用于穩定乙酰-輔酶a衍生化合物生成的方法
【技術領域】
[0001] 本公開文本涉及氧響應性啟動子作為遺傳開關用于調控經遺傳修飾的宿主細胞 的異源非異化化合物生成的用途。
[0002] 發明背景
[0003] 合成生物學的出現帶來了發酵微生物以工業規模和質量自可更新來源生產生 物燃料，化學制品和生物材料的指望。例如，在微生物宿主中成功構建了功能性非天然 生物學途徑，用于生產抗皰藥青蒿素的前體（參見例如Martin et al.，Nat Biotechnol 21:796-802(2003));脂肪酸衍生燃料和化學制品（例如脂肪酯，脂肪醇和和蠟；參見例如 Steen et al.，Nature 463:559-562(2010));構成降膽固醇藥的聚酮合酶（參見例如Ma et al.，Science 326:589-592(2009));和聚酮（參見例如 Kodumal，Proc Natl Acad Sci USA 101:15573-15578(2004))。然而，合成生物學的商業成功會大大依賴于可更新產品的生產 成本是否能夠變成比得上或比得過它們相應非可更新對應物的生產成本。
[0004] 菌株穩定性會是工業發酵成本的一項主要驅動項，因為它影響連續發酵能夠生產 性運行的時間長度。菌株穩定性一般指微生物在延長的培養時間里維持非異化發酵產物的 有利生產特征（即高產率（克化合物每克底物）和生產率（克每升發酵培養基每小時）） 的能力。特別地，遺傳穩定性（即生產微生物群中與產品生成有關的基因的指定等位基因 頻率隨時間變化小至無變化的傾向）在持久的產品輸出中發揮主要作用。
[0005] 對于除生物質以外的產品（根據定義，該產品消耗代謝能和碳，它們原本可用于 生成更多的細胞）的非異化發酵，不穩定性的機制是雙倍的：進化突變和選擇。首先，自發 和隨機發生生產喪失突變。其次，產品產率降低的細胞的生長速率或"適合性"優勢導致低 生產者席卷最終的群，并由此降低總體培養物性能。這種現象可稱作"菌株退化"。
[0006] 巴西燃料乙醇發酵對較長時間段實現自糖獲得乙醇的極高產率，即最大理論產率 的約90%。這部分是因為乙醇生產是異化性的：它生成2個ATP每分子生成的糖，而且不 涉及氧就是氧化還原反應平衡的。突變成不生成乙醇的細胞不太適合在發酵罐的低氧條件 下且不會席卷該群。這允許工業乙醇發酵貫穿季節循環大部分酵母生物質，由此使糖轉變 成酵母細胞生物質最小化并將幾乎所有糖引導至乙醇生產。這擴展繁殖和生物質的再使用 提高乙醇生產的效率：運轉支出減少，因為每個循環期間更少的糖變成生物質（即產率提 高）；而且資金支出減少，因為建造接種所用生物質需要更少和更小的發酵罐。
[0007] 比較而言，許多乙酰-CoA衍生烴（例如類異戊二烯，脂肪酸，和聚酮）的生成在性 質上一般是非異化性的；它們通常要求ATP，NADPH，和碳的凈輸入，常常供應大量的氧來幫 助平衡系統的氧化還原作用。此類環境使得朝向更低產品，更高生物質生成基因型的進化 更加有利，并導致更高速率的菌株退化。
[0008] 降低生成非異化產品的負選擇壓力的一種方式是在不想要該產品的時段期間關 閉產品形成，諸如在必須生成生物質以使發酵罐生產率最大化的發酵階段期間。如此，本領 域需要能夠在發酵期間控制乙酰-CoA衍生化合物生成時機的開關。
[0009] 發明概述
[0010] 本文中提供的是用于自經遺傳修飾的宿主細胞生成異源非異化化合物的發酵工 藝。在一些實施方案中，該工藝包含兩個階段：建造階段，期間非異化化合物生成實質性降 低（"關"階段），同時細胞生物質積累；和生產階段，期間非異化化合物生成開啟。如此，與 非異化化合物生成有關的負選擇壓力在不需要生成的發酵階段期間減輕。建造階段期間非 異化化合物生成的減少或消除導致（i)建造階段期間細胞的生長速率升高；和（ii)生產階 段期間菌株的生產穩定性升高。這導致非異化化合物生成持續更久，由此提高菌株的總體 產率和/或生產率。有利的事，本文中提供的發酵方法中非異化化合物生成的"關"和"開" 狀態經由容易獲得的，承擔得起的，和工業相關的條件來控制。
[0011] 一方面，發酵培養中非異化化合物生成的"關"和"開"狀態通過發酵期間的氧水 平，例如培養基中溶解氧的量，結合使用驅動實現異源非異化化合物生成的途徑酶的基因 表達的氧敏感性啟動子來控制。這些方法利用當培養工程化改造成生成異源非異化化合物 的細胞時能夠以有限量提供氧的觀察結果。這些細胞能夠在微好氧條件下維持生長和存活 力，由此節省與運行完全好氧發酵工藝有關的成本。在一些實施方案中，一旦宿主細胞群達 到足以像供應氧那樣快地消耗氧的密度，就能夠實現微好氧條件。有利的是，通過將途徑基 因表達與氧敏感性啟動子偶聯，化合物生成僅在宿主細胞群的氧消耗高得足以在發酵罐中 實現微好氧條件時（這在建造階段結束時，就是說，在為高效化合物生成實現了最佳細胞 密度時有效發生）開啟。如此，途徑基因表達與實現對生產階段開始理想的群密度緊密偶 聯。因而，本文中提供的方法利用氧水平和遺傳開關來實現用于異源非異化化合物生成的 改良發酵工藝的"關"和"開"階段。
[0012] 如此，本文中提供的是一種用于在經遺傳修飾的宿主細胞中生成異源非異化化合 物的方法，該方法包括：
[0013] (a)在好氧條件下在包含碳源的培養基中培養一群經遺傳修飾的宿主細胞，其中 該宿主細胞包含編碼用于生成該異源非異化化合物的酶促途徑的一種或多種酶的一種或 多種異源核酸，其中該一種或多種酶的表達受微好氧響應性啟動子的活性正調節，其中該 好氧條件限制由該宿主細胞生成的異源非異化化合物的量；并
[0014] (b)在微好氧條件下在包含碳源的培養基中培養所述群或其亞群，其中所述微好 氧條件提高所述群或其亞群的非異化化合物生成。
[0015] 在一些實施方案中，該微好氧響應性啟動子為突變型DAN1啟動子。在一些實施方 案中，該突變型DAN1啟動子包含選自下組的序列：SEQ ID勵：1，2,3,4,5,6,7,8,9和10。 在一些實施方案中，該突變型DAN1啟動子序列包含SEQ ID NO :1。在一些實施方案中，該 突變型DAN1啟動子序列包含SEQ ID NO :2。
[0016] 在一些實施方案中，該微好氧響應性啟動子與該編碼酶促途徑的一種或多種酶的 一種或多種異源核酸可操作連接，且所述微好氧條件提高該酶促途徑的一種或多種酶的表 達。在一些實施方案中，該微好氧響應性啟動子與編碼轉錄調節物的異源核酸可操作連接， 該轉錄調節物正調節該編碼酶促途徑的一種或多種酶的一種或多種異源核酸的表達，且所 述微好氧條件提高該轉錄調節物的的表達。在一些實施方案中，該轉錄調節物為Gal4p，且 該編碼酶促途徑的一種或多種酶的一種或多種異源核酸各自與選自下組的Gal4p響應性 啟動子可操作連接：pGALl，pGAL7和pGALlO。在一些實施方案中，該宿主細胞進一步包含 Gal80p的功能性破壞。
[0017] 在一些實施方案中，該微好氧條件包含該培養基中的溶解氧濃度小于約20 %，小 于約15%，小于約10%，或小于約5%。在一些實施方案中，該微好氧條件包含該培養基中 的溶解氧濃度為約〇 %。在一些實施方案中，該微好氧條件導致該宿主細胞的氧攝取率小于 約50毫摩爾，小于約40毫摩爾，小于約30毫摩爾，小于約20毫摩爾每升培養基，或小于約 10毫摩爾每升培養基。在一些實施方案中，該微好氧條件導致該宿主細胞的比氧攝取率小 于約30毫摩爾，小于約25毫摩爾，小于約20毫摩爾，小于約15毫摩爾，小于約10毫摩爾， 或小于約5毫摩爾每克細胞干重每小時。
[0018] 在一些實施方案中，由該群經遺傳修飾的宿主細胞在步驟（b)的培養期間里生成 的異源非異化化合物與在該酶促途徑的一種或多種酶的表達不受該微好氧響應性啟動子 的活性限制的好氧發酵工藝中實現的異源非異化化合物相比改善。
[0019] 本文中還提供的是一種用于在經遺傳修飾的宿主細胞中生成異源類異戊二烯的 方法，該方法包括：
[0020] (a)在好氧條件下在包含碳源的培養基中培養一群經遺傳修飾的宿主細胞，其中 該宿主細胞包含：
[0021] (i)編碼甲羥戊酸（MEV)途徑的一種或多種酶的一種或多種異源核酸，其各自與 選自下組的Gal4p響應性啟動子可操作連接：pGALl，pGAL7和pGALlO ;和
[0022] (ii)編碼Gal4p的核酸，其與微好氧響應性啟動子可操作連接；
[0023] 其中該好氧條件限制由該宿主細胞生成的異源類異戊二烯的量；并
[0024] (b)在微好氧條件下在包含碳源的培養基中培養所述群或其亞群，其中所述微好 氧條件提高所述群或其亞群的異源類異戊二烯生成。
[0025] 另一方面，發酵培養中的非異化化合物生成的"關"和"開"狀態通過培養基中糖麥 芽糖的量，結合使用調節實現異源非異化化合物生成的途徑酶的基因表達的麥芽糖響應性 啟動子來控制。有利的是，通過將途徑基因表達與麥芽糖敏感性啟動子偶聯，能夠通過控制 給料中麥芽糖的量來開啟或關閉化合物生成。例如，麥芽糖響應性啟動子能夠布線成"開" 閘，用于在麥芽糖存在下誘導異源非異化化合物生成。或者，麥芽糖響應性啟動子能夠布線 成"關"閘，用于在麥芽糖存在下誘導用于化合物生成的酶促途徑的負調節物表達。因而， 本文中提供的方法利用培養基中的麥芽糖水平和遺傳開關來實現用于異源非異化化合物 生成的改良發酵工藝的"關"和"開"階段。
[0026] 如此，本文中提供的是一種用于在經遺傳修飾的宿主細胞中生成異源非異化化合 物的方法，該方法包括：
[0027] (a)在包含碳源（包含麥芽糖）的培養基中培養一群經遺傳修飾的宿主細胞，其中 該宿主細胞包含編碼用于生成該異源非異化化合物的酶促途徑的一種或多種酶的一種或 多種異源核酸，其中該一種或多種酶的表達受麥芽糖響應性啟動子的活性負調節，其中該 培養基中存在麥芽糖限制由該宿主細胞生成的異源非異化化合物的量；并
[0028] (b)在包含碳源的培養基中培養所述群或其亞群，其中麥芽糖缺失或處于足夠低 的量使得該麥芽糖響應性啟動子不再有活性，且該宿主細胞的異源非異化化合物生成升 尚。
[0029] 在一些實施方案中，該麥芽糖響應性啟動子與編碼轉錄調節物的異源核酸可操作 連接，該轉錄調節物負調節該編碼酶促途徑的一種或多種酶的一種或多種異源核酸的表 達，且步驟（a)中的麥芽糖提高該轉錄調節物的表達。在一些實施方案中，該轉錄調節物 為GalSOp，該宿主細胞進一步包含Gal4p，且該編碼酶促途徑的一種或多種酶的一種或多 種異源核酸各自與選自下組的Gal4p響應性啟動子可操作連接：pGALl，pGAL7和pGALlO。 在一些實施方案中，該麥芽糖響應