專利名稱：檢測沙門氏菌屬的寡核苷酸的制作方法
沙門氏菌屬包含2個種Samonella enteria(根據生化特征和在DNA水平上的同源性將該種分成6個亞種)和Salmonellabongori。根據菌體和鞭毛抗原的限定將該屬進一步分成超過2000個血清型。沙門氏菌屬的細菌通常是動物和人的病原體。因此已知在發達國家中沙門氏菌屬是最普遍的食物中毒病例的引發者之一；這就是為什么快速和可信的檢測沙門氏菌屬亞種的方法顯得重要的原因。
引起食物毒性感染的沙門氏菌主要屬于S.enterica的亞種I(也稱I組)。
然而毒性感染不是由沙門氏菌屬感染引起的唯一病狀。
例如，Salmonella enterica亞種的腸血清型傷寒(下文稱為傷寒)是人傷寒發燒的病原體。
如果提供了由沙門氏菌引起的感染的特征且特別需要確定在取自病人或食物的生物學樣品中沙門氏菌的存在，那么得到快速和靈敏地檢測它們在樣品中存在的有效方法似乎是必須的。
到目前為止廣泛地用于檢測沙門氏菌的標準培養方法需要大量的時間并且不適于諸如食品污染的監測。為了克服這些方法的缺陷，根據分子生物學技術(如雜交試驗和以聚合酶鏈式反應為基礎的試驗)已提出了一些方法。各種DNA探針已用于幾個雜交和PCR方法中以檢測食物中沙門氏菌屬的亞種。然而，這些技術無一能令人完全滿意，因為所用的序列不是完全已知的或不是唯一存在于沙門氏菌屬中，因此可能會導致在探針和其它腸細菌DNA序列之間的交叉反應或可能導致大量假陰性或假陽性。
本發明人找到了檢測種S.enterica和/或S.bongori所有沙門氏菌的特異而靈敏的方法。最后，他們把注意力集中到Salmonellaenterica亞種的腸血清型傷寒菌株(S.Typhi)和與S.Typhi侵入細胞有關的基因上。
另外，他們限定了能夠特異性檢測沙門氏菌限定組(例如I組細菌)的某些條件。
本領域的現有技術已表明傷寒菌株能附著到HeLa細胞單層上并能進入這些細胞(Yabuuchi et al，1986)。然而，直到現在，與附著和進入細胞過程有關的遺傳決定因素尚未被清楚地鑒定。Elsinghorst等(1989)克隆了傷寒染色體片段，該片段使大腸桿菌型細菌獲得穿透Henle 407細胞的能力。最近與傷寒Ty2菌株侵入HeLa細胞有關的另一染色體區域已被鑒定和克隆(Popoff andDion，1990)。
本申請發明人鑒定了一條2.4kb的S.typhiDNA片段，它包含在Popoff和Dion(1990)描述的7.9Kb的Hind III序列之中，該區域能參與Salmonella enterica亞種腸血清型傷寒侵入細胞，特別是HeLa型細胞培養物的活動，而且該區域能用于對種S.enterica和/或S.bongori的所有代表菌株進行一般化診斷或任選地在特定檢測條件下對S.enterica I組進行特異性診斷的反應中。
本發明人已鑒定了稱為IagA的序列和稱為IagB的序列并鑒定為參與細胞侵入，這一特征在由Salmonella enterica亞種腸血清型傷寒菌株引起的感染中表現出來。
這些序列在S.Typhi中的特異性使本發明人提出了其用途，以便規定用于對S.typhi感染的診斷或甚至對沙門氏菌屬種S.enterica和/或S.bongori感染的診斷，或在某些情況下檢測S.enterica特定組的工具。
可用于對Salmonella entetrica和/或Salmonella bongori感染進行診斷的這些工具包含能用于核苷酸序列擴增反應(例如聚合酶鏈式反應)中的寡核苷酸。本發明還涉及用于檢測S.enterica或S.enterica特異亞種和/或S.bongori之核酸的探針、這些核酸(其中合適的)被擴增的片段。
本發明的主題還涉及用于檢測在生物樣品(例如食品)或任何用于臨床診斷的樣品中Salmonella enterica和/或Salmonellabongori存在的試劑盒和方法。根據本發明的特定實例，這些檢測試劑盒和方法對S.entericaI組菌株是特異性的。
相反，根據本發明的另一實例，這些方法使搜尋沙門氏菌屬S.enterica或S.bongori細菌的存在成為可能。因此，沙門氏菌屬包含6個亞種或I，II，III，IV，V或VI組。亞種I，II，III，IV或VI屬于S.enterica種，亞種V屬于S.bongori種。
本發明還涉及參與Salmonella enterica亞種腸血清型傷寒菌株侵入細胞的核苷酸序列，其特征在于它們是分別位于

圖1(Iag A)提供之序列的核苷酸97和1755之間和圖1(Iag B)提供之序列的核苷酸1776和2255之間的序列iagA或iagB之一。
本發明還涉及經過與iagA或iagB有關的修飾但卻表現出與侵入細胞有關的相同特征或在嚴緊條件下與上述序列之一雜交的核苷酸序列。
本申請的主題還涉及與圖1提供的序列或這些序列的變異體相應的IagA和IagB蛋白質，這些序列的變異體可通過突變，缺失或增加氨基酸獲得，只要由此獲得的序列可被直接抗上述IagA或、IagB序列之一的抗體識別。
一般來說，本發明的主題涉及由圖1提供的iagA和iagB基因編碼的任何氨基酸序列。
而且，本發明涉及足以使S.typhi保留其附著和感染細胞(特別是培養中的HeLa細胞)之特性的這些序列之一的任何片段，尤其是任何經純化的片段。
感染培養中的HeLa細胞的方法是標準方法，它已被特別地描述于
發明者M·Y·樸坡福, M·里·古恩·佛魯斯 申請人:國家健康與醫學研究所, 巴斯德研究所