專利名稱：治療藥物的制作方法
技術領域：
本發明涉及衍生于天然來源物質的生理活性物質的用途。更詳細地講，其涉及生理活性物質、產生這樣物質的方法、含有作為活性成分的生理活性物質的藥用組合物、食品或飲料、抗氧化組合物、用于保鮮的組合物和化裝品組合物。
編程性細胞死亡為在細胞基因組中原始編程的死亡，并且不同于其為病理性細胞死亡的壞死。更詳細地講，認為以下過程導致死亡。由一些外部或內部因素引發起的編程性細胞死亡編程的基因的活化引起程序性死亡蛋白的生物合成。在一些情況中，在細胞中以其非活性形式存在的程序性死亡蛋白被活化。這樣生成的活化的程序性死亡蛋白摧毀細胞。
在所要求的組織或細胞中誘導編程性細胞死亡是非常有價值的，因為這使得有可能以自然的方式從生命體內消除不需要的或有害的細胞。
本發明的目的本發明的主要目的是提供衍生于天然來源物質的具有生理功能如編程性細胞死亡-誘導的活性的高度安全的物質，以及所述物質的生產方法和用途。本發明概述本發明概述如下。本發明第一方面涉及其含有選自以下的化合物作為活性成分的藥用組合物式(Ⅰ)化合物 其中X和Y為H或CH2OH，條件是當X為CH2OH時，Y為H，而當X為H時，Y為CH2OH；式(Ⅱ)化合物 其中R為通過從含有SH基團的化合物中游離出SH基團而得到的殘基，和它們的鹽，所述組合物用于治療或預防以下疾病對于其治療或預防需要誘導編程性細胞死亡的疾病，癌性疾病，對于其治療或預防需要抑制活性氧生成的疾病，對于其治療或預防需要抑制一氧化氮生成的疾病，對于其治療或預防需要抑制前列腺素合成的疾病，對于其治療或預防需要抑制滑液細胞增殖的疾病、對于其治療或預防需要抑制熱休克蛋白產生的疾病或對于其治療或預防需要抑制α-糖苷酶的疾病。疾病。
本發明第二方面涉及生產式(Ⅰ)化合物的方法，其特征在于所述方法包括在中性至堿性條件下，處理3,6-脫水半乳糖和/或在其還原性末端具有3,6-脫水半乳糖的化合物。
本發明第三方面涉及式(Ⅱ)化合物或它們的鹽。
本發明第四方面涉及生產式(Ⅱ)化合物的方法，其特征在于所述方法包括使式(Ⅰ)化合物與含有SH基團的化合物反應。
本發明第五方面涉及食品或飲料，這種食品或飲料含有選自式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它們的鹽的化合物，通過稀釋選自式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它們的鹽的化合物來生產和/或通過向其中加入選自式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它們的鹽的化合物來生產。
本發明第六方面涉及食品或飲料，這種食品或飲料含有式(Ⅰ)化合物，通過稀釋式(Ⅰ)化合物來生產和/或通過向其中加入式(Ⅰ)化合物來生產，所述式(Ⅰ)化合物通過在中性至堿性條件下處理3,6-脫水半乳糖和/或在其還原性末端具有3,6-脫水半乳糖的化合物得到。
本發明第七方面涉及抗氧化組合物，其含有作為活性成分的選自式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它們的鹽的化合物。
本發明第八方面涉及食品或飲料，其含有本發明第七方面的抗氧化組合物。
本發明第九方面涉及式(Ⅰ)或式(Ⅱ)的抗氧化化合物。例如化合物可用作(但不局限于)抑制活性氧生成的化合物。
本發明第十方面涉及用于保鮮的組合物，其含有作為活性成分的選自式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它們的鹽的化合物。
本發明第十一方面涉及化裝品組合物，其含有作為活性成分的選自式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它們的鹽的化合物。
本發明第十二方面涉及用于抑制α-糖苷酶的組合物，其含有作為活性成分的選自式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它們的鹽的化合物。
本發明第十三方面涉及通過在中性至堿性條件下處理3,6-脫水半乳糖和/或在其還原性末端具有3,6-脫水半乳糖的化合物來產生的編程性細胞死亡-誘導的物質。
本發明第十四方面涉及食品或飲料，這種食品或飲料含有編程性細胞死亡-誘導的物質，通過稀釋編程性細胞死亡-誘導的物質來生產和/或通過向其中加入編程性細胞死亡-誘導的物質來生產，所述編程性細胞死亡-誘導的物質是通過在中性至堿性條件下處理3,6-脫水半乳糖和/或在其還原性末端具有3,6-脫水半乳糖的化合物來產生的。
在下文，將參照附圖詳細解釋本發明。
繪圖的簡要描述

圖1說明樣品2的正相HPLC層析譜。
圖2說明保留時間為4.05至4.16分鐘的組分的質譜。
圖3說明保留時間為4.05至4.16分鐘的組分的1H-NMR譜。
圖4說明在DGE存在下，在多種培養條件下培養得到的培養基中的NO2濃度。
圖5說明其中在預培養期間加入DGE的各種培養條件下通過孵育得到的培養基中的NO2的濃度。
圖6說明其中在預培養期間加入DGE的各種培養條件下通過孵育得到的培養基中的前列腺素E2的濃度。
圖7說明DGE與GSH之間反應產物的質譜。
圖8說明DGE與GSH之間反應產物的1H-NMR譜。
圖9說明DGE與GSH之間反應產物的13C-NMR譜。
圖10說明在DGE存在下培養時3H-胸腺嘧啶核苷的攝取。
本發明的詳細描述如在此使用的3,6-脫水半乳糖意指式(Ⅲ)的3,6-脫水吡喃半乳糖 它的醛式(Ⅳ) 或它的水合物式(Ⅴ) 此外，它包括其硫酸酯化的衍生物和甲基化的衍生物。可使用不同的表達形式來表示由式(Ⅲ)至(Ⅴ)所表示的化合物的結構。打算使式(Ⅲ)至(Ⅴ)化合物包括由這樣的不同表達形式表示的化合物和它們的可能的互變異構體。另外，只要發揮所要求的活性，式(Ⅲ)至(Ⅴ)的構型不局限于特定的某一種。可使用D-型或L-型或它們的混合物。
例如，不加限制通過在低于pH 7的酸性條件下水解和/或酶促消化本發明的含有3,6-脫水半乳糖的物質，能夠得到在其還原性末端具有3,6-脫水半乳糖的化合物。或者，它能夠經化學合成。
在本發明中優選使用的具有3,6-脫水半乳糖的這些化合物包括，例如可溶性糖類，其非還原性末端為除了L-半乳糖-6-硫酸酯的糖，例如除了瓊脂二糖和κ-carabiose之外的在其還原性末端具有瓊脂二糖、κ-carabiose或3,6-脫水半乳糖的的寡糖。沉香寡糖，即其非還原性末端為L-半乳糖的糖類是非常適合用于前藥的。
本發明的含有3,6-脫水半乳糖物質的實例包括(但不局限于)來自于紅藻的粘多糖如瓊脂、瓊脂糖、瓊脂膠、海蘿聚糖、紫菜聚糖、角叉膠、紅藻膠和沙菜糖(hypnean)[Kyoritsu-shuppan公司，“Tatouseikagaku 1-Kagakuhen-(多糖的生物化學1-化學-)，第314頁(1969)1。在本發明中使用的含有3,6-脫水半乳糖的物質也包括含有這些多糖的物質。
例如，屬于石花菜科(Gelidiaceae)如石花菜(Gelidium amansii)、中肋石花菜(Gelidium Japonicum)、大石花菜(Gelidium Pacifium)、扁平石花菜(Gelidium subcostatum)、雞毛菜(Pterocladia tenuis)和日本刺盾藻(AcanthopeltisJaponica)的紅藻，屬于江蘺科(Gracilariaceae)如江蘺(Gracilaria verrucosa)和粗江蘺(Gracilaria gigas)的紅藻，屬于仙菜科(Ceramiaceae)如二叉仙菜(Ceramium kondoi)和鉤凝菜(Campylaephora hypnaeoides)的紅藻以及用作瓊脂糖和瓊脂膠原料的其它的紅藻。通常幾種藻作為原料以組合的形式使用。通過用熱水提取原料藻并然后冷卻提取液得到石花菜凝膠。通過冷凍脫水或壓縮脫水并干燥，經從石花菜凝膠除去水得到瓊脂。瓊脂正常含有大約70％的瓊脂糖和大約30％的瓊脂膠。將瓊脂進一步純化能夠制備具有高純度的瓊脂糖。
本發明中使用的含有3,6-脫水半乳糖的物質包括以上提到的原料藻如瓊脂、石花菜凝膠、瓊脂、純化的瓊脂糖、純化的瓊脂膠和在這些物質的生產過程中得到的中間體產物或副產物。
在太陽下曬干的藻經常用作原料。新鮮的藻和干燥的藻兩者均可用于本發明。也可使用其在干燥期間被噴水漂白的藻，所謂的漂白的原料藻。不管藻源，可使用以多種形式包括以條、帶、板、線和粉末形式存在的瓊脂。能夠使用含有多種瓊脂糖內容物的具有低純度或高純度的純化的瓊脂糖。
瓊脂糖為具有其中D-半乳糖和3,6-脫水-L-半乳糖交替連接在一起的基本結構的多糖。在該結構中，D-半乳糖的1-位通過β-糖苷鍵連接到3,6-脫水-L-半乳糖的4-位，并且3,6-脫水-L-半乳糖的1-位通過α-糖苷鍵連接到D-半乳糖的3-位。通過用稀酸或α-瓊脂酶(agarase)溫和地水解，該α-1,3-鍵被選擇性地水解[Carbohydr.Res.,66:207(1978)]。通過β-瓊脂酶該β-1,4-鍵被選擇性地水解。
角叉菜膠為屬于杉海苔科(Gigartinaceae)、紅翎菜科(Solieriaceae)、沙菜科(Hypneaceae)等的紅藻中含有的多糖。κ-角叉菜膠、入-角叉菜膠和η-角叉菜膠是已知的。κ-角叉菜膠具有基本結構，其中D-半乳糖-4-硫酸酯的1-位通過β-糖苷鍵連接到3,6-脫水-D-半乳糖的4-位,3,6-脫水-D-半乳糖的1-位通過α-糖苷鍵連接到D-半乳糖-4-硫酸酯的3-位，并且它們交替重復。λ-角叉菜膠具有基本結構，其中D-半乳糖的1-位通過β-糖苷鍵連接到D-半乳糖-2,6-二硫酸酯的4-位，D-半乳糖-2,6-二硫酸酯的1-位通過α-糖苷鍵連接到D-半乳糖的3-位，并且它們交替重復。角叉菜膠作為用于食物的凝膠劑使用。
通過化學的、物理的和/或酶法得到的含有3,6-脫水半乳糖的物質的部分分解產物也能使用本發明的含有3,6-脫水半乳糖的物質。此外，在其還原性末端具有3,6-脫水半乳糖的化合物可通過利用化學的、物理的和/或酶法部分分解含有3,6-脫水半乳糖的物質進行制備。
依目的而定，在本發明中可使用含有在其還原性末端具有3,6-脫水半乳糖的化合物的純化的、部分純化的或粗品的物質。
含有3,6-脫水半乳糖的物質的化學分解方法的實例包括在低于pH7的酸性條件下水解。物理分解方法的實例包括電磁波或超聲波輻射。酶消化法的實例包括用水解酶例如瓊脂酶和角叉菜膠酶的水解。
對在低于pH7的酸性條件下分解含有3,6-脫水半乳糖的物質的條件不局限于特定的某一種，只要所述分解產生在其還原性末端具有3,6-脫水半乳糖的化合物，例如，除了瓊脂二糖和κ-carabiose之外的在其還原性末端具有瓊脂二糖、κ-carabiose或3,6-脫水半乳糖的化合物。
例如，通過將含有3,6-脫水半乳糖的材料溶解或懸浮于濃度在0.0001至5N的酸中并使該混合物反應幾秒至幾天之后，生成在其還原性末端具有3,6-脫水半乳糖的化合物。通過在反應期間加熱該混合物，來縮短生成在其還原性末端具有3,6-脫水半乳糖的化合物所需要的反應時間。
任何酸能夠用于溶解或懸浮含有3,6-脫水半乳糖的物質。無機酸如鹽酸、硫酸和硝酸以及有機酸如枸櫞酸、甲酸、乙酸、乳酸和抗壞血酸可被使用。在0.0001至5 N的濃度下不加限制，優選為0.001至1 N的濃度下使用酸。此外，所述反應可在0至200℃(不加限制)，優選在20至130℃的溫度下進行。另外，所述反應可進行幾秒至幾天不加限制。可適宜地選擇酸和它的濃度、反應溫度和時間。這樣的選擇依以下因素而定用作原料的含有3,6-脫水半乳糖的物質如瓊脂糖或角叉菜膠，在其相關的還原性末端具有3,6-脫水半乳糖的化合物如瓊脂二糖和κ-carabiose，以及除了瓊脂二糖和κ-carabiose外在其還原性末端具有3,6-脫水半乳糖的化合物的產率，和除了瓊脂二糖和κ-carabiose外在其相關的還原性末端具有3,6-脫水半乳糖的化合物的聚合度。通過選擇強酸而非弱酸、高的酸濃度而非低的酸濃度，及高的溫度而非低的溫度，通常可使酸分解反應更迅速地進行。
例如，通過將瓊脂在10％(重量)的濃度下懸浮于0.1NHCl中并通過在100℃下將瓊脂加熱13分鐘來溶解所得到的酸分解產物不再凝膠化，即使把該溶液冷卻至它的凝固點。當用凝膠過濾法HPLC、正相HPLC等分析在溶液中含有的糖類時，幾乎觀察不到具有高分子量的糖類并且發現大多數糖類分解成為由10或更少的糖構成的可溶性糖類。
例如，在本發明中使用的除了瓊脂二糖和κ-carabiose外的其還原性末端具有3,6-脫水半乳糖的化合物為不加限制其中糖連接于羥基(hydroxide)而不是連接在3,6-脫水半乳糖的1-位的化合物。它們的實例包括通過用酸分解或用α-瓊脂酶消化瓊脂糖如瓊脂二糖、瓊脂四糖、瓊脂六糖、瓊脂八糖和瓊脂十糖所得到的產物。此外，通過用酸分解或用角叉菜膠酶消化角叉菜膠所得到的產物也能夠被舉例說明。此外，在本發明中使用的在它們的還原性末端具有3,6-脫水半乳糖的除了瓊脂二糖和κ-carabiose的化合物包括其中選自以下的一個或多個被連接于羥基而不是連接于3,6-脫水半乳糖的1-位的那些化合物己糖如葡萄糖、甘露糖和半乳糖、戊糖如木糖、阿拉伯糖和核糖、糖醛酸如葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸和gluronic酸、氨基糖如葡糖胺和半乳糖胺、唾液酸如N-乙酰基神經氨糖酸、脫氧糖如巖藻糖、以及它們的酯、酰胺和/或內酯。另外，以下也被定義為在本發明中使用的在它們的還原性末端具有3,6-脫水半乳糖的除了瓊脂二糖和κ-carabiose的化合物其中丙酮酸酯基團和/或硫酸酯基團連接于瓊脂二糖、κ-carabiose的那些化合物或者在其還原性末端具有3,6-脫水半乳糖的除了瓊脂二糖和κ-carabiose的化合物、以及其羥基被甲基化的化合物。
由于在還原性末端的3,6-脫水半乳糖的1-位碳為端基差向異構體碳，對在其還原性末端具有3,6-脫水半乳糖的化合物存在α-異構體和β-異構體。兩者在本發明中能夠作為其還原性末端具有3,6-脫水半乳糖的化合物被使用。此外，在還原性末端的3,6-脫水半乳糖的1-位具有醛的化合物也能夠作為其還原性末端具有3,6-脫水半乳糖的化合物使用。可使用3,6-脫水半乳糖的D-異構體或L-異構體。另外，也能夠使用α-異構體、β-異構體和醛的混合物以及D-異構體和L-異構體的化合物。
在中性至堿性條件下，通過處理在其還原性末端具有3,6-脫水半乳糖的化合物(例如在其還原性末端具有瓊脂二糖、κ-carabiose或3,6-脫水半乳糖的除了瓊脂二糖和κ-carabiose以外的化合物)，能夠得到本發明本發明的編程性細胞死亡-誘導物質。通過在低于pH 7的酸分解和/或酶消化含有3,6-脫水半乳糖的物質，隨后通過在中性至堿性條件下處理酸分解和/或酶消化的產物，也能夠得到它們。
在pH 7以上的堿性條件下，在處理化合物中，任何堿能夠用來溶解或者懸浮至少一種選自在其還原性末端具有3,6-脫水半乳糖的化合物的化合物，例如在其還原性末端具有瓊脂二糖、κ-carabiose或3,6-脫水半乳糖的除了瓊脂二糖和κ-carabiose以外的化合物。可以使用無機堿如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣和銨以及有機堿例如tris、乙胺和三乙胺。在0.0001至5N，優選為0.001至1N不加限制濃度下使用該堿。另外，在0-200℃，優選為20-130℃不加限制的溫度下，進行該反應。此外，該反應可進行幾秒至幾天(不加限制)。可適宜選擇堿和它們的濃度、反應溫度和時間。這樣的選擇依以下因素而定作為原料使用的化合物、相關的編程性細胞死亡-誘導物質的收率。一般通過選擇高的堿濃度而不是低的堿濃度(盡管可使用任何高于7的pH)和高的溫度而不是低的溫度可容易地進行本發明編程性細胞死亡-誘導物質的生成過程。
例如，通過制備在pH11.5下的瓊脂二糖和κ-carabiose并在37℃下孵育其5分鐘，生成本發明編程性細胞死亡-誘導物質。
依目的而定，可使用在中和之后的含有由此生成的編程性細胞死亡-誘導的物質的堿性溶液或者使用作為pH低于7以下的酸性溶液。
例如，通過使用抑制腫瘤細胞的抗增殖活性作為指標，能夠測量本發明編程性細胞死亡-誘導物質的編程性細胞死亡-誘導活性。通過使用活性作為指標，能夠純化本發明編程性細胞死亡-誘導物質。能夠使用包括化學和物理方法的已知純化方法。使用純化方法如凝膠過濾法、使用分子量分級分膜的分離法、溶劑提取法和使用離子交換樹脂的多種層析法或者像這樣方法的組合能夠純化所述物質。
通過以上描述的式(Ⅰ)化合物，舉例說明以純化形式存在的本發明編程性細胞死亡-誘導的物質。
例如，通過從在中性至堿性條件下處理瓊脂二糖得到的產物中純化其中X為CH2OH和Y為H的式(Ⅰ)化合物。另一方面，通過從在中性至堿性條件下處理κ-carabiose得到的產物中純化其中X為H和Y為CH2OH的式(Ⅰ)化合物在如同以上描述的中性至堿性條件下，通過處理3,6-脫水半乳糖或其還原性末端具有3,6-脫水半乳糖的化合物(例如除了瓊脂二糖和k-carabiose之外的在其還原性末端具有瓊脂二糖、κ-carabiose或3,6-脫水半乳糖的化合物)，生成本發明所使用的式(Ⅰ)化合物。本發明包括在本發明中使用的式(Ⅰ)化合物以及目標為發揮其生理活性的3,6-脫水半乳糖和/或在其還原性末端具有3,6-脫水半乳糖的化合物的用途。
本發明包括目標在于體內產生本發明式(Ⅰ)化合物活性的前藥的用途。具有與器官或組織有親和力的配體的3,6-脫水半乳糖優選用作前藥。在結合進入到細胞中后，這樣的前藥在生理條件下轉化為式(Ⅰ)化合物并發揮多種生理功能。在其它方面中，半乳糖作為配體被舉例說明。通過使用半乳糖作為配體，實現對肝組織有效的靶向結合。具有這樣配體的化合物包括瓊脂寡糖，例如在其非還原性末端具有半乳糖的瓊脂二糖、瓊脂六糖和瓊脂八糖。所述瓊脂寡糖用作前藥。
人們已長期服用在它們的非還原性末端具有半乳糖的瓊脂寡糖。在中性或堿性條件下，在還原性末端的3,6-脫水半乳糖游離并轉化為式(Ⅰ)化合物后，瓊脂寡糖發揮其生理活性作用。即作為前藥吸收進入生命體的瓊脂寡糖轉化為式(Ⅰ)化合物來發揮其生理活性。瓊脂寡糖具有用于其有效吸收的適宜的分子量。因此，它們易于在消化道吸收。此外，在其非還原性末端的半乳糖能夠使瓊脂寡糖在肝吸收活化并經肝便利其在血流中循環。吸收后，在其對非還原性末端的半乳糖具有親和性的組織的局部位點上，瓊脂寡糖轉化為式(Ⅰ)化合物以發揮其生理活性。因此，瓊脂寡糖能夠作為前藥給藥，其為高穩定的、有效結合的并以濃集狀態在局部位點轉化為式(Ⅰ)化合物以發揮其生理活性。
式(Ⅰ)化合物的鹽包括藥學上可接受的鹽。能夠使用已知方法將所述化合物轉化為鹽。
在通過使式(Ⅰ)化合物與含有SH基團的化合物反應得到的反應混合物中，生成在本發明中使用的式(Ⅱ)化合物。
所使用含有SH基團的化合物的實例包括(但不局限于)甲硫醇、丁硫醇、巰基乙醇、含有SH基團的氨基酸和含有SH基團的氨基酸衍生物。含有SH基團的氨基酸的實例包括半胱氨酸和高半胱氨酸。
含有SH基團的氨基酸衍生物的實例包括以上提及的氨基酸例如半胱氨酸衍生物、含有半胱氨酸的肽類和含有半胱氨酸衍生物的肽類。含有半胱氨酸的肽類并不局制于特殊的肽類，只要所述肽含有作為其成分的半胱氨酸。本發明的含有半胱氨酸的肽類包括小分子例如寡肽(如谷胱甘肽)和大分子例如蛋白質。另外，在反應期間生成含有半胱氨酸和高半胱氨酸的肽類的條件下，例如在還原條件下，通過混合處理含有胱氨酸和高胱氨酸的肽類可使其用作本發明的含有半胱氨酸和高半胱氨酸的肽類。含有半胱氨酸的肽類也包括含有糖類、類脂等的含有半胱氨酸的肽類。或者，也可使用如同以上描述的多種物質的鹽、酸酐、酯等。
可在已知反應條件下，進行用于生成式(Ⅱ)化合物的式(Ⅰ)化合物與含有SH基團的化合物之間反應。在其中含有SH基團的化合物的SH基團為反應活性的任何條件下，可進行所述反應。
包括化學和物理方法在內的已知純化方法能夠用于純化和分離由式(Ⅰ)化合物與含有SH基團的化合物或它們衍生物反應所生成的式(Ⅱ)化合物。
例如，在體內式(Ⅰ)化合物與含有SH基團的化合物例如半胱氨酸和谷胱甘肽反應，生成由式(Ⅱ)表示的用作藥物的代謝衍生物。因此，也能夠通過給予式(Ⅰ)化合物得到經所述代謝衍生物發揮的藥物的效力。由此，本發明包括目標在于體內生成式(Ⅱ)化合物的式(Ⅰ)化合物的用途。
式(Ⅱ)化合物的鹽包括藥學上可接受的鹽。已知方法能夠用于將所述化合物轉化為鹽。
在本發明中使用的式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物以及它們的鹽具有以下生理活性，例如編程性細胞死亡-誘導活性、制癌活性、抗氧化活性如抑制活性氧產成的活性、抑制脂質過氧化自由基生成的活性和抑制一氧化氮生成的活性、對病原性微生物的抗微生物活性、抗突變活性、抑制α-糖苷酶活性、免疫調節活性、抑制前列腺素合成活性、抗炎活性、抗變態活性、調節細胞因子生成活性、抗風濕活性、抗糖尿病活性、抑制滑液細胞增殖活性和誘導熱休克蛋白生成的活性。基于這些活性，使用選自式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物以及它們的鹽作為活性成分的化合物能夠生產用于治療或預防以下疾病的藥用組合物。這樣的疾病包括需要誘導編程性細胞死亡以用于其治療或預防的疾病、癌性疾病、需要抑制活性氧的生成以用于其治療或預防的疾病、需要抑制脂質過氧化自由基生成以用于其治療或預防的疾病、需要抑制一氧化氮的產生以用于其治療或預防的疾病、由病原性微生物引起的疾病、由突變原引起的疾病、需要抑制α-糖苷酶以用于其治療或預防的疾病、需要免疫調節以用于其治療或預防的疾病、需要抑制前列腺素合成以用于其治療或預防的疾病、需要抑制炎癥以用于其治療或預防的疾病、需要抑制變態反應以用于其治療或預防的疾病、需要調控抑制細胞因子的產生以用于其治療或預防的疾病、風濕病、糖尿病、需要抑制滑液細胞增殖以用于其治療或預防的疾病和需要誘導熱休克蛋白生成以用于其治療或預防的疾病。換言之，能夠生產以下藥用組合物用于誘導編程性細胞死亡的組合物、制癌組合物、抗氧化組合物例如抑制活性氧生成的組合物、抑制脂質過氧化自由基生成的組合物和用于抑制一氧化氮生成的組合物、抗微生物組合物、抗病毒組合物、抗突變組合物、抗高血糖組合物、抗高血脂組合物、免疫調節組合物、用于抑制前列腺素合成的組合物、抗炎組合物、抗變態組合物、調節細胞因子產生的組合物、抑制滑液細胞增殖的組合物、抗風濕組合物、抗糖尿病組合物和用于誘導熱休克蛋白產生的組合物。
本發明用于誘導編程性細胞死亡的組合物，其包含選自式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它們的鹽作為活性成分，用于消除患有自身免疫疾病的患者的自動反應淋巴細胞、腫瘤細胞、病毒感染的細胞等。通過在要求的組織或細胞中誘導編程性細胞死亡，組合物能夠用于消除以自然方式存在的來自生命體的不必要的或有害的細胞。本發明用于誘導編程性細胞死亡的組合物對之有效的疾病的實例包括自身免疫疾病例如系統紅斑狼瘡、免疫介導的腎小球性腎炎、多發性硬化癥和膠原疾病、和風濕癥。
本發明的用于誘導編程性細胞死亡的組合物能夠用于誘導編程性細胞死亡的方法中。所述方法用于說明編程性細胞死亡的誘導作用機制、以及篩選編程性細胞死亡誘導劑和編程性細胞死亡誘導作用的抑制劑。
酪蛋白酶(caspase)抑制劑如IL-1β轉化酶抑制劑V[Z-Val-Ala-DL-Asp(OMe)-氟代甲基酮Takara Shuzo]能夠抑制本發明用于誘導編程性細胞死亡的組合物的編程性細胞死亡-誘導活性。因此，由所述組合物誘導的編程性細胞死亡被認為是由于依賴酪蛋白酶的編程性細胞死亡的細胞死亡。
已證實酪蛋白酶作為對以下原因的編程性細胞死亡的重要介質起作用在多種細胞死亡之前它會增加；其過度表達誘導細胞死亡。肽抑制劑或抑制蛋白例如CrmA和p35抑制編程性細胞死亡；并且與正常小鼠相比較，編程性細胞死亡在對酪蛋白酶-1或酪蛋白酶-3的剔除小鼠上被部分抑制[Seikagaku(生物化學)，70:14-21(1998)]。即在編程性細胞死亡過程期間半胱氨酸蛋白酶、酪蛋白酶被活化，以降解核蛋白或細胞漿蛋白。酪蛋白酶被首先合成為前體并然后經加工活化。酪蛋白酶活化途徑的調節決定細胞的死亡。哺乳動物具有10種或更多類型的酪蛋白酶。上流酪蛋白酶處理下流酪蛋白酶以級聯模式增強細胞內蛋白水解活性[Saibo kogaku(細胞技術)，17:875-880(1998)]。相反，使用半胱氨酸蛋白酶、酪蛋白酶抑制劑抑制加工活性能夠停止由于酪蛋白酶依賴的編程性細胞死亡的細胞死亡。
在本發明中使用的式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它們的鹽用于抑制氧化物質例如活性氧的生成。因此，含有作為其活性成分的化合物的抗氧化劑組合物例如抑制活性氧生成的組合物用于治療或預防由活性氧的生成和/或過量引起的疾病。
活性氧一般分類為自由基活性氧和非自由基活性氧。自由基活性氧包括羥基自由基、羥基過氧化自由基、過氧化自由基、烷氧基自由基、二氧化氮、一氧化氮(下文稱作NO)、硫自由基(thylradical)和超氧化物。另一方面，非自由基活性氧包括單態氧、過氧化氫、脂質過氧化氫、次氯酸、臭氧和過氧化亞硝酸鹽。它們全部參與多種病理狀態例如各種炎性疾病、糖尿病、癌癥、動脈硬化、神經疾病和局部缺血再灌注疾病。
通過生命體內的多種途徑，活性氧總是在低濃度下即可產生。因此生成的活性氧是不可避免的并且如下包括從電子傳遞系統例如在線粒體中生理滲出的超氧化物和過氧化氫，由過渡金屬例如銅和鐵催化產生的羥基自由基，通過用于防御感染的中性細胞或單細胞生成的次氯酸和通過精氨酸分解產生的NO。生命體具有消除活性氧的系統，包括酶和抗活性氧生成的小分子化合物，以維持生成與消除之間的平衡。然而，如果生成系統由于某些原因活化或與之相反由于消除系統不活化，所述生成系統超過消除系統占據主導地位時，生命體受到氧化損害。這樣的狀況被稱之為氧化應激。此外，除了內部失去平衡以外，由于外界物質例如大氣和食物的原因，生命體總是暴露于氧化應激狀態。因此，在每個人的日常生活中，氧化應激是不可避免的。
換言之，生命體總是暴露于導致由氧化應激引起的或者由于氧化應激導致的疾病癥狀的惡化的環境中，氧化應激與以上描述的多種疾病有關。因此，本發明抗氧化組合物例如抑制活性氧生成的組合物也用于預防或治療由于氧化應激引起的疾病或者預防由于氧化應激引起的疾病狀態的惡化。
脂質過氧化反應總是與氧化應激有關。脂質過氧化自由基一旦生成，反應即可發生。在所述反應生成的4-羥基-2-壬醛(nonenal)(HNE)為有毒性的醛，其特異性針對谷胱甘肽或蛋白質。在多種疾病組織中探測到HNE和蛋白質之間的反應產物并且認為其是與氧化應激有關的疾病狀態的誘導劑。相應地，在本發明中使用的含有抗氧化物質(例如選自式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它們的鹽的化合物)的抗氧化組合物，能夠抑制脂質過氧化物自由基，它作為活性成分用于治療或預防由于氧化應激引起的與老年相關的疾病。
NO為內皮細胞衍生舒血管因子(EDRF)的必需成分[自然，327:524-526(1987)]。本發明提供治療或預防需要抑制NO的生成以用于其治療或預防的疾病的藥用組合物。
本發明的需要抑制NO的生成以用于其治療或預防的疾病的實例包括(但不局限于)由中毒性休克、用細胞因子等治療引起的系統性低血壓、血壓應答降低、糖尿病、血管機能障礙、疾病引起的血管擴張、組織損傷、心血管局部缺血、痛覺過敏、大腦局部缺血、伴隨血管形成的疾病、癌癥等。
一氧化氮合成酶(NOS)產生L-瓜氨酸和來自L-精氨酸和氧的NO。對NOSs已知的是為組成型表達的cNOS和為誘導型的iNOS。通過用細胞毒素或細胞因子例如LPS和IFN-γ刺激來誘導iNOS，以在巨噬細胞等中生成NO。iNOS本身對維持有機體的系統是必需的。另一方面。已證實當iNOS由于多種因素過度表達時，它引起多種疾病并產生過量的NO。
本發明人已證實式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它們的鹽抑制iNOS的表達。通過使用Western印跡試驗在蛋白水平上并通過使用RT-PCR在信使RNA水平上進行以上證實。因此，選自在本發明中使用的式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它們的鹽的化合物抑制iNOS的表達，其是由于多種因素過度表達的，并導致過量的NO產生。由此，所述化合物在治療和預防需要抑制NO的產生以用于其治療和預防的疾病中是有效的。
在本發明中使用的式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它們的鹽抑制巨噬細胞中NO的生成。因此，它們用于治療和預防在巨噬細胞中由NO產生、致癌作用等引起的疾病。通過在本發明中使用的化合物抑制NO生成并不拮抗性抑制NO生成的誘導劑，例如LPS和IFN-γ。當預先加入在本發明中使用的化合物時，可增強抑制NO生成的作用。因此，作為用于預防抗氧化物質生成的組合物的活性成分，選自在本發明中使用的式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它們的鹽的化合物是非常有用的。
本發明的用于抑制NO生成的組合物對研究NO生成的機制和NO的作用模式是有用的并且能夠用于篩選參與NO生成機制的物質。
血管形成對實體腫瘤生長是必需的。血管內皮生長因子/血管通透因子(VEGF)在該過程中起重要作用。NO在多種腫瘤細胞中誘導VEGF。通過抑制NO生成且由此抑制癌細胞周圍的血管形成，本發明用于抑制NO生成的組合物也抑制腫瘤細胞中VEGF的生成。當把本發明用于抑制NO生成的組合物給予其中已將腫瘤細胞皮下植入以形成實體癌的小鼠時，癌組織周圍的血管形成變得不充分并且癌脫落。
亞硝胺為一系列其中亞硝基連接于仲胺的化合物。本領域已知的幾百種類型的亞硝胺中許多種物質在動物上通過損害它們的DNA顯示致癌活性。亞硝胺被認為與人體的致癌作用具有很深的關系。通過在胃中的亞硝酸鹽與胺的反應生成亞硝胺。在中性pH下，NO通過與處于生理條件下的胺反應產生亞硝胺。在患有華支睪吸蟲病或肝硬變的患者中，NO的生成增加，其在流行病學方面與癌癥具有高度相關性。因此，通過給予本發明用于抑制NO生成的組合物以預防NO生成的增加，尤其能夠預防高風險基團的致癌性。如同以上描述的那樣，本發明用于抑制NO生成的組合物以兩個步驟顯示它們的抑制癌的活性，即抑制致癌作用和抑制癌組織中血管形成。
在本發明中使用的化合物由于兩種協同作用而發揮其制癌活性。一種是誘導編程性細胞死亡以殺死腫瘤細胞的直接作用，另一種是通過抑制涉及由NO誘導的VEGF的血管形成迫使腫瘤細胞死亡的間接作用，該作用通過抑制在腫瘤細胞中NO的產生來完成。
NO也誘導在炎癥病灶顯著觀察到的水腫。換言之，其增加血管通透性[Maeda等，日本癌癥研究雜志，85:331-334(1994)]。NO增加為炎性介質的前列腺素的生物合成[Salvemini等，Proceedings of NationalAcademy of Sciences,USA,90:7240-7244(1993)]。另一方面，NO迅速與超氧化物自由基反應，生成過氧化亞硝酸鹽離子。該過氧化亞硝酸鹽離子被認為引起細胞和組織的炎性損傷。
當活化的免疫細胞進入器官并釋放細胞因子時，誘導產生NO。通過特異性破壞β細胞引起胰島素依賴的糖尿病，這種破壞被認為是由NO引起的。在患有類風濕性關節炎、骨質疏松、痛風性關節炎或與培吉特氏病有關的關節炎患者的病灶中滑液流體含有比相同患者的正常關節或者健康個體的關節更高濃度的NO。當把本發明的抑制NO產生的組合物給予這樣的患者時，抑制了在所述病灶中NO的生成，從而導致疾病癥狀態改善。
在大腦缺血期間和再灌注后，NO生成增加，導致腦組織損傷。在大腦局部缺血期間，將本發明用于抑制NO生成的組合物給予患者緩解腦組織損傷并改善其預后。
花生四烯酸代謝極大地參與炎癥的發生和組織損傷。通過環加氧酶的作用，細胞膜上衍生于磷脂的花生四烯酸在體內代謝為前列腺素、前列環素和血栓烷。在它們當中，前列腺素具有血管擴張活性并導致流至器官血流增加的活性。特別是由于它們的增加血流的活性，前列腺素E2和I2增加水腫和白細胞在炎癥部位的浸潤。因此，通過給予本發明用于抑制前列腺素E2合成的組合物來抑制前列腺素的生物而合成發揮鎮靜和抗炎活性。此外，白細胞浸潤進入炎癥部位產生活性氧和引起氧化應激癥狀。因此，抑制前列腺素生物合成的本發明用于抑制前列腺素E2合成的組合物也用于預防、治療或者用于預防如同以上描述的由氧化應激引起的多種疾病的惡化。
另外，NO誘導在炎癥病灶顯著觀察到的水腫，即增加血管通透性和增加為如上描述的炎性介質的前列腺素的生物合成。本發明抑制NO生成的作用和抑制前列腺素E2合成的作用發揮協同效果以顯示鎮靜和抗炎活性以及在預防、治療或者預防由氧化應激引起的多種疾病惡化中起協同作用。本發明的免疫調節組合物具有免疫調節活性例如抑制淋巴細胞的胚細胞樣轉化活性(blastogenesis)和抑制混合型淋巴細胞反應的活性。因此，本發明的免疫調節組合物作為治療或預防由于免疫系統或免疫因子異常引起的疾病的藥用組合物是有用的。
淋巴細胞胚細胞樣轉化為一種其中促分裂原結合于淋巴細胞表面的受體以活化淋巴細胞并且促進其分化與增殖的反應。混合的淋巴細胞反應為一種其中從冷血動物得到的淋巴細胞被混合并培養，由此誘導由于主要的組織相容性抗原的不相容性導致的淋巴細胞活化以促進淋巴細胞分化與增殖的反應。本發明免疫調節組合物抑制這些反應并特別用于治療或預防由于淋巴細胞異常增加引起的慢性疾病，例如自身免疫疾病如慢性腎炎、慢性結腸炎、Ⅰ型糖尿病和類風濕性關節炎并且也用于抑制移植排斥反應。
式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它們的鹽具有誘導熱休克蛋白例如70-kDa熱休克蛋白(HSP70)的活性。它們具有對RNA病毒和DNA病毒例如肝炎病毒、AIDS病毒、流感病毒、皰癥性口腔炎病毒和皰疹病毒的抗病毒活性。熱休克蛋白參與腫瘤免疫。因此，這些化合物對于腫瘤免疫也是有效的。另外，熱休克蛋白參與生物防御包括抗炎作用。因此，通過給予式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它們的鹽能夠預防或治療病毒疾病例如由于流感病毒引起的感冒。
通過使用選自式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它們的鹽的化合物作為其活性成分的并且與已知的藥用載體一起配制，能夠制備本發明用于誘導編程性細胞死亡的組合物。該組合物一般與藥學上可接受的液體或固體載體并且任選與溶劑、分散劑、乳化劑、緩沖劑、穩定劑、賦形劑、粘合劑、崩解劑、潤滑劑等一起混合來配制它。該制劑可以固體制劑例如片劑、顆粒劑、散劑、粉劑和膠囊劑或者以液體制劑例如正常溶液劑、混懸劑和乳劑的形式存在。另外，該組合物可配制成為干燥制劑，其臨用前通過加入適宜的載體能夠重新配制成為液體制劑。
本發明用于誘導編程性細胞死亡的組合物能夠作為口服制劑或非腸道制劑例如注射制劑和滴劑給藥。
按照以上提及的特別的給藥途徑和劑型可以選擇藥用載體。對口服制劑，使用例如淀粉、乳糖、蔗糖、甘露糖醇、羧甲基纖維素、玉米淀粉、無機鹽等。在口服制劑中也可以包括粘合劑、崩解劑、表面活性劑、潤滑劑、流體促進劑、調味劑、著色劑、矯味劑等。
按照常規方法，通過將本發明活性成分即選自式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它們的鹽的化合物溶解或者懸浮于稀釋劑中來制備非腸道制劑，這些稀釋劑包括注射蒸餾水、生理鹽水、葡萄糖水溶液、注射用植物油、芝麻油、花生油、豆油、玉米油、丙二醇和聚乙二醇。可任選將滅菌劑、穩定劑、等滲調節劑、平滑劑等加入到溶液或混懸液中。
通過對組合物的劑型適宜的途徑給予本發明用于誘導編程性細胞死亡的組合物。給藥途徑不局限于特殊的途徑。經內部或外部(或局部)或者經注射給予所述組合物。例如，能夠經靜脈、肌內、皮下、皮內等給予注射制劑。外用制劑包括栓劑。
適當確定本發明用于誘導編程性細胞死亡的組合物的劑量并且依照具體劑型、給藥途徑和目的以及所治療患者的年齡、體重和癥狀而變化。根據在制劑中含有的活性成分的量，成人每天劑量一般為10μg至200mg/kg。當然，劑量能夠依照多種因素變化。因此，在一些情況下，比以上更小的劑量可能是足夠的，但是在另一些情況下，可能需要比以上更多的劑量。本發明的藥用組合物可以其本身那樣口服給藥，或者能夠通過加入到選擇的日常食物和飲料中服用。
通過使用作為其活性成分的選自式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它們的鹽的化合物并且其與已知的藥用載體一起配制，能夠制備本發明制癌組合物。按照如同以上描述的與誘導編程性細胞死亡的組合物的相同方法制備制癌組合物。
通過對所述組合物劑型適宜的途徑給予制癌組合物。給藥途徑不局限于特殊的途徑。內部或外部(或局部)或者經注射給予組合物。例如，靜脈、肌內、皮下、皮內等給予注射制劑。外用制劑包括栓劑。
適當確定制癌組合物的劑量并且依照具體劑型、給藥途徑和目的以及所治療患者的年齡、體重和癥狀而變化。根據在制劑中含有的活性成分的量，成人每天劑量一般為10μg至200mg/kg。當然，劑量能夠依照多種因素變化。因此，在一些情況下，比以上更小的劑量可能是足夠的，但是在另一些情況下，可能需要比以上更多的劑量。本發明的藥用組合物可以其本身那樣口服給藥，或者其能夠通過加入到選擇的日常食物和飲料中服用。
風濕病是一種其中骨細胞和軟骨細胞被損害的自身免疫疾病。式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它們的鹽在滑液細胞上具有編程性細胞死亡-誘導活性。因此，通過使用作為其活性成分的選自式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它們的鹽的化合物并與已知藥用載體一起配制，能夠制備抗風濕組合物。按照以上描述的相同方法，能夠制備抗風濕組合物。
抗風濕組合物能夠作為口服制劑或非腸道制劑例如注射制劑和滴劑給藥。
按照以上提及的具體給藥途徑和劑型能夠選擇藥用載體并且可按照以上描述的與誘導編程性細胞死亡有關的組合物的相同方法使用。
通過對所述組合物劑型適宜的途徑給予抗風濕組合物。給藥途徑不局限于特殊的途徑。可以內用或外用(或局部)或者經注射給予組合物。例如，靜脈、肌內、皮下、皮內等給予注射制劑。外用制劑包括栓劑。
適當確定含有作為其活性成分選自式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它們的鹽的化合物的抗風濕組合物的劑量并且依照具體劑型、給藥途徑和目的以及所治療患者的年齡、體重和癥狀而變化。根據在制劑中含有的活性成分的量，成人每天劑量一般為0.01至50mg，優選為0.1至10mg。當然，劑量能夠依照多種因素變化。因此，在一些情況下，比以上更小的劑量可能是足夠的，但是在另一些情況下，可能需要比以上更多的劑量。本發明藥用組合物可以以其本身那樣口服給藥，或者能夠通過加入到選擇的食物和飲料中日常服用。
另外，通過使用作為其活性成分的選自式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它們的鹽的化合物，按照如同以上描述的與誘導編程性細胞死亡的組合物有關的相同方法制備以下組合物抗氧化組合物、用于抑制活性氧的生成的組合物、用于抑制脂質過氧化自由基生成的組合物、用于抑制NO生成的組合物、對病原性微生物的抗微生物組合物、抗突變組合物、用于抑制前列腺素合成的組合物、用于抑制滑液細胞增殖的組合物、用于誘導熱休克蛋白的組合物和抗病毒組合物。依疾病而定可使用如上所述的與誘導編程性細胞死亡有關的組合物的相同劑量和給藥途徑。
式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它們的鹽對多種α-糖苷酶例如蔗糖酶和麥芽糖酶顯示抑制活性。因此，使用作為活性成分的式(Ⅰ)化合物能夠制備抗高血糖組合物、抗高血脂組合物、抗肥胖組合物、抗糖尿病組合物等。按照與上述用于誘導編程性細胞死亡的組合物有關的相同方法能夠制備這樣的藥用組合物。依疾病而定能夠使用以上描述的與用于誘導編程性細胞死亡的組合物有關的相同劑量和給藥途徑。按照常規方法，使用作為其活性成分的選自式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它們的鹽的化合物，能夠制備用于抑制-糖苷酶的組合物。使用抑制α-糖苷酶的組合物，能夠進行抑制α-糖苷酶的方法。
本發明提供含有選自式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它們的鹽的化合物的食品或飲料，這些飲料或食品可通過稀釋所述化合物來生產和/或通過向其中加入所述化合物來生產。本發明的食品或飲料具有誘導編程性細胞死亡的活性、制癌活性、抗氧化活性、對病原性微生物的抗微生物活性、抗突變活性、抑制前列腺素合成活性、誘導熱休克蛋白產生的活性、抗病毒活性、抑制α-糖苷酶活性等。因此，它對改善以下疾病狀態和預防對選自式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它們的鹽的化合物敏感的疾病是非常有用的，所述疾病包括例如需要誘導編程性細胞死亡以用于其治療或預防的疾病、癌性疾病、需要抑制活性氧的產生以用于其治療或預防的疾病、需要抑制NO產生以用于其治療或預防的疾病、由病原性微生物引起的疾病、由突變原、前列腺素合成等引起的疾病、需要誘導熱休克蛋白生成以用于其治療或預防的疾病、病毒性疾病、需要抑制α-糖苷酶以用于其治療或預防的疾病。
用于生產本發明食品或飲料的方法不局限于具體的方法。可以使用任何方法包括用于生產食品和飲料的烹飪、加工和其它一般使用的方法，只要生成的食品或飲料包含，通過向其中加入來生產的和/或通過稀釋來生產的，作為活性成分的選自式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它們的鹽的化合物。
例如，在食品或飲料的生產中，在中性至堿性條件下，通過處理3,6-脫水半乳糖和/或在其還原性末端含有3,6-脫水半乳糖的化合物，得到式(Ⅰ)化合物。通過在酸性條件下水解或酶消化具有3,6-脫水半乳糖的物質，得到3,6-脫水半乳糖和/或在其還原性末端具有3,6-脫水半乳糖的化合物。
例如，瓊脂、瓊脂糖和/或角叉菜膠能夠用作含有3,6-脫水半乳糖的物質。至少一種選自瓊脂二糖、κ-carabiose和在其還原性末端具有3,6-脫水半乳糖的除了瓊脂二糖、κ-carabiose之外的化合物能夠用作在其還原性末端含有3,6-脫水半乳糖的化合物。
在食品或飲料的生產中，本發明食品或飲料也包括含有式Ⅱ化合物的食品和飲料，它們是通過稀釋和/或通過向其中加入通過式(Ⅰ)化合物與含有SH基團的化合物之間的反應生成的式(Ⅱ)化合物來生產的。
本發明的食品或飲料不局限于特殊的食品或飲料并且它們的實例包括如下加工谷類食物的產品(例如麥粉產品、淀粉產品、預先混合的產品、面條、通心粉、面包、豆醬、蕎麥面條、麥麩面包、大米面條、凝膠面條和包裝大米餅)、加工脂肪和油類的產品(例如軟化脂和油、拌面油(tempura oil)、沙拉油、蛋黃醬和調味品)、加工的豆類產品(例如豆腐、日本豆醬和發酵豆類產品)、加工的肉類產品(例如火腿、熏豬肉、壓制的火腿和香腸)、加工的海產品(例如冷凍底棲魚類、煮熟的魚醬、煮熟的魚醬的管狀卷餅、底棲魚類做的餅、魚醬炸餡餅、魚丸、腱、魚肉火腿和香腸、熟鰹魚干、加工的魚卵產品、罐頭海產品和在甜味醬油中煮熟的魚)、日常產品(例如生奶、奶油、酸奶、黃油、干酪、煉乳、奶粉和冰淇淋)、加工蔬菜和水果產品(例如糊、果醬、腌菜、果汁、蔬菜飲料和混合飲料)、糖果(例如巧克力、餅干、甜小圓面包、蛋糕、米糕甜食和大米甜食)、酒精飲料(例如沙淇酒、中國釀酒(Chinese liquor)、葡萄酒、威士忌、蒸餾酒、伏特加、白蘭地、杜松子酒、郎姆酒、啤酒、軟酒精飲料、果酒和甜酒、奢侈品飲料(例如綠茶、茶、烏龍茶、咖啡、軟飲料和乳酸飲料)、調味品(例如醬油、醬汁、醋和甜米酒)、罐裝、瓶裝或袋裝食品(例如各種烹調食品如用烹調的牛肉和蔬菜形成頂部配料(topped)的大米飯、在小鍋中與肉和蔬菜一起煮沸的大米飯、與紅豆一起汽蒸的大米飯和咖喱食品)、半干或濃縮食品(例如肝糊、其它的涂抹食品、用于蕎麥面條或udon的湯和濃縮的湯)、干食品(例如速食面條、速食咖喱食品、速溶咖啡、果汁粉、湯粉、速食日本豆醬湯、烹調食品、烹調飲料和烹調的湯)、冷凍食品(例如日本式肉片火鍋、咀嚼玉米粥、烤鰻、碎牛肉、燒麥、用絞碎豬肉填塞的湯團、各種棒狀食品和水果雞尾酒)、固體或液體食品(例如湯)、加工的農業或森林產品(例如香料)、加工的家畜產品、加工的海產品等。
本發明食品或飲料含有顯示其生理功能的量的選自式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和及其鹽的化合物，所述食品或飲料是通過稀釋和/或通過向其中加入選自式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和及其鹽的化合物來生產的，它們的形式不局限于特殊的形式。所述食品或飲料可以是任何食用的形式如片劑、顆粒劑和膠囊劑。
本發明食品或飲料含有選自式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它們的鹽的化合物，它們具有生理活性。在攝取食品或飲料時，化合物的生理功能如編程性細胞死亡活性和制癌活性提供預防癌癥的作用、抑制癌癥的作用等。即本發明食品或飲料為具有改善對式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它們的鹽敏感的疾病狀態或預防對式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它們的鹽敏感的疾病的健康食品或飲料。它們特別用于保持胃腸道的健康。
另外，通過稀釋來生產的和/或通過向它們加入來生產的，含有選自式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它們的鹽的化合物的食品或飲料用作基于化合物抑制α-糖苷酶活性的抗高血糖、抗糖尿病、抗肥胖或抗高血脂的食品或飲料。
另外，式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它們的鹽具有抗氧化活性如抑制活性氧生成的活性和抑制脂質過氧化自由基生成的活性。因此，它們能夠作為抗氧化組合物用于抗氧化食品或飲料的生產中，所述抗氧化食品或飲料包括如抑制活性氧生成的組合物、用于抑制脂質過氧化自由基生成的組合物和用于抑制NO生成的組合物。
本發明抗氧化組合物制劑含有至少一種選自以上提及的化合物作為活性成分的化合物不局限于具體的某種化合物。按照常規方法，所述組合物能夠適宜于配制成例如粉劑、糊劑、乳劑等，這取決化合物被加入到的食品或飲料。通過使用本發明抗氧化組合物，能夠被便利地生產含有作為活性成分用于本發明化合物的食品或飲料。
本發明提供由式(Ⅰ)或式(Ⅱ)表示的抗氧化作用的化合物。
例如，通過在中性至堿性條件下處理經低于pH7的酸性條件下的酸性分解和/或酶消化含有3,6-脫水半乳糖的物質，能夠得到由式(Ⅰ)表示的抗氧化作用化合物。能夠使用純化的和部分純化的物質。
能夠使用的含有3,6-脫水半乳糖的物質的實例包括那些衍生于藻如瓊脂、瓊脂糖和/或角叉菜膠。
通過使式(Ⅰ)化合物與含有SH基團的化合物反應，能夠得到由式(Ⅱ)表示的用于抗氧化作用的化合物。能夠使用純化的和部分純化的物質。
本發明用于抗氧化作用的化合物用于消除或抑制生命體中氧化劑如活性氧的生成。因此，所述化合物用于改善由活性氧產生和/或過量引起的疾病狀態或預防由活性氧產生和/或過量引起的疾病。
如同以上描述的那樣，當生命體內用于生成活性氧的系統超過排除系統變得占據主導地位時，通過氧化損害生命體生成的氧化應激參與多種疾病過程。因此，生命體總是暴露于導致由氧化應激引起的疾病或疾病癥狀惡化的環境中。因而，每天服用適宜量的抗氧化物質以用于預防、治療或預防由氧化應激引起的疾病惡化是需要的。對每天攝取適宜量的抗氧化物質而言，要求人們從食物和/或飲料中攝取。含有通過稀釋來生產的和/或通過向其中加入本發明抗氧化化合物來生產的食品或飲料作為抗氧化的食品或飲料或者抗氧化應激的食品或飲料是非常有用的。
本發明中使用的化合物也具有保留水分的能力。因此，它能夠用作生產抗便秘組合物以及抗便秘食物或飲料的活性成分。
本發明還提供含有選自式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它們的鹽的化合物作為其活性成分的化妝品組合物。
可將含有以上提及的化合物作為活性成分的化妝品組合物配制成以下形式基底化妝品組合物如雪花膏、乳液、洗液、潔面劑和面膜、化裝用化妝品如唇膏和粉底、體皂、肥皂等。所述化合物對頭發也是有用的。本發明化妝品組合物能夠以護發產品的形式生產，例如，頭發產品如生發油、美發液、固發洗液、梳理頭發劑、發乳和發發套，以及頭發化妝用品如香波、護發素和滋發劑。依其漂白、潤濕或抗氧化活性而定，能夠適當測定化妝品組合物中混合的化合物的量。至于化妝品組合物中的其它成分，可以使用那些在日常化妝品組合物中混合的成分。通過常規方法如那些在JP-A8-310937中描述的方法，能夠測定漂白活性和潤濕活性。
本發明化妝品組合物具有基于以下活性的優良性質，包括在皮膚上的漂白活性、潤濕活性、抗氧化活性、抑制活性氧生成的活性和抗氧化應激活性，以及在頭發上的潤濕活性、抗氧化活性、抑制活性氧生成的活性和抗氧化應激活性等。
本發明提供用于保鮮的組合物，其含有作為活性成分的選自式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它們的鹽的化合物。式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它們的鹽具有抗氧化活性、保鮮活性、抑制酪氨酸酶活性、抗病理性微生物活性和抗突變活性。因此，通過使用選自式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它們的鹽的化合物作為活性成分，能夠按照已知的配制方法制備用于食物防腐保鮮的組合物，其有效防止食物顏色變化、腐爛、氧化作用等。本發明用于保鮮的組合物對保持各種食物、容易腐爛的食物、加工食物等的味道和新鮮是非常有用的。
按照本發明，使用在中性至堿性條件下經處理3,6-脫水半乳糖和/或在其還原性末端具有3,6-脫水半乳糖的化合物(在下文簡單稱為編程性細胞死亡-誘導物質)生成的編程性細胞死亡-誘導物質作為活性成分，能夠產生誘導編程性細胞死亡的組合物。按照如同以上描述的與用于誘導編程性細胞死亡的組合物相同方法，可制備這樣的組合物。
本發明的含有編程性細胞死亡-誘導物質作為其活性成分的誘導編程性細胞死亡組合物的劑量被適當測定并且依具體劑型、給藥途徑和目的以及受到治療的患者的年齡、體重和疾病而變化。按照包含在制劑中的活性成分的量，一般成人每天劑量為10μg至200mg/kg。當然，所述劑量能夠依多種因素而變化。因此，在一些情況下，低于以上劑量的劑量可能是足夠的，而在另一些情況下，則可能需要高于以上劑量的劑量。本發明藥用組合物可如其本身那樣口服給予，或者通過將其加入到所選擇的食品或飲料中來服用。
含有本發明的編程性細胞死亡-誘導物質作為其活性成分的誘導編程性細胞死亡組合物對腫瘤細胞具有抗增殖活性。因此，使用本發明的編程性細胞死亡-誘導物質作為活性成分，能夠制備制癌組合物。
按照如同以上描述的與用于誘導編程性細胞死亡的組合物相同的生產方法，劑量和給藥途徑能夠用于含有本發明的編程性細胞死亡-誘導物質作為活性成分的制癌組合物。
本發明的編程性細胞死亡-誘導物質能夠用作治療癌癥等的藥用組合物。使用由本發明的編程性細胞死亡-誘導物質作為活性成分表示的化合物誘導編程性細胞死亡的方法用于研究生物學防御機制、癌癥等以及用于開發誘導編程性細胞死亡的抑制劑。
本發明的食品和飲料含有有效量的發揮其生理活性的物質，這些食品和飲料含有本發明的編程性細胞死亡-誘導物質，通過稀釋本發明編程性細胞死亡-誘導物質來生產和/或通過向其中加入本發明的編程性細胞死亡-誘導物質來生產。生產本發明食品或飲料(例如用于誘導編程性細胞死亡的食品或飲料或制癌食品或飲料)的方法不局限于特殊的方法。可采用任何包括烹調、加工和其它一般使用的用于生產食品或飲料的方法只要得到的食品或飲料含有有效量的用于發揮編程性細胞死亡-誘導活性或制癌活性的本發明編程性細胞死亡-誘導物質。所述食品或飲料含有本發明的編程性細胞死亡-誘導物質，這些食品和飲料是通過稀釋和/或通過向其中加入本發明的編程性細胞死亡-誘導物質來生產的，所述編程性細胞死亡-誘導物質是在食品或飲料生產中通過在超過pH 7的堿性條件下處理3,6-脫水半乳糖和/或在其還原性末端具有3,6-脫水半乳糖的原料生成的。
至于本發明食品或飲料含有本發明的編程性細胞死亡-誘導物質，或是通過向其中加入和/或通過稀釋本發明的編程性細胞死亡-誘導物質來生產，它們的形式不局限于特殊的形式。所述食品或飲料可以是任何食用的形式如片劑、顆粒劑和膠囊劑。
本發明食品或飲料含有編程性細胞死亡-誘導活性和制癌活性。因此，它們對改善消化器官的疾病狀態或預防消化器官的癌癥等是非常有用的。
當在100 mg/kg的單次劑量下口服給予小鼠本發明式(Ⅰ)化合物、或式(Ⅱ)化合物、或它們的鹽和編程性細胞死亡-誘導物質時，未觀察到死亡。
如同以上描述的那樣，基于它們的多種生理功能，本發明的式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物、它們的鹽和編程性細胞死亡-誘導物質在包括醫藥、食品和飲料的廣泛領域中是非常有用的。
在高于pH7的堿性條件下，經處理3,6-脫水半乳糖和/或在其還原性末端具有3,6-脫水半乳糖的原料而人工生成的本發明式(Ⅰ)化合物和/或編程性細胞死亡-誘導物質在食品或飲料生產中的用途也包括在本發明中。
在食品或飲料中生成的或者作為式(Ⅰ)化合物與含有SH基團的化合物如含有SH基團的氨基酸或它們的衍生物如半胱氨酸或含有半胱氨酸的氨基酸衍生物(例如谷胱甘肽)之間的反應產物而人工生成的式(Ⅱ)化合物的用途也包括在本發明中。
以下實施例進一步詳細說明本發明，但不打算對本發明范圍構成限制。
實施例1L-甘油基-1,5-環氧-1αβ,6-二羥基-順式-己-3-烯-2-酮(DGE)和D-甘油基-1,5-環氧-1αβ,6-二羥基-順式-己-3-烯-2-酮(κ-DGE)的制備(1)將2.5g的市售瓊脂(AgarNoble,Difco)懸浮于50ml的0.1NHCl中并在100℃下把懸浮液加熱13分鐘以制備溶液。在冷卻至室溫并用NaOH將pH調節至大約中性pH后，將該溶液通過Cosmonice濾膜過濾并如下在正相HPLC上分離。
柱TSK凝膠Amide-80(21.5mm × 300mm,Toso)溶劑A:90％乙腈水溶液溶劑B:50％乙腈水溶液流速5ml/min。
洗脫法從溶劑A至溶劑B(80分鐘)→溶劑B(20分鐘)的線形梯度檢測在195nm下的吸光度所使用樣品的量2ml收集保留時間為66.7、78.5或85.5分鐘的峰并進行質譜分析。揭示這些物質分別為瓊脂二糖、瓊脂四糖和瓊脂六糖。將如同以上描述的在HPLC上的重復分離8次。在減壓下，將由此分離得到的部分蒸發至干，分別得到122mg瓊脂二糖、111mg瓊脂四糖和55mg瓊脂六糖。
(2)將12μl的1NNaOH加入到在實施例1-(1)中得到的600μl100mM瓊脂二糖水溶液(樣品1)中，以調節pH至11.5。在37℃下，將溶液孵育5分鐘。然后向溶液中加入12μl的1NHCl以調節pH至大約5(樣品2)。向50μl溶液中另外加入1μl的1NHCl以調節pH至大約2(樣品3)。
樣品1至3的編程性細胞死亡-誘導活性的對腫瘤細胞的抗增殖活性測量如下。結果，每一個樣品對腫瘤細胞具有幾乎等值的抗增殖活性。
將樣品1至3分別經過濾滅菌并用滅菌水適當稀釋。將10μl每種稀釋液置于96孔微量滴定板的孔中。向其中加入已在56℃下處理30分鐘的含有10％小牛血清(Gibco)的90μl RPMI1640培養基(Nissui)和5,000HL-60細胞(ATCC CCL-240)。在5％CO2存在下，于37℃下將板孵育48小時。在光學顯微鏡下檢查細胞形態學。向其中另外加入在磷酸鹽緩沖的鹽水中的10μl5mg/ml 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物(Sigma)并繼續孵育另外4小時。向孔中加入100μl含有0.04NHCl的2-丙醇并將混合物充分攪拌。測量在590nm下的吸光度以確定細胞生長水平。
(3)如同在實施例1-(2)所述，將樣品1至3點樣到硅膠板60F254(Merck)上并使用乙醇∶1-丁醇∶水=5∶5∶1展開。然后向板上噴淋地衣酚-硫酸試劑以檢測斑點。結果，對樣品2或樣品3未觀察到瓊脂二糖斑點，伴隨觀察到幾個新斑點。
將10μl的每一個樣品1和2如下在正相HPLC上進行分離。
柱PALPAK Type S(4.6 × 250mm,Takara Shuzo)流動相A:90％乙腈水溶液B:50％乙腈水溶液流速1ml/min。
洗脫流動相A(10分鐘)→從流動相A至流動相B(40分鐘)的線性梯度→流動相B(10分鐘)檢測在195nm下的吸光度柱溫40℃
結果，對樣品2未觀察到對樣品1所觀察到的瓊脂二糖峰，而觀察到多個新峰。將樣品2的各峰進行收集，減壓下蒸發至干并溶于水中。用與以上描述的相同的方式測量每一個流分(fraction)對腫瘤細胞的抗增殖活性。結果，保留時間為4.05至4.16分鐘的流分中存在活性。
這些結果顯示于圖1中。圖1說明了樣品2的正相HPLC色譜圖。在圖1中，橫軸表示保留時間(分鐘)，縱軸表示吸光度。
(4)按照在實施例1-(2)中描述的方法，由實施例1-(1)中制備的瓊脂四糖和瓊脂六糖以及用0.1N鹽酸分解κ-角叉菜膠得到的產物制備的κ-carabiose生產堿處理的制劑。然后如同在實施例1-(2)中描述的那樣測量它們對腫瘤細胞的抗增殖活性。結果，對每一種堿處理的制劑觀察到對腫瘤細胞的抗增殖活性。
如下制備κ-carabiose。
將2.5g的κ-角叉菜膠(Sigma,C-1263)懸浮于50ml的0.1NHCl中并在100℃下將懸浮液加熱16分鐘以制備溶液。將該溶液冷卻至室溫，用NaOH中和至大約中性pH，通過Cosmonice濾膜過濾并如同在實施例1-(3)中描述的那樣在正相HPLC上分離。在洗脫時間為27.8分鐘時，收集含有κ-carabiose的流分并減壓下蒸發至干，以制備κ-carabiose。
(5)將2.5g市售瓊脂(AgarNoble)懸浮于50ml的0.1NHCl中并在100℃下將懸浮液加熱13分鐘以制備溶液。將該溶液冷卻至室溫。用NaOH將pH調節至12。然后中和溶液。
如同在實施例1-(3)中描述的那樣，將中和的溶液經歷正相HPLC。收集各峰，減壓下蒸發至干并溶于水中。如同以上描述的那樣，測量各流分對腫瘤細胞的抗增殖活性，證實了保留時間為4.05至4.16分鐘的流分的抗增殖活性。此外，觀察到編程性細胞死亡體的形成。
其次，大量收集保留時間為4.05至4.16分鐘的流分以制備用于結構分析的樣品。
然后使用DX302質譜儀(Nippon Denshi)進行快速原子轟擊質譜法(FAB-MS)。此外，將樣品溶于重二甲基亞砜中并經核磁共振(NMR)進行結構分析。
在圖2中說明保留時間為4.05至4.16分鐘的流分的質譜。在圖3中說明保留時間為4.05至4.16分鐘的流分的1H-NMR譜。在圖2中，橫軸表示m/z值和縱軸表示相對強度(％)。在圖3中，橫軸表示化學位移值(ppm)和縱軸代表信號強度。
FAB-MS:m/z 145[M+H]+將樣品溶于重二甲基亞砜中。甘油用作測量基質。1H-NMR:δ3.50(1H,m,6-H),3.59(1H,m,6-H),4.52(1H,m,5-H),4.95(1H,d,J=5.0Hz,1-H),5.02(1H,t,J=6.0Hz,6-OH的H),6.05(1H,dd,J=2.5,10.5Hz,3-H),7.20(1H,dd,J=1.5,10.5Hz,4-H),7.35(1H,d,J=5.0Hz，1-OH的H)這些結果假定重二甲基亞砜的殘留質子的化學位移值表示為2.49ppm 。
對1H-NMR中信號鑒定的編號如同在下式中所指明的那樣。 從這些結果來看，它揭示出保留時間為4.05至4.16分鐘的部分含有L-甘油基-1,5-環氧-1αβ,6-二羥基-順式-己-3-烯-2-酮(下文簡稱為DGE)。
相似地，如在該實施例中上述的那樣，用堿處理κ-carabiose。用與以上描述的相同方式，從堿處理的制備中純化為編程性細胞死亡-誘導物質的D-甘油基-1,5-環氧-1αβ,6-二羥基-順式-己-3-烯-2-酮(下文稱作κ-DGE)。
(6)將45g瓊脂粉末(Nacalai Tesque)懸浮于400ml蒸餾水中。向懸浮液中加入4.1ml的11NHCl和蒸餾水至450ml。在90℃下，將生成的酸性懸浮液加熱35分鐘。用10N NaOH中和加熱的酸性溶液。將2.7ml的1N NaOH進一步加入其中。在37℃下，于堿性條件下將該溶液孵育15分鐘。用1N HCl中和堿處理過的溶液，并然后使用蒸發器濃縮至150ml。用等體積的乙酸乙酯把濃縮物提取10次。收集來自十個回合的提取的乙酸乙酯相，使用蒸發器濃縮至2ml，并然后溶于20ml氯仿∶甲醇=9∶1中。在下述條件下，以硅膠柱層析法分離生成的溶液柱體積250ml；流量壓力0.2Kgf/cm2；流動相溶劑氯仿∶甲醇=9∶1；和流分體積8ml。在薄層層析上分析每一個流分的組成(用氯仿∶甲醇=9∶1展開)。收集僅含有Rf值大約為0.25斑點的流分52至78作為含有DGE的流分，使用蒸發器，將其濃縮至2ml。如同以上描述的那樣，再次將濃縮物經歷硅膠柱層析法。收集作為含有DGE流分的流分64至96，使用蒸發器濃縮，并然后溶于8ml蒸餾水中。冷凍干燥DGE水溶液，得到113mg的DGE制劑。
實施例2編程性細胞死亡誘導試驗(1)在37℃下，于含有10％小牛血清(JRH)的RPMI 1640培養基(Bio Whittaker)上培養HL-60細胞，其中細胞已在56℃下處理30分鐘，并以2.5 × 105細胞/4.5ml的濃度于RPMI 1640培養基上懸浮。
將在125μM、250μM、500μM、1mM、2mM或4mM的500μl的DGE水溶液加入到4.5ml的懸浮液中。在5％CO2存在下，在37℃下將混合物孵育24小時。
在光學顯微鏡下，檢測培養的細胞。在50μM或更多的最終濃度下，于DGE存在下，對培養的細胞觀察到核的濃縮、細胞的皺縮和編程性細胞死亡體的形成。對含有加入的500μl鹽水的對照組培養的細胞未觀察到這樣的現象。
以如同以上描述的相同方法，使用培養24或48小時的細胞，使用如在Saibo Kogaku,Bessatsu(Cell Technology，增刊)Jikken方案系列編程性細胞死亡Jikken方案(實驗性方案系列用于編程性細胞死亡的實驗方案)(Shujun-sha)第129-130頁中描述的FACScan，實施編程性細胞死亡細胞的測量和如在Bio Manual UP系列Saishin編程性細胞死亡Jikken-ho(Bio Manual UP系列現代編程性細胞死亡實驗方法)(Yodo-sha)第61-63頁中所述分析DNA碎片。結果，在50μM或更多的最終濃度的DGE存在下對培養的細胞觀察到編程性細胞死亡細胞。在50μM或100μM的濃度的DGE存在下，觀察到DNA碎片。對含有加入500μl鹽水的對照組培養的細胞未觀察到這樣的現象。
(2)如同在實施例2-(1)中描述的那樣，用0.4％臺盼藍將培養24小時的細胞部分染色并在光學顯微鏡下檢測。將未染色的活細胞和染為藍色的死亡細胞計數。經測定導致50％生存力[生存力50(μM)]的DGE濃度為81.7μM。如上所述，由于具有編程性細胞死亡-誘導活性，DGE對腫瘤細胞顯示抗增殖活性。另外，κ-DGE顯示相似的活性。
實施例3脂質過氧化自由基生成抑制試驗將金黃色葡萄球菌3A(國立典型菌種收藏所(National CollectionofType Culture),NCTC 8319)接種到5ml的腦心浸液培養基(Difco,0037-17-8)中并在37℃下孵育過夜。經離心收集細胞，用磷酸鹽緩沖鹽水洗滌三次并然后以1×107菌落形成單位/ml的濃度在磷酸鹽緩沖鹽水中懸浮。在37℃下，將100μl的細胞懸浮液、在10或100mM下的100μl的DGE水溶液、100μl的1mg/ml高鐵血紅蛋白溶液(Sigma,M9250)、600μl的磷酸鹽緩沖鹽水和100μl的50mM叔丁基過氧化氫溶液(Katayama Kagaku,03-4 990)反應30分鐘。將1ml的2×NMP培養基加入到反應混合物中以終止反應。如下制備2×NMP將8g營養肉湯(Difco,0003-01-6)、5g胰蛋白胨(Difco,0123-17-3)、5gNaCl、10g甘露糖醇(Nacalai Tesque,213-03)和0.035g酚紅(Nacalai Tesque,268-07)溶于蒸餾水中以使體積達到500ml；用NaOH將pH調至7.4；然后經過濾將混合物滅菌，得到2×NMP培養基。用NMP培養基(經用滅菌水將NMP培養基稀釋2倍來制備)每3倍量稀釋生成的混合物，制備12個連續的稀釋液。將每一個稀釋液160μl置于96孔微滴定板上的每孔中。在37℃下，將板孵育過夜。用裸眼觀察培養基的顏色。由于細菌生長的結果，導致孔中培養基的顏色從紅色變成黃色的樣品被鑒定為具有抑制脂質過氧化自由基生成活性。
結果顯示在表1中。在表1中，+表示觀察到細菌在孔中生長的樣品，而-表示未觀察到細菌在孔中生長的樣品。在表中上線的數字表示于37℃下在叔丁基過氧化氫溶液與細胞反應30分鐘時的反應混合物中DGE的濃度。
表1

如從這些結果中看到的那樣，DGE顯示抑制脂質過氧化自由基生成活性。另外，對以下描述的κ-DGE和DGE-GSH觀察到相似的活性。
實施例4NO生成抑制試驗(1)在3×105細胞/ml濃度下，將RAW264.7細胞(ATCC TIB 71)懸浮于不含有酚紅但含有10％小牛血清(Gibco)和2mML-谷氨酰胺(Life Technologies Oriental,25030-149)的Dulbecco氏改良Eagle氏培養基(Bio Whittaker,12-917F)中。將500μl懸浮液加入到48孔微滴定板上的每一個孔中并在5％CO2存在下于37℃下將板孵育12小時。將10μl含有25μg/ml脂多糖(LPS,Sigma,L-2012)和500U/ml干擾素-γ(IFN-γ，由Cosmobio,GZM-MG-IFN銷售)和10μl的在250或500μM下的DGE水溶液加入到孔中。將板孵育另外12小時。然后測量在培養基中經NO氧化生成的NO2-的濃度。提供不加入LPS或IFN-γ的對照組與不加入DGE的對照組。
在培養后，將100μl的4％Griess氏試劑(Sigma,G4410)加入到100μl培養基中，并在室溫下使混合物放置15分鐘。然后測量在490nm下的吸光度。如同以上描述的那樣，在溶于相同培養基中的所給定的濃度下，通過使用NaNO2制備的校準曲線，計算培養基中NO2的濃度。所有的測量重復三次。
結果，DGE劑量依賴性抑制由LPS和干擾素-γ誘導的NO生成。結果顯示在圖4中。圖4說明了在DGE存在下于相應培養條件下孵育的培養基中的NO2-的濃度。在圖4中，橫軸表示培養條件和豎軸表示NO2-的濃度(μM)。
在與上述相似的條件下，從培養4、6、8小時的RAW264.7細胞制備RNA。通過RT-PCR方法測定包含在RNA中的編碼誘導性NO合酶[iNOS；Biochem.Byophys.Res.Commun.,215:148-153(1995)]的mRNA的量。結果，對未加入DGE水溶液的對照組細胞觀察到來自iNOS mRNA的DNA碎片的擴增。另一方面，對加入DGE水溶液的細胞未觀察到所述碎片的擴增。這些結果提示由DGE抑制的NO生成是通過抑制iNOS的轉錄而引起的。
(2)在3×105細胞/m/濃度下，將RAW264.7細胞懸浮于不含有酚紅但含有10％小牛血清和2mML-谷氨酰胺的Dulbecco氏改良的Eagle氏培養基中。將500μl懸浮液加入到48孔微滴定板上的每一個孔中。在5％CO2存在下，于37℃下將板孵育6小時。將其由在0.5mM的濃度下將DGE溶于水中并將其過濾滅菌的10μl水溶液加入到孔中。將板孵育另外0.5或5小時。然后將含有5μg/ml LPS和2000U/mlIFN-γ的10μl水溶液加入到孔中。將板孵育另外12小時。測量在培養基中經NO氧化生成的NO2-的濃度。提供不加入LPS或IFN-γ的對照組與不加入DGE的對照組。
在培養后，將100μl的4％Griess氏試劑加入到100μl培養的上清液中，并在室溫下使混合物放置15分鐘。然后測量在490nm下的吸光度。如同以上描述的那樣，在溶于相同培養基中的所給出的濃度下，通過使用NaNO2制備的校準曲線，計算培養基中NO2-的濃度。
所有的測量重復三次。
結果，與培養0.5小時的組相比較，在加入LPS和IFN-γ之前，于DGE存在下，對孵育5小時的組觀察到對NO的生成的強力抑制。
其結果顯示在圖5中。圖5說明了在預先孵育期間其中加入DGE的多種培養條件下孵育得到的培養基中的NO2-的濃度。在圖5中，橫軸表示培養的條件和豎軸表示NO2-的濃度(μM)。
如上所述，DGE顯示抑制NO生成的活性。另外，κ-DGE顯示相似的活性。
實施例5抗微生物活性試驗如下測定DGE抗大腸桿菌W3110(細菌1)、鼠傷寒沙門氏桿菌LT2(細菌2)、枯草芽孢桿菌IFO3021(細菌3)、銅綠假單孢菌IFO3080(細菌4)和鏈球菌株突變GS5(細菌5)的抗微生物活性。
在L-液體培養基上，將細菌1至4培養過夜。基于濁度，用敏感肉汁培養基(Nissui)將培養物稀釋至大約2×105細胞/180μl的濃度。在腦心浸液培養基上，將細菌5培養過夜。基于濁度，用腦心浸液培養基將培養物稀釋至大約2×105細胞/180μl的濃度。將每一種細菌稀釋液180μl放入到96孔微滴定板上的每一個孔中。另一方面，將對應細菌稀釋液進一步稀釋并涂布到L-液體培養基或腦心浸液培養基的板上。在37℃下，將板孵育過夜。將生成的菌落計數以測定證實有活力的細胞數目。
將14.4mg/ml DGE溶液每次稀釋2倍以制備系列稀釋液。把每個稀釋液20μl放入其中已放入細菌稀釋液的孔中。無須振搖，在37℃下，將細胞培養24小時。培養后，測量每種培養物的濁度。生成濁度低于已加入鹽水的對照組的孔中濁度的樣品的濃度定義為最小生長抑制濃度。
此外，把那些未觀察到細菌細胞生長的孔的培養基在板上涂布。在37℃下，將板孵育過夜后，將生成的菌落計數以測定證實有活力的細胞數目。與先前測定的證實有活力的細胞相比較，從加入樣品開始無須振搖下培養24小時后，生成較低有活力的細胞數目的培養基中樣品的濃度定義為最小殺菌濃度。對細菌1至5，測定DGE的最小生長抑制濃度和最小殺菌濃度，如表2中所示。
表2

如上所述，DGE顯示抗微生物活性。另外，如下描述的κ-DGE和DGE-GSH也觀察到顯示出活性。
實施例6抗突變活性試驗按照經umu試驗檢測環境突變物的方法，測定抗突變活性，該方法能夠測定相對于β-半乳糖苷酶活性(Mutation Research,147:219(1985))的致突變性。簡言之，將25μl突變原[在10μg/ml下的絲裂霉素C(DNA交聯劑)或在7μg/ml下的4-硝基喹啉-1-氧化物(NQO，一種DNA甲基化試劑)]加入到50μl的不同濃度(1.0、5.0、10或15mM)的DGE溶液中。將在TGA培養基中的在OD 600為0.12下的鼠傷寒沙門氏菌TA1535/pSK1002的培養物加入到該混合物中以使最終體積為1.5ml。然后在37℃及伴隨振搖下，將混合物孵育2小時。按照Miller的方法[分子遺傳學的實驗，第352頁(1972)]，使用200μl培養物以測量β-半乳糖苷酶活性。結果顯示在表3中。
表3β-半乳糖苷酶活性

如同從表中看到的那樣，在最終濃度0.5mM下，DGE分別對絲裂霉素C(DNA交聯劑)顯示37％的抗突變活性和對NQO(甲基化試劑)顯示36％的活性。另外，κ-DGE和如下描述的DGE-GSH也顯示相似的活性。
實施例7制癌活性試驗(1)將瓊脂粉末(Wako Pure Chemical Industries)加入到50mM枸櫞酸溶液中以使最終體積為3％在95℃下，將混合物加熱160分鐘，用pH12的堿處理混合物并然后中和以制備用于制癌活性試驗的受試溶液。
從Nippon Charles River購買雄性裸鼠(SPF/VAFBalb/cAnNCrj-nu,4周齡)并預先喂飼1周。在1.5×106細胞/小鼠下，將人結腸癌細胞系HCT116(ATCC CCL-247)皮下移植到小鼠上。
從移植結腸癌細胞系2周后，用于制癌活性試驗的受試溶液(其臨用前立即調節至pH6.5)每周5天作為飲用水自由給予小鼠。每只小鼠每天攝取的平均體積為3.5ml。另外，來自Oriental Yeast的MF作為食物自由給予小鼠。
開始給予受試溶液4周后，從每只接受受試溶液的小鼠取出實體癌并將實體癌的重量與來自向其給予正常水的對照組小鼠的重量相比較。每組使用10只小鼠進行該試驗。
結果，在口服接受用于制癌活性試驗的受試溶液的組觀察到顯著的腫瘤生長抑制。
(2)將艾氏黑素瘤細胞腹膜內(1.2×106細胞/小鼠)給予18只雌性ddY小鼠(5周齡，體重大約為25g)。觀察持續30天。然后計算平均生存天數、延長率和30天生存數。將小鼠分成3組，每組6只。一組為對照組，且另外2組分別接受2mg/kg和20mg/kg劑量的DGE。從給予癌癥后那天起，將DGE腹膜內給予4天。
結果顯示在表4中。對照組的平均生存天數為14.3天。對接受2mg/ml和20mg/kg劑量的DGE組，30天生存數分別為1和3。對接受2mg/ml和20mg/kg劑量的DGE組，平均生存天數分別為23.7天和28.0天，并且延長率分別為141％或者更多和195％或者更多。因此，觀察到顯著延長作用。
表4

如同以上描述的那樣，DGE顯示制癌活性。另外，如下描述的κ-DGE和DGE-GSH也顯示相似的活性。
實施例8黑素原生成抑制試驗將懸浮于含有10％小牛血清的RPMI-1640培養基中的小鼠黑素瘤細胞B16BL6分散到在5×104細胞/孔/2ml培養基的6孔板上并在37℃下孵育板。第2天，向其中加入100μl的DGE溶液(2mg/ml至0.2mg/ml)。第7天，更換培養基，同時向其中加入100μl DGE溶液(2mg/ml至0.2mg/ml)。第8天，收獲細胞。消化DNA、RNA和蛋白質后，測量400nm下的吸光度以測定抑制黑素原生成活性。
簡言之，通過攪拌除去培養基后，每孔加入溶于20mM EDTA溶液的0.3ml 0.25％胰蛋白酶并在37℃下將板孵育10分鐘。然后向孔中加入2ml新鮮培養基并懸浮細胞。將懸浮液轉移至試管。經離心除去培養基后，將細胞懸浮于2ml PBS中并再次離心。除去上清液后，向細胞加入含有5mM氯化錳和1μl的70,000U/ml DN酶I(Takara Shuzo)的30μl的50mM乙酸鈉緩沖液(pH5.0)。將混合物充分混合并然后在37℃下孵育2小時以消化DNA。然后向混合物加入1μl的10mg/ml核糖核酸酶A(Sigma)并在50℃下將生成的混合物孵育1小時以消化DNA。最后，向其中加入含有100μg/ml蛋白酶K(Sigma)、0.1％Tritton X和10mM EDTA的100mM Tris-鹽酸鹽緩沖液(pH7.8)以制備總體積至200μl對2×106細胞。在37℃下孵育混合物16小時后，測量400nm下的吸光度。
結果，對DGE觀察到抑制黑素原生成活性，它們的漂白作用被證實。另外，如下描述的κ-DGE和DGE-GSH也顯示相似的活性。
實施例9α-糖苷酶抑制試驗(1)經將對硝基苯基-α-D-吡喃型葡糖苷(一種用于α-糖苷酶的產色底物)與來自酵母的α-糖苷酶反應并比色定量水解釋放的4-硝基苯酚，測量DGE抑制α-糖苷酶的活性。簡言之，將10μl的α-糖苷酶溶液[40mU/ml，衍生自S.cerevisiae(啤酒酵母)，Sigma，溶于10mM磷酸鹽緩沖液(在37℃下pH 7.2)中]和10μl含有溶于10mM磷酸鹽緩沖液(在37℃下pH7.2)中的受試樣品的溶液混合。向其中加入80μ1的1.5mg/ml底物溶液[Sigma，溶于10mM磷酸鹽緩沖液(在37℃下pH7.2)]以開始反應。在37℃下反應40分鐘后，測量(島津uv2200)410nm下的吸光度。結果顯示在表5中。由此計算剩余的活性，將未有受試樣品的活性定義為100％。
表5

如從這些結果中看到的那樣，DGE顯示抑制α-糖苷酶的活性。抑制α-糖苷酶活性至50％的DGE濃度(IC50)為500μM。
(2)，將來自大鼠小腸粘膜的α-糖苷酶粗酶制品[根據如在ArneDahlqvist,Anal.Biochem.,7:18-25(1964)中描述的方法制備]用于測量如下DGE抑制α-糖苷酶的活性。
對酶反應，將在10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中的80μl蔗糖、麥芽糖、海藻糖或可溶性淀粉的溶液作為底物，以100mM的最終濃度(對可溶性淀粉0.5％)加入到適當用相同緩沖液稀釋的10μl受試樣品溶液中。向其中加入10μl從大鼠小腸制備的粗酶溶液。在37℃下，將該混合物反應20分鐘。
經向反應混合物中加入3ml的葡萄糖測量試劑(Wako PureChemical Industries)，在37℃下反應5分鐘并然后測量作為在混合物中葡萄糖的含量在505nm下的吸光度，評價酶反應。
按照以上提到的方法，使用在四種不同的濃度下的DGE，測量DGE對經α-糖苷酶的每一種底物的消化的抑制活性。抑制α-糖苷酶的活性表示為相對活性(％)，將無DGE的對照組的活性定義為100％。
結果顯示在表6中。
表6

如同使用狄克松作圖法(plot)測定的那樣，DGE對蔗糖的抑制常數(Ki)為6.0mM。
與使用麥芽糖等時觀察到活性相比較，當蔗糖用作底物時，DGE顯示更高的抑制α-糖苷酶活性。另外，如下描述的κ-DGE和DGE-GSH也觀察到相似的抑制α-糖苷酶活性。
實施例10抗風濕活性試驗DSEK細胞為從患有慢性風濕病患者的滑液膜上建立的成纖維細胞系并作為體外類風濕病模型保存在Saitama醫學院聯合醫學中心第二內科醫學系中。在5％CO2存在下，在37℃下于含有10％FBS(BioWhittaker)的Iscov-MEM培養基(IMDM:Gibco-BRL)上將DSEK細胞培養至匯合。使用胰蛋白酶-EDTA溶液，于3×104細胞/ml濃度下，在相同的培養基上懸浮這些細胞。將200μl懸浮液分散于96孔微滴定板(Falcon)的每一個孔中。在培養5-7天后，此時細胞生長至80％匯合，將培養基改變為200μl含有25、50、75、100、200或400μM的DGE的以上述培養基。
孵育24或72小時后，向孔中加入10μl預先混合的WST-1(Takara Shuzo,MK400)。在37℃下，將混合物反應3.5小時。通過從450nm下的吸光度(A450)減去650nm下吸光度(A650)得到值來表示細胞生長程度。
所述結果顯示在表7中。
表7

如在A450-650數據基礎上測定的那樣，導致半數細胞生長抑制的濃度(IC50)分別為24小時時207μM和72小時時112μM。
如上所述，在體外類風濕病模型(DSEK細胞)上，與加入PBS的對照組孔相比較，在加入DGE孔中的類風濕病細胞的生長被強烈抑制。另外，人們認識到所述化合物不僅保持其生長抑制活性，而且還有在超過預定的時間內增強活性的趨勢。
這些結果證實DGE具有很強的抗風濕活性。因此，人們期待著DGE將被開發為抗慢性風濕病的有效的治療藥物和保健食品。另外，如下描述的κ-DGE和DGE-GSH也觀察到相似的活性。
以培養24或72小時的DSEK細胞中回收150μl/孔培養上清液。使用對相應細胞因子(人FGF-β和人IL-10來自Intergen，及人IL-1α和人TGF-β來自Promega)特異性的ELISA試劑盒，測定DGE對來自細胞上的細胞因子(人TGF-β、人FGF-β、人IL-1α和人IL-10)生成(表達)的作用。
結果，DGE顯示抑制人IL-1α和人FGF-β生成的活性以及增強人IL-10和人TGF-β生成的活性。
實施例11前列腺素E2生成抑制試驗在3×105細胞/m/濃度下，將RAW264.7細胞懸浮于含有10％小牛血清的Dulbecco氏改良Eagle氏培養基中。將500μl懸浮液加入到48孔微滴定板上的每一個孔中并在5％CO2存在下，于37℃下將板孵育6小時。將通過使0.5mM的濃度下的DGE溶于水并過濾滅菌制備的10μl水溶液加入到孔中。將板孵育另外0.5或5小時，然后將10μl50μg/ml的LPS水溶液加入孔中。將板孵育另外12小時后，測量前列腺素E2的量。提供不加入LPS的對照組與不加入DGE的對照組。
在培養后，使用前列腺素E2ELISA試劑盒(Neogen，編碼404110)，測量在培養基上清液中前列腺素E2的量。所有的測定重復3次進行。
結果顯示在圖6中。圖6說明在預先孵育期間，在其中加入DGE的多種培養條件下孵育得到的培養基中的前列腺素E2的濃度。在圖6中，橫軸表示培養的條件和縱軸表示前列腺素E2的濃度(ng/ml)。
結果，DGE抑制由LPS誘導的前列腺素E2的生成。另外，與孵育0.5小時相比較，加入LPS之前對在DGE存在下孵育5小時的孔觀察到較強的前列腺素E2生成的抑制作用。
實施例12熱休克蛋白誘導試驗將5ml含有10％小牛血清的RPMI-1640培養基和在2×105細胞/ml的濃度下的RPMI 1640放入到6孔板的每一個孔中。在5％CO2存在下，在37℃下，將板孵育24小時。然后向其中加入最終濃度0、6.25、12.5、25、50或100μM的DGE。孵育繼續另外6小時。
在培養后，將細胞計數。經離心收獲細胞，用PBS洗滌以制備DGE-處理的細胞。在45℃下加熱10分鐘后，也制備以相同方法培養的細胞。
根據如在分子克隆[Cold Spring Haerbor實驗室出版社(1989)]中描述的方法，將這些處理后的細胞用于SDS-PAGE。在2.5×106細胞/ml濃度下，將處理后的細胞懸浮于SDS-PAGE樣品緩沖液中。于100℃處理細胞懸浮液10分鐘。將每份5μl的細胞懸浮液應用于兩個SDS-PAGE凝膠(5％積層凝膠，10％分離凝膠)并電泳。凝膠之一經受考馬斯藍染色法。另一個凝膠被印跡到聚偏二氟乙烯化物轉移膜上[ImmobilonTM,Millipore,Cat.IPVHOOO-10號]。使用Block Ace(大日本制藥，目錄UK-B25號)，在4℃下將膜阻斷過夜。
阻斷的膜與單克隆抗體HSP72/73(Ab-l)(Oncogene ResearchProducts，目錄HSP01號)反應，其特異性與熱誘導的70kDa熱休克蛋白反應。用含有0.05％吐溫20的TBS洗滌隨后用TBS洗滌膜。然后膜與過氧化酶接合的二級抗體HRT-兔抗鼠IgG(H+L)(Zymed實驗室公司，目錄61-6520號)反應，并然后如上所描述的那樣洗滌。與初級和二級抗體反應的膜與致化學發光試劑RenaissanceTM(杜邦NEN，目錄NEL-100號)反應。然后將膜暴露于X-射線膠片以證實70kDa熱休克蛋白的誘導作用。
結果，觀察到由DGE誘導的70kDa熱休克蛋白。誘導作用的程度顯示在表8中。在表8中，+表示誘導水平。增加的+號數目意指增加的誘導作用。另一方面，-表示未觀察到誘導作用。
另外，如下描述的κ-DGE和DGE-GSH也觀察到誘導熱休克蛋白的相似的活性。
表8

實施例13制備5-L-谷胱甘肽-S-基-2-羥基-3,7-二氧二環[2.2.2]辛-1-醇(DGE-GSH)(1)將DGE和還原的谷胱甘肽(GSH；Nacalai Tesque)以20mM的濃度溶于PBS中并在37℃下把混合物反應過夜。在正相柱，PAL-PAK Type S上分餾100μl的反應混合物。在以下條件下實施層析法流速1ml/min；含有0.1％TFA的90％乙腈水溶液(0-10分鐘)；線性梯度從含有0.1％TFA的90％乙腈水溶液至含有0.1％TFA的50％乙腈水溶液(10-50分鐘)；檢測在195nm下的吸光度；流分收集每次1.5分鐘。將相應流分濃縮至干并重懸浮于50μl蒸餾水中。如同在實施例1-(2)中描述的那樣，使用HL-60細胞，測量對腫瘤細胞的抗增殖活性。結果，對加入大約30-40的流分的組觀察到編程性細胞死亡體。這些組在590nm下的吸光度低于加入水的組的吸光度，說明抑制細胞生長。在反相層析法(TSK凝膠ODS-80Ts(5μm),Toso,4.6×250nm)上，分餾以如同以上描述的相同方法制備的50μl活性組分。在以下條件下實施層析法流速1ml/min；含有0.1％TFA的蒸餾水(0-15分鐘)；線性梯度從含有0.1％TFA的蒸餾水至含有0.1％TFA的50％乙腈水溶液(15-30分鐘)；含有0.1％TFA的50％乙腈水溶液(30-45分鐘)；檢測在215nm下的吸光度；流分收集每次1.5分鐘。將相應流分濃縮至干并重懸浮于50μl蒸餾水中。如同在實施例1-(2)中描述的那樣，使用HL-60細胞，測量對腫瘤細胞的抗增殖活性。結果，對加入大約4至9的流分的組觀察到編程性細胞死亡體。這些組在590nm下的吸光度低于加入水的組的吸光度，說明抑制細胞生長。這些結果證實編程性細胞死亡-誘導活性。
以上提及的正相層析法重復10次。收集具有編程性細胞死亡-誘導活性的流分，濃縮至干，重新溶于1ml蒸餾水中并然后經受正相層析法以制備純化的流分。然后將經正相層析法純化的流分經受以上提及的反相層析法。收集具有編程性細胞死亡-誘導活性的流分并濃縮至干。結果，從含有20mM DGE和20mM谷胱甘肽的1ml反應混合物中，得到5mg具有編程性細胞死亡-誘導活性的化合物。該化合物用于結構測定。
(2)使用DX302質譜儀，進行在實施例13-(1)中得到的編程性細胞死亡-誘導物質即DGE和谷胱甘肽反應產物的質譜分析。另外，將樣品溶于重水中以通過核磁共振譜(NMR)分析結構。結果如下顯示。
在實施例13-(1)中得到的編程性細胞死亡-誘導的物質的質譜示于圖7中。所述物質的1H-NMR譜示于圖8中。所述物質的13C-NMR譜示于圖9中。在圖7中，橫軸表示m/z值和縱軸表示相對強度(％)。在圖8和9中，橫軸表示化學位移值(ppm)和縱軸表示信號強度。
FAB-MS:m/z452[M+H]+474[M+Na]+544[M+甘油+H]+566[M+甘油+Na]+甘油用作基質。1H-NMR:δ1.62(1H,t,J=13.5Hz,6-H),1.96(1H,dd,J=4.0,13.5Hz,6-H),2.07(2H,m,5′-H),2.42(2H,m,4′-H),2.85(1H,dd,J=8.5,13.5Hz,1′-H),2.90(1H,ddd,J=4.0,10.5,13.5Hz,5-H),3.06(1H,dd,J=5.0,13.5Hz,1′-H),3.44(1H,dt,J=5.0,10.5Hz,4-H),3.52(1H,t,J=10.5Hz,H-8),3.66(1H,dd,J=5.0,10.5Hz,H-8),3.82(1H,t,J=6.5Hz,6′-H),3.88(2H,S,9′-H),4.47(1H,dd,J=5.0,8.5Hz,2′-H),4.65(1H,S,2-H)。
假定HOD的化學位移值為4.65ppm來表示1H-NMR的化學位移值。13C-NMRδ26.6(5′-C),31.9(4′-C),32.7(1′-C),35.6(6-C),42.0(9′-H),45.2(5-C),53.9(6′-C),54.4(2′-C),64.7(8-C),70.4(4-C),92.1(2-C),97.2(1-C),173.4(7′-C),173.5(8′-C),173.8(10′-C),175.4(3′-C)。
假定二噁烷的化學位移值為67.4ppm來表示1C-NMR的化學位移值。
在1H-NMR和1C-NMR中的峰鑒定編號如在下式中指明。 從這些結果中，揭示在實施例13-(1)中得到的編程性細胞死亡-誘導的物質為5-L-谷胱甘肽-S-基-2-羥基-3,7-二氧雙環[2.2.2]-辛-1-醇(在下文簡稱為DGE-GSH)。
實施例14編程性細胞死亡誘導試驗將實施例13-(1)中獲得的10mg/ml DGE-GSH水溶液經過濾滅菌并用滅菌水稀釋2、4、8、16、32、64、128、256或512倍。如同在實施例1-(2)中描述的那樣，測量這些稀釋液抗HL-60細胞的抗增殖活性。結果，對加入DGE-GSH的組觀察到編程性細胞死亡體。這些組在590nm下的吸光度低于加入水的對照組的吸光度。基于以上提到的結果計算，GI50(即與加入水的對照組相比較經在590nm下的半數吸光度證實的導致50％生長抑制的濃度)為大約48.7μg/ml。
實施例15:NO生成抑制試驗在3×105細胞/ml濃度下，將RAW264.7細胞懸浮于不含有酚紅但包含10％小牛血清和2mML-谷氨酰胺的Dulbecco氏改良的Eagle氏培養基中。將500μl懸浮液加入到48孔微滴定板上的每一個孔中并在5％CO2存在下于37℃下將板孵育12小時。將10μl含有50μg/ml脂多糖和5000U/ml干擾素-γ的水溶液和通過使實施例13-(1)中制備的DGE-GSH以1mM濃度溶于水制備的10μl水溶液加入到孔中。將板孵育另外16小時。測量在培養基中經NO氧化生成的NO2-的濃度。提供不加入LPS或IFN-γ的對照組與不加入DGE-GSH的對照組。
在培養后，向100μl的培養基加入100μl的4％Griess氏試劑(Sigma,G4410)，并在室溫下使混合物放置15分鐘。然后測量在490nm下的吸光度。如同以上描述的那樣，在溶于相同培養基中所給出的濃度下，通過參照使用NaNO2制備的校準曲線，計算培養基中NO2-的濃度。
結果，未含有加入物的培養基中的NO2-濃度為4.6μM。在加入LPS和IFN-γ而未加入DGE-GSH的對照組培養基中的NO2-濃度為12.1μM。在加入DGE-GSH的培養基中的NO2-濃度是低的(9.4μM)。說明DGE-GSH對LPS和IFN-γ誘導的NO生成的抑制作用。
實施例16前列腺素E2生成抑制試驗在3×105細胞/ml濃度下，將RAW264.7細胞懸浮于不含有酚紅但包含10％小牛血清和2mM L-谷氨酰胺的Dulbecco氏改良Eagle氏培養基中。將500μl懸浮液加入到48孔微滴定板上的每孔中并在5％CO2存在下，于37℃下將板孵育12小時。將10μl的50μg/ml脂多糖溶液和通過把實施例13-(1)中制備的DGE-GSH以1mM的濃度溶于水并過濾滅菌制備的10μl水溶液加入到孔中。將板孵育另外16小時后，測量前列腺素E2的量。提供不加入LPS的對照組與不加入DGE-GSH的對照組。
在培養后，使用前列腺素E2ELISA試劑盒(Neogen,Code,404110)，測量在培養基上清液中前列腺素E2的量。
結果，未含有加入物的培養基中前列腺素E2的濃度為50.3ng/ml。在加入LPS而未加入DGE-GSH的對照組培養基中前列腺素E2的濃度為63.4ng/ml在加入DGE-GSH的培養基中前列腺素E2的濃度是低的(50.7ng/ml)。說明DGE-GSH對LPS誘導的前列腺素E2的生成有抑制作用。
實施例17淋巴細胞激活抑制試驗從Nippon SLC購買DDY小鼠(雌性，7周齡，體重大約25g)并用于實驗前預先喂飼1周。從小鼠取出脾臟，絞碎并懸浮于含有10％小牛血清(HyClone)的RPMI-1640培養基中以得到單細胞懸浮液。除去粘附于塑料培養皿的粘著細胞并將非粘著細胞用作脾淋巴細胞。以2×106細胞/ml的濃度將脾淋巴細胞懸浮于含有10％小牛血清的RPMI-1640培養基中。將200μl懸浮液接種到96孔微滴定板上的每個孔中。除了對照組孔以外，將DGE以各種不同的濃度加入到每孔中。此外，將5μg的伴刀豆凝集素A(Nacalai Tesque)加入到每孔中。在5％CO2存在下，在37℃下，將板孵育2天。在完成培養的前一天，將37kBq的3H-胸苷(Daiichi Pure Chemicals)加入到每孔中以脈沖標記細胞。培養后，在玻璃濾器上收獲細胞以測量放射活性。
結果顯示在圖10中。DGE以劑量依賴方式顯示針對經用突變原刺激活化的淋巴細胞增殖的抑制活性，并在0.3μg/ml濃度下幾乎完全抑制增殖。因此，DGE抗淋巴細胞活化的抑制活性被證實。
如同以上描述的那樣，本發明提供式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物、它們的鹽和用作以下組合物活性成分的本發明編程性細胞死亡-誘導的物質，組合物包括誘導編程性細胞死亡組合物、制癌組合物、抗氧化組合物如抑制活性氧生成的組合物、用于抑制脂質過氧化自由基生成的組合物和用于抑制NO生成的組合物、用于抑制前列腺素合成的組合物、抗致病性微生物組合物、用于保鮮的組合物、抗突變組合物、抗高血糖組合物、抗高血脂組合物、用于誘導熱休克蛋白生成的組合物、抗病毒組合物和用于抑制α-糖苷酶的組合物。
包含通過稀釋這樣的物質來生產的，和/或通過向其中加入這樣的物質來生產的食品或飲料用作具有以下活性的功能性食品或飲料，包括編程性細胞死亡-誘導活性、制癌活性、抗氧化活性如抑制活性氧生成和抑制NO生成的活性、抑制前列腺素合成活性、抗致病性微生物活性、抗突變活性、抗高血糖活性、抗肥胖活性、誘導熱休克蛋白生成活性和抗病毒活性。因此，本發明提供其在患有癌癥或病毒性疾病的患者的病灶細胞中誘導編程性細胞死亡并因此在預防或改善這些疾病的癥狀的食品或飲料。經口服攝取以上提到的在食品或飲料中的本發明化合物，能夠在腫瘤細胞中誘導編程性細胞死亡。因此，在消化器官的癌癥如結腸癌和胃癌的情況中，在它們當中，本發明的食品或飲料具有優良的預防或改善消化器官癌癥的癥狀的效果。此外，基于它們的抗氧化活性如抑制活性氧生成的活性，以上提到的食品或飲料作為抗氧化應激食品或飲料是優良的。
另外，式(Ⅰ)或式(Ⅱ)化合物也用作抑制活性氧生成的抗氧化化合物。含有通過稀釋來生產的和/或通過向其中加入本發明抗氧化作用的化合物來生產的食品和飲料，用作改善由生命體內氧化物質如活性氧導致的疾病的疾病狀態的食品和飲料。此外，本發明的食品和飲料對便秘的改善或預防是有效的。
本發明提供的式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它們的鹽用作對食品或飲料提供抗氧化活性如抑制活性氧生成活性的新的功能性化合物。
本發明化合物具有保鮮活性。因此，它們經常用于保持食品或容易腐爛食物的味道和新鮮。
另外，含有本發明化合物的化妝品組合物用作那些漂白或給皮膚增加水分的化妝品。
權利要求
1．藥用組合物，其包含作為活性成分的選自以下的化合物和它們的鹽式(Ⅰ)化合物 其中X和Y為H或CH2OH，條件是當X為CH2OH時，Y為H，而當X為H時，Y為CH2OH；式(Ⅱ)化合物 其中R為通過從含有SH基團的化合物中游離出SH基團得到的殘基，所述組合物用于治療或預防以下疾病，包括需要誘導編程性細胞死亡以用于其治療或預防的疾病、癌癥疾病、需要抑制活性氧生成以用于其治療或預防的疾病、需要抑制一氧化氮生成以用于其治療或預防的疾病、需要抑制前列腺素合成以用于其治療或預防的疾病、需要抑制滑液細胞增殖以用于其治療或預防的疾病、需要抑制熱休克蛋白產生以用于其治療或預防的疾病或需要抑制α-糖苷酶以用于其治療或預防的疾病。
2．用于制備由權利要求1定義的式(Ⅰ)化合物的方法，其特征在于所述方法包括在中性至堿性條件下處理3,6-脫水半乳糖和/或在其還原性末端具有3,6-脫水半乳糖的化合物。
3．權利要求2的方法，其中3,6-脫水半乳糖和/或在其還原性末端具有3,6-脫水半乳糖的化合物是通過在酸性條件下水解或酶消化含有3,6-脫水半乳糖的物質獲得的。
4．權利要求3的方法，其中在其還原性末端具有3,6-脫水半乳糖的化合物為至少一個選自瓊脂二糖、κ-carabiose和除了瓊脂二糖和κ-carabiose之外的在其還原性末端具有3,6-脫水半乳糖的化合物。
5．權利要求3的方法，其中含有3,6-脫水半乳糖的物質為瓊脂、瓊脂糖和/或角叉菜膠。
6．由權利要求1定義的式(Ⅱ)化合物或其鹽。
7．制備式(Ⅱ)化合物的方法，其特征在于所述方法包括使由權利要求1定義的式(Ⅰ)化合物與含有SH基團的化合物反應。
8．食物或飲料，其包含選自由權利要求1定義的式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它們的鹽的化合物，其通過稀釋選自由權利要求1定義的式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它們的鹽的化合物來生產和/或通過向其中加入選自由權利要求1定義的式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它們的鹽的化合物來生產。
9．食物或飲料，其包含選自由權利要求1定義的式(Ⅰ)化合物，其通過稀釋選自由權利要求1定義的式(Ⅰ)化合物來生產和/或通過向其中加入選自由權利要求1定義的式(Ⅰ)化合物來生產，權利要求1定義的式(Ⅰ)化合物是通過在中性至堿性條件下處理3,6-脫水半乳糖和/或在其還原性末端具有3,6-脫水半乳糖的化合物而得到的。
10．權利要求9的食物或飲料，其中3,6-脫水半乳糖和/或在其還原性末端具有3,6-脫水半乳糖的化合物是通過在酸性條件下水解或酶消化含有3,6-脫水半乳糖的物質而獲得的。
11．權利要求10的食物或飲料，其中在其還原性末端具有3,6-脫水半乳糖的化合物為至少一個選自瓊脂二糖、κ-carabiose和除了瓊脂二糖和κ-carabiose之外的在其還原性末端具有3,6-脫水半乳糖的化合物。
12．權利要求10的食物或飲料，其中含有3,6-脫水半乳糖的物質為瓊脂、瓊脂糖和/或角叉菜膠。
13．抗氧化組合物，其包含作為活性成分的選自由權利要求1定義的式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它們的鹽的化合物。
14．權利要求13的抗氧化組合物，其為用于抑制活性氧生成的組合物。
15．食物或飲料，其包含權利要求13或14的抗氧化組合物。
16．用于抗氧化的由權利要求1定義的式(Ⅰ)或式(Ⅱ)的化合物。
17．權利要求16的化合物，其為抑制活性氧生成的化合物。
18．用于保鮮的組合物，其包含作為活性成分的選自由權利要求1定義的式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它們的鹽的化合物。
19．化妝品組合物，其包含作為活性成分的選自由權利要求1定義的式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它們的鹽的化合物。
20．用于抑制α-糖苷酶的組合物，其包含作為活性成分的選自由權利要求1定義的式(Ⅰ)化合物、式(Ⅱ)化合物和它們的鹽的化合物。
21．通過在中性至堿性條件下處理3,6-脫水半乳糖和/或在其還原性末端具有3,6-脫水半乳糖的化合物產生的編程性細胞死亡-誘導物質。
22．權利要求21的物質，其中在其還原性末端具有3,6-脫水半乳糖的化合物為至少一個選自瓊脂二糖、κ-carabiose和除了瓊脂二糖和κ-carabiose之外的在其還原性末端具有3,6-脫水半乳糖的化合物。
23．食物或飲料，其包含編程性細胞死亡-誘導的物質，其通過稀釋編程性細胞死亡-誘導的物質來生產和/或通過向其中加入編程性細胞死亡-誘導的物質來生產，所述編程性細胞死亡-誘導的物質是通過在中性至堿性條件下處理3,6-脫水半乳糖和/或在其還原性末端具有3,6-脫水半乳糖的化合物來生成的。
全文摘要
用于需要編程性細胞死亡誘導的疾病、癌性疾病、需要抑制活性氧生成的疾病、需要抑制一氧化氮生成的疾病、需要抑制前列腺素合成的疾病、需要抑制滑液細胞增殖的疾病、需要抑制熱休克蛋白產生的疾病或需要抑制α－糖苷酶的疾病的治療或預防藥物,其包括選自由通式(Ⅰ)(其中X和Y各為H或CH
文檔編號A23L3/3535GK1312813SQ99809417
公開日2001年9月12日 申請日期1999年6月8日 優先權日1998年6月9日
發明者榎龍嗣, 友野潤, 小山信人, 豬飼勝重, 佐川裕章, 加藤郁之進 申請人:寶酒造株式會社 被以下專利引用 (1),