻、燕麥、黑麥、大豆、油菜、canola、棉花、紅花、花生、棕櫚、向日葵、甜菜和各種蔬菜和水果作物，例如黃瓜、番茄、辣椒等)中的乙酰輔酶A水平。“改變”是指某給定植物(或植物細胞、組織或器官)中乙酰輔酶A水平與類似植物(其乙酰輔酶A水平未因實施本發明方法而改變)比較，由于實施了本發明方法而不同。
根據上述方法，本發明還提供了細菌、酵母、動物，包括細胞、組織或器官、或植物，包括其細胞、組織或器官，其中酶水平已根據上述方法改變。優選本發明方法用于產生植物細胞、植物組織、植物器官或植物。可培養植物細胞，將其作為植物組織細胞保存，或可在培養基中加入某些本領域已知的植物激素，從而導致植物組織培養細胞分化，形成新的植物品種。在實施本發明該方面內容所用的植物培養方法是本領域熟知的。因此。本發明還提供了植物細胞、植物組織、植物器官或植物，其中酶水平已被改變。優選酶水平的改變導致乙酰輔酶A水平的改變。
上述方法可適用于體外產生乙酰輔酶A，其能用于產生乙酰輔酶A植物化學物質。例如，可從合適的宿主制備乙酰輔酶A合成所需的各種酶，并將其與合適的底物，能量來源，輔因子和本領域已知的其它成分一起置于反應容器中，來產生乙酰輔酶A。
實施例本發明將聯系下文實施例作進一步描述。這些例子將進一步說明本發明，但不限制本發明范圍。
實施例1該實施例描述了從擬南芥克隆ACS cDNA，并將其序列與大腸桿菌和釀酒酵母的序列比較。
用大腸桿菌和釀酒酵母ACS基因的推定的氨基酸序列，使用程序BLAST檢索dbEST數據庫(National Library of Medicine，National Istitute ofHealth，Bethesda，Maryland)。鑒定出一個擬南芥(Arabidopsisthaliana)cDNA克隆是可能的ACS基因。該克隆，220J9T7(登錄號N38599)，獲自俄亥俄州立大學的擬南芥生物學研究中心(ARBC)。
制備了該克隆的質體DNA，并由Biotechnology Instrumentation Facilityof Iowa State University測序。對該序列數據的分析發現該克隆(J9)編碼了大約40％的ACSC-末端部分。對dbEST重復檢索未能發現任何更長的克隆序列。
用cRACE(Maruyama等，核酸研究233796-3797(1995))分離了ACS基因的剩余部分。從新鮮植物組織中制備了擬南芥的mRNA。用嵌套ACS特異性引物(基于J9的5’端序列)在兩個順次cDNA合成反應中產生一特異性單鏈、反義cDNA片段，它編碼已知的J9序列ACS DNA5’片段。用RNA連接酶連接并環化該單鏈cDNA，然后進行兩次PCR擴增，使用基于J9序列的嵌套引物對。該過程得到約320bp的DNA片段，它編碼ACS基因的另一部分。將該片段克隆入載體pBS中(Stratagene)，稱為J9E1，并測序。
PCR擴增構建在載體pSPORT(Life Technologies，Grand Island，NY)中的擬南芥cDNA文庫，獲得ACS基因的其余部分。設計并合成兩種與J9E1的5’端雜交的嵌套反義引物。用這些引物和兩種對載體pSPORT特異性的嵌套有義載體引物來依次用PCR擴增ACS cDNA另270bp的片段。該片段被克隆入pBS，給定名稱J9E2，并測序。
類似的，設計并合成了另兩種嵌套反義引物，其與J9E2的5’末端對應。用這些引物和載體引物對cDNA文庫進行依次PCR擴增，得到一個cDNA片段，它編碼ACS基因的剩余部分。將該片段克隆入pBS，稱為J9E3，并測序。
將所有這些來自克隆J9、J9E1、J9E2和J9E3的序列數據排列并壓縮，得到一條DNA序列，它編碼完整擬南芥ACS基因。該序列被提交給GenBank登錄號AF036618。該DNA編碼一個693氨基酸的蛋白質，計算出的分子量76,678道爾頓。
擬南芥ACS的cDNA序列和大腸桿菌ACS的蛋白質序列，以及釀酒酵母ACS兩種同工型蛋白質序列的MACAW排列對比顯示，擬南芥ACS與大腸桿菌ACS有53％相同性，與釀酒酵母的I同工型有37％的相同性，和釀酒酵母ACS的II同工型有40％相同性。
實施例2該實施例描述了對擬南芥ACS的多克隆抗體的產生。
設計了PCR引物，使克隆J9的編碼區能被PCR擴增，作為被限制性位點終止的DNA片段，適合克隆入大腸桿菌蛋白表達質體pMALC-2(New EnglandBiolabs，Beverly，MA)。根據載體供應商提供的說明書構建了表達載體克隆J9-NT1/pMALC-2。當轉錄入大腸桿菌并用異丙基硫代-β-半乳糖苷(IPTG)誘導時，該克隆導致產生一種重組嵌合融合蛋白質，由擬南芥ACS的C-末端部分與大腸桿菌麥芽糖結合蛋白質(MBP)融合而成。從一升轉化大腸桿菌培養物中純化該重組蛋白質，并用New England Biolabs的直鏈淀粉柱根據廠商的方案純化。電泳分析純化蛋白質的純度，定量，并給予BiotechnologyInstrumentation Facility of Iowa State University，在兔中產生多克隆抗體。通過免疫印跡試驗測試兔的免疫前和免疫血清對原始抗原重組蛋白質的特異性和滴度。
實施例3該實施例描述了pPDH的E1α、E1β和E3亞基cDNA的克隆，和比較了編碼E1β亞基的cDNA序列和紅藻pPDH序列和擬南芥mtPDH序列。
使用程序BLAST，用紫菜PDH的E1α和E1β亞基的推定氨基酸序列檢索dbEST數據庫。從Ohio State University的ABRC獲得了經鑒定可能為pPDH的克隆。
擬南芥EST克隆232D14T7(N65567)和232D13T7(N65566)顯示了與紫菜的PDH E1α亞基顯著程度的同源性。兩個克隆含有相同的核苷酸序列，編碼除pPDHE1α亞基頭50-70個氨基酸以外所有的氨基酸。選出克隆232D14T7(D14)用于測序。該克隆的DNA序列包含SEQ ID NO3，而推定的氨基酸序列包含SEQ IDNO4(見圖2和序列表)。
擬南芥EST克隆163C12T7(R2996；E1β-1)和169K3T7(R64987；E1β-1)顯示與紫菜PDH的E1β亞基顯著程度的同源性。這兩個克隆和對應的擬南芥mtPDH相關，但不相同。選出克隆163C12T7(C12)來測序。克隆C12看來編碼pPDH的E1β亞基幾乎所有的編碼區。該克隆的序列包含SEQ ID NO5而推定的氨基酸序列包含SEQ ID NO6(見圖3和序列表)。通過檢索GenBank中擬南芥基因組序列，發現了第二個E1β亞基基因(E1β-2)。仔細分析顯示，數據庫中的基因組序列與E1β-1的cDNA序列是不同的。因此，從擬南芥生物學資源儲藏中心(Ohio State University，Columbus，OH)獲得了所有的cDNA EST克隆，并測序。E1β-1和E1β-2的cDNA序列幾乎相同。
如下分離了編碼擬南芥pPDH的E3亞基的基因。用氰細菌集胞藍細菌(Synechocystis)PCC6803的E3基因搜索擬南芥EST數據庫(Engels等，微生物學1433543-3553(1997))。從擬南芥生物資源儲藏中心獲得了兩個部分cDNA克隆。用該序列作為探針來篩選cDNA文庫。分離了幾乎全長的克隆。體外翻譯并轉錄該基因，來證實該基因是與線粒體相對的質體基因。將翻譯的蛋白質摻入分離的葉綠體中，并加工成成熟形式。
擬南芥E1βpPDH的cDNA序列和紅藻pPDH的蛋白質序列，以及擬南芥mtPDH蛋白質序列的MACAW排列對比顯示，擬南芥pPDH與紅藻pPDH有68％相同性，與擬南芥mtPDH有37％的相同性。
實施例4該實施例描述抗葉綠體PDH的E1α和E1β亞基的多克隆抗體的產生。
設計引物，使實施例3的D14和C12編碼區摻入大腸桿菌表達載體pET24-a中。這兩個表達構建體裝配完成后，將一表達盒(由載體啟動子、C12編碼序列和載體終止子)從C12表達質體上切下，并摻入D14表達質體中，得到能同時表達pPDH兩個亞基的串聯表達質體。在大腸桿菌中作為不溶性包含體表達這些重組pPDH。將這些包含體純化到幾乎均一。將得到的蛋白質送到Biotechnology Instrumentation Facility of Iowa State University，在兔中產生多克隆抗體。通過免疫印跡試驗測試兔的免疫前和免疫血清對原始抗原重組蛋白質的特異性和滴度。
實施例5該實施例描述了克隆擬南芥ACL的A和B亞基的cDNA。
通過擬南芥EST(表達的序列標記)數據庫的序列相似性檢索，鑒定出cDNA克隆pACL-A1和pACL-B1。鑒定了EST cDNA pACL-A1(克隆ID TASG097，GenBank登錄#Z18045)，因為其5’末端序列與人ATP-檸檬酸裂合酶的5’末端序列相似。鑒定了EST cDNA pACL-B1(克隆ID VBVYC01，GenBank登錄#Z33810)，因為其5’末端序列與人ATP-檸檬酸裂合酶近中部的序列相似。從擬南芥生物資源中心(Ohio State University)獲得了這兩個克隆。在Iowa State University DNASequencing Facility，用ABI自動測序儀對兩個克隆的二鏈進行了測序。
用BLAST序列檢索公眾可得的Arabidopsis GenomeInitiative(http//genome-www.stanford.edu/Arabidopsis/agi.html)產生的數據鑒定出ACL-A2序列。ACL-A2是擬南芥基因，其是ACL-A1 cDNA的共生同源基因。即ACL-A2基因編碼與ACL-A1 cDNA編碼的相同蛋白質，但由于這兩條序列5’-和3’-非翻譯區不同的事實，這兩條序列代表ATP-檸檬酸裂合酶基因家族的不同成員。
通過在載體λgt10中用放射性標記的ACL-B1 cDNA如Sambrook等(1989)見上所述，篩選從發育中的擬南芥長角果中分離的聚腺苷酸化RNA制備的擬南芥cDNA文庫，鑒定出ACL-B2序列。簡單說，使約200,000個該文庫的重組噬菌體在有蓋培養皿上生長，并復制到硝基纖維素膜上。將復制子濾膜在雜交溶液(5×SSC，1×Denhardt’s溶液，0.2％(w/v)SDS，10mM EDTA，0.1mg/ml鮭魚精DNA，10％(w/v)葡聚糖硫酸酯，50mM Tris-HCl，pH8.0)中和32P-標記的探針一起65℃培育12小時。雜交后，65℃用2×SSC、0.5％(w/v)SDS、和依次用0.1×SSC和0.1％(w/v)SDS洗滌濾膜。噬斑純化與探針雜交的重組噬斑，將cDNA插入物亞克隆入質體載體pBSK，供測序。得到的序列被稱為ACL-B2，它是全長cDNA克隆，編碼ACL-B亞基，并由ACL-B1的分離基因編碼。ACL-B1和ACL-B2的核苷酸序列有約80％的相同性，并編碼95％以上相同的兩個多肽。
ACL-A1、ACL-A2、ACL-B1和ACL-B2與大鼠和人ACL具有高度的序列相同性。人ACL mRNA長度為4.3kb，編碼1100殘基的蛋白質。ACL-a1 mRNA長度為1.5kb，編碼423殘基的蛋白質，具有與人ACL的N-末端50％的相同性。ACL-A2基因編碼ACL-A1 mRNA的共生同源mRNA；它們各編碼98％以上相同的兩個蛋白質，雖然它們的核苷酸序列僅約80％相同而其5’-和3’-非翻譯區不同。ACL-A2基因包含12個外顯子和13個內含子。部分ACL-B1 cDNA長度為1.03kb，編碼272個殘基的多肽與人ACL的C-末端具有50％的相同性。全長ACL-B1mRNA長度是2.2kb。
推定的ACL-A和ACL-B多肽沒有可識別的靶向序列，如大鼠和人ACL多肽，它們是細胞質多肽。
檢索了許多序列數據庫是否有其它ACL-A和ACL-B多肽的直向同源物。在釀酒酵母整個基因組中，未鑒定到直向同源物，這與該物種中缺少ACL活性相一致，(Kohlhaw和Tan-Wilson，細菌學雜志，1291159-1161(1977))。然而，在粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)中已鑒定到ACL-A和ACL-B的直向同源物。ACL-A的直向同源物是一個基因的克隆，其位于粟酒裂殖酵母的染色體1上，其氨基酸與擬南芥ACL-A有60％以上的相同。粟酒裂殖酵母的ACL-B直向同源物是部分cDNA克隆，其氨基酸序列與擬南芥ACL-B具有60％相同性。兩種粟酒裂殖酵母的直向同源物由于與動物ACL的高度序列相同性，都已被鑒定為ATP檸檬酸裂合酶。
ACL-B和ACL-A mRNA轉錄自兩種不同基因。該結論的證據來自一系列實驗。首先，用Xba I、Sac I、Hin dIII、Eco RI和Bam HI消化擬南芥DNA，并將ACL-A1 cDNA和ACL-B cDNA用作探針進行DNA印跡雜交。擬南芥DNA分別探測兩種cDNA的雜交分析揭示，各cDNA與一組非重疊限制性片段雜交。第二，用pACL-B和pACL-B篩選基于λ的擬南芥基因組文庫，導致分離得到分別與兩種cDNA之一雜交的兩組非重疊基因組克隆。對12個與pACL-A雜交的基因組克隆進行限制性消化和DNA印跡分析使這些克隆進一步被分成兩組，這與基因組DNA印跡得到的，表明ACL-A mRNA是由小基因家族編碼的數據相一致。基于類似分析，將8個pACL-B雜交基因組克隆被亞分類成3組，這與基因組DNA印跡得到的，表明ACL-B mRNA是由小基因家族編碼的數據一致。第三，含有ACL-A基因(ACL-A1)之一的BAC克隆的序列表明，ACL-B基因不在ACL-A1基因的10kb之內。ACL-A1基因位于擬南芥的染色體1上，其基因序列被11個內含子所間斷。
實施例6該實施例描述了抗ACL的A和B亞基的多克隆抗體的產生。
在大腸桿菌中，使用pET30表達載體(Novagen，Madison，WI)表達了ACL-A和ACL-B序列。然后用制備級SDS-PAGE純化表達的蛋白質，并用來免疫兔，得到抗血清。
用這些抗血清來探測擬南芥幼苗抽提物的蛋白質印跡。抗-ACL-A檢測到一條45-kDa的多肽，其與由pACL-A(其編碼423殘基的多肽)序列預測的分子量十分接近。抗-ACL-B抗體檢測到一條約70kDa的多肽，其與根據ACL-BmRNA(2.2kb)的大小推測的十分接近。
實施例7
該實施例描述了如何用編碼釀酒酵母ACH的cDNA從植物中分離mtACH基因。
通過檢索擬南芥EST(表達的序列標記)數據庫(Arabidopsis GenomeInitiative(http//genome-www.stanford.edu/Arabidopsis/agi.html))與酵母ACHcDNA的序列相似性鑒定了編碼植物mtACH的一個cDNA克隆。然后可從ABRC(Ohio State Resource Center)獲得陽性克隆。然后可對該陽性克隆的兩條鏈進行測序，例如通過使用ABI自動測序儀。
鑒于最近從該數據庫鑒定mtACH EST的努力未獲得任何陽性克隆(這可能由于Arabidopsis Genome Initiave僅含有約20％的基因組)，可通過現存釀酒酵母突變物的互補性從擬南芥克隆植物mtACH基因(Lee等(1990)見上)。可用質粒中文庫表達的擬南芥cDNA(該質粒將在酵母中復制和表達那些基因)轉化該突變物(Minet等，植物雜志2417-422(1992))。然后可選擇與酵母突變物互補，并恢復(如野生型)生長能力的克隆。然后可通過PCR拷貝ACH的擬南芥cDNA，并將此DNA片段克隆入pBS用于測序。
另外，可產生對該酵母ACH的抗血清，并用來分離的植物mtACH。然后可完整或部分測定分離的mtACH的氨基酸序列。可用該序列產生核酸探針，來篩選cDNA文庫或基因組文庫，以分離植物mtACH。然后可對植物的mtACH基因進行測序。
如需要，可用針對分離的植物mtACH的抗血清篩選表達mtACH的表達文庫。可在兔中，用大腸桿菌轉基因表達的蛋白質產生抗血清。例如，可將ACH的擬南芥cDNA作為翻譯性融合物克隆入pET24表達載體。然后可將該質粒轉化入大腸桿菌，在其中表達該蛋白質。然后可通過離心和SDS-凝膠電泳純化作為包含體在細菌中積聚的蛋白質。將該蛋白質交給Iowa State University的Biotechnology Instrumentation Facility，在兔中產生多克隆抗體。通過免疫印跡試驗測試兔的免疫前和免疫血清對原始抗原重組蛋白質的特異性和滴度。
實施例8該實施例描述了克隆擬南芥ALDH cDNA。
用rf2基因編碼的，推定的玉米線粒體ALDH氨基酸序列(Cui等，科學27213341336(1996))，使用程序BLAST搜索dbEST數據庫(National Library ofMedicine，National Institute of Health，Bethesda，Maryland)。這使得鑒定了7種擬南芥EST cDNA克隆(GenBank登錄號R83958、Z26417、N96630、T13678、R86795、AA041030、AA395226)，它們獲自Ohio State University的Arabidopsis Research Center(ABRC)，被各自測序。所有7種克隆是部分cDNA。使用這些EST cDNA作為探針，如實施例5中所述篩選擬南芥cDNA文庫。結果分離得到對應于4種基因產物ALDH1、ALDH2、ALDH3、ALDH4的全長cDNA克隆。給出了擬南芥ALDH1(圖12)、ALDH2(圖13)、ALDH3(圖14)、ALDH4(圖15)的核苷酸序列和推定的氨基酸序列。由Arabidopsis Genome Initiative產生的，公眾可得到的數據(http//genome-www.stanford.edu/Arabidopsis/agi.html)，使用ALDH1、ALDH2、ALDH3、ALDH4核苷酸序列進行的BLAST序列檢索，確認了這些cDNA是4種不同基因的產物。這些基因分別存在于擬南芥染色體3，3，1和4上。在這些序列中，ALDH1和ALDH3編碼最相似的兩個蛋白質(它們之間有85％的序列相似性)，而ALDH1和ALDH3之間的相似性較低(66％)，ALDH1和ALDH4之間的相似性甚至更低(40％)。
實施例9該實施例描述了克隆擬南芥PDC cDNA。
用兩種擬南芥PDC基因的核苷酸序列(PDC1，GenBank登錄#U71122、和PDC2，GenBank登錄#U71122)，使用程序BLAST搜索dbEST數據庫(NationalLibrary of Medicine，National Institute of Health，Bethesda，Maryland)。結果鑒定了6種擬南芥EST cDNA克隆，它們獲自Ohio State University的Arabidopsis Research Center(ABRC)，并被測序。所有6種克隆是部分cDNA克隆，其中三種(GenBank登錄#F14476、T04727和F14475)與PDC1基因序列匹配，而另三種(GenBank登錄#N97215、Z35007和AA597828)與PDC2基因序列匹配。使用這些EST cDNA作為探針，如實施例5中所述篩選擬南芥cDNA文庫。這導致分離得到對應于PDC1和PDC2基因的全長cDNA克隆。給出了擬南芥PDC1(圖10)、PDC2(圖11)的核苷酸序列和推定的氨基酸序列。PDC1和PDC2cDNA具有75％序列相同性，它們編碼的蛋白質有82％的序列相同性或87％序列相似性。由Arabidopsis Genome Initiative產生的，公眾可得到的數據(http//genome-www.stanford.edu/Arabidopsis/agi.html)，使用PDC1和PDC2核苷酸序列進行的BLAST序列檢索確認了這些cDNA是兩種不同基因的產物。這些基因分別存在于擬南芥染色體4和5中。
實施例10該實施例描述了通過RNA印跡分析確認了在植物發育階段ACL-A、ACL-B、PDH和ACS mRNA的積聚。
如前所述，從擬南芥葉、芽、花和長角果中抽提RNA(Weaver等，植物生理學1101021(1995))。通過體外轉錄分別從pBSK克隆中獲得了放射活性的ACL-A和ACL-B RNA。從280納米和260納米處的吸光度測定了RNA濃度。
用在含甲醛的瓊脂糖凝膠中電泳組分分離了來自各組織樣品的10微克RNA。將RNA轉移到尼龍膜上后，在含有50％甲酰胺的緩沖液中，用32P-標記的RNA探針65℃雜交12-16小時。室溫下用2×SSC，2％SDS漂洗雜交膜兩次，每次各10分鐘，然后65℃用0.1×SSC，0.1％SDS洗滌兩次，每次各20分鐘。將膜在磷熒光屏(Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA)下暴露4小時，用Storm840 PhosphorImager(Molecular Dynamics)定量測各條帶的放射性。
ACL-A和ACL-B mRNA的積聚圖樣在這些技術提供的分辨水平下是相同的。在長角果發育過程中，ACL-A和ACL-B mRNA在花芽和開花1-4天后長角果發育中積聚達最高水平。然而，ACL-A和ACL-B水平在開花8日后的長角果中逐漸減少，開花15天后的長角果中幾乎檢測不到。
在發育所有階段的長角果中，PDH E1β亞基mRNA積聚的絕對水平(每總RNA)比ACS mRNA的要高。PDH E1β亞基mRNA積聚在含有經歷快速油積聚(開花后5-7天)種子的長角果中非常高。
實施例11該實施例描述了由原位雜交測定的，pPDH、ACS和ACL表達的時空模式。
收集擬南芥長角果(開花后1-13天)和花芽，切成3-4毫米的長條。固定組織，脫水，包埋并切片，如前所述(Wang等，美國植物學雜志821083(1995)；和Ke等，植物生理學113357(1997))。
從含有ACL-A、ACL-B、E1βpPDH或ACS cDNA(克隆入pBluescript SK)的載體轉錄35S-標記的探針。如Ke等(1997)，見上所述，將標記探針與組織切片雜交。
重復原位雜交三次，使用兩組已各自加工過的植物材料，都得到了相似結果。將含有長角果切片的對照載玻片與從上述載體轉錄得到的有義RNA探針雜交，實際上在這些玻片上未檢測到信號。
使用RNA原位雜交，測定了pPDH、ACS、ACL-A和ACL-B表達的時空模式。并發現PDH mRNA的積聚在魚雷式分段(torpedo-staged)和步行分段的胚胎中非常高，其中在油積聚階段是最高的。該模式與異側的乙酰輔酶A脫羧酶(ACC)的模式幾乎相同。這些結果意味著pPDH可作為乙酰輔酶A質粒庫的來源。與pPDH E1β亞基mRNA相反，編碼ACS的mRNA在擬南芥胚胎中積聚水平非常低，最大的積聚發生在髓心部階段的胚胎中，其后積聚降低。另外，ACS mRNA的積聚在吸收1-4日后種子胚根的根尖中，在花藥絲(尤其靠近花絲和花藥的接縫處)中，和在種子整個發育過程的珠柄中水平最高。ACS在花絲中的極高表達與該器官中質體乙酰輔酶A的某些作用一致。雖然ACS看來對提供乙酰輔酶A，用于油的脂肪酸合成并不重要，但pPDH的時空表達和該酶一致，與產生乙酰輔酶A，供發育種子中油的生物合成相關。ACL-A和ACL-B mRNA的時空模式在這些技術提供的分辨水平上是相同的。ACL-A和ACL-B mRNA在種皮(種子外殼)沉積前一天在胚珠內珠被中；在生長器官的表皮細胞中；在花藥的絨氈層細胞中；和在幼葉的表皮和表皮毛狀物中積聚至高水平。ACL-A和ACL-B與細胞質ACC的共積聚表明ACL產生了乙酰輔酶A細胞質庫。表皮中mRNA更高水平的積聚可能與角質層蠟形成相關。ACL-A、ACL-B和ACC mRNA在種皮沉積前一天在內珠被中的共積聚可能和類黃酮多聚物櫟鞣紅的沉積相關(Stafford，“酚醛塑料的代謝與調節我們知識中的缺口”植物化學物質和健康，D.L.Gustine和H.E.Flores，編輯.Amer.Soc.Plant Physiol.(1995))。
實施例12該實施例描述了擬南芥抽提物ACL-A和ACL-B多肽的免疫沉淀對ACL活性的作用。
可用實施例6的抗體來測定免疫沉淀對擬南芥抽提物中的ACL活性的作用。將等份的擬南芥抽提物和遞增量的各抗血清或和對照免疫前血清混合。冰上培育后，將抗原-抗體復合物與蛋白A-瓊脂糖珠結合，離心沉降該瓊脂糖珠。測試上清液的ACL活性。
可采取最初為動物開發(Takeda等，酶學方法27153-160(1969))，并已用于確定豌豆(Kaethner和ap Rees，Planta 163290-294(1985))和蕓苔(Ratledge等，脂類327-12(1997))抽提物中ACL的分光光度試驗來測定ACL酶活性。該試驗將草酰乙酸產物的出現速率與用蘋果酸脫氫酶氧化NADH結合起來，得到340納米處可測量的吸光度改變。
實施例13該實施例描述了植物中乙酰輔酶A水平如何通過增加參與乙酰輔酶A產生的一種或多種基因的拷貝數而提高。
可通過提高一種或多種與乙酰輔酶A產生有關的酶的積聚而增加植物細胞中產生的乙酰輔酶A水平。這可通過將該一種或多種基因的額外拷貝引入該生物體的基因組而實現。將各種產生乙酰輔酶A的基因克隆入合適的轉化載體(可選擇的標記基因)，并將該載體轉化入所選的生物體中。根據該標記基因選擇轉化物。通過DNA印跡分析推定轉化物的DNA，確認轉化物。在某些情況下，該單轉化事件將引入多個拷貝的產生乙酰輔酶A的基因。另外，將多個產生乙酰輔酶A基因的拷貝克隆入轉化載體中。另外，將產生乙酰輔酶A的基因克隆入攜帶有不同的可選擇標記基因的轉化載體中，并進行多重轉化，來引入乙酰輔酶A產生基因的多個拷貝。在某些情況下，需要引入乙酰輔酶A產生基因的組合。這可通過將乙酰輔酶A產生基因的組合克隆入同一轉化載體，或克隆入不同轉化載體(其攜帶有不同的可選擇標記基因)而實現。
實施例14該實施例描述了如何通過提高一個或多個參與乙酰輔酶A產生的基因的表達，來增加植物中乙酰輔酶A的水平。
可通過增加一種或多種產生乙酰輔酶A的酶的積聚，來提高植物細胞中產生的乙酰輔酶A的水平。這可通過在生物體的基因組中引入數拷貝的一種或多種產生乙酰輔酶A的基因，或引入與新的表達調控序列(其以比正常水平更高的表達產生乙酰輔酶A的基因)融合的cDNA。可將產生乙酰輔酶A的基因或cDNA的一個拷貝與轉錄或翻譯調控序列的上游(5’)和/或下游(3’)融合，并將該嵌合基因克隆到合適的，攜帶有可選擇的標記基因的轉化載體中去，將該載體轉化入所選的生物體。根據該標記基因選擇轉化體。通過DNA印跡分析來自推定轉化體的DNA，確認了轉化體。可將每個新的乙酰輔酶A產生基因的多個拷貝，或新的乙酰輔酶A產生的基因的組合引入實施例12所述的生物體的基因組中。
實施例15該實施例描述了通過使用反義技術，如何降低植物中乙酰輔酶A的水平。
通過減少參與乙酰輔酶A產生的一種或多種酶的積聚，可降低植物細胞中產生的乙酰輔酶A的水平。這可通過將表達參與乙酰輔酶A產生的一種或多種酶的反義RNA的轉基因，引入基因組來實現。該反義RNA基因包含編碼產生乙酰輔酶A的酶的cDNA，其與轉錄或翻譯調控序列的上游(5’)和/或下游(3’)融合，該cDNA與正常朝向相反。將該反義基因克隆入合適的轉化載體，并轉化入實施例14所述的基因組中。可將該反義基因的多個拷貝引入如實施例14所述的基因組。可將乙酰輔酶A產生酶的組合的反義基因引入實施例14所述的基因組。
實施例16該實施例描述了如何用核酶降低植物中乙酰輔酶A的水平。
可通過減少一種或多種產生乙酰輔酶A的酶的積聚，來降低植物細胞中產生的乙酰輔酶A的水平。這可通過在基因組中引入表達針對編碼乙酰輔酶A產生酶的mRNA的核酶的轉基因來實現。該含有核酶的基因包含全長或部分的cDNA，它們編碼與正常朝向相反的乙酰輔酶A產生酶，其中插入了核酶序列。將該含有核酶的cDNA與轉錄或翻譯調控序列的上游(5’)和/或下游(3’)融合。將含有核酶的該基因克隆入合適的轉化載體，并轉化入實施例14所述的基因組中。可將多個拷貝的含有核酶的基因引入實施例14所述的基因組中。可將含有針對乙酰輔酶A產生酶的組合的核酶的基因，引入實施例14所述的基因組中。
實施例17該實施例描述了使用基因替換，如何提高或降低植物中乙酰輔酶A水平。
可通過改變一種或多種產生乙酰輔酶A的酶的活性，來改變植物細胞中產生的乙酰輔酶A的水平。這可用一種基因替換方法，通過同源重組來實現。在該方法中，內源性乙酰輔酶A產生基因被誘變的乙酰輔酶A產生基因所替換。該誘變的乙酰輔酶A產生基因編碼一種產生乙酰輔酶A的酶，該酶催化效率比內源性、被替換的基因編碼的酶高或低。該乙酰輔酶A產生基因由于一個或多個核苷酸缺失、插入、重復或替換而被誘變。將該誘變的基因與可選擇標記基因融合，并引入細胞中。根據該可選擇標記基因，選擇可導致基因替換的同源重組。用DNA印跡分析或PCR和DNA測序確認基因替換。
實施例18該實施例描述了如何使用共抑制降低植物中乙酰輔酶A水平。
可通過減少一種或多種產生乙酰輔酶A的酶的積聚，來降低植物細胞中產生的乙酰輔酶A的水平。這可用共抑制來實現。例如將編碼乙酰輔酶A產生酶的cDNA與轉錄或翻譯調控序列的上游(5’)和/或下游(3’)融合，并將該嵌合基因克隆入合適的轉化載體中，該載體攜帶有可選擇標記基因，將該載體轉化入所選的生物體中。根據該可選擇標記基因，選擇轉化體。用DNA印跡分析推定轉化體的DNA，確認轉化體。大部分從這些實驗衍生而得的轉基因生物體將表達該轉基因。然而，在一些情況下，該轉基因將共抑制內源性乙酰輔酶A產生基因的表達。為了鑒定這些共抑制植物，將分析至少100株轉基因植物的抽提物有無乙酰輔酶A產生酶的酶促活性。
實施例19該實施例描述了如何通過在模型生物(即擬南芥)中過度表達一種產生乙酰輔酶A的酶(如ACS)，來增加乙酰輔酶A的水平。
將全長ACS cDNA克隆入一種植物表達載體，如pBI101，花椰菜花葉病毒35S RNA啟動子(CaMV，35S啟動子)的下游。將得到的重組載體轉化入根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)。用得到的菌株通過真空過濾方案來轉化擬南芥植物。即將擬南芥的花芽浸在根癌農桿菌菌株培養液中1-5分鐘。使植物產生種子，并收集。
使種子在含有50-100微克/毫升卡那霉素的瓊脂培養板上發芽，將在該培養基上生長的帶抗性、轉化的幼苗轉移到土壤中。收集10到50株分別轉化的幼苗，并使其開花并結籽。種子的T2子代和轉基因是純合的。從得到的T2代幼苗中抽提DNA，并用ACS cDNA和CaMV 35S啟動子作為探針進行DNA印跡分析，確認了該種子的轉基因性質。
測試了轉基因植物的ACS轉基因的表達，提高的ACS活性和增加的乙酰輔酶A積聚。
通過分析ACS mRNA和多肽的積聚進行ACS轉基因的表達。可通過與ACScDNA進行RNA雜交，或通過用ACS轉基因特異性探針的RNase保護試驗來檢測ACS mRNA。
可通過蛋白質印跡分析經SDS-PAGE分離的總蛋白質，并用ACS特異性抗體探測，來檢測ACS多肽。通過與標記乙酸在輔酶A和ATP存在下培育抽提物，來測定ACS活性，并監測標記的乙酰輔酶A的產生。通過用10％三氯乙酸抽提幼苗來監測乙酰輔酶A的積聚。
用C-18反相柱對得到的抽提物進行高效液相層析。洗脫液是KH2PO4，pH5.5，溶于乙腈。通過與真乙酰輔酶A共洗脫鑒定乙酰輔酶A的洗脫。基于254納米的吸光度測定了乙酰輔酶A的濃度。
實施例20該實施例描述了如何通過在模型生物(即擬南芥)中表達產生乙酰輔酶A的酶(如ACS)的反義RNA，降低乙酰輔酶A的水平。
將全長(或部分片段)ACS cDNA克隆入一種植物表達載體，如pBI101，花椰菜花葉病毒35S RNA啟動子(CaMV，35S啟動子)的下游，但朝向與正常相反。將得到的重組載體轉化入根癌農桿菌。用得到的菌株通過真空過濾方案來轉化擬南芥植物。即將擬南芥的花芽浸在根癌農桿菌菌株培養液中1分鐘。使植物產生種子，并收集。
使種子在含有50-100微克/毫升卡那霉素的瓊脂培養板上發芽，將在該培養基上生長的帶抗性、轉化的幼苗轉移到土壤中。收集10到50株分別轉化的幼苗，并使其開花并結籽。種子的T2子代和轉基因是純合的。從得到的T2代幼苗中抽提DNA，并用ACS cDNA和CaMV 35S啟動子作為探針進行DNA印跡分析，確認了種子的轉基因性質。
測試了轉基因植物的反義ACS轉基因的表達，降低的ACS多肽積聚，降低的ACS活性和減少的乙酰輔酶A積聚。
通過分析ACS反義RNA的積聚進行反義ACS轉基因的表達。從轉基因幼苗中抽提RNA，用RNA雜交或用ACS有義鏈核糖探針進行RNase保護試驗，來檢測ACS反義RNA。
可通過蛋白質印跡分析經SDS-PAGE分離的總蛋白質，并用ACS特異性抗體探測，來檢測ACS多肽。通過與標記乙酸在輔酶A和ATP存在下培育抽提物，來測定ACS活性，并監測標記的乙酰輔酶A的產生。
通過用10％三氯乙酸抽提幼苗來監測乙酰輔酶A的積聚。用C-18反相柱對得到的抽提物進行高效液相層析。洗脫液是KH2PO4，pH5.5，溶于乙腈。通過與真乙酰輔酶A共洗脫鑒定乙酰輔酶A的洗脫。根據254納米的吸光度測定了乙酰輔酶A的濃度。
實施例21該實施例描述了用有義和反義核酸改變植物中ACS的濃度。
將全長的ACS cDNA克隆入稱為pCB200的植物表達載體，該表達載體衍生自載體pBI121(Clontech)，通過用大腸桿菌BAR基因替換卡那霉素抗性(kan-r)基因，來產生對除草劑Liberty的抗性(Becker等，植物分子生物學201195-1197(1992))。將全長ACS cDNA克隆入pCB200，CaMV35S啟動子的下游，對于有義和反義表達，分別是正常或相反朝向，使用標準技術(Sambrook，分子克隆實驗手冊，Cold Spring Harbor Laboratory New York(1989))。根據廠商建議的方案使用限制性內切核酸酶和DNA連接酶(Gibco BRL，Grand Island，NY)。將得到的載體分別轉化入根癌農桿菌。用得到的菌株通過真空過濾方案，根據Bechtold等所述方案轉化擬南芥(生態型Columbia)植物(分子生物學方法82259-266(1993))。簡單說，將擬南芥的花芽浸在根癌農桿菌菌株培養液中1分鐘。使植物產生種子，并收集。
通過將種子播在無菌土壤中選擇轉基因植物。14天后，用0.5％草丁膦(w/v)(除草劑Liberty的活性組分)噴撒在幼苗上。非轉基因植物在約7日內死亡，而轉基因植物存活，并長到成熟，收集種子。
將獨立轉化的植物的各轉基因種系看作獨立的轉化事件。在下面的子代中，從獨立的轉基因種系收集種子，并進一步測試對除草劑Liberty的抗性。考慮當僅有一個轉基因拷貝摻入其基因組，而且所有測試的子代幼苗(50以上)對除草劑Liberty有抗性時，認為該轉基因種系是純合的。
產生了兩種ACS反義植物的轉基因種系。通過T3代分析了第一種系的特性，觀察到低至野生型20％的ACS酶活性水平。通過T2代分析了第二種系的特性，觀察到低至野生型11％的ACS酶活性水平。
產生了20種ACS有義植物的轉基因種系。通過T3代分析了一個種系的特性，而通過T2代分析了所有其它種系的特性。觀察到高至野生型166％到219％的ACS酶活性水平。
因此，這些數據顯示產生乙酰輔酶A的ACS的表達可被提高或降低。
實施例22該實施例描述了用反義核酸改變植物中pPDH的水平。
使用實施例21的方法，將全長pPDH E1α或pPDH E1β的cDNA克隆入稱為pCB200的植物表達載體，CaMV35S啟動子的下游，對于反義RNA表達，朝向與正常相反。產生了兩種pPDHE1α反義植物的轉基因種系，和三種pPDHE1β反義植物的轉基因種系，通過T1代培養它們。將根據實施例21的方法分析這些植物。
實施例23該實施例描述了用有義和反義核酸改變植物中ALDH的水平。
使用實施例21的方法，將全長ALDH cDNA克隆入植物表達載體，對于有義和反義表達，朝向分別是正常和相反pCGN8641，napin啟動子，kan-r基因(2有義；1反義)pCGN8643，napin啟動子，kan-r基因(2反義；1有義)pCGN8640，CaMV35S啟動子，植物抗性基因bar(Liberty除草劑)(2反義；1有義)pCGN8644，CaMV35S啟動子，bar基因(2有義；1反義)pKMB(Mylne和Botella，植物分子生物學報道16257-262(1998))，CaMV35S啟動子，bar基因(3有義)pSMB(Mylne和Botella(1998)，見上)，CaMV35S啟動子，bar基因(3反義)。
從pCGN1558構建了用于植物轉化的二分載體，pCGN5139(McBride和Summerfelt，植物分子生物學14269-276(1990))。用含有獨特限制性內切核酸酶位點，AscI、PacI、XbaI、SwaI、BamHI和NotI的多接頭替換作為HindIII/Asp718片段的pCGN1558的多接頭。在pCGN5139中保留了Asp718和HiddIII限制性內切酶位點。
構建一系列超二分載體，來迅速將DNA序列克隆入含有轉錄起始區(啟動子)和轉錄終止區的二分載體中。
通過將寡核苷酸5′-TCGAGGATCCGCGGCCGCAAGCTTCCTGCAGG-3′[SEQ ID NO31]和5′-TCGACCTGCAGGAAGCTTGCGGCCGCGGATCC-3′[SEQ ID NO32]連接入用Sal I/Xho I消化的pCGN7770中，構建了質體pCGN8618。通過Asp718I消化從pCGN8618上切下含有napin啟動子、多接頭和napin3′區的片段；用Klenow片段填充5′突出端將該片段兩端補成平頭，然后連接入已用Asp718I和Hin dIII消化的pCGN5139，用Klenow片段填充5′突出端將兩端補成平頭。質體所含插入物的朝向使napin啟動子和pCGN5139的平端Asp18I位點最接近，和使napin3′和平端Hin dIII位點最接近。對該質體進行序列分析，確認兩種插入物朝向和克隆接頭的完整性。得到的質體被稱為pCGN8622。
通過將寡核苷酸5′-TCGACCTGCAGGAAGCTTGCGGCCGCGGATCC-3′[SEQ ID NO33]和5′-TCGAGGATCCGCGGCCGCAAGCTTCCTGCAGG-3′[SEQ ID NO34]連接入用Sal I/Xho I消化的pCGN7770中，構建了質體pCGN8619。通過Asp718I消化，從pCGN8619上取出含有napin啟動子、多接頭和napin 3′區的片段；用Klenow片段填充5′突出端將該片段兩端補成平頭，然后連接入已用Asp718I和Hin dIII消化的pCGN5139，用Klenow片段填充5′突出端將兩端補成平頭。質體所含插入物的朝向使napin啟動子和pCGN5139的平端Asp18I位點最接近，和使napin3′和平端Hin dIII位點最接近。對該質體進行序列分析，確認兩種插入物朝向和克隆接頭的完整性。得到的質體被稱為pCGN8623。
通過將寡核苷酸5′-TCGAGGATCCGCGGCCGCAAGCTTCCTGCAGGAGCT-3′[SEQ ID NO35]和5′-CCTGCAGGAAGCTTGCGGCCGCGGATCC-3′[SEQ ID NO36]連接入用Sal I/Sac I消化的pCGN7787中，構建了質體pCGN8620。通過Asp718I完全消化和NotI部分消化，從pCGN8620上取出含有d35S啟動子、多接頭和tml3′區的片段。用Klenow片段填充5′突出端將該片段兩端補成平頭，然后連接入用Asp718I和Hin dIII消化的pCGN5139，用Klenow片段填充5′突出端將兩端補成平頭。質體所含插入物的朝向使d35S啟動子和pCGN5139的平端Asp18I位點最接近，和使tml3′和平端Hin dIII位點最接近。對該質體進行序列分析，確認兩種插入物朝向和克隆接頭的完整性。得到的質體被稱為pCGN8624。
pCGN8640是pCGN8624的修飾體。用Rfu聚合酶將從轉座子Tn7分離的，編碼細菌壯觀霉素和鏈霉素抗性，一種大腸桿菌和農桿菌選擇的決定簇的938bp PstI片段(Fling等，核酸研究13(19)7095-7106(1985))平端補齊。將該平端片段連接入已用SpeI消化的pCGN8624中，并用Pfu聚合酶補齊平端。對含有PstI片段的區域進行測序，來確認插入物朝向和克隆的完整性。
如下，將壯觀霉素抗性標記引入pCGN8622和pCGN8623。將來自pCGN8640的7.7Kbp的AvrII-SnaBI片段與來自pCGN8623或pCGN8622的10.9Kbp的AvrII-SnaBI片段連接。得到的質體分別是pCGN8641和pCGN8643。
通過將寡核苷酸5’-GATCACCTGCAGGAAGCTTGCGGCCGCGGATCCAATGCA-3’[SEQ ID NO37]和5’-TTGGATCCGCGGCCGCAAGCTTCCTGCAGGT-3’[SEQ ID NO38]連接入用Bam HI-PstI消化的pCGN8640，構建了質體pCGN8644。
根據實施例21的方法產生并分析了轉基因植物，除了根據卡那霉素抗性選出用載體pCGN8641和pCGN8643產生的轉基因植物外。對于該選擇，通過將種子在50％(v/v)常用漂白劑(5.25％次氯酸鈉)和0.02％Triton X-100中培育7分鐘，然后用無菌水漂洗三次，來對種子進行表面滅菌。將種子播種在含有MS選擇培養基(50μg/ml卡那霉素，1× Murashige和Skoog′s鹽(Sigma ChemicalCo.，St.Louis，MO)，1％蔗糖，1XGamborg′s維生素(Sigma)，0.5g/lMES，pH5.7，和0.8％純化瓊脂(Becton Dickinson，Cockeysville，MD))的Peri平板上。播種后約10到14日，將卡那霉素抗性的幼苗轉移到無菌土壤上(Sunshine Mix，SunGro Horticulture，Bellevue，WA)。23℃在連續光照或16小時光照然后是8小時黑暗的光周期下，使植物生長。每周用Nutriculture soluble fertilizer special blend21-8-18(Plant Marvel Laboratory，Chicago Heights，IL)給植物澆水一次。
將獨立轉化植物的各轉基因種系看作是獨立的轉化事件。在下面的子代中，從獨立的轉基因種系收集種子，并進一步在MS選擇培養基上培養，調查卡那霉素抗性性狀的分離。對于卡那霉素抗性分離的各次試驗，使用了30顆以上的種子。當僅有一個轉基因拷貝摻入其基因組，而且所有測試的子代幼苗(50以上)是卡那霉素抗性時，才認為轉基因種系是純合的。
實施例24該實施例描述了用有義和反義核酸改變植物中的PDC水平。
使用實施例21的方法，將全長PDC cDNA克隆入植物表達載體，對于有義和反義表達，朝向分別是正常和相反，見下pCGN8641，napin啟動子，kan-r基因(1有義；1反義)pCGN8643，napin啟動子，kan-r基因(1有義)pCGN8640，CaMV 35S啟動子，bar基因(1有義)pCGN8644，CaMV 35S啟動子，bar基因(1有義)pKMB，CaMV35S啟動子bar基因(1反義)pSMB，CaMV35S啟動子，bar基因(1反義)。
根據實施例21和23的方法產生和分析了轉基因植物。
實施例25該實施例描述了用有義和反義核酸改變植物ACL水平。
使用實施例21的方法，將全長ACL-A1或ACL-B2cDNA克隆入植物表達載體，對于有義和反義表達，朝向分別是正常和相反，見下pBI121衍生質體，CaMV35S啟動子，kan-r基因(1ACL-A1有義；1ACL-B2有義；1ACL-A1反義；1ACL-B2反義)pBI121衍生質體，缺失CAC1啟動子(CAC1啟動子的核苷酸-529到+32，其中核苷酸編號相對于ATG翻譯起始密碼子的腺嘌呤核苷(它是+1)，kan-r基因(1ACL-A1有義；1ACL-B2有義)pBI121衍生質體，CaMV35S啟動子，kan-r基因(1ACL-A1(與質體靶序列融合)有義)。
如實施例23所述，根據卡那霉素抗性選出了所有轉基因植物。
產生了含有缺失CAC1啟動子控制下的有義ACL-A1的轉基因植物，并已通過T2子代進行了培育。這些植物顯示葉子非常大的改變的表型。
產生了含有在CaMV35S啟動子控制下的反義ACL-A1的轉基因植物，并已通過T2子代培育。這些植物顯示兩種表型。一種表型包括縮小了很多的植物體，更短和更細的開花莖，更小的花或不開花，縮小或偶爾提前枯萎的花瓣，定時或開裂機制有明顯問題的花粉囊，如存在長角果，是縮小的，部分裝有種子，或是空的，在長角果中有小而干燥的種子，有種子的長角果中提前成熟開裂，而且葉子大大縮小，顯示花青素產生。
另一種表型包括更小的植株，具有前一種表型特征的較溫和變體，更細，卷曲的長角果，具有更易于鑒別的外部種子輪廓，其中常含有萎縮、干燥的種子，而且開裂延遲。
根據實施例21和23的方法產生并分析了其它轉基因植物。
所有在本文中引用的文獻，包括專利、專利申請和出版物，在此全文引入以供參考。
雖然本發明已著重于優選例進行了描述，但本領域普通技術人員顯然將明白，可在優選例中制備和使用各種變化，而且除了本文中特別描述的以外，可用其它方式實施本發明。本發明將包括這些變化和其它實施方式。因此，本發明包括在本發明權利要求中所確定的精神和范圍內的所有變化。
權利要求
1.一種分離或純化的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子編碼一種植物質體乙酰輔酶A合成酶，或其含有至少約20個核苷酸的連續片段。
2.如權利要求1所述的分離或純化的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子分離自擬南芥。
3.如權利要求1所述的分離或純化的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子是(i)DNA，并包含SEQ ID NO1或編碼SEQ ID NO2的序列，(ii)RNA，并包含由SEQ ID NO1編碼的序列或編碼SEQ ID NO2的序列，或(iii)一種核酸分子，其在嚴格條件下能與上述任何一條核酸雜交。
4.一種分離或純化的核酸分子，其特征在于，該核酸分子編碼包含一個或多個插入、缺失和/或取代的修飾植物質體乙酰輔酶A合成酶，由所述分離或純化的核酸分子編碼的修飾的植物質體乙酰輔酶A合成酶與對應的未修飾的植物質體乙酰輔酶A合成酶功能相同，或其含有至少約20個核苷酸的連續片段。
5.如權利要求4所述的分離或純化的核酸分子，其特征在于，所述對應的未修飾的植物質體乙酰輔酶A合成酶包含SEQ ID NO2。
6.如權利要求5所述的分離或純化的核酸分子，其特征在于，如用標記的乙酸體外試驗測定時，由所述分離或純化的核酸分子編碼的修飾的植物質體乙酰輔酶A合成酶能以包含SEQ ID NO2的植物質體乙酰輔酶A合成酶的至少約90％，把乙酸轉化成乙酰輔酶A。
7.如權利要求4所述的分離或純化的核酸分子，其特征在于，所述一個或多個取代不導致所編碼的植物質體乙酰輔酶A合成酶氨基酸的變化，或導致編碼的植物質體乙酰輔酶A合成酶的一個氨基酸被另一個大小、形狀和電荷近似相等的氨基酸取代。
8.一種分離或純化的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子編碼植物質體丙酮酸脫氫酶的E3亞基，或其含有至少約20個核苷酸的連續片段。
9.如權利要求8所述的分離或純化的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子分離自擬南芥。
10.如權利要求8所述的分離或純化的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子是(i)DNA，并包含SEQ ID NO27，SEQ ID NO29，編碼SEQ ID NO28或SEQ ID NO30的序列，(ii)RNA，并包含由SEQ ID NO27編碼的序列，由SEQ ID NO29編碼的序列，編碼SEQ ID NO28或SEQ ID NO30的序列，或(iii)一種核酸分子，所述核酸分子在嚴格條件下與前面的任何一條核酸分子雜交。
11.一種分離或純化的核酸分子，其特征在于，該核酸分子編碼包含一個或多個插入、缺失和/或取代的植物質體丙酮酸脫氫酶的修飾的E3亞基，或其包含至少約20個核苷酸的連續片段，由所述分離或純化的核酸分子編碼的植物質體丙酮酸脫氫酶的修飾的E3亞基，與對應的植物質體丙酮酸脫氫酶未修飾的E3亞基功能相同。
12.如權利要求11所述的分離或純化的核酸分子，其特征在于，所述對應的植物質體丙酮酸脫氫酶的未修飾的E3亞基包含SEQ ID NO28或SEQ ID NO30。
13.如權利要求11所述的分離或純化的核酸分子，其特征在于，如用標記丙酮酸體外試驗測定時，由所述分離或純化的核酸分子編碼的植物質體丙酮酸脫氫酶的E3亞基和質體丙酮酸脫氫酶的其余未修飾亞基一起，能以包含SEQ IDNO28或SEQ ID NO30的植物質體丙酮酸脫氫酶的E3亞基的至少約90％，把丙酮酸轉化成乙酰輔酶A。
14.如權利要求11所述的分離或純化的核酸分子，其特征在于，所述一個或多個取代不導致所編碼的植物質體丙酮酸脫氫酶的E3亞基氨基酸的變化，或導致編碼的植物質體丙酮酸脫氫酶的E3亞基的一個氨基酸被另一個大小、形狀和電荷近似相等的氨基酸取代。
15.一種分離或純化的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子編碼植物ATP-檸檬酸裂合酶的A亞基，或其含有至少約20個核苷酸的連續片段。
16.如權利要求15所述的分離或純化的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子分離自擬南芥。
17.如權利要求15所述的分離或純化的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子是(i)DNA，并包含SEQ ID NO7，或編碼SEQ ID NO8的序列，(ii)RNA，并包含由SEQ ID NO7編碼的序列，或編碼SEQ ID NO8的序列，或(iii)一種核酸分子，所述核酸分子在嚴格條件下與前面的任何一條核酸分子雜交。
18.一種分離或純化的核酸分子，其特征在于，該核酸分子編碼包含一個或多個插入、缺失和/或取代的植物ATP-檸檬酸裂合酶修飾的A亞基，由所述分離或純化核酸分子編碼的植物ATP-檸檬酸裂合酶修飾的A亞基，或其包含至少約20個核苷酸的連續片段與對應的植物ATP-檸檬酸裂合酶未修飾的A亞基功能相同。
19.如權利要求18所述的分離或純化的核酸分子，其特征在于，所述對應的植物ATP-檸檬酸裂合酶未修飾的A亞基包含SEQ ID NO8。
20.如權利要求19所述的分離或純化的核酸分子，其特征在于，由所述分離或純化的核酸分子編碼的植物ATP-檸檬酸裂合酶修飾的A亞基和植物ATP-檸檬酸裂合酶的未修飾的B亞基一起，如用標記檸檬酸體外試驗測定時，能以包含SEQ ID NO8的A亞基的植物ATP-檸檬酸裂合酶的至少約90％，把檸檬酸轉化成乙酰輔酶A。
21.如權利要求18所述的分離或純化的核酸分子，其特征在于，所述一個或多個取代不導致編碼的植物ATP-檸檬酸裂合酶A亞基氨基酸的變化，或導致編碼的植物ATP-檸檬酸裂合酶A亞基的一個氨基酸被另一個大小、形狀和電荷近似相等的氨基酸取代。
22.一種分離或純化的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子編碼植物ATP一檸檬酸裂合酶的B亞基，或其含有至少約20個核苷酸的連續片段。
23.如權利要求22所述的分離或純化的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子分離自擬南芥。
24.如權利要求22所述的分離或純化的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子是(i)DNA，并包含SEQ ID NO9，SEQ ID NO11，編碼SEQ ID NO10的序列，或編碼SEQ ID NO12的序列(ii)RNA，并包含由SEQ ID NO9編碼的序列，SEQ ID NO11編碼的序列，編碼SEQ ID NO10的序列，或編碼SEQ IDNO12的序列，或(iii)一種核酸分子，該分子能在嚴格條件下與前面的任何一條核酸分子雜交。
25.一種分離或純化的核酸分子，其特征在于，該核酸分子編碼包含一個或多個插入、缺失和/或取代的植物ATP-檸檬酸裂合酶修飾的B亞基，由所述分離或純化核酸分子編碼的植物ATP-檸檬酸裂合酶修飾的B亞基，或其包含至少約20個核苷酸的連續片段與對應的植物ATP-檸檬酸裂合酶未修飾的B亞基功能相同。
26.如權利要求25所述的分離或純化的核酸分子，其特征在于，所述對應的植物ATP-檸檬酸裂合酶未修飾的B亞基包含SEQ ID NO10或SEQ ID NO12。
27.如權利要求26所述的分離或純化的核酸分子，其特征在于，由所述分離或純化的核酸分子編碼的植物ATP-檸檬酸裂合酶修飾的B亞基和植物ATP-檸檬酸裂合酶的未修飾的A亞基一起，如用標記檸檬酸體外試驗測定時，能以包含SEQ ID NO10或SEQ ID NO12的植物ATP-檸檬酸裂合酶的至少約90％，把檸檬酸轉化成乙酰輔酶A。
28.如權利要求25所述的分離或純化的核酸分子，其特征在于，所述一個或多個取代不導致所編碼的植物ATP-檸檬酸裂合酶B亞基氨基酸的變化，或導致編碼的植物ATP-檸檬酸裂合酶B亞基的一個氨基酸被另一個大小、形狀和電荷近似相等的氨基酸取代。
29.一條分離和純化的核酸分子，其特征在于，該核酸分子包含SEQ ID NO15或SEQ ID NO17的核苷酸序列，或編碼SEQ ID NO16或SEQ ID NO18的氨基酸序列。
30.一種分離和純化的核酸分子，其特征在于，該核酸分子包含SEQ ID NO21的核苷酸序列，或編碼SEQ ID NO22的氨基酸序列，或含有至少約20個核苷酸的上述核酸分子的連續片段，或能與前述核苷酸之一在嚴格條件下雜交的核酸分子。
31.一種分離和純化的核酸分子，其特征在于，該核酸分子包含SEQ ID NO25的核苷酸序列，或編碼SEQ ID NO26的氨基酸序列，或含有至少約20個核苷酸的上述核酸分子的連續片段，或能與前述核苷酸之一在嚴格條件下雜交的核酸分子。
32.一種載體，其特征在于，該載體包含權利要求1-31任一項所述的核酸分子。
33.一種載體，其特征在于，該載體包含或編碼一條至少約20個核苷酸的反義序列，所述反義序列與編碼植物質體乙酰輔酶A合成酶的RNA分子雜交，或該載體包含或編碼一種能切割編碼植物質體乙酰輔酶A合成酶的RNA分子的核酶。
34.一種載體，其特征在于，該載體包含或編碼一條至少約20個核苷酸的反義序列，所述反義序列與編碼植物質體丙酮酸脫氫酶E1α亞基的RNA分子雜交，或該載體包含或編碼一種能切割編碼植物質體丙酮酸脫氫酶E1α亞基的RNA分子的核酶。
35.一種載體，其特征在于，該載體包含或編碼一條至少約20個核苷酸的反義序列，所述反義序列與編碼植物質體丙酮酸脫氫酶E1β亞基的RNA分子雜交，或該載體包含或編碼一種能切割編碼植物質體丙酮酸脫氫酶E1β亞基的RNA分子的核酶。
36.一種載體，其特征在于，該載體包含或編碼一條至少約20個核苷酸的反義序列，所述反義序列與編碼植物質體丙酮酸脫氫酶E2亞基的RNA分子雜交，或該載體包含或編碼一種能切割編碼植物質體丙酮酸脫氫酶E2亞基的RNA分子的核酶。
37.一種載體，其特征在于，該載體包含或編碼一條至少約20個核苷酸的反義序列，所述反義序列與編碼植物質體丙酮酸脫氫酶E3亞基的RNA分子雜交，或該載體包含或編碼一種能切割編碼植物質體丙酮酸脫氫酶E3亞基的RNA分子的核酶。
38.一種載體，其特征在于，該載體包含或編碼一條至少約20個核苷酸的反義序列，所述反義序列與編碼植物ATP-檸檬酸裂合酶A亞基的RNA分子雜交，或該載體包含或編碼一種能切割編碼植物質體ATP-檸檬酸裂合酶A亞基的RNA分子的核酶。
39.一種載體，其特征在于，該載體包含或編碼一條至少約20個核苷酸的反義序列，所述反義序列與編碼植物ATP-檸檬酸裂合酶B亞基的RNA分子雜交，或該載體包含或編碼一種能切割編碼植物質體ATP-檸檬酸裂合酶B亞基的RNA分子的核酶。
40.一種載體，其特征在于，該載體包含或編碼一條至少約20個核苷酸的反義序列，所述反義序列能與編碼植物丙酮酸脫羧酶的RNA分子雜交，或該載體包含或編碼一種能切割編碼植物丙酮酸脫羧酶的RNA分子的核酶。
41.一種載體，其特征在于，該載體包含或編碼一條至少約20個核苷酸的反義序列，所述反義序列能與編碼植物丙酮酸脫氫酶的RNA分子雜交，或該載體包含或編碼一種能切割編碼植物丙酮酸脫氫酶的RNA分子的核酶。
42.一種載體，其特征在于，該載體包含或編碼一條至少約20個核苷酸的反義序列，所述反義序列能與編碼植物醛脫氫酶的RNA分子雜交，或該載體包含或編碼一種能切割編碼植物醛脫氫酶的RNA分子的核酶。
43.一種宿主細胞，其特征在于，該宿主細胞包含權利要求32-42任一項所述的載體。
44.一種由包含權利要求32所述載體的宿主細胞產生的多肽。
45.一種多克隆抗體，其特征在于，該抗體能與植物乙酰輔酶A合成酶結合，不和非植物乙酰輔酶A合成酶結合。
46.一種多克隆抗體，其特征在于，該抗體能與植物質體丙酮酸脫氫酶E1α亞基結合，不和非植物丙酮酸脫氫酶結合。
47.一種多克隆抗體，其特征在于，該抗體能與植物質體丙酮酸脫氫酶E1β亞基結合，不和非植物丙酮酸脫氫酶結合。
48.一種多克隆抗體，其特征在于，該抗體能與植物ATP-檸檬酸裂合酶A亞基結合，不和非植物ATP-檸檬酸裂合酶A亞基結合。
49.一種多克隆抗體，其特征在于，該抗體能與植物ATP-檸檬酸裂合酶B亞基結合，不和非植物ATP-檸檬酸裂合酶B亞基結合。
50.一種至少20個核苷酸的反義分子，其特征在于，該反義分子可與編碼編碼植物質體乙酰輔酶A合成酶、植物質體丙酮酸脫氫酶E1α亞基，植物質體脫氫酶E1β亞基、植物質體丙酮酸脫氫酶E2亞基、植物質體丙酮酸脫氫酶E3亞基、植物ATP-檸檬酸裂合酶A亞基、植物ATP-檸檬酸裂合酶B亞基、植物丙酮酸脫羧酶、植物線粒體丙酮酸脫氫酶或植物醛脫氫酶的RNA分子雜交。
51.一種核酶，其特征在于，該核酶能切割編碼植物質體乙酰輔酶A合成酶、植物質體丙酮酸脫氫酶E1α亞基，植物質體脫氫酶E1β亞基、植物質體丙酮酸脫氫酶E2亞基、植物質體丙酮酸脫氫酶E3亞基、植物ATP-檸檬酸裂合酶A亞基、植物ATP-檸檬酸裂合酶B亞基、植物丙酮酸脫羧酶、植物線粒體丙酮酸脫氫酶或植物醛脫氫酶的RNA分子。
52.一種改變植物細胞、植物組織、植物器官或植物中酶水平的方法，其特征在于，該方法包括使植物細胞、植物組織、植物器官或植物與包含核酸分子的載體接觸，所述核酸分子選自(i)一種基因，該基因編碼酶，或如果該酶由亞基構成，則編碼該酶的亞基，這些酶選自質體乙酰輔酶A合成酶、質體丙酮酸脫氫酶、ATP-檸檬酸裂合酶、丙酮酸脫羧酶、乙酰輔酶A水解酶、線粒體丙酮酸脫氫酶和醛脫氫酶的酶亞基，(ii)一種核酸分子，包含或編碼針對從(i)的基因轉錄而得的RNA分子的至少約20個核苷酸的反義分子，和(iii)一種核酸分子，包含或編碼針對從(i)的基因轉錄而得的RNA分子的核酶，其中所述包含核酸分子(i)的載體能提高或降低所述植物細胞、植物組織、植物器官或植物中的所述酶水平，而所述包含(ii)或(iii)的核酸分子的載體能降低所述植物細胞、植物組織、植物器官或植物中的所述酶水平。
53.如權利要求52所述的方法，其特征在于，所述酶是質體乙酰輔酶A合成酶，質體丙酮酸脫氫酶、ATP-檸檬酸裂合酶或線粒體丙酮酸脫氫酶。
54.如權利要求52所述的方法，其特征在于，所述酶是乙酰輔酶A水解酶，丙酮酸脫羧酶或醛脫氫酶。
55.如權利要求52-54任一所述的方法，其特征在于，所述酶的改變導致所述植物細胞、植物組織、植物器官或植物中乙酰輔酶A水平的改變。
56.一種植物細胞、植物組織、植物器官或植物，其特征在于，已按照權利要求52-54任一項所述的方法改變了其中質體乙酰輔酶A合成酶、質體丙酮酸脫氫酶、ATP-檸檬酸裂合酶、丙酮酸脫羧酶、乙酰輔酶A水解酶、線粒體丙酮酸脫氫酶或醛脫氫酶的水平。
57.一種植物細胞、植物組織、植物器官或植物，其特征在于，已按照權利要求55所述的方法改變了其中乙酰輔酶A的水平。
全文摘要
本發明提供了乙酰輔酶A合成酶(ACS)、質體丙酮酸脫氫酶(pPDH)、ATP檸檬酸裂合酶(ACL)、擬南芥丙酮酸脫羧酶(PDC)、和擬南芥醛脫氫酶(ALDH),具體是ALDH－2和ALDH－4的核酸序列和氨基酸序列。本發明還提供了一種重組載體,包含一條編碼上述酶之一的核酸序列,其反義序列或其核酶,被這樣的載體轉化的細胞,這些酶的抗體,在酶水平上被改變的一種植物細胞,一種植物組織、一種植物器官或一種植物,和產生這樣的植物細胞、植物組織、植物器官或植物的方法。理想的,酶水平上的改變導致該植物細胞、植物組織、植物器官或植物中乙酰輔酶A水平的改變。另外,本發明提供了一種重組載體,包含編碼丙酮酸脫羧酶(PDC)、pPDH的E1α亞基、pPDH的E1β亞基、pPDH的E2亞基、線粒體丙酮酸脫氫酶(mtPDH)或醛脫氫酶(ALDH)的核酸序列的反義序列,或包含一種能切割編碼PDC、E1αpPDH、E1βpPDH、E2pPDH、mtPDH或ALDH的RNA分子的核酶。
文檔編號C12N15/82GK1322252SQ99809549
公開日2001年11月14日 申請日期1999年6月25日 優先權日1998年6月26日
發明者B·J·尼古勞, E·S·維特勒, D·J·奧利弗, R·貝阿爾, P·S·施納貝, 柯金閃, J·L·約翰遜, C·C·奧爾雷德, B·法特蘭德, I·呂策格, 溫翠蓉 申請人:愛阿華州立大學研究機構