專利名稱：丙酸桿菌載體的制作方法
技術領域：
本發明涉及丙酸桿菌屬(Propionibacterium)的一種內源質粒，由其衍生的載體，和這些載體在細胞特別是丙酸桿菌中表達(異源)蛋白質的應用。被轉化的細菌尤其能用來通過發酵生產維生素B12或用于干酪制造。
引言丙酸桿菌是能在多種工業方法中生產多種有用化合物的革蘭氏陽性菌。例如，已知幾種丙酸桿菌屬的菌種能在大規模發酵過程中產生維生素B12(鈷胺素)。其它菌種用于乳制品用途，如干酪制造，它們促成了干酪的特殊香味和質地，在許多情況下甚至是其主要原因。據認為許多丙酸桿菌屬的菌種作為活生物摻入食物和動物飼料中是安全的。
為了能夠充分開發丙酸桿菌屬的生物工藝潛力，需要有效且靈活的遺傳工程技術。這些技術依賴于合適質粒的可得性，以在丙酸桿菌中由異源基因表達蛋白質。
EP-A-0400931(Nippon Oil)涉及一種來源于戊糖丙酸桿菌(Propionibacterium pentosaceum)(ATCC4875)的內源質粒(pTY-1)，但未描述其序列，也未說明如何用它來表達異源基因。
JP 08-56673涉及質粒pTY-1用于生產維生素B12，但未提供關于該質粒作為一種自由復制的染色體外元件或該質粒在被轉化細胞內穩定的任何證據。
因此本發明試圖提供比現有技術中的那些載體更有效并能保留于染色體外和成穩定的載體。特別是本發明旨在提供一種有效的載體，用于丙酸桿菌或外源基因組片段或基因向(丙酸桿菌)宿主菌株中的克隆或表達。由此可繞開宿主特異性限制酶，從而避免宿主以外源多核苷酸處理該質粒。
發明概述因此，本發明在第一方面提供了一種多核苷酸，其包含一種能與下列序列選擇性雜交的序列(a)SEQ ID NO:1或其互補序列；(b)費氏丙酸桿菌(Propionibacterium freudenreichii)CBS 101022的3.6kb質粒的序列；(c)費氏丙酸桿菌CBS 101023的3.6kb質粒的序列；或(d)一種編碼本發明的多肽的序列，如SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:3的(至少一部分)氨基酸序列，或其互補序列。
SEQ ID NO:1顯示了發明者已發現的丙酸桿菌LMG 16545的內源質粒的DNA序列。第一種編碼序列從核苷酸273到核苷酸1184，該編碼序列的預測氨基酸序列示于SEQ ID NO:2中。第二種編碼序列從核苷酸1181到核苷酸1483，該編碼序列的預測氨基酸序列示于SEQ ID NO:3中。
發明者篩查了大量丙酸桿菌分離株，并鑒定了兩種均攜帶3.6kb大小的隱蔽性質粒的菌株。一種菌株是費氏丙酸桿菌LMG 16545，其根據布達佩斯條約的條款于1998年6月19日保藏于真菌菌種保藏中心(CBS)，Oosterstraat 1,Postbus 273,NL-3740 AG Baarn，荷蘭，保藏者為Gist-brocades B.V.,Wateringseweg 1，郵政信箱1,2600 MA delft，荷蘭，保藏號為CBS 101022。另一種菌株為費氏丙酸桿菌LMG 16546，也由同一保藏者根據布達佩斯條約的條款于1998年6月19日保藏于CBS，保藏號為CBS 101023。
通過對LMG 16545的核苷酸序列的全面表征和計算機輔助分析，發明者已能鑒定用于外源DNA片段插入的位點。這些位點使得能構建在丙酸桿菌中仍能自主復制的質粒。
令人驚訝地發現，放線菌紅色糖多孢菌(Saccharopolysporaerythraea)的紅霉素抗性基因可在丙酸桿菌中高效表達，因此能用作被轉化細胞的選擇性標記。
也構建了在大腸桿菌和丙酸桿菌屬中都可穩定保持且可選擇的雙功能載體。這使得大腸桿菌可用于載體構建，以及同源或異源基因在丙酸桿菌中的功能性表達。應用大腸桿菌的載體構建比較容易，且能快速完成。
本發明的多核苷酸可在細菌如丙酸桿菌屬中自主復制或處于染色體外。
因此另一方面，本發明提供一種包含本發明的多核苷酸的載體。
本發明也提供一種制備多肽的方法，該方法包括在可表達該多肽的條件下培養一種用本發明的載體轉化或轉染的宿主細胞。
本發明還提供一種多肽，其包含SEQ ID NO:2或3所示的序列，或與該序列基本同源的序列，或其中任一序列的片段，或提供本發明的多核苷酸所編碼的蛋白質。發明詳述多核苷酸本發明的多核苷酸能選擇性地雜交SEQ ID NO:1的序列，或能選擇性地與SEO ID NO:1的一部分雜交，或能選擇性地與同該序列或序列的一部分互補的序列雜交。本發明的多核苷酸能選擇性地雜交費氏丙酸桿菌CBS 101022或CBS 101023的3.6kb質粒的序列，或能選擇性地與其中任一質粒的一部分序列雜交。通常，本發明的多核苷酸是一種連續的核苷酸序列，它能選擇性地雜交SEQ ID NO:1或任一3.6kb質粒的序列，或能選擇性地與其中任一序列的一部分雜交，或能選擇性地與同這些序列或任一序列部分的互補序列雜交。
本發明的多核苷酸和SEQ 1D NO:1的序列，或任一3.6kb質粒，或編碼一種多肽的序列，或這些序列的一部分，能以明顯高于背景的水平雜交。例如，可由于制品中存在其它多核苷酸而發生背景雜交。本發明的多核苷酸與SEQ ID NO:1或任一3.6kb質粒的序列或這些序列的部分之間相互作用所產生的信號水平，比其它多核苷酸與SEQ ID NO:1或任一3.6kb質粒的編碼序列或編碼多肽的序列或這些序列的部分之間的相互作用一般至少強10倍，優選地至少100倍。例如，可通過用如32P放射性標記探針測定相互作用的強度。選擇性雜交一般用中度嚴格(例如0.3M氯化鈉和0.03M檸檬酸鈉，大約50℃)到高度嚴格(相同條件，但在大約60℃)條件實現。
本發明包括的多核苷酸在至少20個，優選地至少30個，例如至少40、60或100個或更多連續核苷酸的區域內與(序列(a)-(d))一般能至少70％同源，優選地至少80％或90％，更優選地至少95％，最佳地98％同源。
上述同源性程度與最小大小的任一組合可用來限定本發明的多核苷酸，優選更嚴格的組合(即在更長長度上的更高同源性)。因此，例如，在25個，優選地超過30個核苷酸上至少80％或90％同源的多核苷酸構成本發明的一個實施方案，在40個核苷酸上至少90％或95％同源的多核苷酸也構成一個實施方案。
以上提及的部分可以是SEQ ID NO:1或任一3.6kb質粒的編碼序列。其它優選的SEQ ID NO:1部分包括復制起點，啟動子或調節序列，或能實現或輔助在宿主細胞如丙酸桿菌中自主復制的序列。
已經發現，質粒從限制位點SalⅠ到AlwNⅠ的部分似乎是質粒復制所需的區域。曾經缺失質粒的其它部分，但復制似乎未受不利影響。因此在本發明中，序列(b)和(c)可以是限制位點SalⅠ和AlwNⅠ所示的區域。其長度接近1.7kb。此外，序列(b)或(c)可被替換為對應于SEQID NO:1的核苷酸1-1800，如100-1700，合適地150-1500，有利地200-1300，最佳地250-1200的序列。
可認為分別由ORF1和ORF2編碼的蛋白質(SEQ ID NO:2和3)均有助于質粒復制。質粒經已知的滾環復制法復制，其中以內鏈為模板輔助產生一個外鏈拷貝的蛋白質切割原始dsDNA質粒處。去除外環拷貝，連接末端。宿主然后用產生的外環作為模板復制一個新的內環。
本發明的編碼序列可經核苷酸置換如1、2或3到10、25、50或100個置換的修飾。序列(a)-(d)的多核苷酸可替換地或另外可經一種或多種插入或缺失和成在一端或兩端延伸而修飾。如以下關于本發明的多肽所述，當被修飾序列翻譯時，可進行簡并置換，和/或可進行將導致保守氨基酸置換的置換。
本發明的多核苷酸可包括DNA或RNA。它們也可以是其中包含合成的或修飾的核苷酸的多核苷酸。本領域中已知許多不同類型的多核苷酸修飾。包括膦酸甲基酯和硫代磷酸酯主鏈，吖啶或聚賴氨酸鏈在分子3’和/或5’端的添加。對于本發明，可以理解，此處所述的多核苷酸可用本領域中可用的任何方法修飾。可進行這些修飾來提高體內活性或壽命。
本發明的多核苷酸可用作引物，例如PCR(聚合酶鏈反應)引物，另一種擴增反應的引物，探針，如通過使用放射性或非放射性標記的常規方法用顯示性標記物標記的探針，或者可將多核苷酸摻入或克隆到載體中。
這些引物、探針和其它片段的長度至少為15個，優選地至少20個，例如至少25、30或40個核苷酸。其長度一般可達40、50、60、70、100或150個核苷酸。探針和片段可比150個核苷酸更長，如長度可達200、300、500、1000或1500個核苷酸，甚至是序列(a)-(d)中任一個中短數個核苷酸，如5個或10個核苷酸的序列。
根據本發明的多核苷酸如DNA多核苷酸和引物可重組產生、合成或經本領域技術人員可用的任何方法產生。也可用標準技術克隆。多核苷酸一般為分離的和/或純化的形式。
通常用合成法產生引物，包括每次一個核苷酸地逐步產生希望的核酸序列。用自動化的技術實現這一點的技術在本領域中可輕易獲得。
更長的多核苷酸一般用重組方法如用PCR克隆技術產生。包括制備一對針對SEQ ID NO:1或欲克隆的任一3.6kb質粒的區域的引物(例如大約15-30個核苷酸)，使該引物與從丙酸桿菌中獲得的DNA接觸，在可引起希望區域擴增的條件下進行聚合酶鏈反應，分離擴增的片段(例如通過用瓊脂糖凝膠純化反應混合物)并回收擴增的DNA。可將引物設計為含有適當的限制酶識別位點，使得擴增的DNA能被克隆到一種合適的克隆載體中。這些技術可用來獲得全部或部分的SEQ ID NO:1或任一3.6kb質粒。
此處提及的技術在本領域中眾所周知10。
與SEQ ID NO:1或任一3.6kb質粒不是100％同源但屬于本發明范圍的多核苷酸能用多種方法獲得。
例如，通過探查基因組DNA文庫可獲得SEQ ID NO:1或任一3.6kb質粒的同源多核苷酸，該基因組DNA文庫由多種丙酸桿菌制備，如費氏丙酸桿菌、詹氏丙酸桿菌(P.jensenii)、特氏丙酸桿菌(P.thoenii)、產丙酸丙酸桿菌(P.acidipropionici)，或放線菌綱的其它菌株，或其它革蘭氏陽性菌，或富含G:C的菌株。所有這些生物都是可用于本發明的同源或異源基因、啟動子、增強子或宿主細胞的合適來源。
這些同源物及其片段通常能選擇性雜交SEQ ID NO:1或其互補序列或任一3.6kb質粒的編碼序列。在中度到高度嚴格條件下(例如0.03M氯化鈉和0.3M檸檬酸鈉，大約50-60℃)，用包含SEQ ID NO:1或任一3.6kb質粒的所有或部分編碼序列的探針探查丙酸桿菌基因組DNA文庫，可獲得這些序列。
用簡并PCR也能獲得同源物，該方法使用針對同源物內保守序列設計的引物。將SEQ ID NO:1或任一3.6kb質粒的序列與其同源物序列對比，能預測保守序列。這些引物可包含一個或多個簡并位點，并可在低于用針對已知序列的單序列引物克隆序列的嚴格條件時使用。
此外，也可經SEQ ID NO:1或任一3.6kb質粒或其同源物的定點誘變獲得這些多核苷酸。例如，當為將表達多核苷酸序列的特定宿主細胞優選密碼子偏好性而需要序列的沉默密碼子改變時，這可能是有用的。為了引入限制酶識別位點或改變多核苷酸編碼的多肽的性質或功能，其它序列改變也可能是希望的。
測定多核苷酸同源性的方法在本領域中眾所周知。例如，UWGCG程序包提供了能用例如其缺省設置計算同源性的BESTFIT程序7。對于與下面所述本發明的多肽有關的氨基酸同源性，人們可使用BLAST(基本局部對比搜索工具1)，其可進行氨基酸序列(必要時核苷酸序列)的對比，來測定序列相似性。因此能用BLAST確定真實配對或鑒定同源物，特別可用于那些不合缺口(gap)的配對。BLAST技術使用基于高評分片段對(HSP)的算法。
本發明包括包含本發明的多核苷酸序列及其互補序列的雙鏈多核苷酸。
本發明的多核苷酸(例如探針或引物)可帶有一種顯示性標記。合適的標記包括放射性同位素如32P或35S、酶標記或其它蛋白質標記如生物素。對這些標記的檢測技術原本已知。
(標記的或未標記的)多核苷酸可在基于核酸的試驗中用于檢測樣品中的本發明的另一種多核苷酸或測序。
本發明的多核苷酸包括SEQ ID NO:1或任一3.6kb質粒的序列變體，它們能在宿主細胞中自主復制或保持于染色體外。這些變體可穩定于細菌如丙酸桿菌中。
多核苷酸通常包含SEQ ID NO:1或任一3.6kb質粒的復制起點和/或編碼區，或這些序列的同源物。在宿主細胞如丙酸桿菌或大腸桿菌中穩定的本發明的多核苷酸是在5代如15代優選地30代之內不從宿主中丟失的多核苷酸。每一代兩個子細胞一般都遺傳這種多核苷酸。
多核苷酸可包含一種啟動子或復制起點(例如編碼一種復制蛋白的任何序列的上游)。
例如通過適當的方法能將本發明的多核苷酸轉化或轉染到細菌如丙酸桿菌或大腸桿菌中11。它可以以5-500如10-100的拷貝數存在于細菌中。
多核苷酸能在除丙酸桿菌之外的細菌中自主復制。這樣的細菌可以是大腸桿菌，或革蘭氏陽性菌或富含G:C的細菌或放線菌綱的細菌之一。這種多核苷酸通常包含能使該多核苷酸在細菌中自主復制的序列。這些序列可能來源于能在該細菌中復制的質粒。
本發明的多核苷酸可以是在丙酸桿菌中復制產生的多核苷酸。此外，也可以在另一種細菌如大腸桿菌中復制產生。該多核苷酸能避開丙酸桿菌的宿主限制系統。載體本發明的第二方面涉及含有第一方面的多核苷酸的載體。該載體能在宿主細胞中復制，如一種細菌，如放線菌，如丙酸桿菌或大腸桿菌。該載體可以是一種線性多核苷酸，或者更常見地是一種環形多核苷酸。該載體可以是本發明的多核苷酸與另一種載體的雜合體。其它載體可以是大腸桿菌載體，如pBR322，或pUC家族的載體，R1、ColD或RSF 1010或由其衍生的載體。
本發明的多核苷酸或載體可以是一種質粒。這種質粒可具有與圖1、2a或2b所示限制圖譜相同或基本相似的限制圖譜。
多核苷酸或載體可具有1kb-20kb如2-10kb最佳地3-7kb的大小。
多核苷酸或載體可含有多個功能性克隆位點。這些克隆位點一般包含限制酶的識別序列。多核苷酸或載體可包含SEQ ID NO:1所示的序列，和/或含有EcoRⅠ、SacⅠ、AlwN1、BsmⅠ、BsaBⅠ、BclⅠ、ApaⅠ、HindⅢ、SalⅠ、HpaⅠ、PstⅠ、SphⅠ、BamHⅠ、Acc65Ⅰ、EcoRⅤ和BgⅢ的限制酶識別位點。多核苷酸或載體于是可包含一個、超過一個或全部這些限制酶位點，通常為圖中所示的順序。
優選地，當存在于細菌如丙酸桿菌或大腸桿菌中時，本發明的多核苷酸或載體不整合到細菌染色體中。多核苷酸或載體在5代優選地20或30代之內一般不整合。
多核苷酸或載體可以是一種能保持于宿主細胞染色體外的自主復制的質粒，該質粒來源于一種內源丙酸桿菌質粒，當含有外源基因(對宿主而言)時，能在宿主細胞內表達該基因。術語“來源于”意思是自主復制質粒包括一種與本發明的多核苷酸相同的序列。
本發明的載體可包含一種選擇性標記。選擇性標記可以是提供抗生素抗性的基因，如氨芐青霉素、卡那霉素或四環素抗性基因。選擇性標記可以是紅霉素抗性基因。紅霉素抗性基因可來源于放線菌，如紅色糖多孢菌，例如來源于紅色糖多孢菌NRRL2338。可存在于載體中的其它選擇性標記包括提供氯霉素、硫鏈絲菌肽、紫霉素、新霉素、阿泊拉霉素、潮霉素、博來霉素或鏈霉素抗性的基因。
載體可以是一種表達載體，因此可含有一種異源基因(不天然存在于宿主細胞如丙酸桿菌中)，或宿主細胞(如丙酸桿菌)的內源或同源基因。在表達載體中，欲表達的基因通常與能引起宿主細胞中該基因表達的控制序列有效連接。
術語“有效連接”是指并列，其中所述組分的關系使它們以預期的方式起作用。以這樣的方式連接與編碼序列“有效連接”的控制序列，以在適合控制序列的條件下實現編碼序列的表達。
可將異源或內源基因插入SEQ ID NO:1的核苷酸1-200或核苷酸1500-3555之間，或同源多核苷酸中的相當位置處。
這些基因可括同源或內源基因，如延伸因子、啟動子調節序列或元件和復制蛋白。其它基因(對于宿主可能是異源的)包括那些編碼或參與生產營養因子、免疫調節劑、激素、蛋白質和酶(如蛋白酶、淀粉酶、肽酶、脂肪酶)、結構改進劑、調味劑(例如雙乙酰、丙酮)、基因簇、抗微生物劑(如乳鏈菌肽)、用于食品(如香腸、干酪)的物質、代謝酶、維生素(如B12)、尿卟啉原(Ⅲ)甲基轉移酶(UP Ⅲ MT)、cobA、抗原和(例如用于疫苗)治療劑的基因。可以看出，宿主能產生多種物質，不只是多肽，它們可以是希望的產物或可用來產生希望的產物。
異源基因可對人或動物有治療作用。這種基因可包含例如來源于致病生物的抗原。包含含這種異源基因的多核苷酸的宿主如丙酸桿菌可用作或用于疫苗，并可提供針對病原體的保護。
異源抗原可以是一種完全蛋白質或含有一種表位的部分蛋白質。抗原可來源于細菌、病毒、酵母或真菌。宿主細胞與表達宿主細胞構成了本發明的第三方面，其包含第一或第二方面的多核苷酸或載體。宿主細胞可以是如放線菌綱的細菌。細菌可以是丙酸桿菌或大腸桿菌。丙酸桿菌可以是費氏丙酸桿菌、詹氏丙酸桿菌、特氏丙酸桿菌或產丙酸丙酸桿菌。
本發明的第四方面提供了一種生產第三方面的宿主細胞的方法，該方法包括例如用公知的轉化技術11用第一或第二方面的多核苷酸或載體轉化或轉染宿主細胞。
本發明的第五方面提供了一種制備多肽的方法，該多肽由本發明的宿主細胞中存在的本發明的多核苷酸或載體編碼，該方法包括將宿主細胞置于或培養于該多肽可表達的條件下。
因此本發明此方面提供了一種制備特定基因編碼的多肽的方法，該方法包括在可引起該多肽表達的條件下培養一種用含有該基因的表達載體轉化或轉染的宿主細胞，并任選地回收表達的多肽。宿主細胞可屬于放線菌綱，或是革蘭氏陽性菌如丙酸桿菌或大腸桿菌。
多核苷酸或載體中存在的啟動子、翻譯起始物、翻譯終止子、延伸因子基因、核糖體RNA、抗生素抗性基因、合成啟動子(例如針對共有序列設計的)及其它表達調節信號可以是適于在宿主細胞中表達的那些。這樣的啟動子包括宿主細胞內源基因的啟動子。
培養條件可以是需氧或厭氧條件，這取決于宿主。對于發酵法，宿主細胞可置于厭氧條件中然后可能是需氧條件。然后例如從宿主細胞或發酵培養基中回收產生的化合物如表達的多肽。表達的多肽可由宿主細胞分泌。此外，多肽也可不由宿主細胞分泌。在這種情況中，多肽可在宿主細胞表面表達。例如，如果多肽包含在人或動物中希望對其產生免疫應答的一種抗原，則這樣的表達是希望的。
可存在于本發明的載體中的同源基因可以是cobA。因此含有該載體的宿主細胞能由一種底物產生一種化合物如維生素B12，或者該化合物可以是一種酶的產物。本發明特別提供了一種制備維生素B12的方法，包括在可表達UP(Ⅲ)MT基因的條件下培養或發酵這種宿主細胞。表達的酶能在底物被轉化為維生素B12的條件下與適當底物接觸。這可導致維生素B12產量的提高。治療如上所述，本發明的多核苷酸可包含一種是治療基因的異源基因。因此本發明包括一種含有本發明的載體的宿主細胞，該載體含有一種用于治療人體或動物身體的方法的治療基因。這種宿主細胞可以是丙酸桿菌。宿主細胞可以是活的或死的。
通過與一種藥學可接受的載體或釋稀劑混合能配制宿主細胞用于臨床施用。例如，能用于局部、腸胃外、靜脈內、肌內、皮下、經口或穿皮施用。宿主細胞可與藥學可接受的并適用于希望的施用途徑的任一載體混合。藥學可接受的注射用載體或釋稀劑可以是，例如無菌或等滲溶液，如注射用水或生理鹽水。
宿主細胞的劑量可根據多種參數調節，特別是根據所用宿主細胞的類型，欲治療的患者的年齡、體重和病情；所用的施用模式；欲治療的疾病；和需要的臨床方案。通常，例如口服施用的宿主細胞的數量為70kg成人每次107-1011個宿主細胞。
此處所述的施用途徑和劑量只是作為指導，因為技術人員能容易地確定任何特定患者和疾病的最佳施用途徑和劑量。多肽本發明的第六方面提供一種本發明的多肽，其包含SEQ ID NO:2或3所示的氨基酸序列，或基本上同源的序列，或這些序列中任一個的片段的氨基酸序列之一。該多肽可以是由第一方面的多核苷酸編碼的多肽。通常優選SEQ ID NO:2或3所示的天然存在的氨基酸序列。然而，本發明的多肽包括天然序列的同源物，和天然序列的片段及其同源物，它們具有天然存在的多肽的活性。一種這樣的活性可實現本發明的多核苷酸的復制。本發明的多肽特別可包括(a)SEQ ID NO:2或3的蛋白質；或(b)其同源物，來源于放線菌，如費氏丙酸桿菌或其它丙酸桿菌菌株；或(c)一種與(a)或(b)至少70％同源的蛋白質。
一種同源物可天然存在于丙酸桿菌中，并可以以與SEQ ID NO:2或3的多肽基本類似的方式起作用。這類同源物可存在于放線菌或革蘭氏陽性菌中。
一種與SEQ ID NO:2或3的蛋白質至少70％同源的蛋白質或其同源物在至少20個優選地至少30個如至少40、60或100個或更多連續氨基酸的區域中與之優選地至少80％同源，或90％更優選地至少95％、97％或99％同源。測定蛋白質同源性的方法在本領域中眾所周知，本領域的技術人員根據本說明書應當理解，以氨基酸同一性(有時稱作“硬同源性”)為基礎計算同源性。
因此能修飾SEQ ID NO:2和3的蛋白質及同源物的序列，產生本發明的其它多肽。
可進行氨基酸置換，例如從1、2或3個到10、20或30個氨基酸的置換。修飾的多肽通常保留其天然活性。例如可根據下表進行保守置換。第二列同一格中的氨基酸，優選地第三列中同一行中的氨基酸可以互相替換
本發明的多肽也包括上述全長多肽及其變體的片段，包括SEQ IDNO:2或3所示序列的片段。這些片段可保留全長多肽的天然活性。
合適的片段大小至少為約5個，例如10、12、15或20個氨基酸。SEQID NO:2和3的多肽片段及其同源物可包含一個或多個(例如2、3、5或10個)置換、缺失或插入，包括保守置換。
本發明的多肽可以是基本上分離的形式。本發明的多肽也可以是基本純化的形式，在此情況中該多肽一般包含于一種制品中，其中該制品中超過90％，例如95％、98％或99％的多肽是本發明的多肽。
本發明的多肽可以用顯示性標記物標記。顯示性標記可以是使多肽能被檢測到的任一合適的標記。合適的標記包括放射性同位素，如125I、35S、酶、抗體、多核苷酸和連接物如生物素。工業用途從敘述中應當明白，第三方面的宿主細胞不僅能用來生產重組蛋白質，而且能生產其它目的化合物，包括非蛋白質，如無機化學品，特別是維生素。因此本發明的第七方面涉及生產化合物的方法，該方法包括在生產希望的化合物的條件下培養或發酵第三方面的宿主細胞。盡管該化合物可以是多肽，例如第六方面的多肽，但也可以是前面關于欲表達的基因的敘述中所提及的化合物之一。顯然無機化合物不是由基因表達的，但它們可由一種酶產生，或者多肽或酶可幫助宿主細胞產生希望的化合物。這些化合物可以在細胞內產生，然后，例如在宿主細胞裂解后分離，或者可通過宿主細胞壁進入周圍的培養基中，該培養基可以是一種發酵培養基，如一種水性溶液。這樣，能在含有細胞和細胞所需養分如可同化碳源和成氮源的水性培養基中培養宿主細胞。
這樣產生的多肽可具有治療用途。它們可能是藥物或其它藥理活性化合物，或者可能有抗原性或免疫原性，在此情況中它們可在疫苗方面得到應用。
本發明還包括利用該方法生產的化合物，無論它是否為重組多肽。特別希望的化合物是維生素如維生素B12(鈷胺素)。
有時化合物不需要從發酵培養基或宿主細胞中分離。宿主細胞本身可用于特定用途，例如用于食品如香腸或其制造，或用于干酪制造，或者例如宿主細胞可包含于動物飼料中，如當宿主細胞含有所述動物可攝取的化合物時。因此本發明擴展到這些化合物或宿主細胞在食品如干酪和香腸生產中的用途。本發明也構思了含有宿主細胞或本發明生產的化合物的食品或動物飼料。
在本發明的一個特別優選的實施方案中，宿主細胞可用于干酪制造方法中，因此本發明還包括一種制造干酪的方法，其中所使用的微生物是本發明的宿主細胞。這些宿主細胞可代替其它細菌如乳酸菌或與之一起使用。丙酸菌目前常用于干酪制造方法中，例如嗜溫培養(Maasdam型干酪)和嗜熱培養(瑞士干酪(Emmental))。嗜溫和嗜熱生物都能引起牛奶或干酪的酸化。這樣本發明的宿主細胞不僅能用于干酪而且能用于其它發酵乳制品(例如酸牛乳)的生產。丙酸菌可用于干酪制造，因為它們具有將乳酸鹽(酯)和碳水化合物轉化為丙酸、乙酸和二氧化碳的能力。特別是當其為丙酸桿菌時，能使用本發明的宿主細胞，因為它們對硝酸鹽和鹽較不敏感，這可減少或省略牛奶的離心除菌(通常用來降低梭狀芽孢桿菌(Clostridia)的水平)。
宿主細胞的發酵可具有一個或兩個階段或時期。例如，可能是生長和/或生產期，或厭氧和/或需氧期。優選地是生長和/或厭氧期，適當地也(例如之后)是生產和/或需氧期。
碳源和成氮源都可以是復合來源或單個化合物。對于碳源，優選的是葡萄糖。對于氮源，合適的來源包括酵母提取物或氨或銨離子。
本發明一個方面的優選特征加以必要的改變后適合于另一方面。
附圖以


本發明，其中圖1是本發明的一種載體-從費氏丙酸桿菌LMG 16545(CBS101022)中獲得的p545-的限制圖譜；和圖2a和圖2b每個均包括兩種載體的兩個圖譜，所有4種載體都屬于本發明。
現在參照下列實施例以實施例的形式描述本發明，不應把這些實施例看作是限制性的。
然后用一種最初為大腸桿菌建立并作了某些改進的質粒DNA分離法4從細菌中純化質粒用25％蔗糖、50mM Tris-HCl pH8溶液洗滌5ml培養物的細胞，將其重懸浮于含10mg/ml溶菌酶(BoehringerMannheim)的250μl TENS(25％蔗糖+50mM NaCl+50mMTris-HCl+5mM EDTA pH8)中，37℃溫育20-30分鐘。然后用500μl 0.2NNaOH/1％SDS裂解細菌細胞(在冰上溫育2-5分鐘)。在加入400μl 3MNaAc pH4.8(冰上5分鐘)隨后用酚/氯仿抽提后，加入異丙醇沉淀DNA。
經1％瓊脂糖凝膠電泳分析DNA，并用溴化乙錠顯示。大多數菌株是陰性的，即在該分析中不顯示存在固有質粒，而大多數證明為陽性的菌株含有大(≥20kb)質粒。在6個菌株中發現有較小的質粒。其中，詹氏丙酸桿菌LMG 16453、產丙酸丙酸桿菌ATCC4875、產丙酸丙酸桿菌LMG16447和非特異的丙酸桿菌株(LMG16550)含有一種大小為6-10kb的質粒。兩種菌株(費氏丙酸桿菌LMG16545和費氏丙酸桿菌LMG16546)顯示2種質粒的相同質粒分布。一種質粒是大質粒(未測定大小)而其它的較小，更多地存在且具有3.6kb的大小。選擇來源于LMG16545和LMG16546的這些3.6kb質粒用于進一步分析。
放射性標記LMG16545株的3.6kb質粒(此處稱為p545)，用于Southern印跡雜交實驗。雜交條件是0.2×SSC,65℃。它與LMG16545和LMG16546質粒DNA提取物有同樣的反應，支持了這些菌株的密切相關性，而產丙酸丙酸桿菌ATCC4875的質粒DNA提取物——其攜帶被稱作pTY1或pRG01的6.6kb質粒8——不能與之反應。
用Applied Biosystems 373A自動測序儀以熒光染料標記的雙脫氧核苷酸測定質粒p545的DNA序列，其作為SEQ ID NO:1包括于序列表中。對已用EcoRⅠ線性化并插入EcoRⅠ消化的pBluescript SKⅡ+DNA(Stratagene,La Jolla,Ca.，美國)中的質粒DNA進行序列分析。用BLAST搜索1獲得的序列計算機輔助分析表明了與參與幾種富含GC生物的質粒復制的蛋白質的同源性(例如，偶發分枝桿菌(Mycobacterium fortuitum)的pAL5000編碼的repA和repB8,14顯示與質粒p545的各自的推斷復制蛋白有28-30％的同一性和34-38％的相似性；谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)[PIR保藏號S32701]的pXZ10142是編碼與p545推斷復制蛋白同源的復制蛋白的質粒的另一個實例)。實施例7和8詳述了與同源序列數據庫對比的結果。
將該合成DNA與大片段連接，并將連接混合物轉移回大腸桿菌(使用T4連接酶)。獲得具有預期組成的質粒(pBR322ΔⅠ)。多克隆位點能用來引入選擇性標記及質粒p545 DNA。
作為一個實例，如此處所述進行提供紅霉素抗性的大腸桿菌/丙酸桿菌穿梭質粒的構建。
將來源于紅色糖多孢菌NRRL2338紅霉素生物合成簇并含有紅霉素抗性基因的1.7kb Acc65Ⅰ片段15,2插入Acc65Ⅰ線性化的pBR322ΔⅠ中。然后用EcoRV線性化新產生的被命名為pBRES的構建體，并與BsaBⅠ消化的p545 DNA連接。發現大腸桿菌轉化子攜帶含兩個方向正確插入片段的載體。得到的質粒載體被命名為pBRESP36B1和pBRESP36B2(圖2a和圖2b)。
也用在位于推斷復制區之外的另一個限制位點即AlwNⅠ處線性化的p545 DNA獲得質粒載體構建體。為進行該構建，pBRES載體應具有一個合適的克隆位點。設計了一種接頭，其由下列組成的兩種互補寡核苷酸(SEQ.ID.NO 6和7)組成5′GTACCGGCCGCTGCGGCCAAGCTT 3′5′GATCAAGCTTGGCCGCAGCGGCCG 3′這些oligo的退火產生一個雙鏈DNA片段，其分別具有Acc65Ⅰ和BglⅡ粘端，而且還含有一個內部SfiⅠ限制位點，該位點使末端可匹配AlwNⅠ消化的p545質粒。將該接頭克隆于pBRES的BglⅡ和近端Acc65Ⅰ位點之間。隨后用SfiⅠ消化這樣獲得的pBRES-Sfi載體，并與AlwNⅠ消化的p545連接。經限制酶分析證實，大腸桿菌的轉化產生含有正確載體的轉化子。獲得的載體被命名為pBRESP36A(圖2)。
在SLB(乳酸鈉培養液17)中30℃培養細菌細胞至穩定生長期，隨后用新鮮SLB 1∶50稀釋。30℃溫育約20小時后，收集細胞(現在處于指數生長期)并用冷0.5M蔗糖充分洗滌。隨后用由0.5M蔗糖組成的、1mM乙酸鉀pH5.5緩沖的電穿孔緩沖液洗滌細胞一次，最后以初始培養體積的大約1/100將其重懸浮于該電穿孔緩沖液中。在整個過程中細胞均置于冰上。
為進行電穿孔(BIORAD的裝置)，在預冷的1mm或2mm電穿孔杯中將80-100μl細胞懸液與±1μg DNA(或更小的量)混合，并釋放電脈沖。發現最佳脈沖條件是25kV/cm,200Ω電阻，25μF電容。然而，更低和更高的電壓(也在100Ω)也可產生轉化子。
脈沖后立即向脈沖細胞懸液中加入900μl含0.5M蔗糖的冷SLB，隨后30℃溫育2.5-3小時，之后將適量稀釋液平板接種于含0.5M蔗糖和10μg/ml紅霉素的SLB/瓊脂平板上。在厭氧條件下30℃溫育5-7天后，檢測轉化子。
從大腸桿菌DH5α(Promega)中分離的DNA產生每μg DNA 20-30個轉化子的轉化率。當從大腸桿菌JM110(dam-,dcm-株)中分離DNA時，達到高10-100倍的轉化率。大腸桿菌轉化按照BIORAD說明書進行。
轉化子含有無法與用于ATCC6207轉化的原始質粒DNA區分的可靠載體。用前述小規模質粒DNA分離法從轉化子中分離的質粒DNA的限制酶分析證明了這一點。
載體作為自主復制質粒獨自存在。與總DNA分離物的Southern印跡雜交13顯示，染色體DNA不能與用作探針的載體DNA雜交，表明未發生質粒DNA的染色體整合。
應用載體pBRESP36B2和pBRESP36A也成功進行了轉化，表明載體的功能性不依賴于p545的方向或所用的克隆位點。在此情況中也證實了載體的可靠性。
此外，與使用從大腸桿菌DH5α中分離的DNA相比，用從丙酸桿菌轉化子中分離的DNA轉化費氏丙酸桿菌ATCC6207株導致使轉化效率提高105-106倍。
另一種費氏丙酸桿菌株LMG16545(可從中獲得p545質粒的相同菌株)的轉化產生與ATCC株相當的轉化效率。
轉化結果和對維生素B12產量的影響顯示于下表中。
10個轉化子中的8個具有比對照株高可達50％的維生素B12含量。

實施例5含cobA基因的質粒載體的構建下面將描述一種質粒載體的構建及其提高費氏丙酸桿菌ATCC6207株中維生素B12(鈷胺素)合成水平的應用。
用下列引物(SEQ.ID.NO 8和9)經PCR產生在紅色糖多孢菌中提供紅霉素抗性的基因的啟動區正向引物(5′-3′)AAACTGCAGCTGCTGGCTTGCGCCCGATGCTAGTC反向引物(5′-3′)AAACTGCAGCAGCTGGGCAGGCCGCTGGACGGCCTGCCCTCGAGCTCGTCTAGAATGTGCTGCCGATCCTGGTTGC這樣產生的PCR片段在5’端含有一個AlwNⅠ位點，隨后是可靠啟動區和紅霉素抗性基因編碼區的前19個氨基酸，用于確保適當的轉錄和翻譯起始。在3’端具有XbaⅠ和XhoⅠ位點(用于在晚期插入cobA基因)，存在于紅霉素抗性基因下游的終止序列，和一個AlwNⅠ位點。
用AlwNⅠ消化PCR產物，與用AlwNⅠ部分消化的pBRESP36B2連接。在pBRESP36B2中存在的兩個AlwNⅠ位點中，只有存在于載體的p545特異部分的一個位點容納該片段。獲得攜帶預期構建體的大腸桿菌轉化子，該構建體被命名為pBRES36pEt。如下所述該載體用于進一步構建。
使用下列引物(SEQ.ID.NO 10和11)，經PCR從費氏丙酸桿菌ATCC6207株中產生編碼尿卟啉原Ⅲ甲基轉移酶的基因——cobA的編碼序列正向(5′-3′)CTAGTCTAGACACGGATGAGGAAACCCGATGA反向(5′-3′)CCCAAGCTTCTCGAGTCAGTGGTCGCTGGGCGCGCG這樣擴增的cobA基因在N端編碼區有一個XbaⅠ位點，在C端編碼區有HindⅢ和XhoⅠ位點。
通過將PCR產物作為XbaⅠ-HindⅢ片段克隆于pUC18中，及隨后大腸桿菌JM109株的轉化，證實了該cobA基因的功能性。當用紫外線照射時，含有功能性cobA基因的轉化子顯示亮紅色熒光。用XbaⅠ和XhoⅠ消化從這種轉化子中分離的質粒DNA，與同樣消化的pBRESP36B2連接。經限制酶消化和凝膠電泳分析DNA和來自幾個轉化子的用于大腸桿菌轉化的DNA。發現轉化子在表達載體中攜帶正確的插入片段。這種新的載體被命名為pBRES36COB。隨后按照前面所述的方法將該載體轉移到費氏丙酸桿菌ATCC6207中。分析獲得的10個轉化子，發現它們攜帶pBRES36COB載體，限制酶消化分析顯示，該載體無法與用于轉化的原始載體相區分。如下測定這10個轉化子中的維生素B12合成水平。
在含50ml BHI(腦心浸液)培養基(Difco)的100ml搖瓶中接種1-10號丙酸桿菌轉化子的冷凍培養物及只含載體質粒pBRESP36B2的對照株，并在不搖動的情況下28℃溫育72小時。將4ml該預培養液轉移到500ml搖瓶內的由15g/l Difco酵母提取物、30g/l Nalactate、0.5g/lKH2PO4、0.01g/l MnSO4和0.005g/l CoCl2組成的200ml生產培養基中，并在不搖動的情況下28℃溫育56小時，然后在New Brunswick旋轉振蕩器中200轉/分培養48小時。
用公知的HPLC法5測定維生素B12效價。10個轉化子中的9個顯示比對照株大約高25％的維生素B12產量。
與來源于偶發分枝桿菌質粒pAL5000(JS0052)的蛋白質比較，在194個氨基酸中發現37.1％的匹配(INIT 167,292)。與來源于谷氨酸棒桿菌(S32701)的蛋白質比較，在125個氨基酸中發現32.0％的匹配(INIT125,116)。與來源于大腸桿菌(SO4455)的ColE2蛋白比較，在221個氨基酸中發現29.9％的匹配(INIT 86,259)。對于同樣來源于大腸桿菌(SO4456)的ColE3蛋白，在相同數量氨基酸中發現完全相同的匹配。
將ORF2序列與來源于偶發分枝桿菌(S32702)的蛋白質比較，在75個氨基酸中發現53.3％的匹配(INIT 207,207)。
為此用SstⅡ和BclⅠ消化載體pBRESP36A(圖2)，產生一個1.7kb片段和一個6.5kb片段。將1.7kb片段(實際上是質粒p545的1.6kbAlwNⅠ-BclⅠ片段)替換為一種合成雙鏈DNA，該DNA包含SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13，具有SstⅡ和BclⅠ匹配末端和許多單一限制酶識別位點。SEQ.ID.No.125′GGAGATCTAGATCGATATCTCGAG 3′SEQ.ID.No.135′GATCCTCGAGATATCGATCTAGATCTCCGC3′這樣提供下列限制酶識別位點SstⅡ(恢復的)、BglⅡ、XbaⅠ、ClaⅠ、EcoRV、XhoⅠ(BclⅠ未恢復)。將連接混合物轉移給大腸桿菌，篩選含有預期組成的載體的轉化子。該載體被命名為pBRESAΔS-B。隨后用該載體對費氏丙酸桿菌ATCC6207株的成功轉化表明，p545中位于AlwNⅠ和BclⅠ之間的1.6kb區不是質粒復制所必需的。
通過去除質粒p545中對應于SalⅠ和BclⅠ之間區域的240bp進行另一種缺失。實現方法是分別用SalⅠ-SstⅠ和SstⅠ-XhoⅠ消化pBRESAΔS-B，并分離1.3kb SalⅠ-SstⅠ片段和6.6kb SstⅠ-XhoⅠ片段。連接這些片段，將連接混合物轉移給費氏丙酸桿菌ATCC6207，產生許多轉化子。分離新產生的構建體，命名為pBRESAΔS-S，經限制酶切作圖證實其結構。
這樣，關于質粒p545復制的所有必需信息都被定位于限制位點SalⅠ和AlwNⅠ所限定的1.7kb片段上，該片段包含ORF1和ORF2所編碼的預測的復制蛋白，并且能在不明顯妨礙質粒復制或穩定性的情況下刪除1.8kb。
通過PvuⅡ和HindⅢ消化獲得含cml基因(包括其自身啟動子)的片段，并分離含該基因的3.3kb片段。連接兩種載體特異片段和cml片段PvuⅡ和HpaⅠ末端為平端，從而插入cml基因并恢復親代載體的ermE基因。將連接混合物轉移給大腸桿菌，篩選載體含有正確cml插入片段的轉化子。該載體被命名為pBRESBCM。
用該載體對費氏丙酸桿菌ATCC6207的轉化，在含10μg/ml紅霉素或5μg/ml氯霉素的平板上的篩選，分別產生紅霉素和氯霉素抗性菌落，表明除紅霉素抗性基因外(丙酸桿菌-大腸桿菌穿梭載體在先顯示)，在丙酸桿菌中也表達氯霉素抗性基因。轉化子能在含有高達20μg/ml氯霉素的液體培養基中培養。
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(B)街道Wateringseweg 1(C)城市Delft(E)國家荷蘭(F)郵政編碼2611 XT(ⅱ)發明名稱丙酸桿菌載體(ⅲ)序列數目13(ⅳ)計算機可讀形式(A)介質類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，版本#1.25(EPO)(2)SEQ.ID.NO.1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度3555個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結構環狀(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅲ)假設否(ⅲ)反義非(ⅵ)初始來源(A)生物費氏丙酸桿菌(B)單獨分離物CBS 101022 LMG16545(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵詞CDS
(B)位置273..1184(D)其它信息/基因=“ORF1”(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1181..1438(D)其它信息/基因=“ORF2”(ⅹⅰ)SEQ.ID.NO.1的序列描述GTCGACCCTG ACAGCCGGCG AGCAGTTCAG GCGAAGATCG CACAGCTGCG CGAGGAACTA60GCCGCAATGC CCGAACACGC CCCAGCCATC CCTTGGAGCA GGTGGCAGCG TCAGGGGAGT120CGGGGGATGT TTGGCAGGGG ATGTGGAAAG AGAGTTCGCT TTGCTCACAT GGCTCAACCG180GGTAACTAAC TGATATGGGG TCTTCGTCGC CCACTTTGAA CACGCCGAGG AATGGACCAC240GCTGAACGTG ACTCGCATGC TTCACTGCAT GT ATG GAT TCG TTC GAG ACG TTG293Met Asp Ser Phe Glu Thr Leu1 5TTC CCT GAG AGC TGG CTG CCA CGC AAG CCG CTG GCG TCA GCC GAG AAG341Phe Pro Glu Ser Trp Leu Pro Arg Lys Pro Leu Ala Ser Ala Glu Lys10 15 20TCT GGG GCG TAC CGG CAC GTG ACT CGG CAG AGG GCG CTG GAG CTG CCT389Ser Gly Ala Tyr Arg His Val Thr Arg Gln Arg Ala Leu Glu Leu Pro25 30 35TAC ATC GAA GCG AAC CCG TTG GTC ATG CAG TCC TTG GTC ATC ACC GAT437Tyr Ile Glu Ala Asn Pro Leu Val Met Gln Ser Leu Val Ile Thr Asp40 45 50 55CGA GAT GCT TCG GAT GCT GAC TGG GCC GCA GAC CTC GCT GGG CTG CCT485Arg Asp Ala Ser Asp Ala Asp Trp Ala Ala Asp Leu Ala 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TGCCATGAGT GAGCATCTAC TGCACGGCAA GCCCGTCACC AACGAGCAGA2891TTCAGGCATG GGCAGACGAG GCCGAGGCCG GATACGACCT GCCCAAACTC CCCAAGCCAC2951GGCGCGGACG CCCGCCCGTA GGAGACGGTC CGGGCACCGT CGTACCCGTG CGTCTCGACG3011CGGCCACCGT TGCCGCTCTC ACAGAACGAG CAACAGCCGA GGGCATCACG AACCGTTCAG3071ACGCGATCCG AGCCGCAGTC CACGAGTGGA CACGGGTTGC CTGACCTCCA CGACTCAGCA3131CGCAAGCACT ACCAACGAGA CCGGCTCGAC GACACGGCCG TGCTCTACGC GGCCACCCAC3191GTTCTCAACT CCCGGCCACT CGACGACGAA GACGACCCGC GCCGCTGGCT CATGATCGGGA3251ACCGACCCAG CAGGCCGCCT ACTCGAACTC GTCGCACTGA TCTACGACGA CGGCTACGAA3311CTGATCATCC ACGCAATGAA AGCCCGCACC CAATACCTCG ACCAGCTCTA ACCAAGAAAG3371GAACCTGATG AGCGACCAGC TAGACAGCGA CCGCAACTAC GACCCGATGA TCTTCGACGT3431GATGCGCGAG ACCGCGAACC GCGTCGTCGC CACGTACGTT GCATGGGAAG ATGAAGCCGC3491TGATCCCCGC GAGGCTGCGC ACTGGCAGGC CGAGCGATTC CGCACCCGGC ACGAGGTGCG3551CGCC3555(2)SEQ.ID.NO.2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度303個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)SEQ.ID.NO.2的序列描述Met Asp Ser Phe Glu Thr Leu Phe Pro Glu Ser Trp Leu Pro Arg Lys1 5 10 15Pro Leu Ala Ser Ala Glu Lys Ser Gly Ala Tyr Arg His Val Thr Arg20 25 30Gln Arg Ala Leu Glu Leu Pro Tyr Ile Glu Ala Asn Pro Leu Val Met35 40 45Gln Ser Leu Val Ile Thr Asp Arg Asp Ala Ser Asp Ala Asp Trp Ala50 55 60Ala Asp Leu Ala Gly Leu Pro Ser Pro Ser Tyr Val Ser Met Asn Arg65 70 75 80Val Thr Thr Thr Gly His Ile Val Tyr Ala Leu Lys Asn Pro Val Cys85 90 95Leu Thr Asp Ala Ala Arg Arg Arg Pro Ile Asn Leu Leu Ala Arg Val100 105 110Glu Gln Gly Leu Cys Asp Val Leu Gly Gly Asp Ala Ser Tyr Gly His115 120 125Arg Ile Thr Lys Asn Pro Leu Ser Thr Ala His Ala Thr Leu Trp Gly130 135 140Pro Ala Asp Ala Leu Tyr Glu Leu Arg Ala Leu Ala His Thr Leu Asp145 150 155 160Glu Ile His Ala Leu Pro Glu Ala Gly Asn Pro Arg Arg Asn Val Thr165 170 175Arg Ser Thr Val Gly Arg Asn Val Thr Leu Phe Asp Thr Thr Arg Met180 185 190Trp Ala Tyr Arg Ala Val Arg His Ser Trp Gly Gly Pro Val Ala Glu195 200 205Trp Glu His Thr Val Phe Glu His Ile His Leu Leu Asn Glu Thr Ile210 215 220Ile Ala Asp Glu Phe Ala Thr Gly Pro Leu Gly Leu Asn Glu Leu Lys225 230 235 240His Leu Ser Arg Ser Ile Ser Arg Trp Val Trp Arg Asn Phe Thr Pro245 250 255Glu Thr Phe Arg Ala Arg Gln Lys Ala Ile Ser Leu Arg Gly Ala Ser260 265 270Lys Gly Gly Lys Glu Gly Gly His Lys Gly Gly Ile Ala Ser Gly Ala275 280 285Ser Arg Arg Ala His Thr Arg Gln Gln Phe Leu Glu Gly Leu Ser290 295 300(2)SEQ.ID.NO.3的信息(ⅰ)序列特征(A)長度85個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)SEQ.ID.NO.3的序列描述Met Thr Thr Arg Glu Arg Leu Pro Arg Asn Gly Tyr Ser Ile Ala Ala1 5 10 15Ala Ala Lys Lys Leu Gly Val Ser Glu Ser Thr Val Lys Arg Trp Thr20 25 30Ser Glu Pro Arg Glu Glu Phe Val Ala Arg Val Ala Ala Arg His Ala35 40 45Arg Ile Arg Glu Leu Arg Ser Glu Gly Gln Ser Met Arg Ala Ile Ala50 55 60Ala Glu Val Gly Val Ser Val Gly Thr Val His Tyr Ala Leu Asn Lys65 70 75 80Asn Arg Thr Asp Ala85(2)SEQ.ID.NO.4的信息(ⅰ)序列特征(A)長度59個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型DNA(合成)(ⅹⅰ)SEQ.ID.NO.4的序列描述AATTCAAGCT TGTCGACGTT AACCTGCAGG CATGCGGATC CGGTACCGAT ATCAGATCT59(2)SEQ.ID.NO.5的信息(ⅰ)序列特征(A)長度59個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型DNA(合成)(ⅹⅰ)SEQ.ID.NO.5的序列描述CCGAAGATCT GATATCGGTA CCGGATCCGC ATGCCTGCAG GTTAACGTCG ACAAGCTTG59(2)SEQ.ID.NO.6的信息(ⅰ)序列特征(A)長度24個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型DNA(合成)(ⅹⅰ)SEQ.ID.NO.6的序列描述GTACCGGCCG CTGCGGCCAA GCTT24(2)SEQ.ID.NO.7的信息(ⅰ)序列特征(A)長度24個堿基對(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型DNA(合成)(ⅹⅰ)SEQ.ID.NO.7的序列描述GATCAAGCTT GGCCGCAGCG GCCG24(2)SEQ.ID.NO.8的信息(ⅰ)序列特征(A)長度35個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型DNA(合成)(ⅹⅰ)SEQ.ID.NO.8的序列描述AAACTGCAGC TGCTGGCTTG CGCCCGATGC TAGTC35(2)SEQ.ID.NO.9的信息(ⅰ)序列特征(A)長度76個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型DNA(合成)(ⅹⅰ)SEQ.ID.NO.9的序列描述AAACTGCAGC AGCTGGGCAG GCCGCTGGAC GGCCTGCCCT CGAGCTCGTC TAGAATGTGC60TGCCGATCCT GGTTGC76(2)SEQ.ID.NO.10的信息(ⅰ)序列特征(A)長度32個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型DNA(合成)(ⅹⅰ)SEQ.ID.NO.10的序列描述CTAGTCTAGA CACCGATGAG GAAACCCGAT GA32(2)SEQ.ID.NO.11的信息(ⅰ)序列特征(A)長度36個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型DNA(合成)(ⅹⅰ)SEQ.ID.NO.11的序列描述CCCAAGCTTC TCGAGTCAGT GGTCGCTGGG CGCGCG36(2)SEQ.ID.NO.12的信息(ⅰ)序列特征(A)長度24個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型DNA(合成)(ⅹⅰ)SEQ.ID.NO.12的序列描述GGAGATCTAGATCGATATCTCGAG24(2)SEQ.ID.NO.13的信息(ⅰ)序列特征(A)長度30個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型DNA(合成)(ⅹⅰ)SEQ.ID.NO.13的序列描述GATCCTCGAGATATCGATCTAGATCTCCGC30
權利要求
1．一種多核苷酸，其包含能選擇性地與下列序列雜交的序列(a)SEQ ID NO:1或其互補序列；(b)費氏丙酸桿菌CBS 101022的3.6kb質粒的序列；(c)費氏丙酸桿菌CBS 101023的3.6kb質粒的序列；或(d)一種編碼多肽的序列，其包含SEQ ID NO:2或3，與之基本同源的氨基酸序列，或其中任一序列的片段。
2．一種多核苷酸，它是一種能保持于宿主細胞中染色體外的自主復制質粒，該質粒來源于一種內源丙酸桿菌質粒，當包含異源基因時能在宿主細胞內表達該基因。
3．根據權利要求1的多核苷酸，其在宿主細胞中自主復制。
4．根據權利要求3的多核苷酸，其中宿主細胞是丙酸桿菌。
5．根據權利要求4的多核苷酸，其中丙酸桿菌是費氏丙酸桿菌。
6．根據前述任一權利要求的多核苷酸，其能選擇性地與在丙酸桿菌屬中自主復制所必需的一種或多種SEQ ID No:1中的序列雜交。
7．根據權利要求1的多核苷酸，其包含限制位點SalⅠ和AlwNⅠ所限定的SEQ ID No:1的1.7kb片段或SEQ ID No:1的核苷酸1-1750。
8．一種包含根據前述任一權利要求的多核苷酸的載體。
9．根據權利要求8的載體，它是一種質粒。
10．根據權利要求8或9的載體，其另外包含一種選擇性標記。
11．根據權利要求8-10中任一項的載體，其在大腸桿菌中自主復制。
12．根據權利要求8-11中任一項的載體，它是一種表達載體。
13．根據權利要求12的載體，其包含丙酸桿菌的一種內源基因或與能引起基因表達的控制序列有效連接的異源基因。
14．根據權利要求13的載體，其中該基因是cobA基因。
15．根據權利要求13的載體，其中所述異源基因編碼一種在人或動物中是治療性的多肽。
16．一種多肽，其包含序列SEQ ID NO:2或3的序列或與之基本同源的序列，或所述任一序列的片段，或為權利要求1-7中任一項所述的多核苷酸所編碼。
17．一種宿主細胞，其含有根據權利要求1-15中任一項的異源多核苷酸或載體，或者能用根據權利要求13-15中任一項的載體轉化或轉染。
18．根據權利要求17的宿主細胞，它是一種細菌。
19．根據權利要求18的宿主細胞，它是丙酸桿菌或大腸桿菌。
20．一種生產根據權利要求17-19中任一項的宿主細胞的方法，包括用根據權利要求1-15中任一項的多核苷酸或載體轉化或轉染宿主細胞。
21．一種制備多肽或其它化合物的方法，該方法包括在允許所述多肽或化合物表達或產生的條件下培養或發酵權利要求17-19中任一項所述的宿主細胞。
22．根據權利要求21的方法，它是一種發酵法，其中在需氧或厭氧條件下培養宿主細胞。
23．根據權利要求21或22的方法，其中從宿主細胞中回收表達的多肽或產生的化合物。
24．根據權利要求23的方法，其中所述多肽是一種蛋白酶，淀粉酶、脂肪酶或肽酶，或者所述化合物是維生素B12。
25．根據權利要求21-24中任一項的方法，其中多肽由宿主細胞分泌。
26．根據權利要求25的方法，其中多肽在宿主細胞表面表達，和/或該多肽是一種抗原或免疫原。
27．一種用根據權利要求20-26中任一項的方法制備的多肽或化合物。
28．一種生產維生素B12(鈷胺素)的方法，該方法包括在生產該維生素的條件下培養根據權利要求17-19中任一項的宿主細胞，并在必要時分離該維生素。
29．用根據權利要求28的方法生產的維生素B12。
30．根據權利要求27的多肽，其用于治療人或動物身體的方法中。
31．根據權利要求17-19中任一項的宿主細胞，其用于治療人或動物身體的方法或用于動物飼料中。
32．根據權利要求17-19中任一項的宿主細胞或根據權利要求27的多肽或化合物在制造干酪或干酪制造業中的應用。
33．根據權利要求17-19中任一項的宿主細胞或根據權利要求27的多肽或化合物在食品制造或動物飼料中的應用。
34．一種含有根據權利要求27的多肽或化合物或根據權利要求17-19中任一項的宿主細胞的食品。
35．一種根據權利要求34的食品，用于人類(例如干酪、香腸)或動物消費。
36．一種制造干酪或其它發酵乳產品的方法，該方法包括使用根據權利要求17-19中任一項的宿主細胞。
37．根據權利要求36的方法，其中用宿主細胞代替乳酸菌或與之一起使用。
38．根據權利要求36或37的方法，其中宿主細胞是丙酸桿菌屬的細胞。
全文摘要
描述了丙酸桿菌的一種內源質粒,其分離自費氏丙酸桿菌LMG16545(保藏號為CBS101022),并提供了其序列。該質粒能用來轉化丙酸桿菌以表達同源或異源蛋白質,用于重組蛋白質或酶產物如維生素B
文檔編號C12N15/74GK1314941SQ99809489
公開日2001年9月26日 申請日期1999年6月25日 優先權日1998年6月25日
發明者P·H·普沃爾斯, N·范魯吉克, J·P·M·喬爾, R·G·M·路特恩 申請人:Dsm公司