專利名稱：兔病毒性出血癥強毒毒株的選育及疫苗研制方法
技術領域：
本發明涉及兔病毒性出血癥強毒毒株的選育及其混合滅活疫苗的研制方法。用該混合滅活苗來預防兔病毒性出血癥。
兔病毒性出血癥(又名兔瘟)是一種新發現的兔傳染病。我國1984年春在江蘇省最早發現此病。此病是一種兔的急性傳染病，主要特征是傳染性強，潛伏期短，發病率和死亡率均高。1984年冬迅速蔓延到了上海、浙江、安徽等省市。1985年以來湖南、貴州、青海、北京、河南、河北等地都相繼出現此病。“兔瘟”的出現，給養兔業造成嚴重的經濟損失。1984年6月，南京農業大學獸醫微生物教研組對此病進行了病原和病理方面的初步研究，提出了使用組織滅能苗加入氫氧化鋁或福氏不完全佐劑緊急預防接種以控制疫情的方法，并且收到了較好效果。同年，江蘇農學院牧醫系病原微生物研究室對“兔瘟”進行了較有成效的研究，找到了一種可靠的預防途徑利用兔瘟華西系強毒HC-84毒株(1984年3月采集病料分離而得)，接種易感兔，取病死兔的肝、脾、腎作為制苗材料，將材料無菌搗碎，用生理鹽水1∶10稀釋后過濾，加福爾馬林溶液充分混勻、滅能，制得“兔瘟”疫苗。該疫苗免疫期為6個月。此后，湖南、青海、北京、河南、河北等地也均采取臟器滅活苗來預防此病。目前最好的預防措施就是采取上述的臟器滅活疫苗進行免疫。但是此方法也存在著不足之處僅取臟器作為制苗材料，產量低，成本高，不能滿足預防兔瘟者的需要。
本發明的目的在于分離及培育出一種毒力較為穩定的強毒毒株，并進行臟器及肌肉的混合滅活疫苗的制備，來提高疫苗的產量，降低成本，滿足預防兔瘟者的需要。
本發明的技術特征是用病兔肝組織制成乳劑，接種易感兔，分離和篩選出HA價較高的毒株LY，用含毒的肌肉組織懸液通過易感連續傳代培育，第13-36代中肌肉的HA價在160-640倍，肝HA價在5120-20480倍，得到強毒毒株MLY，以MLY毒株的F15-35之間作為種毒，接種易感兔，取24-72小時之間發病、具有典型病變死亡的兔，剖檢取肝、脾、心、腎、肌肉組織，按常規方法進行制苗。
下面結合實施例進一步說明強毒毒株MLY的選育及其混合滅活苗的制備方法。
(一)病毒的分離和篩選1986年我們采集病死兔分離的8個毒株，經與江蘇農學院贈送已知兔病毒性出血癥的HC-84-RF18株免疫血清做血清學試驗，證明都具有相同的抗原性。對人的“O”型紅細胞發生凝集。我們篩選出HA價較高的毒株以蔡氏濾器(EK濾板)抽濾和采用終點稀釋方法提純，通過血凝價和對家兔毒力的測定最后篩選出毒力強的淶源毒(肝的HA價為10240-20480倍，肌肉HA價在8-16倍)，以下簡稱LY毒株，做為試驗毒株。
(二)種毒的培育LY毒在開始的代數，其含毒肝的HA價為10240-20480倍，肌肉組織HA價為8-16倍，1∶4肌肉組織懸液5毫升未能引起家兔死亡。從而表明兔病毒性出血癥死亡兔的肌肉含毒量很低，我們通過連續傳代增加肌肉的含毒量，以達到提高疫苗產量的目的。
接種傳代以含毒的肌肉組織制成乳劑，由肌肉或皮下注射健康家兔，開始大劑量，而后隨著代次的增加，遞減接種劑量，在傳代過程中每隔一定階段測定HA價，并對家兔的致病性做了測定。結果，在傳代過程中不同代數采取病死兔的肌肉或肝來測定HA價，得出病毒對肌肉已從13代以后用10-1，1毫升能有規律地引起易感兔發病和死亡，肌肉的HA價也明顯提高，說明隨繼代的遞增而毒力逐漸增強，培育出的強毒毒株簡稱MLY毒株(詳見表1)。
表1肌肉毒不同代數接種兔的反應及含毒組織的HA價
毒種必須符合下列標準1、用作毒種的材料必須經細菌學檢驗，證明無菌。
2、毒種對易感兔的最小感染量不低于10-3/1毫升。
3、毒種對人的“0”型紅細胞凝集價必須達到320倍以上(肝對人“O”型紅細胞凝集價不低于10240倍)。
(三)毒種的保存和繼代1、毒種的保存毒種保存于-20℃以下的冰箱內，保存期6個月。
2、種毒的繼代將種毒用生理鹽水1∶9稀釋，每毫升加入雙抗(青霉素、鏈霉素)各1000單位，置4℃冰箱作用4小時，以2000-3000轉/分離心10-20分鐘，取上清液作為接種材料。每隔6個月繼代一次，每代接種4只體重在1.5-2.5公斤的易感健康兔，每兔頸部皮下接種1-2毫升，接種的易感兔應于36-72小時發病死亡，取其典型病變并經無菌檢驗的混合肌肉，置于無菌的容器內閉封保存于-25℃以下冰箱，作為種毒繼代用。
(四)接種和采樣1、家兔的選擇(1)制造疫苗和檢驗，均需選用自繁自養或定點供應的健康易感兔。
(2)家兔接種前至少觀察3天，選擇1.5-2.5公斤健壯者使用。
2、接種材料的制備以MLY毒株的F15-35之間做為種毒，將毒種剪碎放入研磨器內研磨，磨細后用生理鹽水作10倍稀釋，每毫升加雙抗各1000單位，置4℃冰箱作用3-4小時，然后以2000-3000轉/分離心10-20分鐘，取上清液作為接種材料。
3、接種每兔頸部皮下注射上述材料1-1.5毫升，一般于24-72小時死亡。
4、制苗材料的采集以無菌手術取具有典型病變的24-72小時死亡兔的肝、脾、心、腎、肌肉，放置于無菌的容器內，并于結凍的冰箱內保存，作為制苗材料。
(五)疫苗制造1、病料的研磨將病料經無菌搗碎，用無菌PH7.2-7.6的緩沖液作10倍稀釋后，加雙抗每毫升各1000單位，在室溫(20-30℃)作用4小時，經2層紗布加一層60-80目銅紗過濾于無菌容器內。
2、滅能按組織懸浮液量加入0.6%福爾馬林溶液(甲醛含量為36%)充分混勻，瓶口用膠布封閉，于37℃滅能48小時，每2小時搖一次，滅活完畢后進行分裝。
(六)疫苗檢驗1、感觀檢驗滅活苗呈土褐色。
2、無菌檢驗每批疫苗中任選2瓶(分裝始及末各取一瓶)作10倍稀釋，分別接種于肉湯、厭氣肝湯及普通瓊脂培養基中，每管0.5毫升，于37℃溫箱培養48-96小時，無菌者即為無菌檢驗合格。
3、安全檢驗每批疫苗任選2瓶(分裝始及末各取一瓶)作為檢驗樣品，用1.5-2.5公斤的健康兔4只，每只頸部皮下注射5毫升，無出現典型臨床癥狀和死亡者認為合格。如有一只死亡或出現典型臨床癥狀即為不合格。
4、免疫力檢驗每批疫苗任選2瓶作為免疫力檢驗。選易感兔4只，每只頸部皮下注射1毫升，14-15天用強毒病料0.1克攻擊，應全部保護為合格。
(七)疫苗的保存和使用1、有效期疫苗保存于室溫(20-30℃)陰暗處有效期為6-8個月。
2、免疫劑量及途徑每只頸部皮下注射1毫升，4公斤以上者每只頸部皮下注射2毫升。
3、免疫期為6-9個月。
本發明試制兩年來，取得了可喜的成績。兩年來，共試制疫苗16批，35萬毫升，通過室內效檢205只兔，經攻毒100%保護，達到部頒專業質量標準。在19個縣、市對不同品種、年齡及懷孕兔26萬只的免疫接種均無不良反應，經走訪、檢測和抽樣攻毒試驗，結果平均保護率達到99.1%(疫苗期的試驗結果見表2、表3)。本疫苗免疫期達6-9個月，室溫(20-30℃)保存6-8個月仍保持良好的免疫原性。而且，用本方法制備的肌肉、臟器混合滅活苗產量高，成本低，10只兔可取肝、脾、腎、心511克，肌肉1859克，可制組織苗21810毫升，每毫升成本費為0.0038元，但制臟器滅活苗僅有4990毫升，每毫升0.015元，組織苗比臟器苗產量提高337%，成本費降低74%，具有明顯的積極效果和廣闊的推廣前景。
表2五批疫苗效檢結果
分子存活或死亡數;分母試驗兔數表311批苗6次免疫期試驗結果
權利要求
1.一種兔病毒性出血癥強毒毒株的選育及其疫苗的研制方法，其特征在于用病兔肝組織制成乳劑，接種易感兔，分離和篩選出HA價較高的毒株LY，(1)用含毒的肌肉組織懸液通過易感兔連續傳代培育，第13～36代中肌肉的HA價在160～640倍，肝HA價在5120～20480倍，得到強毒毒株MLY，(2)以MLY毒株的F15～35之間作為種毒，接種易感兔，取24～72小時之間發病、具有典型病變死亡的兔，剖檢取肝、脾、心、腎、肌肉組織，按常規方法進行制苗。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于制造疫苗時，將接種易感兔病料經無菌搗碎，用無菌PH7.2～7.6的緩沖液作10倍稀釋后，加雙抗每毫升各1000單位，在室溫下(20～30℃)作用4小時，經2層紗布加一層60～80目銅紗過濾于無菌容器內。
3.根據權利要求1所述的制造方法，其特征在于將過濾組織懸液加入0.6%福爾馬林溶液(甲醛含量為36%)充分混勻，閉封，于37℃滅活48小時，每2小時搖一次，滅活后分裝。
全文摘要
本發明是一種兔病毒性出血癥(兔瘟)的強毒毒株選育及其疫苗的研制方法，用分離和篩選出的毒株通過易感兔連續傳代培育出強毒毒株MLY，接種易感兔，剖檢取肝、脾、心、腎、肌肉，按常規方法進行混合滅活苗的制備。用本方法制備的肌肉臟器混合苗產量高，成本低，每毫升成本費為0.0038元，組織苗比臟器苗產量提高337％，成本費降低74％。
文檔編號C12N7/04GK1043739SQ88108859
公開日1990年7月11日 申請日期1988年12月28日 優先權日1988年12月28日
發明者蔡崇雅, 趙恩保, 楊秀女, 薛宗麗, 邢玉蓮, 武秋雙 申請人:河北省畜牧獸醫研究所