專利名稱：一種培育雜交水稻種子的方法
技術領域：
本發明涉及一種培育雜交水稻種子的方法，尤其涉及利用雄性不育水稻有效地培育雜交水稻種子的方法。
水稻通過自花傳粉進行自然繁殖。因此為獲得雜交水稻種子，必須在開花之前摘除雄蕊。摘除雄蕊很費力，故難以獲得大量的雜交水稻種子。為解決這個問題，使用了雄性不育的水稻秧并省去摘除雄蕊的費力工作，從而大大地提高了生產效率。
眾所周知，一般說來，如果將植株進行雜交、雜交產物(第一代雜交后代F1)獲得高度改善的特性，從而提高了質量和產量。我們把這種現象稱之為雜種優勢。利用雜種優勢可培養出雜交水稻。
保持母本的胞質雄性不育性，這對培育雜交水稻來說是不可缺少的。為保持胞質雄性不育性，在母株和父株雜交后，分別收集在母株中培育的種子和在父株中培育的種子(已無用)。
這種方法有一個缺點，即要用人工將雜交種子同由父株自花傳粉培育的種子分離開。因而，培育雜交水稻的效率受到限制。此外，由于母株和父株應在不同的攏里種植，以確保分別收集雜交種子，這樣就不可能縮短母株和父株之間的距離，因此，傳粉率低，導致雜交種子單位面積產量也相應變低。
本發明的目的是提供一種培育雜交水稻種子的方法，這種方法克服了傳統方法中的缺點，而且用這種方法能高效培育出雜交種子。
眾所周知，植株對除草劑的敏感程度不同。申請人通過廣泛研究發現、利用植株對除草劑的不同敏感性，可以把雜交種子和由自花傳粉產生的種子分離開，以便達到本發明的目的。
在本發明的方法中，使具有雄性不育性的母本水稻具有抗除草劑的特性。然后，讓這種母本水稻與一種父本水稻進行異花授粉，從而培育出雜交種子。如果不進行處理，父本水稻的自花傳粉也培育出種子，那是無用的種子。可是在本發明的方法中，用除草劑處理親本，被選出來的只有雜交水稻種，母本對該除草劑具有抗性，只有父本水稻被殺死，而母本卻保持存活。
根據本發明的方法，由于存活的只是具有雄性不育性的母本，那么能夠高效率地收集雜交種子。從而摘除雄蕊的繁重工作就可免掉。另外，由于在收集種子時，沒有必要區分母本和父本，所以母本和父本可以混合種植，結果，不象在傳統方法中那樣讓母本和父本分壟種植，母本和父株之間的距離就能夠縮短，因此提高了母株和父株之間的傳粉率，也提高了雜交種子的單位面積產量。再者，由于能使胞質對除草劑具有抗性，所以能用三系法培育出比由傳統方法培育的種子具有更高純度的種子。
在本發明的方法中，通過遺傳重組技術，或者通過促使變異的方法使雄性不育性的母本水稻對除草劑具有抗性。
可以通過遺傳重組技術形成除草劑抗性的辦法，舉例如下首先，將水稻原生質體從水稻細胞懸浮液中離析出來。從細胞懸浮液中生成原生質體是眾所周知的現有技術。用眾所周知的電擊穿技術將一種產生除草劑抗性的基因引入由上述方法離析出來的原生質體〔例如參見FrommM等所著《電擊穿法轉入雙子葉(Monocot)和單子葉(Dicot)植物細胞內的基因表達》(Expression)ofGenesTransferredintoMonocot和DicotPlantCellsByElectroporation)，美國全國科學院文集Proc.Natl.Soi.U.S.A.82(17)，1985〕。在本技術領域，產生抗除草劑特性的基因是公知的，例如，這包括抗磺酰尿素的基因〔MazurB.J等所著《用密碼進行乙酰乳酸(Acetolactate)合成的植物基因的分離與定性，兩類除草劑的靶酶》(IsolationandCharacterizationofPlantGenesCodingforAcetolactateSynthase，TheTargetEnzymeforTwoClassesofHerbioides)，《植物生理學》(Bethesda)，85(4)，1987，第1110-1117頁〕，抗鎮草寧(Glyphosate)基因〔見ShadD.M.等所著《轉移基因植物中工程除草劑的耐量(EngineeringHericideToleranceinTransgenioPlants)，《科學》(華盛頓)，233(4762)，1986，第478-481頁，ThompsonG.A.等人所著《用密碼導致抗鎮草寧特性的一種細菌基因在植物中的表達》(ExpressioninPlantsofaBaoterialGeneCodingforGlyphosateResistance)Weedsci35(副刊1)，1987，第19-23頁〕和抗莠去津基因。然后，經培養，原生質體再生出愈傷組織。從原生質體中再生愈傷組織是公知的技術，并且在美國正審查中的專利申請06/865，519號，06/865，422和06/865，423號(或在中國申請的86103448號和中國專利8610337.4和86103461.9)均有所描述。在使愈傷組織再生的培養基中加入有效量的、基因對其有抗性的除草劑，加入量以能選出抗除草劑的愈傷組織為準。經過除草劑處理，那些對除草劑不具有抗性的愈傷組織被殺死，從而只選出符合要求的對除草劑具有抗性的愈傷組織。
通過促使變異也可產生抗除草劑的性能，方法如下首先，需對水稻細胞的懸浮液進行一種常規的變異處理。常規變異處理包括，X射線輻照(最佳值為15-100千拉德)或γ射線輻照和用乙烷基甲烷磺酸鹽處理(重量百分比的最佳值約為0.25)，或用亞硝基脲，亞硝基胍或吖丙啶處理。將處理過的細胞放在含一種除草劑的培養基中進行培養〔除草劑例如用莠去津Atrazine(Ciba-Geigy公司生產的市面上供應的以三嗪triazine為基礎的除草劑)，綠黃隆Chlorosulfone(E.I.DuPontDeNemours公司生產的市面上供應的以磺酰脲類Sulfonylurea為基礎的除草劑)，Sulfometuronmethyl(E.I.DuPontDeNenours公司生產的市面上供應的以磺酰脲類為基礎的除草劑)，鎮草寧Glyphosate(Monsante公司生產的市面供應的以磷酸鹽為基礎的除草劑)、Basta(Hoechst公司生產的市面上供應的以磷酸鹽為基礎的除草劑)、百草枯(Paraguat)(皇家化工公司生產的市面上供應的以四價銨鹽為基礎的除草劑)以及西瑪津〕，除草劑的用量以有效地選出接受除草劑抗性的細胞為準，使用該除草劑的目的就是為了選出有抗性的細胞。然后將已得到的抗除草劑細胞放在生長基中以生成愈傷組織。
將通過遺傳重組技術或促使變異技術所獲得到的愈傷組織轉入一種分化介質中。這種分化介質是公知的，06/865，519號美國審理中的專利申請(或為86103448號的中國專利申請)有所描述。這樣就可以使完整水稻植株再生。這種完整水稻植株在馴化之后最好在溫室中生長。
通過涂抹或噴灑一種含除草劑的溶液，對全部再生植株的抗除草劑性進行核查。作為對照將不具抗除草劑性質的水稻植株用同樣的方法進行處理，大約二周以后，就檢查出這些植株是否被殺死。如果不具抗除草劑性的對照植株被殺死而具有抗除草劑性的植株仍舊存活，那么，這種抗除草劑植株就可以用作母本植株。
水稻植株的這種抗除草劑的特性通常在許多品種可以穩定地遺傳。這樣，一旦這種抗除草劑的特性確立下來，就可以通過常規的雜交方法將這種特性引入其它品種。
雜交水稻的采種體系包括含有母本和父本的二品系法和含有母本、殘留母本及父本的三品系法。在三品系法中，母本殘留系中產生的種子可能與母本中產生的種子發生混染。如果發生了這種混染，就會降低雜交的純度。將抗除草劑基因引入原生質體，就可以解決這個問題。如果將這種抗除草劑基因引入原生質體，再用除草劑對幼苗進行處理就能夠排除混雜在由母本產生的種子中的、由殘留系產生的種子，于是就可以獲得具有高純度的雜交種子。通過上述遺傳重組技術或促使變異法可以將抗除草劑基因引入原生質體。
在已獲得的具有雄性不育性和抗除草劑性的母本水稻與一種父本水稻之間，通過異花授粉可以產生雜交種子。這種雜交最好是通過隨意地或混合地種植母本和父本植株來進行。將母本種子和父本種子混合后組成幼苗，然后在田里種植這些幼苗，這就是隨意種植可采用的方法。將母本和父本混合，可以縮短它們之間的距離，從而提高異花授粉率。母庸贅言，母本植株和父本植株也可以分壟種植。
然后用除草劑對父系植株和對該除草劑有抗性的母本植株進行處理。使用適量的除草劑殺死父本植株而保存母本植株。這樣，只有母本植株存活，所以后來收獲的所有種子都是母本中生成的雜交種子。雖然不一定非這樣做不可，但最好在開花后約10-20天給這種植株施用除草劑。當父本植株和母本植株混合種植時，在除草劑處理后3周左右和在收獲種子時，要核實植株死亡百分比與父本植株在全部植株中所占百分比相同。當母本植株和父本植株分壟種植時，經除草劑處理后3周左右和在收獲種子時，也要核實父本植株全部死亡。
采用本發明的方法，在收獲種子時或在收獲種子以后，不需任何選擇，所獲得的雜交種子的純度不低于99%。即使將父本植株和母本植株混合種植，雜交種子的純度也不會降低。另外，如果將母本植株和父本植株混合種植，它們之間的距離也縮短了，以致異花授粉率，也就是結實率就大大地提高了。
下面要用實例來描述本發明。應當指出，所列案例僅僅是為了說明問題，而不能對實例作限制性理解。
例1從水稻〔水稻屬(Oryza sativa)，品種栽培品種MT-CMA5〕種子中產生出愈傷組織，這種水稻種子是依據常規方法從具原生質體雄性不育性因素的Chinsura BoroⅡ中產生的。為了得到細胞懸浮液，每周在R2液體培養基中對愈傷組織進行中間培養，這種培養基(見Ohira等人在Plant Cell Physiol.14.pp.1113-1121上發表的文章)含重量百分比為0.3%的酪素水解產物，重量百分比為3%的蔗糖以及濃度為1ppm的2.4-D。用60KradX射線對這種懸浮液進行輻照，將輻照后的細胞放在含50ppm莠去津的生長基中培養。所用的生長基(以下簡稱生長基)為R2培養基，它含重量百分比為0.1%的酪素水解產物，重量百分比為3%的蔗糖，1ppm的2.4-D，重量百分比為0.8%的瓊脂。將存活的愈傷組織轉入含50ppm莠去津的生長基中。然后，將愈傷組織轉入一種分化介質，以再生完整植株。這種分化基為N6基(見Chu等人發表在《中國科學》18期第659-663頁上的文章)，它含重量比為3%的蔗糖(以下簡稱“分化基”)。用1000ppm的莠去津噴灑這種再生植株，并選出活著的植株。對選出的抗除草劑植株進行無性繁殖，以便保留其特性，通過花藥培養使這種特性穩定。通過這個過程，獲得53種具有雄性不育性的品系。為了F1種子，用已獲得的抗除草劑的植株作為母本，通過父本和母本混合種植進行雜交。開花20天后，每公頃田里噴灑40公斤的莠去津。在收獲種子時，父本植株完全被殺死。于是就獲得F1種子，結實率為28%。
例2對于例1中所獲得的懸浮培養細胞，用含重量比為0.25%的乙烯基甲烷(ethylenemethane)磺酸鹽進行處理。這種細胞在含有0.5mM甘草膦的生長基中培養1個月。為了進一步精選，將存活的愈傷組織轉入含有1mM甘草膦的生長基中。然后將存活的愈傷組織轉入分化基中，以再生完整植株。對由此而得的再生植株，施用0.1ml的膦酸甘氨酸(Roundup除草劑成分中所含有效成分)，選出了35個抗除草劑的單株。為了保持抗除草劑特性，對被選出的植株進行無性繁殖。此外，為了獲得穩定保持抗磺酸鹽特性并具有細胞質雄性不育特性的二種品系(MT-CM5-GR1和MT-CMA5-GR2)，將所獲得的植株與普通水稻(水稻屬，品種栽培品種MT-B5)雜交并進行無性繁殖。通過無性繁殖保留了這兩種品系。
為了獲得F1種子，用所得到的植株作為母本植株，通過分壟種植母本植株和父本植株來進行雜交。親本植物開花10天和30天后，每公頃田里噴灑20公升的膦酸甘氨酸。在采集種子的時候，父本植株已完全被殺死。F1種子的結實率為30.0%。
例3用與例1相同的方法從由Yahai(中國原產)生成的具有胞質雄性不育因素的水稻(水稻屬，品種栽培品種MT-CMA9)中，獲得懸浮培養出來的細胞。將這種懸浮的細胞放在含有0.1mMBensulfuronmethyl的生長基中培養1個月。為了再生完整植株，將所獲得的愈傷組織轉入分化基中。給得到的再生植株噴灑1000ppm的Bensulfuronmethyl，即選出了62個具有很強的抗除草劑性的單株。為了保持抗除草劑特性，對被選出的植株進行無性繁殖。此外，為了獲得穩定保持抗Bensulfuronmethyl特性并具有原生質體雄性不育性的4種品系(MT-CMA9-BR1，MT-CMA9-BR2，MT-CMA9-BR3和MT-CMA9-BR4)將被選出的植株與具有常規繁殖力的水稻(MT-B9)進行雜交，然后進行無性繁殖。
為了獲得F1種子，用上述所獲植株作為母本植株，分壟種植母本植株和父本植株，按常規方法進行雜交。在親本植株開花20天后，每公頃田里噴灑0.5公斤Bensulfuronmethyl。一個月以后，父本植株死亡得到了證實。F1種子的結實率為43%。
例4同例3中所獲得的抗Bensulfuronmethyl植株，(其種子顏色正常，再生的種子顏色也正常)作為母本植株，通過分開種植母本植株和父本植株，或者混合種植母本植株和父本植株，雜交后獲得F1種子。父本植株具有使種子呈黃色的特性。另外，改變親本數的比率，就可測出結實率。親本植株開花10天后，整個稻田用0.5公斤/公頃的Bensulfuronmethyl進行噴灑。種子成熟時，無選擇地采集田里所有的種子。在這種情況下，根據種子的顏色可以清楚地識別出F1種子和由父本植株自花傳粉產生的種子。本例子中采集得到的種子都是F1種子，沒有由父本自花傳粉產生的種子。在這個例子中，F1種子的結實率如下表所示表1分壟種植母本植株/父本植株比率結實率1/141.4%2/137.7%3/132.7%4/132.5%5/130.5%表2混合種植母本植株/父本植株比率結實率1/175.4%2/170.5%3/171.8%4/168.0%5/160.4%
例5用常規的核子-交換方法將例1中獲得的抗除草劑特性轉入其它品種，即用品種MT-CMA5-AR2作母本植株，用水稻屬，品種栽培品種AKitakomachi作父本植株進行雜交。用父本花粉使父本植株與由F1種子生成的植株進行雜交。這種回交共重復5次。這樣得到的品系(MT-CMA51-AR2)在形態、成熟時間和種子特性方面與品種Akitakomachi無區別。該品系具有胞質雄性不育性，而且對莠去津有抗性。
使用由此而得的品系作為母本，用常規方法進行雜交，可獲得F1種子。親本植株開花20天后，在整個稻田里，每公頃噴灑40公斤的莠去津。采集種子時，父本植株已全部被殺死。F1種子的結實率為35%例6用常規核交換方法將例1中獲得的抗除草劑性轉入其它品種。也就是說，用品種MT-CMA5-GR2作為母本植株，用水稻屬，品種栽培品種Satohonami作為父本植株進行雜交。從F1種子生成的植株通過父本花粉同父本進行雜交。這種回交共重復5次。這樣得到的一個品系(MT-CMA52-GR2)在形態、成熟時間和種子特性方面都與品種Satohonami無區別。該品系具有胞質雄性不育性，而且抗甘草膦。
使用由此而得的品系做為母本，用常規方法進行雜交便獲得F1種子。親本植株開花20天后，整個稻田以每公頃20公升噴灑甘草膦。采集種子時，父本植株已全部被殺死。F1種子的結實率為31%。
權利要求
1.一種培育雜交水稻種子的方法，它包括使雄性不育性母本水稻對除草劑具有抗性；使母本水稻和父本水稻雜交，以培育雜交水稻種子；以及使用母本對其有抗性的除草劑處理親本，以便只殺死父本水稻，來選出水稻雜交種子。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于將一種產生將抗除草劑性的基因引入母本水稻的胞質中。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于一種產生將抗除草劑性的基因引入母本水稻核內的一個染色體中。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于通過遺傳重組技術將一種產生抗除草劑性的基因引入母本水稻中。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于通過在母本中促使變異將一種產生抗除草劑性的基因引入母本水稻中。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于通過種植母本水稻和父本水稻，以使將它們混合起來，從而使母本水稻和父本水稻雜交。
全文摘要
現公開一種有效地培育雜交水稻種子的方法。本發明的方法包括使雄性不育性母本水稻具有抗除草劑性，將母本水稻與父本水稻雜交以生成雜交水稻種子，以及通過使用母本對其有抗性的除草劑來處理親本，以便只將父本水稻殺死，從而選出雜交水稻種子。
文檔編號C12N15/00GK1036120SQ88109218
公開日1989年10月11日 申請日期1988年11月17日 優先權日1987年11月17日
發明者赤木宏守, 藤村達人, 土屋猛, 高橋正昌 申請人:三井東圧化學株式會社