專利名稱：降低診斷雜交測定中對靶核酸的序列變異的依賴性的方法
技術領域：
本發明涉及設計用于克服擴增效率差異的引物，出現所述擴增效率差異的具體原因在于引物結合的易變性，靶核酸序列的非保守核苷酸，例如不同基因型之間的變異。通過缺失非保守核苷酸的互補堿基，引物(稱作缺失引物)對所有靶(基因型)的結合將會相同。本發明可以轉用于其它技術層面，例如在定量測定中作為內部對照和/或檢測其它與靶競爭的核酸序列，其中在靶核酸的變體之間，通過所述缺失引物對靶、內部對照和/或競爭性序列進行的擴增是可比的。
背景技術：
分子生物學的發展使得可以通過使用擴增技術實現核酸的靈敏檢測。擴增的方法已經變成非常強大的工具，因為它們可以在相對短的時間內實現非常少量的核酸的指數擴增。這產生了能夠靈敏地檢測低至單拷貝RNA或DNA的強大的測定方法。已經開發了多種的擴增技術，例如PCR、LCR、NASBA、TMA和SDA，并為本領域技術人員所熟知。這些方法每個都基于不同的作用機制，但全部都依賴于一種或多種引物退火至靶核酸序列或其互補序列。在靶或其部分的擴增期間或擴增之后，要檢測產生的擴增子的存在或擴增子的量。這可以用多種已知技術進行，例如在凝膠上分離樣品隨后進行印跡和探針檢測。這只可以在擴增完成后進行。在一種均質的方法中，擴增和檢測不對反應組分進行分離。在擴增過程中檢測擴增子。因此，可以實時監測擴增子的產生并且因此獲得的數據可以用于確定擴增子存在與否和/或擴增子的量。在核酸序列的擴增和檢測中，對用作引物和探針的寡核苷酸的選擇對于測定的靈敏度和特異性是關鍵的。待擴增的序列通常僅以微量存在于樣品(例如獲得自懷疑被病毒感染的患者的血液樣品)中。引物應當與靶序列充分互補以使得有效擴增存在于樣品中的病毒核酸。如果引物不恰當地退火至靶序列(由于兩條鏈中核苷酸堿基的錯配)，擴增被嚴重阻礙。當靶不是線性的而是具有特別的結構，其較不易被引物接近，從而也導致擴增減少。這將影響測定的靈敏度并且會造成假陰性的測試結果。引物的有效雜交一般需要至少15個連續的互補核苷酸。如果使用更少的核苷酸， 引物特異性和非特異性退火的比例將降低至靶核酸能發生有效擴增的比例以下。如果靶核苷酸序列的幾個遺傳學變異是已知的，可以鑒定出保守的核苷酸區段(stretch)并用于引物設計。然而，一些物種(如RNA病毒)中的優選的保守區段，例如人丙型肝炎病毒部分編碼區域，有時候太小而不能用于設計有效的引物。另外，甚至這些保守的片段也具有突變的傾向并不斷地產生未知的多態性。這在快速分裂的生物體如病毒和細菌中最為顯著，造成引物雜交的效率降低。結果是可能不發生擴增，其在例如常規診斷中是非常不受歡迎的，因為假陰性結果可以對有關患者造成嚴重后果。同樣，在定量測定中，靶中的序列變異(多態性)可以導致對其定量過低(under-quantification)。另外，擴增的靶序列和用于檢測的探針之間的序列差異還降低檢測的效率。對具有多態性的靶的檢測因此不如對與探針共有序列完全匹配的靶的檢測那樣好。
文獻EP-A-1. 426. 448涉及一種降低序列變異在診斷雜交測定中的影響的方法， 所述診斷雜交測定使用核酸探針檢測擴增的核酸分析物。其在于導入一個或多個的具有增加親和力的修飾的核苷酸，更具體地是在分子信標環上導入。因為探針對多態分析物的親和力增加了，所以降低了對多態性的敏感性。盡管如此，該方法是探針專用的，并且沒有克服引物與包含至少一個核苷酸變異的靶的錯配問題。此外，關于探針的設計，該建議的解決方案需要修飾核苷酸，昂貴并需要特別的制造過程。文獻ΕΡ-Β-0. 246. 864涉及用于區別可替換核苷酸序列的方法，其中使用兩個核苷酸探針并和互補靶序列形成分裂探針雜交物。這樣的探針使得靶序列中潛在的錯配位于所述探針之間。如上面文獻所述，該方法的一個缺點是其僅專用于探針而不適用于引物。此外，該方法需要使用和設計兩個探針。因此，明顯地需要一種擴增方法，其更不易于受到靶序列的雜交片段中的突變或遺傳學變異的影響。發明概述本發明提供引物和/或探針，其是在均質測定中降低對序列變異依賴性的具有非常多用途的工具。根據第一實施方案，本發明提供設計為用于擴增靶核酸序列的引物，該靶序列含有至少一個變異，定義為稱作基因型變異的一個非保守核苷酸，或定義為同一種基因型內的一個核苷酸變異，其中所述引物包含與其靶序列互補的核酸序列，但至少一個與所述變異互補的堿基除外，其不存在于引物中。在一個具體的實施方案中，引物與含有至少兩個變異的靶互補，其中所述變異彼此相鄰。根據一個實施方案，引物與含有至少兩個變異的靶序列互補，其中所述每個變異由至少一個保守核苷酸相互分開。根據另一個實施方案，該引物可以和另一種引物形成引物對。因此，本發明提供引物對以擴增靶核酸序列，該靶序列含有至少一個變異，定義為稱作基因型變異的一個非保守核苷酸，或定義為同一種基因型內的一個核苷酸變異，其中所述引物中至少一種是根據本發明設計的。因此，擴增通過將樣品和一對引物接觸而進行，所述引物稱作正向和反向引物，在NASBA方法中分別是Pl和P2。當進行NASBA時，Pl引物將雜交在感興趣的序列的下游，而P2引物將與由正向引物延伸產生的鏈互補并置于所述感興趣的序列的上游。當進行 PCR擴增時，正向引物在感興趣的序列的上游而反向引物在下游。本發明的另一個目的是設計為用于檢測靶核酸序列的探針，該靶序列含有至少一個變異，定義為稱作基因型變異的一個非保守核苷酸，或定義為同一種基因型內的一個核苷酸變異，其中探針包括與其靶序列互補的核酸序列，但至少一個與所述變異互補的堿基除外，其不存在于探針中。根據一個實施方案，探針包括至少一種標記物。本領域已知多種的標記部分。所述標記部分例如可以是放射性化合物、可檢測的酶(如辣根過氧化物酶(HRP))、半抗原樣生物素或能夠產生可檢測信號(如比色的、熒光的、化學發光的或電化學發光的信號)的任何其它部分。
根據引物或探針的任何實施方案，靶序列是靶RNA。此外，根據另一個實施方案，引物具有啟動子序列。術語“啟動子序列”定義了由 RNA聚合酶特異地識別的核酸序列區域，所述RNA聚合酶結合至識別的序列并起始轉錄過程，產生RNA轉錄本。原則上可以采用任何啟動子序列，只要有已知的和可用的聚合酶能夠識別其起始序列即可。已知的和有用的啟動子是那些由某些噬菌體RNA聚合酶識別的啟動子，例如噬菌體T3、T7或SP6。連接至啟動子序列的寡核苷酸通常稱作“啟動子引物”。 但是，在一些基于轉錄的擴增反應的實施方式中，它們作為引物的功能，例如延伸反應的起點，可以被阻斷(如上面已經提及的)或不存在。本發明還提供了擴增樣品中的核酸靶序列的方法，所述核酸靶序列含有至少一個變異，定義為稱作基因型變異的一個非保守核苷酸，或定義為同一種基因型內的一個核苷酸變異，所述方法包括對樣品進行擴增反應放大所述靶序列的存在，所述擴增反應使用1)第一引物，其能夠特異地雜交至靶序列的一個區域并能夠在延伸條件下引導該引物向第二引物雜交區域延伸，以及2)第二引物，其能夠特異地雜交至靶序列另一個區域的互補序列并能夠在延伸條件下引導第二引物向第一引物雜交區域的互補序列延伸，以及其中所述至少一個變異位于所述引物中的至少一種引物的雜交區域中，以及其中所述引物中的至少一種引物包括與靶序列互補的核酸序列，但至少一個與所述變異互補的堿基除外，其不存在于引物中。根據另一個實施方案，本發明的方法可以是使用引物和探針檢測核酸分析物的任何種類的方法。這樣的測定可以基于對擴增分析物的檢測，例如在基于PCR、TMA或NASBA 的測定中。然而，引物和探針也能夠用于微陣列中。定量和定性的診斷測定中都可以使用本發明，在這些測定中，靶的序列多態性影響測定可靠性。本發明的另一個目的是檢測樣品中核酸靶序列的方法，所述核酸靶序列含有至少一個變異，定義為稱作基因型變異的一個非保守核苷酸，或定義為同一種基因型內的一個核苷酸變異，所述方法包括(a)對樣品進行擴增反應檢測靶序列的存在，所述擴增反應使用(1)第一引物，其能夠特異地雜交至靶序列的一個區域或靶序列的一個互補區域， 并能夠在延伸條件下引導第一引物向第二引物雜交區域延伸，以及(2)第二引物，其能夠特異地雜交至靶序列另一個區域或靶序列的另一個互補區域，并能夠在延伸條件下引導第二引物向所述第一引物雜交區域的互補序列延伸，以及(b)使用至少一種探針對樣品進行檢測反應檢測所述靶序列的存在，所述探針能夠特異地雜交至靶序列的第一引物能夠雜交的區域和第二引物能夠雜交的區域之間的區域，其中所述至少一個變異位于所述引物中的至少一種引物的雜交區域中，并且其中所述引物中的至少一種引物包括與靶序列互補的核酸序列，但至少一個與所述變異互補的堿基除外，其不存在于引物中。根據本方法的另一個實施方案，擴增反應選自基于轉錄的擴增和PCR。在本方法的一個具體的實施方案中，基于轉錄的擴增反應是NASBA反應。NASBA 方法描述于歐洲專利號ΕΡ-Β-0. 329. 822。盡管該方法允許擴增RNA，但如歐洲專利申請EP-A-1. 366. 179所描述，其也能用于擴增雙鏈核酸。這些方法對PCR的主要優勢是它們是等溫進行的。根據本方法的另一個實施方案，靶序列是靶RNA。本發明的另一個目的是檢測樣品中核酸靶序列的方法，所述核酸靶序列含有至少一個變異，定義為稱作基因型變異的一個非保守核苷酸，或定義為同一種基因型內的一個核苷酸變異，該方法包括(a)至少一種能夠特異地雜交至靶序列的一個區域的探針，以及(b)檢測所述靶序列的存在，其中所述至少一個變異位于所述探針中的至少一種探針的雜交區域中，以及其中所述探針中的至少一種探針包括與靶序列互補的核酸序列，但至少一個與所述變異互補的堿基除外，其不存在于探針中。根據本方法最后一個實施方案，在檢測由靶序列產生的擴增子的存在的檢測反應之前進行擴增反應。根據本方法的另一個實施方案，擴增反應包括(a)加入第一引物，其能夠特異地雜交至靶序列的一個區域或靶序列的一個互補區域，并能夠在延伸條件下引導第一引物向靶序列中的、第二引物能夠雜交的靶互補序列 (稱作第二引物雜交區域)延伸，以及(b)加入第二引物，這可以在第一引物加入的同時進行，所述第二引物能夠特異地雜交至靶序列另一個區域或靶序列的另一個互補區域，并能夠在延伸條件下引導第二引物向靶序列中的、第一引物能夠雜交的靶互補序列(稱作第一引物互補雜交區域)延伸，以及(c)將樣品置于如酶、三磷酸核苷酸等試劑中，并置于如溫度、PH等物理條件下， 以使得所述引物雜交和延伸并釋放因此獲得的擴增子。根據本方法的另一個實施方案，探針的雜交區域位于以下區域之間第一引物通過該區域可以雜交至靶序列或所述靶序列的互補序列的區域，第二引物通過該區域可以雜交至靶序列或所述靶序列的互補序列的區域。根據本方法的另一個實施方案，探針包括至少一種標記物。根據本方法的另一個實施方案，探針是在其每個末端帶有一種標記物的核酸。本發明的探針可以是所謂的分子信標(MB)。這些探針以比線性探針更高的特異性識別其靶序列。已經描述了一類稱作分子信標的寡核苷酸探針，其促進均質檢測特異的核酸靶序列(Piatek 等(1998)Nature Biotechnology 16 :359-363 ;Tyagi 禾口 Kramer(1996)Nature Biotechnology 14:303-308)。分子信標是具有莖-環結構的單鏈寡核苷酸。環部分包括與擴增子(DNA或RNA)互補的序列。莖是由于3’ -末端和5’ -末端的雜交而形成。莖可以與擴增子無關并且是雙鏈的。莖的一條臂用熒光染料在其游離端標記，而另一條臂也在其游離端偶聯至淬滅部分。在莖-環狀態下所述探針僅僅產生少量熒光，因為熒光基團的能量被轉移至淬滅分子。當分子信標雜交至擴增子，失去莖-環結構而且淬滅劑和熒光基團分離。在該階段，熒光基團發出的熒光不再被淬滅，能夠被檢測并定量。根據本方法的另一個實施方案，檢測反應是實時檢測。另外，本發明提供包括上述的至少一個引物對以及至少一種探針的試劑盒。定義
根據本發明，術語“核酸”(NA)指的是在任何可能的構象(即是核酸的雙鏈(ds) 形式或核酸的單鏈(ss)形式或其組合)的DNA和RNA。這樣的核酸對應于至少連續兩個脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，可以包括至少一個修飾的核苷酸。該多核苷酸可以在核苷酸間鍵的水平(例如，硫代磷酸酯、H-磷酸酯、烷基磷酸酯)和主鏈的水平(α-寡核苷酸(FR-A-2 607 507)或 PNA (Μ. Egholm et al.，J.Am· Chem. Soc.，114，1895-1897，1992)或2' _0_烷基核糖)進行修飾。這些修飾的每一種都可以組合進行，條件是所述核酸中存在至少一個磷酸酯。核酸可以是天然的或合成的、寡核苷酸、多核苷酸、核酸片段、核糖體RNAjfH RNA、轉運RNA、通過酶學擴增技術獲得的核酸，所述酶學擴增技術例如_PCR(聚合酶鏈反應)，描述于美國專利號4683195、美國專利號4683202和美國專利號4800159，以及其RT-PCR(反轉錄PCR)衍生技術，尤其是如專利EP-B-0569272中描述的一步形式的RT-PCR，-RCR (修復鏈反應)，描述于專利申請W0-A-90/01069，-3SR (自主序列復制)，專利申請W0-A-90/06995,-NASBA (基于核酸序列的擴增)，專利申請W0-A-91/02818，和-TMA (轉錄介導擴增)，美國專利號5399491.。這樣的“核酸”可以用作靶、引物或探針。“靶序列”定義為核酸分子的待檢測的部分。通過引物和擴增相關的酶對其進行擴增。擴增導致形成“擴增子”，其是通過雜交至探針而被物理檢測的核酸分子。靶序列的長度長達30個核苷酸并且優選在100和300個核苷酸之間，但是可以考慮更長的多核苷酸 (長達1500個核苷酸)。本文所用的術語“引物”指的是天然出現的(如限制性酶切片段)或合成產生的寡核苷酸，當置于合適的條件(如緩沖液、鹽、溫度和PH)下，存在核苷酸和用于核酸聚合的試劑(如酶，如DNA依賴或RNA依賴聚合酶)時，其能夠作為引物延伸產物的合成起始點， 所述引物延伸產物與核酸鏈(模板或靶序列)的部分互補。通常一組引物將由至少兩種引物組成，一種“上游”引物和一種“下游”引物，其一起限定擴增子(使用所述引物擴增的序列并且是靶序列的部分或與靶序列的部分互補)。其中一種引物雜交至(+)鏈，而第二種引物雜交至靶的(_)鏈。引物的長度應當在10和50個核苷酸之間，優選在10和30個核苷酸之間。引物可以額外地與啟動子序列例如T7啟動子連接。如本文所用，術語“探針”意思是其包括能夠雜交至擴增子的一段核苷酸。優選雜交部分是10-50，更優選15-35，最優選15-30個核苷酸的區段。在本申請中術語“分析物”、“擴增子”和“靶”或“靶序列，，可以互換使用。分析物是待檢測的原始核酸分子。靶序列是通過引物擴增的分析物的部分。擴增導致形成擴增子， 其是通過雜交至探針而被物理檢測的核酸分子。擴增子的序列與分析物內的靶序列相同或互補。術語“非保守核苷酸”或“基因型變異”或“一個核苷酸變異”或“變異”指的是任何單或多核苷酸置換、缺失或插入。這些核苷酸變異可以是突變體或多態性等位基因變異。如本文所用，術語“多態性”指的是兩個或更多個不同的核苷酸序列可以存在于 DNA或RNA的特別位點。
本發明將在下面的實施例中進一步闡述，所述實施例并不旨在以任何方式限制本發明。附圖簡述

圖1顯示使用缺失pi引物對HCV的NASBA擴增對應于通過正常pla/p2b引物對 (圖1A)和根據本發明的pld/p2b引物對(圖1B)進行的擴增的兩個曲線圖的比較，其中 Pld包含一個缺失。圖2顯示使用不同的缺失pi引物對HCV的NASBA擴增對應于通過正常p2引物 (HCV-E2 p2b)和引物對中的pi引物進行的擴增的四個曲線圖的比較，其中所述Pl是 含有一個缺失的缺失引物HCV-E2_pld，如圖2A所顯示， 含有兩個缺失的缺失引物HCV-E2-ple，如圖2B所顯示， 含有兩個缺失的缺失引物HCV-E2_plf，如圖2C所顯示，和 含有三個缺失的缺失引物HCV-E2_plg，如圖2D所顯示。圖3顯示使用不同缺失pi引物對HIV RNA的擴增對應于通過正常p2引物 (HIV-E2 p2b)和引物對中的pi引物進行的擴增的四個曲線圖的比較，其中所述pi是 不含有缺失的正常引物HIV. 27，如圖3A所顯示， 含有一個缺失的缺失引物HIV. 55，如圖:3B所顯示， 含有一個缺失的缺失引物HIV. 56，如圖3C所顯示，和 含有兩個缺失的缺失引物HIV. 57，如圖3D所顯示。圖4相關的兩個圖顯示使用缺失pi和缺失p2引物對HIV RNA的NASBA擴增。HIV擴增使用缺失引物組HIV缺失pi (HIV. 57)和HIV缺失p2(表1)進行，所述引物都包括兩個缺失(圖4b)。使用的參照引物組是HIV參照pi (HIV. 27)和HIV參照p2 (表 1)，所述引物都沒有缺失(圖如)。擴增在HIV特異的分子信標(HIV WT MB,Me23)存在下進行。使用5000、500、50和5個拷貝的體外轉錄的HIV B亞型RNA作為擴增的輸入材料。 沒有模板的樣品(NT)用作陰性對照。圖5相關的兩個圖說明在缺失分子信標存在下對HIV RNA的NASBA擴增。使用參照引物組(HIV參照pi (HIV. 27)和HIV參照p2)的HIV擴增在HIV特異的分子信標(HIV WT MB，0TMB8472，表1)或在包括兩個缺失的HIV缺失信標(HIV WT deletion MB，表1)存在下進行。所述HIV特異的分子信標標為“HIV WT參照信標”(圖fe)，所述HIV缺失信標標為“HIV WT缺失信標”(圖5b)。使用5000、500、50和5個拷貝的體外轉錄的HIV B亞型 RNA作為擴增的輸入材料。沒有模板的樣品(NT)用作陰性對照。圖6顯示使用缺失引物的對HIV DNA的PCR擴增。HIV PCR擴增在HIV特異的分子信標(HIV WT MB(MB41，表1))存在下，使用有或沒有缺失的不同的引物組合進行。使用了兩種缺失引物，HIV PCR缺失pi和HIV缺失p2，都包括兩個缺失。測試了引物的四種不同組合圖6a 參照引物組，HIV PCR參照pi和HIV參照p2，圖 6b :HIV PCR 缺失 pi 和 HIV 參照 p2,圖 6c :HIV PCR 參照 pi 和 HIV 缺失 p2 和圖 6d :HIV PCR 缺失 pi 和 HIV 缺失 p2。使用含有部分HIV B亞型序列的質粒DNA大約106、IO4和100個拷貝的稀釋系列作為擴增的輸入材料。沒有模板的樣品(NT)用作陰性對照。在下面顯示的實施例1-6中所使用的pi弓丨物、p2引物和分子信標的序列是用于 NASBA擴增的，并總結于表1。
權利要求
1.設計為用于擴增靶核酸序列的引物，所述靶序列含有至少一個變異，定義為稱作基因型變異的一個非保守核苷酸，或定義為同一種基因型內的一個核苷酸變異，其中所述引物包含與所述靶序列互補的核酸序列，但至少一個與所述變異互補的堿基除外，其不存在于所述引物中。
2.權利要求1的引物，其中所述引物與含有至少兩個變異的靶序列互補，每個變異由至少一個保守核苷酸相互分開。
3.擴增靶核酸序列的引物對，所述靶序列含有至少一個變異，定義為稱作基因型變異的一個非保守核苷酸，或定義為同一種基因型內的一個核苷酸變異，其中所述引物中的至少一種是根據權利要求1或2設計的。
4.設計為用于檢測靶核酸序列的探針，所述靶序列含有至少一個變異，定義為稱作基因型變異的一個非保守核苷酸，或定義為同一種基因型內的一個核苷酸變異，其中所述探針包含與所述靶序列互補的核酸序列，但至少一個與所述變異互補的堿基除外，其不存在于所述探針中。
5.權利要求4的探針，其中所述探針包含至少一種標記物。
6.權利要求1-4任一項的引物或引物對或探針，其中所述靶序列是靶RNA。
7.權利要求1-3任一項的引物或引物對，其中一種引物具有啟動子序列。
8.一種擴增樣品中的核酸靶序列的方法，所述核酸靶序列含有至少一個變異，定義為稱作基因型變異的一個非保守核苷酸，或定義為同一種基因型內的一個核苷酸變異，所述方法包括對樣品進行擴增反應放大所述靶序列的存在，所述擴增反應使用1)第一引物，其能夠特異地雜交至靶序列的一個區域并能夠在延伸條件下引導第一引物向第二引物雜交區域延伸，以及2)第二引物，其能夠特異地雜交至靶序列另一個區域的互補序列并能夠在延伸條件下引導第二引物向所述第一引物雜交區域的互補序列延伸，以及其中所述至少一個變異位于所述引物中的至少一種引物的雜交區域中，以及其中所述引物中的至少一種引物包含與所述靶序列互補的核酸序列，但至少一個與所述變異互補的堿基除外，其不存在于所述引物中。
9.一種檢測樣品中核酸靶序列的方法，所述核酸靶序列含有至少一個變異，定義為稱作基因型變異的一個非保守核苷酸，或定義為同一種基因型內的一個核苷酸變異，所述方法包括(a)對所述樣品進行擴增反應檢測靶序列的存在，所述擴增反應使用(1)第一引物，其能夠特異地雜交至靶序列的一個區域或靶序列的一個互補區域，并能夠在延伸條件下引導第一引物向第二引物雜交區域延伸，以及(2)第二引物，其能夠特異地雜交至靶序列另一個區域或靶序列的另一個互補區域，并能夠在延伸條件下引導第二引物向所述第一引物雜交區域的互補序列延伸，以及(b)使用至少一種探針對樣品進行檢測反應檢測所述靶序列的存在，所述探針能夠特異地雜交至靶序列中位于第一引物能夠雜交的區域和第二引物能夠雜交的區域之間的區域，其中所述至少一個變異位于所述引物中的至少一種引物的雜交區域中，并且其中所述引物中的至少一種引物包含與靶序列互補的核酸序列，但至少一個與所述變異互補的堿基除外，其不存在于所述引物中。
10.權利要求8或9的方法，其中所述擴增反應選自基于轉錄的擴增和PCR。
11.權利要求10的方法，其中所述基于轉錄的擴增是NASBA。
12.權利要求8或9的方法，其中所述靶序列是靶RNA。
13.—種檢測樣品中核酸靶序列的方法，所述核酸靶序列含有至少一個變異，定義為稱作基因型變異的一個非保守核苷酸，或定義為同一種基因型內的一個核苷酸變異，所述方法包括(a)至少一種能夠特異地雜交至靶序列的一個區域的探針，以及(b)檢測所述靶序列的存在，其中所述至少一個變異位于所述探針中的至少一種探針的雜交區域中，以及其中所述探針中的至少一種探針包含與靶序列互補的核酸序列，但至少一個與所述變異互補的堿基除外，其不存在于所述探針中。
14.權利要求13的檢測方法，其中在檢測由所述靶序列產生的擴增子的存在的檢測反應之前進行擴增反應。
15.權利要求14的檢測方法，其中所述擴增反應包括(a)加入第一引物，其能夠特異地雜交至靶序列的一個區域或靶序列的一個互補區域， 并能夠在延伸條件下引導第一引物向第二引物雜交區域延伸，以及(b)加入第二引物，這可以在第一引物加入的同時進行，所述第二引物能夠特異地雜交至靶序列另一個區域或靶序列的另一個互補區域，并能夠在延伸條件下引導第二引物向所述第一引物雜交區域的互補序列延伸，以及(c)將樣品置于如酶、三磷酸核苷酸等試劑中，并置于如溫度、PH等物理條件下，以使得所述引物雜交和延伸并釋放因此獲得的擴增子。
16.權利要求13-15任一項的檢測方法，其中所述探針的雜交區域位于以下區域之間 第一引物可以通過該區域雜交至靶序列或所述靶序列的互補序列的區域，第二引物可以通過該區域雜交至靶序列或所述靶序列的互補序列的區域。
17.權利要求13-16任一項的檢測方法，其中所述探針含有至少一種標記物。
18.權利要求17的檢測方法，其中所述探針是在其每個末端帶有一種標記物的核酸。
19.權利要求13和15-18任一項的檢測方法，其中所述檢測反應是實時檢測。
20.試劑盒，其含有權利要求3的至少一種引物對和權利要求4或5的至少一種探針。
全文摘要
本發明提供引物或/和探針，其靶序列含有至少一個變異，定義為稱作基因型變異的一個非保守核苷酸，或定義為同一種基因型內的一個核苷酸變異，其中所述引物或/和探針包含與其靶序列互補的核酸序列，但至少一個與所述變異互補的堿基除外，其不存在于引物或/和探針中。本發明在用于診斷、預防和治療用途的方法中特別有用。
文檔編號C12Q1/68GK102165077SQ200980137630
公開日2011年8月24日 申請日期2009年9月21日 優先權日2008年9月24日
發明者B·戴曼, D·范斯特里普 申請人:生物梅里埃公司