菘藍4-香豆酰輔酶a連接酶蛋白家族編碼序列及應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及菘藍4-香豆酰輔酶A連接酶蛋白家族的核苷酸序列及其應用，本發明 還涉及菘藍4-香豆酰輔酶A連接酶蛋白家族的氨基酸序列，屬于生物技術領域。
【背景技術】
[0002] 菘藍為十字花科植物，其根入藥，即為常用中藥板藍根，有清熱解毒，涼血利咽等 功效，應用十分廣泛，主要制劑有板藍根顆粒、板藍根含片等，臨床用于流行性感冒、流行性 乙型腦炎、流行性腮腺炎、急慢性肝炎、帶狀皰疹等。化學成分及藥理活性研究表明落葉松 脂素是菘藍發揮抗病毒功效的重要活性物質基礎。因此，提高落葉松脂素的含量是獲得抗 病毒活性高的優良菘藍品系的關鍵，具有重要的應用價值；同時，落葉松脂素屬于木脂素類 成分，降低菘藍中落葉松脂素的含量，減少木質化的程度，能有效降低以其作為原料轉化為 生物燃料的難度，對于生物能源的生產也具有重要意義。
[0003] 植物次生代謝工程是利用基因工程和分子生物學方法闡明植物次生代謝產物生 物合成的機制，了解清楚代謝途徑和相關酶的信息，對控制生物合成路徑的基因進行調控， 從而達到在分子水平上改造代謝途徑，調控目標產物的定向合成，趨利避害，提高或降低植 物中特定化合物產量的目的。經文獻檢索發現，4-香豆酰輔酶A連接酶（4CL)對落葉松脂 素的生物合成起到了非常重要的調控作用，是木脂素代謝工程的重要靶點。因此，從菘藍中 分離獲得4-香豆酰輔酶A連接酶并利用其進行目標性的代謝調控，一方面有可能打破落葉 松脂素生物合成限速瓶頸，獲得落葉松脂素高產的高品質菘藍株系；另一方面有可能降低 以落葉松脂素為代表的木脂素的含量，減少菘藍木質化的程度，為生物能源的生產提供有 效的原材料。目前尚未發現與本發明所提及的菘藍4-香豆酰輔酶A連接酶蛋白及應用的 相關報道。

【發明內容】

[0004] 本發明提供了編碼菘藍4-香豆酰輔酶A連接酶蛋白家族的核苷酸序列，其特征在 于：其核苷酸序列分別如SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3所示。
[0005] 本發明還提供了菘藍4-香豆酰輔酶A連接酶蛋白家族的氨基酸序列，其特征在 于：其序列如 SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5 以及 SEQ ID NO. 6 所示。
[0006] 本發明還提供了一種通過調控菘藍4-香豆酰輔酶A家族蛋白的表達以改變落葉 松脂素的生物合成的應用。
[0007] 發明作用與效果
[0008] 本發明提供了菘藍4-香豆酰輔酶A連接酶蛋白家族的三段編碼序列，分別如SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3 所示。
[0009] 本發明還提供了菘藍4-香豆酰輔酶A連接酶蛋白家族的氨基酸序列，其特征在 于：其序列如 SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5 以及 SEQ ID NO. 6 所示。
[0010] 本發明還提供了一種通過調控菘藍4-香豆酰輔酶A家族蛋白的表達以改變落葉 松脂素的生物合成的應用。
【附圖說明】
[0011] 圖1是Ii4CL蛋白的氨基酸序列與擬南芥中4CL蛋白氨基酸序列的比對；
[0012] 圖2是Ii4CLl、Ii4CL2、Ii4CL3融合蛋白在大腸桿菌E. coli BL21(DE3)中原核表 達的SDS-PAGE檢測；
[0013] 圖3是Ii4CLl、Ii4CL2、Ii4CL3經純化的融合蛋白的SDS-PAGE檢測；
[0014] 圖4是抑制Ii4CLl的株系與野生型株系的Ii4CLl的相對表達量；
[0015] 圖5是抑制Ii4CLl的株系與野生型株系的落葉松脂素的含量對比；
[0016] 圖6是抑制Ii4CL2的株系與野生型株系的Ii4CL2的相對表達量；
[0017] 圖7是抑制Ii4CL2的株系與野生型株系的落葉松脂素的含量對比；
[0018] 圖8是抑制Ii4CL3的株系與野生型株系的Ii4CL3的相對表達量；以及 [0019] 圖9是抑制Ii4CL3的株系與野生型株系的落葉松脂素的含量對比。
【具體實施方式】
[0020] 〈實施例一〉菘藍4-香豆酰輔酶A連接酶家族基因的克隆
[0021] 1.組織分離
[0022] 菘藍（I. indigotica)葉片采集自第二軍醫大學藥學院植物園，采取材料后，立即 置于液氮中冷凍保存。
[0023] 2. mRNA 的分離
[0024] 取部分組織，用研缽研碎，加入盛有裂解液的50ml管，充分振蕩后，再移入玻璃勻 漿器內。勻漿后移至50ml新管，使用TRIzol (TRIzol Reagents, Gibco, NY, USA)試劑抽提 總RNA。用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質量。
[0025] 3.基因克隆（Cloning of the gene)
[0026] 3. L第一鏈cDNA的合成
[0027] 3. 2.菘藍4-香豆酰輔酶A連接酶家族基因（Ii4CLl、Ii4CL2、Ii4CL3)編碼區的 PCR擴增
[0028] 根據 GenBank登錄的 4CL基因家族的編碼序列（Genbank accessionNo. GU937875, Genbank accession No. KC430622，Genbank accession No. KC430623)，設計擴增出完整編 碼框的上下游引物分別為：
[0029] 4CL1-F:ATGGAGAAATCCGGCTACGG;(SEQ ID No. 7)
[0030] 4CL1-R:TCACATCTTGGATCTT ACTT;(SEQ ID No. 8)
[0031] 4CL2-F:ATGGTGCTCCAACAACAACA;(SEQ ID No. 9)
[0032] 4CL2-R:CTACTTAGGGTACTCG GTTT;(SEQ ID No. 10)
[0033] 4CL3-F:ATGCAGAAACAGAGCAGCAA;(SEQ ID No. 11)
[0034] 4CL3-R:TTAGTTCACCAACCCA GTTG(SEQ ID No. 12)
[0035] 并在上游和下游引物上分別引入限制性內切酶位點（這可視選用的載體而定)，以 便構建表達載體。以第一鏈cDNA為模板，經PCR擴增后進行測序。· ·Α序列測定由上海博 亞或晶泰生物技術服務有限公司采用3730自動測序儀完成。測序結果表明，所克隆的序列 與GenBank登錄的菘藍4CL基因編碼序列一致(表1至3)。
[0036] 表1.菘藍Ii4CLl基因的全長cDNA及氨基酸序列
[0037]
【主權項】
1. 編碼菘藍4-香豆酰輔酶A連接酶蛋白家族的核苷酸序列，其特征在于： 其中，所述核苷酸序列分別如SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3所示。
2. 菘藍4-香豆酰輔酶A連接酶蛋白家族的氨基酸序列，其特征在于： 其序列如 SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5 以及 SEQ ID NO. 6 所示。
3. -種通過調控菘藍4-香豆酰輔酶A家族蛋白的表達以改變落葉松脂素的生物合成 的應用。
【專利摘要】本發明提供了菘藍4-香豆酰輔酶A連接酶蛋白家族的三段編碼序列，分別如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示。本發明還提供了菘藍4-香豆酰輔酶A連接酶蛋白家族的氨基酸序列,其特征在于：其序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5以及SEQ ID NO.6所示。本發明還提供了一種通過調控菘藍4-香豆酰輔酶A家族蛋白的表達以改變落葉松脂素的生物合成的應用。本發明在育種和生物能源方面具有重要的應用價值。
【IPC分類】C12N9-00, C12N15-52, A01H5-00
【公開號】CN104805096
【申請號】CN201410030374
【發明人】肖瑩, 周洵, 楊穎博, 陳萬生, 張磊
【申請人】中國人民解放軍第二軍醫大學
【公開日】2015年7月29日
【申請日】2014年1月23日