專利名稱：從微生物細胞中制取核酸的方法
技術領域：
本發明涉及一種制備有機化合物的方法，具體地說是一種從微生物細胞中制取核酸的方法。
核酸是DNA和RNA的總稱，是一切生命基因-細胞的核心物質，它決定著生物體的生長、發育、繁殖、遺傳，以及人體的衰老和患病都是由于缺乏核酸使基因受損而致，世界衛生組織建議成年人每天應補充外源核酸1-1.5克，以促進正常的新陳代謝，延緩衰老，中國發明專利公開了一種制取核酸的方法，其專利申請號為94115437.8，名稱為“從天然植物細胞中提取核酸的生產工藝”，它以脫脂大豆粕為原料，經過溶脹、勻漿制備、細胞裂解、溶劑抽提、透析處理等生產工藝制得核酸提取液和核酸純化干品，其不足是利用化學試劑如酚或乙醇抽提，提取液需要進行透析處理，通常需要48-72小時，而且每隔6-8小時更換一次透析液，其生產周期長，成本高，有害液體的排放還會污染環境，不適合于工業化生產。
本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種從微生物細胞中制取高純度核酸原料的方法，其原料來源廣泛、工藝簡單、生產成本低、與人的基因相同緣，宜吸收且無毒害。
為達到上述發明目的，本發明可以通過以下措施來實現一種從微生物細胞中制取核酸的方法，主要包括如下工藝步驟1、基礎原料及初加工選擇以微生物-酵母細胞為基料，將其加工成為生物活性物，2、培養高核酸細胞將生物活性物-酵母基料進行稀釋，稀釋成稠粥狀稀釋液，對稀釋液中的酵母細胞植入動物胎體的細胞基因，進行細胞培養，使稀釋液中酵母細胞核酸的含量增高，得到高核酸基料，3、細胞的裂解往高核核酸基料中加入含有0.1M-0.25M的氯化鈉溶液進行稀釋，在稀釋液中加入適量的堿調整PH值，使之PH在8-12之間，然后在90℃-100℃的條件下蒸煮2-4小時，再以10000轉/分-12000轉/分的速度在勻漿機中進行勻質、裂解40分鐘-60分鐘，同時進行高溫滅菌，得到核酸裂解液，3、提取核酸采用分離、濃縮、壓濾的力法從核酸裂解液中提取核酸制品。
本發明還可以通過以下措施來實現用弱酸調節核酸裂解液的PH值，使之PH值在6-8之間，然后輸入離心機以1000轉/分-3000轉/分的轉速離心15分鐘-30分鐘，所得上部液態即為核酸提取液，將核酸提取液加入飽和硫酸銨進行稀釋，核酸提取液與飽和硫酸銨的比例為1∶8-16，然后離心10分鐘-20分鐘，以除去蛋白質，在去除蛋白質的液態核酸中加入助濾液-氯化鈉，使液態核酸中氯化鈉的含量為3M-6M，再離心10分鐘-20分鐘，在所得沉淀核酸中加蒸餾水稀釋，兩者的比例為1∶1-2，然后用生物膜真空抽濾除去氯化鈉，將去除氯化鈉的核酸液進行干燥，所得制品即為純凈核酸原料。
本發明還可以通過以下措施來實現采用壓濾方法過濾核酸裂解液，提取純核酸，核酸裂解液經上述蒸煮步驟后，其粘度比較大，固體顆粒已相當小(＜5um=，在壓濾機過濾核酸裂解液之前，清洗并裝好濾布，助濾液的每次用量為壓濾機容積的2-3倍，開始泵入裂解液，為了使裂解液粘度變得較小，泵入核酸裂解液的溫度一般控制在50℃-90℃，為了保證濾速和濾量，泵壓一般控制在0.1-0.5Mpa。過濾結束時，在濾板和隔膜之間通入壓縮空氣，壓力為0.3-0.7Mpa，通過壓縮空氣來壓榨濾餅，將液體核酸擠壓出來，關閉空壓機，打開壓濾機，卸出濾餅，濾餅的含水量一般為50％左右，濾餅經烘干粉碎是含50％以上的蛋白質，可進一步加工成蛋白粉氨基酸等，壓濾機將擠壓出來的液體為液態核酸，提純核酸在等電點罐沉淀工藝中進行，A、核酸在等電點罐沉淀之前，須將液態核酸進行降溫，溫度一般應控制在4℃-16℃之間，B、等電點罐是具有隔熱性能的保溫罐，首先緩慢攪拌液態核酸，按液態核酸的重量加入0.1-1％的氯化鈣或氯化鈣溶液，使之充分溶解混合，然后緩慢加入硫酸(濃度3-6M)，使分離液的PH值在2-3之間，此時產生大量絮狀核酸的沉淀物，停止攪拌，保溫靜止，C、排放上清液，等電點罐中液態核酸，調節等電點并靜止6小時以上，固體和液體自動分離，排出上清液，沉淀物即為濕核酸，D、酒精清洗濕核酸，濕核酸中含有大量的水分及雜質，此過程加入2-3倍濕核酸體積的高濃度酒精(酒精度＞80％)，開啟攪拌機，用酒精對濕核酸進行脫水及溶出雜質，攪拌20分鐘后停止攪拌，靜止4小時以上，使酒精與核酸自然分離，E、酒精的回收，待酒精與核酸自然分離后，放出酒精上清，因該酒精已被稀釋，可在酒精回收塔中重新濃縮，使酒精循環使用，F、核酸干燥粉碎，經酒精脫水清洗的核酸放入干燥盤，在干燥室中85℃烘干，冷卻后用粉碎機粉碎即為成品核酸。
本發明與現有技術相比具有如下特點1、采集飲、食品工廠排放的酵母為原料，加工成為生物活性固體狀物；將活性酵母基料稀釋，進行細胞培養，使其核酸的含量增高，經高溫、高速勻質等物理方法進行細胞與核蛋白的裂解，對核酸大分子進行物理與化學的切割，其原料來源廣泛、工藝簡單、適合工業化生產。
2、在整個生產過程中，不需添加有害的化學試劑進行抽提、透析，不會污染環境，還可保留微生物本身營養成分，其基因又與人體生命的基因相同，吸收率可達99％以上，宜于推廣和使用。
3、在等量原料中提取的純核酸是現有技術的4-5倍，制得核酸純度高，生產成本低。
4、原料來源于酒廠和食品生產廠，已經進行了衛生免疫的前處理，經過二次酵母培養和提純，衛生標準高于現有技術的產品，無任何直接和間接的毒副作用，并且原料屬二次利用，來源廣泛、價格便宜，設備投資小，生產工藝簡單，產品成本低。物理離心提取和金屬離子及等電點沉淀兩種方法共用，使核酸的提取率和產品純度大幅度提高；工藝穩定，操作簡單，適宜大規模工業化生產。
實施例1將固體狀物的生物活性酵母基料進行稀釋，在稀釋液中對酵母基料植入從動物胎體中精選優質健壯的種細胞進行培養，使其核酸的含量增高，將稀釋發酵生產的高核酸酵母10噸(含干物質10％)放入配料池，開啟攪拌機，緩慢加入1噸含有0.1-0.25M的氯化鈉并使之溶解混勻，在攪拌中加入氫氧化鈉調PH值在9-11之間，采用高溫蒸煮，停止攪拌。用泵泵入蒸煮罐，在圓形蒸煮罐的下方沿切線方向通入蒸汽加熱，待加熱至95℃時，關小蒸汽閥門使之保溫4小時。酵母細胞的裂解率大于90％，然后以10000-12000轉/分的速度在勻漿機中進行勻質、裂解40-60分鐘，以加速細胞與核蛋白的裂解并加強了對核酸大分子的切割，促進蛋白質的水解，同時進行高溫滅菌。
所得裂解液用鹽酸調PH值至7，然后輸入離心機并以3000轉/分的轉速離心15分鐘，所得上部液態即為食用核酸提取液；取液態核酸以1∶10的比例飽和硫酸銨混合稀釋，然后離心10-20分鐘，在去除蛋白質的液態核酸中加入氯化鈉為助濾液，使液態核酸中氯化鈉的含量為4.5M，離心10-20分鐘，在所得沉淀核酸中加蒸餾水稀釋，兩者的比例為1∶1.2，然后用生物膜真空抽濾除去氯化鈉，將去除氯化鈉的核酸液進行干燥，所得制品即為純凈核酸原料，經測定計算，核酸的收率為干酵母重的5.2％，對核酸的總提取率為81.7％，核酸純度84％。純凈核酸原料中含核酸可達95％以上。
實施例2將發酵生產的高核酸酵母10噸(含干物質10％)放入配料池，開啟攪拌機，緩慢加入1噸食鹽并使之溶解混勻，停止攪拌，用泵泵入蒸煮罐，在圓形蒸煮罐的下方沿切線方向通入蒸汽加熱，待加熱至95℃時，關小蒸汽閥門使之保溫4小時。
在溶積為1立方米的雙面充氣板框式壓濾機上裝好隔膜、隔板、濾布(濾布型號為610)并連接好充氣管線。在助濾液勾兌池中加入2立方米清水，攪拌混合均勻，一邊攪拌，一邊泵入壓濾機，此時從壓濾機中流出清水，泵完2立力米助濾液為止。將蒸煮液預冷至80℃左右，在泵完助濾液后泵入蒸煮液，泵入壓力開始時要低，控制在0.2MPa左右，壓力的控制是由節流閥控制液體的回流與進入壓濾機的比例來實現，隨著壓濾機內濾餅的形成，壓力會逐漸增大，控制節流閥使之不要超過0.5MPa。泵入8-10立方米蒸煮液后(時節間為3小時)，停止泵液，開啟空氣壓縮機，向橡膠隔膜中泵入空氣，空氣壓力控制在0.6MPa待壓濾機沒有液體流出后(沖氣時間約為20分鐘)，關閉空壓機，打開壓濾機，卸出濾餅，濾餅的含水量一般為50％左右。濾餅經烘干粉碎是富含50％以上的蛋白質，可進一步加工成蛋白粉氨基酸等。
從壓濾機過濾出的分離液流入預貯藏，在預貯罐中冷卻至自然氣溫，然后開啟制冷機組及換熱器，分離液的冷卻溫度通過調節換熱器中的冷卻液和分離液的節流閥的節流閥來實現，分離液在換熱器中出口溫度為8℃然后流入等電點罐。分離液冷卻注入等電點罐的體積是9.2立方米，開啟等電點罐的攪拌機，加入含氯化鈣20％的氯化鈣溶液300公斤，測定等電點罐中的PH值，緩慢慢加入30％的H2SO4使PH值逐漸降低，直至PH值為2.2時停止加入H2SO4，此時產生大量的絮狀核酸，停止攪拌，保溫靜止8小時，使絮拜謝核酸自然沉淀。打開等電點罐上清液放出閥放出上清液，上清液放出閥直通等電點罐內部并具有彎形導管結構，通過調節彎形導管的角度達到控制放出上清液的液位，直至上清液基本排出。關閉上清液放出閥，向等電點罐注入2立方米的95％的工業酒精，再次開啟攪拌機，攪拌20分鐘，關閉攪點注入2立方米的95％的工業酒精，再次開啟攪拌機，攪拌20分鐘，關閉攪拌機，靜止4小時，打開上清液放出閥放出酒精上清。將等電點罐中經酒精脫水清洗的核酸沉淀裝入干燥盤。干燥盤放入干燥室，85％拱干10小時，將干燥盤搬出預冷并將核酸掰至塊狀。塊狀核酸經粉碎機粉碎后包裝即為成品核酸粉。經測定計算，核酸的收率為干酵母重的8.2％，對核酸的總提取率為92％，核酸純度95％。
權利要求
1.一種從微生物細胞中制取核酸的方法，其特征在于采用如下工藝步驟(1)基礎原料及初加工選擇以微生物-酵母細胞為基料，將其加工成生物活性物，(2)培養高核酸細胞將生物活性物-酵母基料進行稀釋，并對稀釋液中的酵母進行細胞培養，使稀釋液中酵母細胞的核酸含量增高，得到高核酸基料，(3)細胞的裂解往高核酸基料中加入含有0.1M-0.25M的氯化鈉溶液進行稀釋，在稀釋液中加入適量的堿調整PH值，使之PH在8-12之間，然后在90℃-100℃的條件下蒸煮2-4小時，再以10000轉/分-12000轉/分的速度在勻漿機中進行勻質、裂解40-60分鐘，同時進行高溫滅菌，得到核酸裂解液，(4)提取核酸采用分離、濃縮、壓濾的方法從核酸裂解液中提取核酸制品。
2.根據權利要求1所述的一種從微生物細胞中制取核酸的方法，其特征在于所說的提取核酸的方法是用弱酸調核酸裂解液的PH值，使PH值在6-8之間，然后輸入離心機以1000-3000轉/分的轉速離心10-30分鐘，所得上部液態即為食用核酸提取液。
3.根據權利要求1、2所述的一種從微生物細胞中制取核酸的方法，其特征在于所說的提取核酸的方法是將核酸提取液加入飽和硫酸銨進行稀釋，核酸提取液與飽和硫酸銨的比例為1∶8-16，然后離心10-20分鐘，以除去蛋白質，在去除蛋白質的液態核酸中加入助濾液-氯化鈉，使液態核酸中氯化鈉的含量為3M-6M，再離心10-20分鐘，得到沉淀核酸，在沉淀核酸中加入蒸餾水進行稀釋，兩者的比例為1∶1-2，然后用生物膜真空抽濾除去氯化鈉，將去除氯化鈉的核酸液進行干燥，得到核酸制品。
4.根據權利要求1所述的一種從微生物細胞中制取核酸的方法，其特征在于所說的提取核酸方法是用壓濾方法過濾核酸裂解液，核酸裂解液的溫度為50℃-90℃，過濾核酸裂解液過程中采用清水為助濾液，過濾后將液體核酸擠壓出來。
5.根據權利要求1、4所述的一種從微生物細胞中制取核酸的力法，其特征在于所說的提取核酸方法是將壓濾出來的液態核酸進行提純，提純核酸在等電點罐沉淀中進行，核酸在等電點罐沉淀之前，須將液態核酸降溫，溫度應控制在4-16℃之間，并攪拌液態核酸，然后加入濃度為3M-6M的硫酸，得到分離液，使分離液的PH值在2-3之間，當產生大量絮狀核酸的沉淀物時，應停止攪拌，保溫靜止，等電點罐中液態核酸，經調等電點靜止6小時以上，固體和液體自動分離，排出上清液，沉淀物即為濕核酸。
6.根據權利要求1、4、5所述的一種從微生物細胞中制取核酸的方法，其特征在于所說的提取核酸方法是采用酒精清洗濕核酸，加入2-3倍濕核酸體積的高濃度酒精，攪拌15-25分鐘，再靜止4小時以上，待酒精與核酸自然分離后，放出酒精上清液，并進行干燥制成純核酸。
全文摘要
本發明公開了一種從微生物細胞中制取核酸原料的方法,其工藝步驟分別是基礎原料及初加工;培養高核酸細胞;細胞的裂解;提取核酸,本發明具有原料來源廣泛,其基因又與人體生命的基因相同,吸收率可達99%以上,宜于推廣和使用,制得核酸純度高,生產成本低,無任何毒副作用,設備投資小,生產工藝簡單,工藝穩定,操作簡單,適宜大規模工業化生產。
文檔編號C12P19/00GK1308130SQ0012944
公開日2001年8月15日 申請日期2000年12月26日 優先權日2000年12月26日
發明者李永武 申請人:李永武