酵母中生產乙酰-CoA的酶的制作方法
【專利說明】
[0001]本申請是申請號為200880100320. 7的中國專利申請的分案申請，原申請是國際 申請PCT/EP2008/059119的中國國家階段申請。
技術領域
[0002] 本發明屬于使用異源表達體系在酵母中生產代謝產物的領域。具體地，本發明涉 及對下述酵母菌株的代謝改造，所述酵母菌株能夠生產需要胞質乙酰-CoA作為前體的代 謝產物，例如生產丁醇的酵母菌株。本發明涉及鑒定異源酶的實驗體系，所述異源酶在酵母 胞質中表達時能夠將丙酮酸、乙醛或乙酸轉化為乙酰-CoA。
【背景技術】
[0003] 乙酰-輔酶A(C〇A)是大量代謝通路的必需中間產物，并且是許多工業相關化合物 合成中的關鍵前體，所述化合物例如為脂肪酸、類胡蘿卜素、類異戊二烯、維生素、氨基酸、 脂質、蠟酯、（多）糖多羥基鏈烷酸酯、他汀、聚酮化合物和乙酸酯（例如乙酸乙酯和乙酸異 戊酯）。具體地，乙酰-CoA也是工業上重要的大量使用的化學品1- 丁醇的前體。
[0004] 與細菌例如E. coli相比，酵母細胞提供了生產上述乙酰-CoA衍生產物的非常合 適的替代方式，原因是因為基于酵母的過程可以在低pH下運行，所以酵母對噬菌體或其它 感染不易感。因此，使用酵母不需要無菌的過程，從而降低了感興趣的產物的成本價格。
[0005] 當天然（野生型）酵母不能夠生產感興趣的乙酰-CoA衍生產物時，使用代謝工 程改造能夠提供表達能夠支持這類過程的異源基因的酵母細胞。在這類情況下，異源基 因產物通常被靶向酵母的胞質區室。因為乙酰-CoA-衍生產物的生物合成會完全或部分 地在胞質溶膠中進行，所以在胞質區室中供應足量的前體乙酰-CoA是至關重要的。在 Saccharomyces cerevisiae中，乙酰-CoA的生物合成發生于兩個分開的區室中。在線粒體 中，通過丙酮酸脫氫酶復合物（PDH)催化的丙酮酸氧化脫羧作用合成乙酰-CoA，該合成具 有以下的總反應化學計量：
[0006]丙酮酸（Pyr) +CoA+NAD+=乙酰-C〇A+C0 2+NADH+H+
[0007] 在胞質溶膠中，通過丙酮酸脫氫酶（PDH)旁路合成乙酰-CoA，該旁路涉及酶丙酮 酸脫羧酶（PDC)、乙醛脫氫酶（ALD)和乙酰-CoA合成酶（ACS)，其具有以下的總體反應化學 計量：
[0008] Pyr+CoA+ATP+NAD (P) + =乙酰-C〇A+C0 2+NAD (P) H+AMP+PP i +H+。
[0009] 酵母S. cerevisiae的丙酮酸-脫氫酶-負性（Pdc_)突變體不具有功能性PDH旁 路，并且由于不能為生長提供（足量的）胞質乙酰-CoA而不能在含葡萄糖作為唯一碳源的 最小培養基上生長（Flikweert et al.，（1996)Yeastl2:247-57)。因此，PDH旁路對在胞質 區室中提供乙酰-CoA而言是必需的。然而，從以下的總體反應化學計量中可以看出，對能 量平衡而言酵母中的PDH旁路不是最適的：通過H)H-旁路合成每摩爾乙酰-CoA需要2摩 爾ATP，因為乙酰-CoA合成酶反應ATP被水解為AMP。相反，經由PDH的線粒體通路不需要 ATP。PDH旁路的額外ATP需求可能是從胞質乙酰-CoA前體合成感興趣的產物的一個問題， 因為為了產生ATP需要通過例如氧化磷酸化和/或底物磷酸化（例如糖酵解）將更多的碳 源轉化，從而降低基于碳的產物總體產率。
[0010] 將酵母代謝工程改造為生產1-丁醇時，可以在酵母細胞的胞質溶膠中表達異源 生物合成基因（W0 2007/041269)。通常，1摩爾葡萄糖通過糖酵解產生2摩爾乙酰-CoA，這 是1摩爾丁醇的前體；因此，如果不考慮細胞生長和維持，則每摩爾葡萄糖最多能夠合成1 摩爾丁醇。然而，與丁醇生物合成組合使用TOH旁路時，由于能量不平衡而不能達到該最大 理論產率：其中在糖酵解中每摩爾轉化的葡萄糖產生2摩爾ATP，PDH旁路中形成2摩爾乙 酰-CoA需要總計4摩爾（2乘以2摩爾）ATP，所述2摩爾乙酰-CoA被轉化為1摩爾丁醇。 因此，如果使用PDH旁路從1摩爾葡萄糖中合成1摩爾1- 丁醇，則存在ATP的凈短缺。
[0011] 因此，需要鑒定出其中不需要PDH旁路的可能替代性代謝途徑，用于在酵母中生 產胞質乙酰-CoA，用于生產乙酰-CoA衍生產物，尤其是丁醇。
[0012] 丁醇是重要的工業化學品，并且適合用作替代性的引擎燃料，其具有優于乙醇的 改進的特性。丁醇還可用作多種化學和紡織過程的溶劑，用于塑料的有機合成中，用作化學 中間產物，和在涂層和食品和調味劑工業中用作溶劑。丁醇可以產自生物質（生物丁醇） 以及化石燃料（石油丁醇）。
[0013] 可以通過本領域已知的多種可用方法完成丁醇異構體之一的化學 合成（見例 如 Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry,6th edition,2003, ffiley-VCHVerlag GmbH and Co., ffeinheim, Germany, Vol. 5, pp. 716-719) 〇 這些工藝的缺點是它們基于石油化學品衍生物的使用，所述石油化學品衍生物通常是昂貴 的并且對環境不友好。
[0014] 可以使用細菌Clostridium acetobutylicum或其它Clostridium物種進行的丙 酮-丁醇-乙醇（ABE)過程，通過發酵實現丁醇的生物合成。然而，ABE過程的一個重要缺 點在于，其產生丙酮、1-丁醇和乙醇的混合物。另外，細菌的使用需要無菌的工藝條件，并通 常使該過程對噬菌體感染易感。因此，酵母細胞提供了上文所述的非常合適的替代方式。

【發明內容】

[0015] 本發明人目前鑒定了在酵母中提高胞質乙酰-CoA生產的替代性代謝途徑，所述 途徑能夠克服PDH旁路的問題。
[0016] 一種可能的途徑包括通過使用乙酰基化乙醛脫氫酶（E. C. 1. 2. 1. 10)(見圖2,反 應A，A⑶H)將乙醛直接轉化為乙酰-CoA而不消耗ATP。另一途徑包括通過酶或多酶復合物， 例如通過使用丙酮酸：NADP氧化還原酶（E. C. 1.2. 1.51)(見圖2,反應C，PN0)，將丙酮酸直 接轉化為乙酰-CoA而不消耗ATP。在這兩種可能的途徑中，每摩爾葡萄糖形成1摩爾丁醇會 導致形成2摩爾ATP。還有另一種途徑包括通過替代性酶或酶組合，例如通過使用乙酸：CoA 連接酶（ADP-形成，E. C. 6. 2. 1. 13)，或通過使用ATP:乙酸磷酸轉移酶（E. C. 2. 7. 2. 1)與 乙酰-CoA:Pi乙酰基轉移酶（E. C. 2. 3. 1.8)組合，將乙酸轉化為乙酰-CoA，形成每個乙 酰-CoA消耗1個ATP。在該途徑中，每摩爾葡萄糖形成1摩爾丁醇是ATP-平衡的，即不會 形成ATP。本發明人目前發現，PDH旁路的這一替代方式可以在酵母的胞質溶膠中導致乙 酰-CoA合成，并且這樣的乙酰-CoA可以在生物合成中用于產生更高量的想要的發酵產物， 例如丁醇。
[0017] 在第一方面，本發明提供了鑒定下述異源多肽的方法，所述多肽具有在酵母細胞 (的胞質溶膠）中將丙酮酸、乙醛或乙酸轉化為乙酰-CoA的酶活性，所述方法包括：
[0018] -提供突變的酵母細胞，其中所述突變包括至少一種（PDH)旁路基因的失活，所述 基因選自編碼丙酮酸脫羧酶（PDC)、乙醛脫氫酶（ALD)和乙酰-CoA合成酶（ACS)的基因；
[0019]-用包含至少一種異源核苷酸序列的表達載體轉化所述突變的酵母細胞，所述異 源核苷酸序列與在酵母中有功能的啟動子可操作地連接，并且所述異源核苷酸序列編碼至 少一種具有將丙酮酸、乙醛或乙酸轉化為乙酰-CoA的潛在酶活性的候選多肽；
[0020] -針對在含葡萄糖作為唯一碳源的最小培養基上生長的能力，測試所述重組突變 的酵母細胞，和
[0021] -當觀察到所述細胞的生長時，將所述候選多肽鑒定為具有在所述酵母細胞（的 胞質溶膠）中將丙酮酸、乙醛或乙酸轉化為乙酰-CoA的酶活性的異源多肽。
[0022] 在所述方法的一個優選的實施方案中，酵母細胞是Saccharomyces cerevisiae 細胞，針對在Saccharomyces cerevisiae中的表達，對所述異源核苷酸序列進行了密碼子 (對）優化。
[0023] 在另一個優選的實施方案中，所述突變包括乙酰-CoA合成酶同種型2 (acs2)基因 的失活。
[0024] 在另一個優選的實施方案中，所述具有將乙醛轉化為乙酰-CoA的酶活性的至少 一種候選多肽是（推定的）乙酰基化乙醛脫氫酶。
[0025] 或者，所述在酵母細胞（的胞質溶膠）中具有將丙酮酸、乙醛或乙酸轉化為乙 酰-CoA的酶活性的至少一種異源多肽可以由兩種或更多酶組成，所述兩種或更多酶一起 發揮作用，達到想要的從丙酮酸、乙醛或乙酸到乙酰-CoA的轉化。
[0026] 在另一方面，本發明提供了用于在酵母細胞基因組中整合異源核苷酸序列并隨后 從中表達異源多肽的整合載體，所述異源核苷酸序列編碼具有將丙酮酸、乙醛或乙酸轉化 為乙酰-CoA的酶活性的多肽。
[0027] 在另一方面，本發明提供了在酵母中表達異源多肽的表達載體，所述表達載體包 含異源核苷酸序列，所述異源核苷酸序列與在酵母中有功能的啟動子可操作地連接并且編 碼下述多肽，所述多肽在所述酵母細胞（的胞質溶膠）中具有將丙酮酸、乙醛或乙酸轉化為 乙酰-CoA的酶活性。
[0028] 在所述載體的一個優選的實施方案中，通過上文所述的根據本發明的方法，鑒定 具有將丙酮酸、乙醛或乙酸轉化為乙酰-CoA的酶活性的多肽。
[0029] 在另一個優選的實施方案中，所述多肽選自SEQ ID勵:19、22、25、28和52及其功 能性同源物。
[0030] 在另一個優選的實施方案中，所述表達載體用于在Saccharomyces cerevisiae 中 的表達，其中針對在Saccharomyces cerevisiae中的表達，對所述異源核苷酸序列進行了 密碼子（對）優化。
[0031] 在另一個優選的實施方案中，所述異源核苷酸序列選自SEQ ID N0:20、23、26和 29 〇
[0032] 在另一方面中，本發明提供了包含如上所述本發明的表達載體的重組酵母細胞。
[0033] 在一個優選的實施方案中，重組酵母細胞還包含至少一個（PDH)旁路基因的失 活，所述基因選自編碼丙酮酸脫羧酶（PDC)、乙醛脫氫酶（ALD)和乙酰-CoA合成酶（ACS)的 基因。
[0034] 優選地，根據本發明的酵母細胞包含編碼乙酰-CoA合酶的基因的失活。
[0035] 在另一個優選的實施方案中，重組酵母細胞還包含下述基因（核苷酸序列）的失 活，所述基因編碼能夠催化乙醛轉化為乙醇的酶，所述基因優選是編碼醇脫氫酶的基因。
[0036] 在本文中使用時，可以通過編碼酶的基因或核苷酸序列（的部分）的突變、缺失或 斷裂，實現編碼酶的基因（核苷酸序列）的失活。
[0037] 優選地，根據本發明的酵母細胞顯示在含有葡萄糖作為唯一碳源的最小培養基上 生長。
[0038] 在本發明酵母細胞的另一個優選的實施方案中，所述酵母細胞還包含一個或多 個引入的基因，所述基因編碼從胞質乙酰-CoA形成1- 丁醇的重組通路。從乙酰-CoA到 1-丁醇的合適的重組通路是本領域已知的。這類通路例如從W0 2007/041269中已知。優 選地，所述一個或多個引入的基因編碼生產乙酰乙酰基-C〇A、3-羥基丁酰基-CoA、丁烯酰 基-CoA、丁酰基-CoA、丁醛和/或1- 丁醇的酶。所述酶可以是：
[0039]-乙酰-CoA 乙酰基轉移酶（E. C. 2. 3. 1. 9 [Enzyme Nomenclature 1992, Academic Press，San Diego];盡管具有更寬泛的底物范圍的酶（E. C. 2. 3. 1. 16)也同樣有作用），所 述酶將2摩爾乙酰-Coa轉化為乙酰乙酰基-CoA ;
[0040] -NADH-依賴性或NADPH-依賴性3-羥基丁酰基-CoA脫氫酶（E. C. 1. 1. 1. 35或 E.C. 1. 1. 1.30,分別為E.C. 1. 1. 1. 157或E.C. 1. 1. 1.36)，所述酶將乙酰乙酰基-CoA轉化為 3-羥基丁酰基-CoA ;
[0041]-3-羥基丁酰基-CoA脫氫酶（也稱作巴豆酸酶；E. C. 4. 2. 1. 17或E. C. 4. 2. 1. 55)， 其將3-羥基丁酰基-CoA轉化為丁烯酰基-CoA ;
[0042] -NADH-依賴性或NADPH-依