專利名稱：進行細胞裂解和核酸提取的裝置的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于聯合進行細胞裂解和核酸(NA)提取的整合式芯片實驗室 (lab-on-a-chip)診斷裝置。該系統可以用于從含有細胞和/或顆粒的測試樣品中提取核 酸。
背景技術：
對細菌細胞和病毒顆粒的DNA和/或RNA的分析是很多技術領域如例如診斷學、 環境監測、法庭辯論和分子生物學研究中的關鍵步驟。為了分析含有核酸的樣品，通常需要 進行兩個步驟。首先，對樣品進行破碎、分離和濃縮以產生純化的核酸提取物。其次，擴增 純化的核酸提取物以增加存在的核酸量，以利于核酸的檢測。 常規地，核酸的提取、純化和擴增是在實驗室由經過訓練的技術人員手動進行的。
這不僅需要有技術熟練的使用者，還由于使用者錯誤而導致顯著的錯誤率。另外，這種常規
提取使得提取、純化和擴增無法在現場即時進行，因此，生物測定的結果被推遲。因此，需要
提供生物測定，其降低和簡化使用者輸入，并使得測定可在實際取樣的時間和地點進行，例
如在醫生的手術室、診所、獸醫的手術室、甚至在患者的家中或者野外。 微制造的"芯片實驗室"裝置是進行完備的(contained)生物反應的有吸引力的
選擇。這些裝置需要使用者進行盡可能少的試劑操作，并且允許使用小樣品體積，這對于需
要昂貴試劑的生物反應而言是一個顯著的優點。 之前的一個提供微制造"芯片實驗室"裝置來提取和純化含核酸的樣品的方法在 W0 2005/073691中描述。在該文獻中，過濾含有細胞和/或顆粒的樣品。將濾液(即細胞 和/或顆粒)通過裂解流體進行裂解。然后，使已裂解的樣品通過核酸提取單元。核酸被提 取并保留在提取單元中，而裂解液流出該單元。合適的核酸提取方法的實例涉及在離液劑 存在下使DNA結合到二氧化硅顆粒上(見Boom等J. Clin. Microbiol. 1990， 28， 495-503)。 將提出的核酸用一次或多次洗滌溶劑洗滌，然后用洗脫液提取核酸。這個步驟也用于濃縮 核酸。 W0 2005/073691描述了如何在樣品被注射到系統中之后用單個泵驅動系統中的 所有流體。W0 2005/073691還描述了完成它的一種方法，即在由氣隙分隔的單個通道中提 供裂解流體、洗滌流體和洗脫液。 當核酸被提取、濃縮和純化后，然后通常需要對其進行擴增。通常使用聚合酶鏈 式反應(PCR)技術，而在一些情況下可以使用的另一種擴增技術是基于核酸序列的擴增 (NASBA)。本領域技術人員會理解，NASBA與PCR存在若干差異。尤其是，PCR涉及樣品的熱 循環，通常只產生DNA擴增產物，而NASBA是等溫技術，通常用于產生RNA擴增產物。
W0 02/22265中描述了特別設計用于進行NASBA的微制造系統。此系統包括兩個 室。第一室加熱樣品，使其變性并且促進引物與變性樣品的結合。第二室含有NASBA酶并
且等溫加熱樣品至約4rc的溫度。 為進行擴增，有必要將核酸樣品與引物混合。這些引物需要存在混合流體。此流
5體可包括匿SO和山梨糖醇中的一種或兩種。在W0 02/22265中，描述了如何將該流體預裝 入第一室中，并在第一室中將樣品與流體混合。

發明內容
本發明提供用于進行細胞裂解和核酸(優選mRNA)提取的改進的整合式裝置，該 裝置預裝有細胞裂解和核酸提取所需的試劑。本發明裝置的特征在于多種預裝的試劑以 可精確控制并可通過單個泵驅動的方式裝入。特別地，使用變位閥(variable position valve)與一套平行的流體儲器相組合來容納預裝試劑，這使得可以通過單泵精確可靠地驅 動流體。作為補充或替代，所述裝置的特征在于該裝置包括用于在提取和純化核酸樣品之 后和將樣品運送到核酸擴增單元之前將樣品與溶劑進行混合的部件。 因此，本發明提供用于對含細胞和/或顆粒的流體樣品進行核酸提取過程的整合
式芯片實驗室裝置，所述裝置包括 (a)用于裝載流體樣品的樣品入口 ； (b)用于裂解流體樣品中存在的細胞和/或顆粒的裂解單元；
(c)用于該裂解單元的裂解流體儲器；
(d)裂解單元下游的核酸提取單元；禾口 (e)用于該核酸提取單元的第一洗滌緩沖液和洗脫流體的儲器，該裝置還包括
(f)核酸提取單元下游的混合單元；禾口
(g)用于該混合單元的混合流體源。 在第二方面，本發明提供用于對含細胞和/或顆粒的流體樣品進行核酸提取過程 的整合式芯片實驗室裝置，該裝置包括
(a)用于裝載流體樣品的樣品入口 ； (b)用于裂解流體樣品中存在的細胞和/或顆粒的裂解單元；
(c)用于該裂解單元的裂解流體儲器；
(d)裂解單元下游的核酸提取單元；禾口 (e)用于該核酸提取單元的第一洗滌緩沖液和洗脫流體的儲器，其中所述裂解流 體、第一洗滌緩沖液和洗脫流體的儲器平行排列，每個儲器具有上端和下端，其中該裝置還 包括 (h)與裂解流體、第一洗滌緩沖液和洗脫流體之儲器的上端連接的上變位閥，
(i)與上變位閥連接接的泵， (j)與上述至少三個流體儲器的下端連接的下變位閥，
(k)連接下變位閥與裂解單元的第一驅動通道，禾口
(1)連接下變位閥與核酸提取單元的第二驅動通道。 第二方面的特征可以與第一方面分開使用，或者可以與第一方面的特征相組合。
在第三方面，本發明提供用于對含細胞和/或顆粒的流體樣品進行核酸提取以及 核酸序列的擴增和檢測過程的整合式芯片實驗室診斷系統，所述系統包括根據本發明第一 或第二方面的核酸提取裝置以及核酸擴增單元。 在第四方面，本發明提供了使用整合式芯片實驗室裝置對含細胞和/或顆粒的流 體樣品進行核酸提取過程的方法，所述方法包括
(i)提供整合式芯片實驗室裝置，其包括樣品入口 ，裂解單元，核酸提取單元，混合 單元，以及裂解流體、第一洗滌緩沖液、洗脫流體和混合流體的儲器；
(ii)通過該裝置的樣品入口裝入樣品； (iii)通過使來自裂解流體儲器的裂解流體經過細胞和/或顆粒而對樣品中的細 胞和/或顆粒進行裂解， (iv)使裂解流體經過核酸提取單元以提取核酸； (v)運送來自第一洗滌緩沖液儲器的第一洗滌緩沖液經過核酸提取單元； (vi)運送來自洗脫液儲器的洗脫流體經過核酸提取單元，以產生來自核酸提取單
元的洗脫樣品；禾口 (vii)在混合單元中將洗脫樣品與混合流體混合。 第一或第二方面的裝置或第三方面的系統可以用于這種方法中。 在第五方面，本發明提供了使用整合式芯片實驗室裝置對含細胞和/或顆粒的流
體樣品進行核酸提取過程的方法，所述方法包括 (i)提供整合式芯片實驗室裝置，其包括樣品入口 ，裂解單元，核酸提取單元，混合 單元，和裂解流體、第一洗滌緩沖液、洗脫流體和混合流體的儲器；
(ii)通過該裝置的樣品入口裝入樣品； (iii)通過使來自裂解流體儲器的裂解流體經過細胞和/或顆粒來對樣品中經過 濾的細胞和/或顆粒進行裂解， (iv)使裂解流體經過核酸提取單元以提取核酸；禾口 (v)運送來自第一洗滌緩沖液儲器的第一洗滌緩沖液經過核酸提取單元；禾口
(vi)運送來自洗脫液儲器的洗脫流體經過核酸提取單元，以產生來自核酸提取單 元的洗脫樣品， 其中所述裂解流體、第一洗滌緩沖液和洗脫流體由單個泵驅動。 該第五方面的特征可以與第四方面分開使用，或者可以與第四方面的特征相組
合。第一或第二方面的裝置或者第三方面的系統可用于這種方法中。


參考下列附圖描述本發明。這些圖用作本發明的實例。 圖1和2提供本發明裝置的示意圖。 圖3顯示試劑存儲儲器的平行排列。 圖4和5顯示混合單元之構造的實例。 圖6是可在本發明裝置中進行的過程的實例的分步指南。 圖7是示例性核酸擴增系統。 圖8顯示本發明的一個詳細實例。 圖9顯示本發明混合單元的一個詳細實例。 發明詳述 本發明提供用于進行完整的樣品制備方法的整合式芯片實驗室裝置。所述裝置可 用于進行核酸擴增和檢測的微制造反應室系統之中，或與其結合使用，或與其整體成形。 本發明的發明人認識到了使用WO 2005/073691中所述系統在擴增前制備核酸樣品的優勢。本發明人還注意到，WO 02/22265提供了用于實施核酸擴增反應(尤其是NASBA) 的方便的微制造系統。但是，當試圖將如WO 2005/073691中所述的樣品制備系統與如WO 02/22265中所述的擴增系統相結合時，本發明人發現，與大規模實驗所預計的相比，有時結 合后的系統顯示特異性和效率降低。 本發明人發現，這種特異性降低意外地是由擴增反應的引物本身所導致的。尤其， WO 02/22265要求在裝載樣品之前將所有用于擴增反應的試劑預裝到其微制造系統中。盡 管本發明人認識到，這種方法有利是因為其簡化擴增系統的制造和操作，但本發明人發現， 預裝一種特定試劑尤其可降低擴增反應的特異性。這種特定的試劑是在擴增中用來使引物 溶劑化并將它們與樣品混合的混合流體。 不希望被理論所限，認為混合溶劑幫助使擴增中所用引物分子溶劑化，以使得引 物分子完全延伸。如果不使用混合溶劑，則引物分子不完全延伸，因此它們結合特異性將下 降。本發明人發現，這在可用匿S0/山梨糖醇混合物使NASBA引物溶劑化的NASBA中尤其 成為一個問題。 因此，發明人尋找了其他方法來提供混合流體。本發明人發現，通過在核酸提取和 純化之后以及在樣品運送至核酸擴增單元之前將混合流體與核酸樣品混合，可以提高引物 與樣品的結合特異性。 因此，在第一方面中，本發明提供用于對含細胞和/或顆粒的流體樣品實施核酸 提取方法的整合式芯片實驗室裝置，該裝置包括
(a)用于裝入流體樣品的樣品入口 ；
(b)樣品入口下游的可選的過濾單元； (c)用于裂解流體樣品中所存在的細胞和/或顆粒的裂解單元，其與過濾單元(如 果存在的話)整合在一起，或者在過濾單元的下游；
(d)用于該裂解單元的裂解流體儲器；
(e)裂解單元下游的核酸提取單元；禾口 (f)用于該核酸提取單元的第一洗滌緩沖液和洗脫流體的儲器，此裝置還包括
(g)核酸提取單元下游的混合單元；禾口
(h)用于該混合單元的混合流體源。 發明人還認識到使用單個泵來驅動WO 2005/073691之裝置中的預裝試劑的優 勢。尤其，單泵的使用提供了簡化的微制造測定。W0 2005/073691提出了將其系統設計成 可使用單泵的一種方法是，在具有氣隙的單個通道中將裂解流體、洗滌流體和洗脫液分隔 開。但是，本發明的發明人發現，當使用這種方法時，不同的流體有匯合的趨勢。這在使用 通常用作洗滌溶劑的低表面能溶劑如醇(包括乙醇和異丙醇)時尤其是一個問題。
因此，在第二方面，本發明提供了對含細胞和/或顆粒的流體樣品實施核酸提取 方法的整合式芯片實驗室裝置，該裝置具有特定的試劑存儲單元，用于預裝和控制其試劑 的移動，所述裝置包括 (a)用于裝入流體樣品的樣品入口 ；
(b)樣品入口下游的可選的過濾單元； (c)用于裂解流體樣品中所存在的細胞和/或顆粒的裂解單元，其與過濾單元(如 果存在的話)整合在一起，或者在過濾單元的下游；
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(d)用于該裂解單元的裂解流體儲器；
(e)裂解單元下游的核酸提取單元；禾口 (f)用于該核酸提取單元的第一洗滌緩沖液和洗脫流體的儲器，其中所述裂解流 體、第一洗滌緩沖液和洗脫流體的儲器平行排列，每個儲器具有上端和下端，其中該裝置還 包括 (i)與裂解流體、第一洗滌緩沖液和洗脫流體之儲器的上端連接的上變位閥；
(g)與該上變位閥連接的泵； (h)與所述至少三個流體儲器的下端連接的下變位閥；
(j)連接下變位閥與裂解單元的第一驅動通道；禾口
(k)連接下變位閥與核酸提取單元的第二驅動通道。
第二方面的特征可以用于第一方面，反之亦然。 本文中所用的術語"下游"是指，在運行時樣品依次經過裝置的不同部件。術語 "下游"的范圍包括該裝置的兩部件直接流體連通，但其范圍也包括兩個部件被隔開(例如 被閥或者該裝置的另一部件隔開)。術語"整合"是指該裝置的兩個不同部件組合成單個單 元，以使得例如該裝置的同一部件可用于過濾樣品和用作裂解單元。當術語"整合"用于與 核酸擴增單元組合的本發明第一和第二方面所述裝置時，其指的是系統的兩個部件彼此連 接，從而在使用中它們彼此流體連通。另一方面，術語"整合"指裝置的不同部件優選在共 同的基底上形成。在用于裝置的兩個部件時，術語"連接"是指這兩個部件可以彼此直接流 體連通(例如通過直接連接到一起或者通過通道連接)或者可以被例如閥或者該裝置的另
一部件相互隔開。優選地，術語"與......連接"是指裝置的兩個部件彼此直接連接。 以下將更加詳細地描述第一和第二方面的特征。
樣品入口 樣品入口設計成使得樣品能被裝入裝置中。例如，其可適用于通過注射器注入樣 品。樣品入口也可以與泵連接。在這種情況下，樣品可以包含在容器中而沒有其自身的驅 動部件，使得在使用時樣品被泵吸入樣品入口 。
過濾單元 所述裝置可包括過濾單元。此單元可位于裂解單元上游，或者與裂解單元整合形 成。過濾單元可包括例如交錯流過濾器或者中空過濾器。或者，裂解單元本身可進一步包 括過濾流體樣品的部件。所述部件可包括例如交錯流過濾器或者中空過濾器，它們可以與 裂解單元整合。 裂解單元和可詵的核酸片段化單元 所述裝置包括適于裂解流體樣品(例如生物或環境流體或者由其衍生的流體樣 品)中所存在細胞的裂解單元，以及適于從裂解單元所裂解細胞或顆粒的內容物中提取核 酸(例如mRNA)的核酸提取單元。裂解單元可以是任何裂解單元，如WO 2005/073691中所 述的裂解單元，該文獻通過引用全文并入本文中。裂解單元可具有任何合適的形狀和構造， 但通常為通道或室的形式。裂解單元優選用于裂解流體樣品中所含的真核細胞和/或原核 細胞和顆粒，例如病毒顆粒。 如果必要，所述裝置還可包括核酸片段化單元，其位于裂解單元的下游，并優選 位于核酸提取單元的上游。或者，裂解單元本身可進一步包括對流體樣品中的細胞/顆粒裂解時所釋放的核酸進行片段化的方法。作為樣品預處理步驟，DNA或RNA的隨機片段 化經常是必要的。片段化可以使用限制酶以生物方法實現，或者通過施加物理力使分子 斷裂(參見例如P. N. Hengen， Trends in Biochem. Sci. ， vol. 22， 273-274頁，1997，以及 P. F. Davison, Proc. Nat. Acad. Sci. USA， vol. 45， 1560-1568頁，1959)。通過剪切對DNA進 行片段化通常包括使樣品經過短的縮窄件(constriction)。在一個優選實施方案中，DNA 和/或RNA在泵過狹窄的孔口時由于對分子的快速牽拉而在機械力下斷裂。壓力驅動流可 以產生剪切力，這導致核酸的片段化。國際專利申請PCT/GB03/004768描述了一種用于核 酸片段化的微流體裝置。 裂解單元本身可以進一步包括對流體樣品進行過濾的部件，可選地還包括對核酸
進行片段化的部件。禾亥斷是耳又転 核酸提取單元可以具有任意合適的形狀和構造，但是通常為通道或室的形式。核 酸提取單元可以至少部分地填充有非特異性結合核酸(如mRNA)之材料(例如二氧化硅) 的珠子、顆粒、過濾器或纖維。作為替代或補充，核酸提取單元可包括二氧化硅過濾器。核 酸在離液劑存在下與二氧化硅表面結合。所述單元通常包括基底和上層覆蓋物，提取單元 由基底表面的凹陷和所述覆蓋物的相鄰表面所限定。基底優選由硅、P匿S(聚二甲基硅氧 烷)、PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)、COC(環烯烴共聚物)、PE(聚乙烯)、PP(聚丙烯)、PC(聚 碳酸酯)、PL(聚交酯)、PBT(聚對苯二甲酸丁二醇酯)和PSU(聚砜)形成，還包括其中兩 種或多種的混合物。優選的聚合物是COC。在一個具體實施方案中，核酸提取單元包括通道 中的二氧化硅珠堆、顆粒過濾器或者纖維。 無論核酸提取單元是什么形式，本發明人都發現，提取單元在使用前經過氧化氫 處理后將更加有效。發現這產生了可更可靠地擴增的樣品。還發現對從核酸提取單元中提 取的樣品進行稀釋會促進選擇性擴增。這可以通過例如使混合流體中包含稀釋流體(例如 水)來完成。 所述裝置可還包括對裂解單元和/或核酸提取單元的內容物進行加熱的部件。所 述部件可包括例如一個或多個位于裂解單元和/或核酸提取單元之中或其附近的珀爾帖 兀件(Peltier elements)。
試劑儲存和驅動單元 在最一般性的方面中，本發明包括三個試劑存儲儲器，即裂解流體儲器、第一洗滌 緩沖液儲器和洗脫流體儲器。 在一個優選方面，這三個儲器平行排列。每個儲器具有兩個端，這兩端命名為上端 和下端。每個儲器的上端與第一變位閥連接(稱為"上"變位閥)，而下端與第二變位閥連接 (稱為"下"變位閥)。上變位閥還與驅動全部三個流體儲器的單個泵連接。所述單泵還可 以驅動所有預裝到該裝置中的其他流體和/或裝載到裝置中的樣品。下變位閥使得流體能 夠在使用中轉移到裝置的相應部件。為實現此目的，所述裝置配有將下變位閥與裂解單元 連接的第一驅動通道以及進一步將下變位閥與核酸提取單元連接的第二驅動通道。這樣， 使用中，上和下變位閥的適當定位使得單泵能夠驅動裂解流體使其經過第一驅動通道轉移 到裂解單元，以及驅動第一洗滌緩沖液和洗脫流體使它們經過第二驅動通道轉移到核酸提 取單元。
可選地，第四儲器與其他三個儲器平行排列。此第四儲器是核酸提取單元的第二 洗滌緩沖液的儲器。同樣，如果此儲器的兩端被稱為上端和下端，則此第四儲器的上端與上 變位閥連接，并且下端與下變位閥連接。第二洗滌緩沖液被驅動另外三個儲器的同一個泵 驅動。使用中，驅動第四洗滌緩沖液以使其經過第二驅動通道轉移通過核酸提取單元。
因此，每個儲器中預裝有其相應的試劑。裂解流體儲器預裝有裂解流體；第一洗滌 緩沖液儲器預裝有第一洗滌緩沖液；洗脫液儲器預裝有洗脫液。可選地，第二洗滌緩沖液儲 器預裝有第二洗滌緩沖液；混合流體儲器預裝有混合流體。 通過使用這個特定系統，可以使用試劑存儲及驅動單元有效且高效地分隔不同的 流體，以使得它們不會在混合過程或使用過程中發生不期望的混合。另外，可以使用單個泵 來驅動所有預裝的流體。這會簡化系統并提高可靠性。 裂解流體可以是能夠裂解流體樣品中目的細胞和/或顆粒的任何合適的裂解流 體/緩沖液。合適的裂解緩沖流體的實例是100mMTris/HCl，8M GuSCN(pH 6. 4)。
洗脫流體可以是任何適于從核酸提取單元中洗脫經純化核酸的流體。合適的洗脫 緩沖液的實例是10mM Tris/HCl，lmM EDTANa2 (pH 8)。 第一洗滌溶劑可以選自任何合適的溶劑，不過優選易于蒸發的溶劑，例如乙醇。
第二洗滌溶劑可以選自任何合適的溶劑，不過優選易于蒸發的溶劑，例如異丙醇。
混合流體也可以是此試劑存儲系統的一部分(如下)。當使用時，混合流體通常是 為進行下游過程或反應而添加到從核酸提取單元洗脫出的純化核酸中的試劑。在一個實施 方案中，混合流體可以是DMSO、山梨糖醇或者它們的混合物。其他混合流體是本領域技術人 員已知的(例如多元醇，其為具有一個或多個側醇基的分子，如甘油)。如上所述，這些特定 的混合流體為進行NASBA而特別提供。 為了控制通過裝置而存儲在試劑儲器中的單個試劑的流量，試劑存儲及驅動系統 的兩個變位閥協同操作。第一變位閥稱為上閥，可以變換位置以使得泵與任何試劑存儲通 道之間流體連通。其也稱為泵閥。第二變位閥稱為下閥，可以變換位置以選擇性地在驅動 通道與每一個試劑儲器之間輪流建立流體連通。其也可稱為驅動閥。根據驅動閥的所選位 置，每一次只有一個試劑儲器與驅動通道流體連通。當裝置在使用中時，下閥使得每個試劑 儲器的試劑流被單個試劑流驅動器驅動。 本發明試劑存儲及驅動系統的使用使得所述裝置在使用時，從試劑儲器經過該裝 置到裂解單元及核酸提取單元的試劑流能夠根據預定的方案使用單個試劑流驅動器來驅動。 混合單元 本發明的裝置還可包括單獨的混合單元，以在樣品裝入擴增單元的第一反應室中 之前將樣品和混合流體進行預混合。發明人已發現，盡管提高了裝置的復雜度，但對裝置的 這種修改實際上提供了樣品與混合流體之間高效且有效得多的混合。這可以提高下游擴增 單元中進行的擴增反應的特異性。 因此，所述裝置還可包括在核酸提取單元下游的混合單元，以便在使用該裝置時 接收來自提取單元的洗脫液。混合單元也與預裝載混合流體的試劑儲器流體連通。混合流 體可以是用于促進擴增引物與其靶標選擇性雜交的流體。這種溶劑的實例包括亞砜和/或 山梨糖醇。亞砜的實例是匿SO。將混合單元設計成使來自核酸提取單元的洗脫液(或者包
11含該洗脫液的流體，如稀釋的洗脫液)與預裝的混合流體混合。
混合單元可具有任何合適的形狀和構造。 在一個實施方案中，混合流體的儲器與裂解流體、第一洗滌緩沖液和洗脫流體的 儲器平行放置。如果這個儲器的兩端命名為上端和下端，則混合流體儲器的上端與上變位 閥連接，下端與下變位閥連接。這是能夠使該儲器與所有其他預裝載到該裝置之流體的儲 器用同一泵驅動的便捷方法。如果混合試劑以這種方式存儲，則該裝置還包括連接下變位 閥與混合單元的第三驅動通道。在使用中，可以驅動混合流體以使其經過第三驅動通道轉 移到混合單元。這種構造使得混合流體可以被存儲，然后在需要時提供給混合單元。
因此，混合單元可具有
(i)第三變位閥； (ii)具有第一和第二端的第一和第二通道，其中第一和第二通道的第一端與第三 變位閥連接，而第一和第二通道的第二端具有共同的端， (iii)具有第一和第二端的伸長通道，其中第三通道的第一端與第一和第二通道 的第二端具有共同的端。 使用中，這種構造允許樣品從核酸提取單元中洗脫，然后裝載到第一通道中。然后
混合流體裝載到第二通道中。最后，洗脫樣品和溶劑同時泵到伸長通道中。 在這種構造中，混合單元還可包括用于測量在第一通道中從核酸提取單元中洗脫
出來的樣品和在第二通道中的混合流體的位置(或栓)的部件。這使得對流體能夠精確控
制，以確保樣品與混合流體的有效混合。所述測量部件優選是含有光源的光學系統。為了
簡化裝置的設計，光源可以是與濁度測定中所用的相同的光源(見下文)。 或者，混合流體可存儲在兩端均與第三變位閥連接的儲器中。在這種情況下，混合
通道或室可以直接與第三變位閥連接，以使得裝置包括 混合單元，其包括與核酸提取單元的出口連接的變位閥，以及與該變位閥連接的 混合通道，其中混合流體儲器的兩端均與第三變位閥直接連接。本發明人發現這是有利的， 因為簡化了混合單元的操作。尤其是，這意味著該裝置可以與在樣品裝入混合通道或室之 前用于測量樣品位置的簡化檢測系統協同操作，或者根本不需要任何檢測系統。已經發現 這會提高裝置的可靠性。 在任何實施方案中，樣品和混合流體在其中混合的通道或室通常是伸長通道的形 式，可以包括嵌入物或者結構化的側壁以促進混合。伸長的通道可以巻曲的，例如呈波狀。 為了實現將洗脫液與下游試劑進行混合，使這兩種流體沿著混合單元的伸長通道混合并流 動。伸長的通道提供足夠長度的流動路徑，以使得兩種流體通過單純擴散而混合。
應該注意到，上述的第三變位閥可幫助控制裝置的其他部件。或者，可以提供單獨 的變位閥來幫助沿著該裝置驅動流體。在任一情況下，閥都與第一和第二變位閥協同操作。 這樣，將其命名為試劑流路控制閥。此閥的作用可以是變位以在選定的儲器與裂解單元、核 酸提取單元或者(在儲器預裝載有混合流體的情況下)混合單元之間建立流體連通。根據 流路控制閥的選擇位置，只有一個試劑儲器與裂解單元、核酸提取單元或者混合單元(如 果存在)流體連通。
其他特征 根據本發明的裝置通常還包括與樣品入口、裂解單元和核酸提取單元中的任何一個或者任何組合流體連通的廢棄物單元。可以存在可選的閥來控制流體流到廢棄物單元。 廢棄物單元可以是微制造的，并與其他組件整合。 所述裝置旨在與試劑流驅動器一起使用，這是將空氣(或其他流體)引入該裝置 的一個部件。例如，試劑流驅動器可與試劑存儲系統連接。試劑流驅動器可以形成裝置的 一部分，或者是與裝置一起使用的單獨組件。試劑流驅動器可包括泵或注射器，或者與試劑 存儲系統連接的體積可變室。 所述裝置還包括將流體樣品引入樣品入口的部件，或者與其一起使用。所述部件 可包括泵或注射器。或者，這種部件可包括一個或多個與樣品入口連接的體積可變室，其中 改變該體積可變室的體積會影響和/或限制流體樣品流入和/或流出入口 。體積可變室通 常包括覆蓋在下層基底中凹陷上的柔性膜。國際專利申請PCT/GB02/005945描述了 一種優 選的流體運輸系統。 所述裝置還包括濁度傳感器。傳感器可位于過濾單元的上游。為了簡化裝置的設 計，該傳感器可使用與混合系統的位置傳感器相同的光源。 所述裝置還可以包括壓力傳感器。優選地，壓力傳感器是封閉末端(dead-end)壓 力傳感器而不是線上(in-line)壓力傳感器，因為本發明人發現，使用封閉末端傳感器防 止了同一芯片上提取和純化的不同樣品之間的污染。
肝則亍禾亥斷是耳又扁禾,l隨充 本發明也提供用于對含有細胞和/或顆粒的流體樣品進行核酸提取和核酸序列 擴增及檢測過程的整合式芯片實驗室診斷系統，所述系統包括根據本發明第一或第二方面 的核酸提取裝置以及核酸擴增單元。 通常，核酸擴增單元將與核酸提取單元流體連通，或者與混合單元(如果存在的 話)流體連通，從而使得來自核酸提取單元的洗脫液或者其與溶劑的混合物可以直接流到 核酸擴增單元。可以存在可選的閥來控制二者之間的流體流動。優選地，核酸反應單元是 微制造的，并且優選與其他組件整合。 在反應單元中可以進行任何常規反應。在一個具體實施方案中，所述反應能夠對 特異性靶核酸序列進行檢測和定量分析。核酸反應單元通常包括核酸序列擴增單元，該單 元允許通過核酸擴增反應來檢測特異性序列。實例包括PCR和等溫擴增技術，例如基于核 酸序列的擴增(NASBA)。最優選的是使用分子信標檢測擴增產物的實時NASBA。
因此，在一個優選方面，本發明提供對含有細胞和/或顆粒的流體樣品進行樣品 制備、核酸序列擴增和檢測過程的整合式芯片實驗室診斷系統，更優選實時NASBA。 NASBA 反應的一般特征和要求在本領域中眾所周知。國際專利申請W0 02/22265 (該文內容通過 引用并入本文)描述了用于進行NASBA的微制造反應室系統，該系統可適于包括在本發明 的系統中。 核酸反應單元可具有任何合適的構造。在一個實施方案中，反應單元可包括多個 平行反應通道或室。在一個實施方案中，反應室/通道可預裝有核酸擴增和/或檢測所需 的試劑，例如實時NASBA所需的試劑。這些試劑可包括酶、緩沖組分、NTP、引物、探針等。試 劑可以存儲為干燥狀態，并在臨用前重建，例如通過添加在該系統的樣品制備部分中制備 的流體核酸樣品來重建。 在一個優選實施方案中，用于核酸擴增的引物預裝到擴增單元中。將引物預裝載并將混合流體與核酸樣品在本發明的混合單元中混合，這二者的組合有助于促進引物與其 靶標的特異性結合。引物可以預裝載到多組平行排列的雙室中的第一個室中。每個第一室 可以與共同的入口連接。在這種情況下，擴增酶(如NASBA酶)在第二室中提供，優選是預 裝的。所有其他試劑可以在第一室中提供，優選是預裝的。 術語"預裝"是指試劑在其最終使用之前(例如在裝置制造過程中)加入裝置中。 這樣，固體試劑可以沉積到所述裝置上，例如通過使溶液中的溶劑蒸發而使試劑溶液干燥 來實現。 核酸反應單元還可以包括計量部件，其用于在將流體核酸樣品引入平行反應室/ 通道時對其等分試樣進行計量。該計量部件可以采取任何合適的形式。
在一個具體實施方案中，本發明的系統可以用于裂解流體樣品中存在的細胞，提 取mRNA，對一種或多種特定靶序列進行NASBA擴增，以及對擴增產物進行實時檢測。
碰白懇隨 所述裝置的各個組件可以是微制造的。在一個實施方案中，裂解單元、核酸提取單 元和試劑存儲及驅動系統的試劑儲器是微制造的并整合在一起，即在同一基底上形成。
所述系統或至少其母版(master version)通常由半導體材料形成，或者包括半導 體材料，但是也可以使用絕緣體(例如玻璃、熔融二氧化硅、石英、聚合物材料和陶瓷材料) 和/或金屬材料。半導體材料的實例包括以下一種或多種第IV族元素(即，硅和鍺)； III-V族化合物(例如砷化鎵、磷化鎵、銻化鎵、磷化銦、砷化銦、砷化鋁和銻化鋁)；II-VI 族化合物(例如硫化鎘、硒化鎘、硫化鋅、硒化鋅)；以及IV-VI族化合物(例如硫化鉛、硒 化鉛、碲化鉛、碲化錫)。硅和砷化鎵是優選的半導體材料。所述系統可使用傳統上用于批 量生產半導體微電子裝置以及近年來用于生產半導體微機械的常規方法來制造。這些微制 造技術包括如外延生長(例如氣相、液相、分子束、金屬有機化學氣相沉積)、平板印刷(例 如光平板印刷、電子束平板印刷、X射線平板印刷、離子束平板印刷)、蝕刻(例如化學蝕刻、 氣相蝕亥IJ、等離子體蝕刻)、電沉積、濺射、擴散摻雜、離子注入和微機械加工。也可以使用非 晶體材料，如玻璃和聚合物材料。 聚合物材料的實例包括PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)、P匿S(聚二甲基硅氧烷)、 PC(聚碳酸酯)、C0C(環烯烴共聚物)、PE(聚乙烯)、PP(聚丙烯)、PL(聚交酯)、PBT(聚 對苯二甲酸丁二醇酯)和PSU(聚砜)，還包括兩種或更多種上述物質的摻和物。優選的聚 合物是PDMS或者C0C。 所述裝置或系統通常整體成形。所述裝置或系統可以在共同的基底材料(如本文 所述的半導體材料，但也可以使用如玻璃或陶瓷材料等絕緣體基底材料)上進行微制造。 然而，優選的共同基底材料是塑料或聚合物材料，并且適當的實例如上給出。所述裝置或系 統可優選通過對例如硅母版進行復制來成形。 以塑料代替硅玻璃用于微結構的優點有很多，至少在生物學應用上是這樣。 一個 最大的優點是減少了采用例如微注射模制、熱壓印和鑄塑等方法進行大量生產的成本。復 合結構的系數為ioo或更高并不是不可能的。復制多層模具之結構的可能性使得在設計自 由度上具有巨大的靈活性。由于有了將常用的標準部分相組合的選擇余地，因此在很多情 況下微觀世界和宏觀世界的相互聯系更為容易。組裝技術可以使用不同的方法，例如由微 結構制成的US焊接或溶劑焊接、激光焊接、膠黏和層壓。其他有利的特征是表面改性。對于專用于生物分析的微型化結構而言，重要的是表面具有生物相容性。通過利用等離子體處
理和等離子體聚合，可在涂層中獲得多樣性方面的靈活性和變化性。塑料對酸堿的化學耐
性要遠優于容易被腐蝕掉的硅基底。生物技術領域中的大部分檢測方法都涉及光學測量。
因此，相對于不透明的硅基底，塑料的透明性是一個重要的特征。聚合物微流體技術目前在
芯片實驗室市場中是已經建立但仍在發展的領域。 本文所述微制造的裝置或系統也意欲包括納米制造的裝置。 就硅母版或半導體母版而言，可以通過如蝕刻或者微機械加工而在硅基底上以準 確的微觀尺度限定出一個或多個體積可變室、微流體通道、反應室和流體互連。然后由所述 硅母版制造塑料復制物。以這種方式，可以通過任何適當的方法(例如使用粘合劑或者通 過加熱)，將具有蝕刻微結構或機械加工微結構的塑料基底結合到覆蓋物上。
驟,ffl誠 本發明的裝置或系統可以根據本發明的第四或第五方面來使用。這些方法的步驟 概括如下 (i)通過樣品入口裝入樣品； (ii)可選地測量樣品的濁度和/或壓力； (iii)可選地使樣品經過過濾單元； (iv)使來自樣品的流體可選地轉移到廢棄物單元； (V)使裂解流體從裂解流體儲器中移出，并轉移到樣品中的細胞和/或顆粒上；這 可以通過使裂解流體流經第一驅動通道來進行；
(vi)然后使裂解流體流入核酸提取單元； (Vii)使經過核酸提取單元之后剩余的流體可選地轉移到廢棄物單元；
(viii)使第一洗滌緩沖液從第一洗滌緩沖液儲器流經核酸提取單元，然后可選地 轉移到廢棄物單元；這可以通過使第一洗滌緩沖液經第二驅動通道從第一洗滌緩沖液儲器 中移出來實施； (ix)使第二洗滌緩沖液可選地從第二洗滌緩沖液儲器流經核酸提取單元，然后可 選地轉移至廢棄物單元；這可以通過使第一洗滌緩沖液經第二驅動通道從第一洗滌緩沖液 儲器移出來實現； (x)使洗脫流體經第二驅動通道從洗脫液儲器流經核酸提取單元；
(xi)然后，可選地，使洗脫的樣品轉移到混合單元；
(xii)在混合單元中，使洗脫的樣品與混合流體混合；
(xiii)然后樣品轉移至擴增單元。
在擴增單元中，樣品可以 (xiv)轉移至第一室中并且加熱至6(TC或更高，然后
(xv)轉移到含有NASBA酶的第二室中并加熱到約40°C 。 從上述本發明的第一、第二和第三方面的描述中可明顯看出，可以對這一步驟順
序進行修改、填加和刪減。
裝置的制造 本發明還提供用于制造本文所述的整合式芯片實驗室診斷系統的方法，該方法包 括
A.提供在其表面上具有入口凹陷、裂解單元凹陷、核酸提取單元凹陷、裂解流體儲 器凹陷和洗脫液儲器凹陷的基底；
B.提供覆蓋物；禾口 C.將所述覆蓋物結合到所述基底上，以形成各自由所述基底表面的各個凹陷和所 述覆蓋物的相鄰表面所限定的(a)入口、(b)裂解單元、(c)核酸提取單元、(d)裂解流體儲 器和(e)洗脫液儲器。 本文中用到的術語凹陷還意欲涵蓋多種特征，包括例如槽、縫、？L、溝和通道，包括 它們的一部分。 所述方法可以進一步包括在將覆蓋物結合到基底上之前或之后將裂解流體引入 裂解流體儲器中的步驟。 所述方法可以進一步包括在將覆蓋物結合到基底之前或之后將洗脫液引入洗脫 液儲器中的步驟。 所述方法可以進一步包括在將覆蓋物結合到基底之前或之后將乙醇引入第一洗 滌溶劑儲器中的步驟。 所述方法可以進一步包括在將覆蓋物結合到基底之前或之后將異丙醇引入洗滌 溶劑儲器中的步驟。 基底可以由例如硅形成，而上層覆蓋物可以由例如玻璃形成。在這種情況下，優選 將玻璃覆蓋物與硅基底陽極鍵合，所述陽極鍵合可選地通過在該基底表面上形成的中間二 氧化硅層進行。 硅中的凹陷可以采用反應性離子蝕刻形成。諸如聚合物材料等其他材料也可以用 作基底和/或覆蓋物。這些材料可以使用例如硅復制物(r印lica)來制造。或者，所述裝 置可以如下制造通過研磨和放電工具(EDM)來構建模具，然后對芯片部分進行注射模制， 然后采用例如鉆孔、研磨、去毛剌(deburring)等對聚合物部分進行機械性后加工。隨后， 可以接著進行濾器的插入、溶劑結合和流體連接的安裝。 聚合物材料的實例包括PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)、COC(環烯烴共聚物)、 P匿S(聚(二甲基硅氧烷))、PE(聚乙烯)、PP(聚丙烯)、PC(聚碳酸酯)、PL(聚交酯)、 PBT(聚對苯二甲酸丁二醇酯)和PSU(聚砜)，包括其兩種或多種的摻和物。優選的聚合物 是C0C。 優選地，尤其是如果需要對小室中的內容物進行光學觀測的話，則上層覆蓋物由 諸如玻璃、Pyrex或C0C等透光物質或材料制成。 微制造組件與一種或多種其他元件(如玻璃板或輔助微制造元件)的組合是經常 使用的，并且意欲落在本文所使用的術語"微制造"的范圍之內。 部分或全部的基材基底可以具有涂層，所述涂層的厚度通常至多為lym，優選小 于O. 5 ii m。該涂層優選由以下的一種或多種形成聚乙二醇(PEG)、牛血清白蛋白(BSA)、吐 溫和葡聚糖。優選的葡聚糖是分子量為9000 200000的葡聚糖，特別優選的是分子量為 20000 100000，尤其是25000 75000 (例如35000 65000)的葡聚糖。吐溫(或聚氧 乙烯脫水山梨糖醇)可以是可得自SigmaAldrich Company的任何吐溫。優選將PEG單獨 地或組合地作為涂層部件。PEG包括純的聚乙二醇，即式H0-(CH^H^)n-H，其中n是使PEG 通常具有200 50000、尤其是PEG1000 20000、例如15000 20000的分子量的整數；或者是化學改性的PEG，其中一種或多種乙二醇低聚物通過同雙官能團(homobifunctional group)(例如磷酸部分或芳香族間隔物)連接。特別優選的是具有數均分子量為15000 20000的聚乙二醇PEG。這種PEG的實例是SigmaAldrich Company銷售的產品P2263。施 加于所述小室/室、入口 、出口和/或通道的上述涂層可以改善流體流過該系統的流動。特 別地，已發現樣品不大容易附著或粘結到這種表面上。PEG涂層是優選的。
就硅母版或半導體母版而言，可以通過如蝕刻或者微機械加工而在硅基底上以準 確的微觀尺度限定出一個或多個體積可變室、微流體通道、反應室和流體互連件(深層反 應性離子蝕刻(DRIE)是優選的技術)。然后由所述硅母版制造塑料復制物。以這種方式，可 以通過任何適當的方法(例如使用粘合劑或者通過加熱)，將具有蝕刻微結構或機械加工 微結構的塑料基底結合到覆蓋物上，從而形成密閉的片段化小室、入口 、出口和連接通道。
通常，所述裝置優選用塑料如C0C注入模制來制造。這使得裝置的制造簡易又方 便。 所述裝置包括基底，其上表面上形成預期的微結構。例如，該基底可以是硅，或者 是通過硅母版復制而形成的塑料基材。該基底的上表面與覆蓋物結合，從而限定出一系列 的單元/小室、入口、出口和/或通道。所述覆蓋物可以由例如塑料或玻璃形成。該覆蓋物 優選是透明的，這允許對流體進行觀測。如果裝置由硅制成，其可以通過DRIE制造，或者所 述裝置可以如下制造通過研磨和放電工具(EDM)來構建模具，然后對芯片部分進行注射 模制，然后采用例如鉆孔、研磨、去毛剌等對聚合物部分進行機械性后加工。隨后，可以接著 進行濾器的插入、溶劑結合和流體連接的安裝。 核酸樣品可以是或者來自于例如生物流體、乳制品、環境流體和/或飲用水，或者 含有細胞的流體樣品，所述流體樣品獲得自或來自臨床組織樣品，例如活檢或類似的組織 取樣方法，例如宮頸刮片。非限制性實例包括血液、血清、唾液、尿、奶、飲用水、海水和池水。 對于許多復雜的生物樣品例如血液和奶，應該理解，在可從樣品中的細菌細胞和病毒顆粒 中分離和純化DNA何/或RNA之前，首先需要將病毒顆粒和細菌細胞與樣品中的其他顆粒 分開。還應該理解，在進一步破壞細菌細胞壁或者病毒蛋白被膜并分離核酸之前，為了濃縮 細菌細胞和病毒顆粒，即減少起始材料的體積，可能需要進行另外的樣品制備步驟。這在 起始材料具有大體積(例如含有相對較少的細菌細胞或病毒顆粒的水溶液)時是非常重要 的。這種類型的起始材料在環境監測應用(如飲用水中細胞污染的例行監測)中經常碰到。
所述裝置或系統優選設計成處理1 100ml的樣品體積。 本發明還提供用于分析生物樣品和/或環境樣品的設備，該設備包括本文所述的 系統。該設備可以是一次性設備。 現在通過舉例的方式并參照附圖對本發明進行描述。 典型的裝置布局在圖1中示意性示出。該裝置包括流體樣品入口 1、帶有整合濾 器的裂解單元4、核酸提取單元5和混合單元6。該裝置配有裂解流體(7)、第一緩沖溶液 (8)、洗脫流體(9)的儲器，可選地配有第二緩沖溶液(10)和混合流體(11)的儲器。
使用中，流體進入樣品入口 。可以通過例如注射器的作用主動將流體泵入入口 。或 者，可以提供與入口流體連通的泵，以使得樣品從被動存儲系統中被吸入流體入口。該泵可 以與用于驅動該裝置中預裝流體的泵27相同或者不同。 可選地，該系統可包括濁度傳感器2和/或壓力傳感器3。也可以通過用光學傳感
17器組件2，通過測量透過光和散射光來測量濁度，作為樣品中糖蛋白含量和細胞數的指標。 可以通過壓力傳感器3來測量壓力，作為濾器負荷的指標。使用中，如果樣品不具備預定水 平的壓力和濁度，樣品會被拒絕。 使用中，可選地過濾樣品后，來自樣品的流體可以穿過廢棄物單元12。另外，當從 核酸提取單元中洗脫時，裂解流體和第一緩沖溶液可以穿過廢棄物單元12。這兩個出口在 圖1中顯示為不同的出口。在這種情況下，可選的閥15和16用于控制流體經過流體途徑 或通往廢棄物單元的流動。但是，圖2顯示了更加方便的方案。在該圖中提供了單個廢棄 物單元。顯示其具有可選的出口，以使該系統中不產生壓力。這個出口也允許在核酸純化 單元的可選空氣干燥步驟中將氣體從系統中釋放。另外，試劑沿著芯片的流動可通過一個 變位閥控制，上文稱為第三變位閥或者驅動閥。盡管未在圖2中示出，但這個第三變位閥也 可與圖2所示的其他功能組合提供，或者作為單獨的變位閥向混合單元6提供混合流體11。
試劑7、8、9和10可在平行的試劑儲器中提供。圖3中顯示了三個平行儲器的示例 性排列。在此圖中，儲器20、21和22的兩端各與變位閥23(上變位閥)和24(下變位閥) 連接。儲器20中含有試劑7，儲器21中含有試劑8，儲器22中含有試劑9。可選地，可以提 供一個或兩個另外的平行試劑儲器。它們可含有混合流體和/或第二洗滌緩沖液。
上變位閥與泵27連接。這個泵優選驅動裝置上的所有試劑7、8、9和10和11 (如
果存在)。 下變位閥與第一和第二驅動通道25和26連接。第一驅動通道與裂解單元連接， 從而使得在使用中裂解流體可以用泵27驅動，并通過第一驅動通道供應到裂解單元。第二 驅動通道與核酸提取單元連接，從而使得在使用中第一洗滌緩沖液和洗脫流體通過第二驅 動通道供應到核酸提取單元。 應該理解，上變位閥和下變位閥的協同控制可用于驅動預裝到裝置上的所有流 體。這種控制可以通過使用如圖2所示的第三變位閥得到進一步改善。
核酸提取單元可包括二氧化硅珠子，例如0. 3mg的15_30 y m大小的二氧化硅珠 子。也可以在填料床的正下方提供電極(未示出)，用于通過電運動收集帶負電荷的洗脫核酸。 圖4和5顯示了混合單元6的兩種可能的構造。在圖4中，第三變位閥33用于定 位第一通道30中來自核酸提取單元5的洗脫樣品。然后，來自混合流體儲器的混合流體11 通過第三變位閥33裝載到第二通道31中。 一旦裝載后，驅動這兩個通道。由于通道在伸 長混合通道32的起點具有共同末端，混合流體和洗脫樣品傳遞到伸長混合通道中并混合。 該伸長混合通道的外形有利于樣品與混合流體的完全混合。 在圖4中，優選地通過光學儀器測量混合流體和洗脫樣品栓體(plug)的位置。優 選地，這個光學儀器是進行樣品濁度測量的同一光學儀器。這在圖2中用箭頭指出提供單 個光學檢測器，其檢測用于濁度測量(52)和定位混合單元55中樣品與混合流體前端位置 的光。 圖5示出圖4的另一個替代性構造。具體地，提供第三變位閥33與混合通道32 直接連接。這個第三變位閥還與混合流體儲器(示為34)的兩端都連接。該閥也與核酸提 取單元5的出口連接。使用中，該變位閥使得混合流體和從核酸提取單元洗脫出來的樣品 能夠在混合通道中直接混合，而不需要復雜的光學系統來測量樣品和混合流體兩者的栓體(即最前點)的位置。 因此，使用中，裝入該裝置的樣品經過如圖6中所示的幾步。第一步是樣品裝載。 將1 20ml流體樣品經由樣品入口引入裝置中(例如使用注射器泵)，并且流經裂解/過 濾單元成為廢棄物。樣品中存在的細胞和/或顆粒通過裂解單元中的濾器保留下來。使用 壓力表測量壓力，作為濾器負荷的指示。還通過光學傳感器組件測量透射光和散射光，作為 樣品中糖蛋白含量和細胞數的指標。 第2步是裂解。將裂解流體從預裝有裂解溶液的試劑儲器中移出，例如經過第一 驅動通道移出。然后裂解流體轉移到核酸提取單元。第l步中保留在濾器中的細胞和/或 顆粒裂解釋放其內容物，然后裂解的樣品被傳遞到核酸提取單元。裂解樣品中存在的核酸
被核酸提取單元中的二氧化硅珠子結合并保留。流體離開提取單元成為廢棄物。如果變位 閥設置成與提取單元的出口連接，則該閥設置成使得流體能夠流經核酸提取單元離開成為 廢棄物。在這一步中，所有流體可以用單個泵驅動。 第3步是第一次洗滌。將第一洗滌溶劑轉移至核酸提取單元，優選經過第二驅動 通道轉移。與核酸提取室的出口連接的變位閥可以設置成允許流體流經核酸提取單元離成 為廢棄物。所有流體均可以用上述步驟中的同一單泵驅動。 第4步是可選的第二次洗滌，例如用異丙醇。這一步洗滌的細節與第一次洗滌相 同。同樣，所有流體均可以用第2到4步中的同一單泵驅動。 第5步是風干和加熱。將第2 4步中用于驅動所有流體的單泵再用于將空氣泵 過核酸提取單元。這一點的實現是通過例如使允許第二洗滌緩沖液泵入核酸提取單元的流 體通路保持開放。如果需要可對室進行加熱。 第6步是核酸的洗脫。利用第2 5步中用于驅動所有流體的同一單泵將洗脫流 體從洗脫液儲器中泵出。如果存在的話，將第三變位閥設置成使得流體流經核酸提取單元 離開到混合單元。核酸從核酸提取室中被洗脫出來并且轉移到混合單元。光學傳感器可以 用于監測混合單元中洗脫核酸的到達。 第7步是混合。如前所述，這一步混合步驟的具體細節取決于混合單元的構成。
與混合流體混合后，樣品被傳遞到核酸擴增單元。 在一個實施方案中，核酸擴增單元包括如圖7所示的一系列雙室。在第一室40中， 預裝有用于擴增反應的引物。它們以干燥形式預裝載。可在核酸擴增單元的其他構造中提 供類似地預裝載的引物。 圖7中，如果要在反應室系統中進行NASBA，則將NASBA試劑預裝入第二室41中。 所有其他試劑也可以提供預裝入第一或第二反應室或者兩者中。 圖8示出本發明的裝置的一種可能構造。該圖顯示了樣品入口 (50)、壓力傳感器 (51)、濁度傳感器(52)，它們被設計成使得其能夠用于測量以下單元中的流體的位置混 合單元、整合式過濾及裂解單元(53)、核酸提取單元(54)、廢物單元(56)、用于驅動裝置中 所有流體的泵(57)、上變位閥和下變位閥(58和59)、用于混合單元中的定位樣品和混合流 體以及控制流體沿該裝置流動和向廢物單元(56)流動的第三變位閥、試劑存儲儲器(61、 62、63、64和65)以及將下變位閥與裂解單元、核酸提取單元和混合單元(66， 67和68)連接 的特定驅動通道。可見一個通道離開混合單元(55)的伸長通道，其與核酸擴增單元(未示 出)連接。
圖9示出混合單元的一種替代構造。變位閥(72)用于控制混合流體儲器(70)。 所述閥與混合通道(71)連接。樣品通過驅動通道(74)從核酸提取單元中提供。
因此，本發明的裝置可用于毫升樣品體積的常規診斷。本發明人已經通過包含 50 50000個細胞的樣品進行了證實。特別地，在核酸擴增單元中提供HPV16的引物，并 用NASBA擴增從細胞中提取出的RNA。遵循以上實驗方案。具體地，將3ml樣品裝入樣品入 口 。所述系統由C0C制造。核酸提取單元中的二氧化硅用3%的過氧化氫預處理24小時。 使用"Genomed A"二氧化硅濾器。 裝入樣品后，將120iU "Biomerieux Buffer pH 7. 5"用作裂解流體。然后，將 230 iU 75%乙醇水溶液用作第一洗滌緩沖液。第二洗滌緩沖液由100%醇構成。用7X4ml 以1. 5ml/分鐘供應的和1X2ml以1. 5ml/分鐘供應的空氣干燥核酸提取單元。然后將核 酸提取單元在6(TC干燥20分鐘。然后用HPV16的引物對樣品進行NASBA。觀察到樣品的 陽性結果。
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權利要求
一種用于對含有細胞和/或顆粒的流體樣品進行核酸提取過程的整合式芯片實驗室裝置，所述裝置包括(a)用于裝入流體樣品的樣品入口；(b)用于裂解所述流體樣品中存在的細胞和/或顆粒的裂解單元；(c)用于所述裂解單元的裂解流體儲器；(d)在所述裂解單元下游的核酸提取單元；和(e)用于所述核酸提取單元的第一洗滌緩沖液和洗脫流體的儲器，所述裝置還包括(f)在所述核酸提取單元下游的混合單元；和(g)用于所述混合單元的混合流體源。
2. 權利要求1所述的整合式芯片實驗室裝置，還包括(h) 過濾單元，所述過濾單元在所述裂解單元的上游，或者與所述裂解單元是整合形成的。
3. 權利要求1或權利要求2所述的整合式芯片實驗室裝置，其中所述裂解流體、第一洗滌緩沖液和洗脫流體的儲器平行排列，每個儲器具有上端和下端，其中所述裝置還包括(i) 與所述裂解流體、第一洗滌緩沖液和洗脫流體之儲器的所述上端連接的上變位閥，(g) 與所述上變位閥連接的泵，(h) 與所述至少三個流體儲器的所述下端連接的下變位閥， (j)將所述下變位閥與所述裂解單元連接的第一驅動通道，禾口(k)將所述下變位閥與所述核酸提取單元連接的第二驅動通道，其中至少所述裂解流 體、第一洗滌緩沖液和洗脫流體由單個泵(g)驅動。
4. 上述權利要求中任一項的裝置，還包括(1)用于所述核酸提取單元的第二洗滌緩沖液的儲器，其與所述裂解流體、第一洗滌緩 沖液和洗脫流體的儲器平行排列，其中所述第二洗滌緩沖液的儲器具有上端和下端，所述 儲器的上端與所述上變位閥連接，并且所述儲器的下端與所述下變位閥連接，其中所述第 二洗滌緩沖液由所述單個泵(g)驅動。
5. 上述權利要求中任一項的裝置，其中所述混合流體包括DMS0、山梨糖醇或者它們的 混合物。
6. 上述權利要求中任一項的裝置，其中所述混合流體由所述單個泵(g)驅動。
7. 權利要求6的裝置，其中所述混合流體的儲器與所述裂解流體、第一洗滌緩沖液和 洗脫流體的儲器平行排列，并且具有上端和下端，其中所述上端與所述上變位閥連接，和所 述下端與所述下變位閥連接。
8. 權利要求7的裝置，其中所述裝置還包括將所述下變位閥與所述混合單元連接的第 三驅動通道。
9. 上述權利要求中任一項的裝置，其中所述混合單元包括(i) 在所述核酸提取單元下游并且與所述混合流體儲器連接的第三變位閥，禾口 (ii)在所述第三變位閥下游的混合通道。
10. 上述權利要求中任一項的裝置，其中所述裝置還包括濁度傳感器，其設置成測量經 由所述樣品入口裝入的流體樣品的濁度。
11. 上述權利要求中任一項的裝置，其中所述裝置還包括壓力傳感器，其設置成測量經由所述樣品入口裝入的流體樣品的壓力。
12. 上述權利要求中的任一項的裝置，其中所述裝置還包括(m)廢棄物單元，其中所述廢棄物單元與所述裂解單元和/或所述核酸提取單元流體 連通。
13. 上述權利要求中任一項的裝置，其中所述裝置還包括加熱所述裂解單元和/或所 述核酸提取單元中內容物的部件。
14. 權利要求13的裝置，其中所述加熱部件包括一個或多個珀爾帖元件，其位于所述 裂解單元和/或所述核酸提取單元中，或者與它們相鄰。
15. —種用于對含有細胞和/或顆粒的流體樣品進行核酸提取過程的整合式芯片實驗 室裝置，所述裝置包括(a) 用于裝入流體樣品的樣品入口 ；(b) 用于裂解所述流體樣品中存在的細胞和/或顆粒的裂解單元；(c) 用于所述裂解單元的裂解流體儲器；(d) 在所述裂解單元下游的核酸提取單元；禾口(e) 用于所述核酸提取單元的第一洗滌緩沖液和洗脫流體的儲器，其中所述裂解流體、 第一洗滌緩沖液和洗脫流體的儲器平行排列，每個儲器具有上端和下端，其中所述裝置還 包括(i)與所述裂解流體、第一洗滌緩沖液和洗脫流體的儲器的上端連接的上變位閥；(g) 與所述上變位閥連接的泵；(h) 與所述至少三個流體儲器的下端連接的下變位閥；(j)將所述下變位閥與所述裂解單元連接的第一驅動通道；禾口 (k)將所述下變位閥與所述核酸提取單元連接的第二驅動通道。
16. —種用于對含有細胞和/或顆粒的流體樣品進行核酸提取和核酸序列擴增及檢測 過程的整合式芯片實驗室診斷系統，所述系統包括根據權利要求1 15中任一項的核酸提取裝置，禾口 核酸反應單元。
17. 如權利要求16所述的系統，其中所述核酸提取裝置和所述核酸反應單元是整合形 成的。
18. —種使用整合式芯片實驗室裝置對含有細胞和/或顆粒的流體樣品進行核酸提取 過程的方法，所述方法包括(i) 提供整合式芯片實驗室裝置，其包括樣品入口、裂解單元、核酸提取單元、混合單 元，以及裂解流體、第一洗滌緩沖液、洗脫流體和混合流體的儲器；(ii) 通過所述裝置的所述樣品入口裝入樣品；(iii) 通過使來自所述裂解流體儲器的裂解流體經過所述細胞和/或顆粒而對所述樣 品中的細胞和/或顆粒進行裂解，(iv) 使所述裂解流體經過所述核酸提取單元以提取核酸；(v) 將來自所述第一洗滌緩沖儲器的第一洗滌緩沖液運送經過所述核酸提取單元；(vi) 將來自所述洗脫液儲器的洗脫流體運送經過所述核酸提取單元，以產生所述核酸 提取單元的洗脫樣品；禾口(vii)在所述混合單元中將所述洗脫樣品與混合溶劑混合。
19. 一種使用整合式芯片實驗室裝置對含細胞和/或顆粒的流體樣品進行核酸提取過程的方法，所述方法包括(i) 提供整合式芯片實驗室裝置，其包括樣品入口、裂解單元、核酸提取單元、混合單元，以及裂解流體、第一洗滌緩沖液、洗脫流體和混合流體的儲器；(ii) 通過所述裝置的所述樣品入口裝入樣品；(iii) 通過使來自所述裂解流體儲器的裂解流體經過所述細胞和/或顆粒而對所述樣 品中的細胞和/或粒子進行裂解，(iv) 使所述裂解流體經過所述核酸提取單元以提取核酸；(v) 將來自所述第一洗滌緩液沖儲器的第一洗滌緩沖液運送經過所述核酸提取單元；和(vi) 將來自所述洗脫液儲器的洗脫流體運送經過所述核酸提取單元，以產生來自核酸 提取單元的洗脫樣品。其中，所述裂解流體、第一洗滌緩沖液和洗脫流體由單個泵驅動。
全文摘要
本發明提供用于對含有細胞和/或顆粒的流體樣品進行核酸提取過程的整合式芯片實驗室裝置，所述裝置包括(a)用于裝載流體樣品的樣品入口(1)；(b)用于裂解流體樣品中存在的細胞和/或顆粒的裂解單元(4)；(c)用于所述裂解單元的裂解流體儲器(7)；(d)所述裂解單元下游的核酸提取單元(5)；和(e)用于核酸提取單元的第一洗滌緩沖液和洗脫流體的儲器(8、9、10)，其中該裝置還包括(f)核酸提取單元下游的混合單元(6)；和(g)用于所述混合單元的混合流體源(11)。所述裂解流體、第一洗滌緩沖液和洗脫流體的儲器設置為互相平行，以使得它們可以用單個泵驅動。
文檔編號B01L3/00GK101765463SQ200880023815
公開日2010年6月30日 申請日期2008年6月9日 優先權日2007年6月7日
發明者克勞斯·斯特凡·德雷澤, 利夫·富魯貝格, 安雅·格利克森, 弗蘭克·卡爾森, 托比亞斯·拜爾, 托馬斯·翰森-哈格, 拉斯·A·索利, 雷納·格蘭澤 申請人:諾奇普公司