專利名稱：用于局部治療皮膚細胞增生疾病的核苷酸類似物的制作方法
技術領域：
本發明提供了用于局部治療牛皮癬及由皮膚細胞增生過度造成的其它疾病的制劑。具體地，本發明涉及利用含有核苷類似物、抗增生核苷和DNA鏈封端的二脫氧核苷的磷酸酯的制劑治療牛皮癬及其它皮膚疾病。
牛皮癬是人皮膚良性疾病，其特征一般在于斑塊被增厚的鱗屑覆蓋。該疾病是由未知原因的表皮細胞增生增加引起的。在正常皮膚中，細胞從底層移至上部顆粒層所需的時間大約為五周；而在牛皮癬中，部分由于增生細胞數量的增多以及分裂細胞比例的增加，此時間僅為6至9天(G.Grove,Int.J Dermatol 18:111,1979)。美國人口中大約有2％的人患有牛皮癬，其中大約有3％高加索美國人，大約1％非洲美國人，而很少本土美國人患有此疾病。
與炎癥有關的表皮增生是牛皮癬皮膚的特征。感染區域的皮膚活組織檢查顯示出隨核片段保留的角膜肥厚，隨著有缺陷角化的增生增加以及慢性炎癥浸潤。(參見E.A.Bauer,M.Tabas和J.B.Goslen，內科醫學課本(Texbook of Internal Medicine),W.N.Kelly(編輯),1989,pp1042-1045)。隨著細胞增生增加，感染組織中DNA合成增加，所述感染組織已是用于評估治牛皮癬藥的效力測定的基礎。
盡管已報道過具有牛皮癬臨床和病理組織學特征的稀有靈長類(N.J.Lowe,Drug Dev.Res.13:147-155,1988)，卻沒有公認的用于牛皮癬的動物模型。因此治療牛皮癬藥物的研究依賴于經受易剝落皮膚的自發突變(fsn)的動物或小鼠菌株中的實驗誘導增生(J.P.Sundberg等人，J.Invest.Dermatol 92:414,1989)。用于與表皮增生有關的疾病的另一個小鼠模型是必須脂肪酸缺乏(EFAD)的無毛小鼠。
實驗誘導的動物模型還包括無胸腺裸體小鼠，該小鼠具有免疫學缺陷并移植有疾病的人皮膚。
當今的治療法是由降低細胞迅速增生和減少炎癥的嘗試組成的。這些治療法包括局部地、系統地使用活性劑，或者兩者，這種治療法可任意地結合照射。局部治療包括使用類固醇膏以及在紫外線照射(UVB,290-320nm)之后使用煤焦油軟膏。人們已在局部用5-氟尿嘧啶上取得了一些成功，但是這種治療會引起形成嚴重的紅斑、水腫、大皰以及在治療區域皮膚潰瘍，因此不能很好地被患者接受(C.J.McDonald,Pharmac.Ther.14:1-24,1981)。在牛皮癬患者皮膚上曾局部試驗過TriazureTM(6-氮雜尿苷三乙酸酯)，但是沒有效果(William Drell，個人通訊(personal commuication),1993年5月)。
包括氨甲喋呤、6-氮雜尿苷和氮尿苷乙酯的抗增生劑也曾被系統地使用過。大面積的牛皮癬已通過口服，8-甲氧基補骨脂素-一種光敏劑，接著進行紫外線A(320nm)照射或服用類視色素如阿維A酯，接著進行紫外線A照射治療(C.J.McDonald,Pharmac.Ther.14:1-24,1981；E.A.Bauer,M.Tabas和J.B.GoSlen,in Textbook of Internal Medicine,W.N.Kelly(ed.),1989,pp 1042-1045)。由皮膚細胞增生引起的其它疾病包括特應性皮炎、扁平苔癬、光化性角化病、基底細胞癌和鱗狀細胞癌。抗增生核苷和二脫氧核苷及其類似物的磷酸酯的局部用途還沒有被報道用于治療牛皮癬或由皮膚細胞增生引起的其它疾病。
相關的PCT公開WO94/26273公開了抗皰疹核苷的磷酸酯如阿昔洛韋在由突變病毒菌株感染的動物中是有效的，其中由于突變感染病毒酶、胸苷激酶，阿昔洛韋不能轉變成阿昔洛韋磷酸酯。
本發明提供了治療牛皮癬及由皮膚細胞增生引起的其它疾病的方法，該方法包括局部應用含有具有下式的核苷類似物磷酸酯或其可藥用鹽作為活性成分的組合物
其中N為具有抗增生活性的核苷類似物；Z為O或S或NH；以及n為1、2或3。該方法可通過使用含有具有下式的核苷類似物磷酸酯或其可藥用鹽作為活性成分的組合物而進行
其中N為具有抗增生活性的核苷或核苷類似物；X為O或CH2或S；Z為O或S或NH；以及n為2。
在優選的實施方案中，核苷或核苷類似物選自阿糖胞苷、阿糖鳥苷(guanosine arabinoside)、5-氟脫氧尿苷、5-氟尿苷、6-氮雜尿苷、2-氯脫氧腺苷、2-氯-2＇-氟阿糖脫氧腺苷、2-氟阿糖脫氧腺苷、6-甲基巰基嘌呤核苷、二脫氧胞苷、二脫氧胸苷、二脫氧鳥苷、二脫氧肌苷、二脫氧腺苷、2＇-脫氧殺結核菌素、2＇-脫氧同型霉素、2＇-脫氧-(3,4-d)嘧啶、阿昔洛韋和更昔洛韋；根據本發明的方法，組合物中活性成分的濃度為0.001gm％至100gm％；在優選的實施方案中，組合物中活性成分的濃度為0.01gm％至10gm％；在特別優選的實施方案中，組合物中活性成分的濃度為0.1gm％至5gm％。
根據本發明的一個方面，在皮膚區域中每天應用組合物1至10次，每次應用劑量為0.001gm％至100gm％。另一種方法是在皮膚區域中每天應用組合物1至10次，每次應用劑量為0.01gm％至10gm％。在優選的實施方案中，在皮膚區域中每天應用組合物1至10次，每次應用劑量為0.1gm％至5gm％。
本發明的另一方面提供了一種藥物組合物，該組合物包含所述方法中的核苷類似物磷酸酯作為活性成分。在優選的實施方案中，所述藥物組合物還含有丙二醇、聚乙二醇400和聚乙二醇3350。在特別優選的實施方案中，所述組合物還含有在局部應用中能夠增強皮膚滲透的成分。
本發明還提供了用于本發明方法中的抗增生核苷類似物的磷酸酯。在一優選的實施方案中，核苷類似物為氨基磷酸酯或硫代磷酸酯和/或亞甲基磷酸酯或硫代膦酸酯。
本發明提供了抗增生核苷的磷酸酯，如2-氯脫氧腺苷、2-氯-2＇-氟阿糖脫氧腺苷、胞苷或鳥苷阿糖苷、6-氮雜尿苷、6-巰基嘌呤核苷、5-氟尿苷、5-氟脫氧尿苷、阿昔洛韋、更昔洛韋、二脫氧胞苷及其它二脫氧核苷和鏈封端的核苷類似物；當它們被局部應用時，其在降低細胞增生速率和消除牛皮癬皮膚中的淋巴細胞上令人驚奇和不尋常地有效。
一磷酸酯、二磷酸酯和三磷酸酯具有下列通式
其中N為抗增生核苷類似物；Z為O、S或NH；以及n為1或2；或者它們具有下式
其中N為抗增生核苷類似物；Z為O、S或NH；X為O、CH2或S；以及n為1、2或3。
因此，所述磷酸酯可以是磷酸酯、硫代磷酸酯(phosphothiorate)或氨基磷酸酯，二酯和三酯可以具有除氧原子之外的橋原子，如2,3-μ-硫代三磷酸酯或2,3-μ-亞甲基二磷酸酯。
與預期的結果相反，這些核苷類似物磷酸酯能夠令人驚奇地通過增生過度皮膚細胞的細胞膜并通過抑制嘌呤和嘧啶、核苷酸、RNA和DNA的生物合成中的各種酶步驟，可以降低細胞分裂速率。另外，化合物2-氯脫氧腺苷磷酸酯和2-氯-2＇-氟阿糖脫氧腺苷磷酸酯特別適用于治療牛皮癬炎癥部分，這是因為其抑制存在于牛皮癬患者皮膚炎癥浸潤物中的淋巴細胞和單核白血細胞生長的能力。本發明還提供了核苷類似物一-、二-和三磷酸酯的藥物制劑，其中所述磷酸酯的濃度應當能夠在局部應用時有效地降低牛皮癬皮膚細胞的增生。當以適當的局部制劑用于皮膚時，DNA鏈封端的二脫氧核苷磷酸酯能夠類似地降低牛皮癬細胞的增生。它們包括阿昔洛韋、更昔洛韋、二脫氧胞苷、二脫氧胸苷、二脫氧鳥苷、二脫氧腺苷、二脫氧肌苷、3＇-疊氮二脫氧胸苷(AZT)及其它二脫氧核苷類似物，如未決美國專利申請SN07/373,088中所描述的那些，該文獻在此引入作為參考。
當局部施用時可用作治牛皮癬藥的另外的核苷磷酸酯包括核苷酸代謝(Nucleotide Metabolism)(J.F.Henderson&A R.P.Paterson,AcadeicPress,1973,pp 266-271)中所羅列的那些。
這些化合物的鹽可容易地制得，這類鹽必須在水介質(如膏、膠體或其它水分散體)中顯示出很強的溶解性。這些化合物的典型的有用鹽包括鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽、銨鹽或氫鹽。也可使用任何本領域技術人員公知的生理可接受的陽離子。而且，這類鹽在提供良好的粘膜或皮膚分散相的聚乙二醇膏劑和洗液是有用和有效的。
局部用組合物本發明的另一方面提供了用于局部治療牛皮癬的方法，該方法包括將含有本發明核苷類似物磷脂酸的組合物應用于感染患者皮膚的牛皮癬損害處。
如前所述的局部應用的本發明核苷類似物磷酸酯、二脫氧核苷和鏈封端的核苷磷酸酯可通過引入各種本領域技術人員公知的組合物而制得，所述公知的組合物是指皮膚病學用途中有用和方便的組合物。核苷磷酸酯通常比相應的堿更溶于水，因此，水溶液、油包水乳液或水膏是非常優選的制劑。本發明核苷類似物磷酸酯的水溶性可通過制備其鹽如鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽、銨鹽或氫鹽而得到提高。在特別優選的組合物中，活性成分是在聚乙二醇(PEG)媒介物中制得的。另外，通過利用不溶性粉末如淀粉或滑石粉作為稀料或載體，可以以干粉制劑形式局部應用活性成分。
由于媒介物可選擇成能夠提高滲透性、延長活性持續時間或滿足用藥位置的要求，所以媒介物是一些局部用組合物中的重要成分。例如，應用于身體胼胝部位如手掌或腳底的制劑可包括提高滲透劑如二甲基亞砜、丙二醇或AzoneTM。另外，粉狀組合物可選擇成適用于擦爛區域如人體兩腿分叉處、內肘或手指或腳趾之間。組合物也可制成含有各種有機聚合物或本領域技術人員公知的其它組合物，從而得到活性治牛皮癬衍生物的持續釋放。
大量適合的局部用組合物可在藥物化學家公知的處方集中找到Blaug,S.,Ch.87 in Remington＇s Pharmaceutical Sciences(15th Ed.,1975,Mack Publishing Company,Easton,Pennsylvania 18042)。這些組合物包括如粉劑、糊劑、軟膏、凝膠、蠟、油、類脂、無水吸收劑、水包油或油包水乳劑、碳蠟乳劑(不同分子量的聚乙二醇)、半固體凝膠以及含碳蠟的半固體混合物。
本發明局部用組合物中活性成分的濃度可為約0.001gm％至100gm％，優選約0.01gm％至10gm％，最優選約0.1gm％至約5gm％。該組合物可進一步包括有效濃度的有助于促進皮膚滲透和愈合的其它試劑，正如上述參考處方集中描述及本領域高普通技術人員公知的那些。
含有本發明活性核苷類似物磷酸酯的局部用組合物的效力可使用本領域技術人員公知的常規試驗方法進行評估。這些包括使用模擬動物模型(如表皮增生)和其它體內預測測定(N.J.Lowe,Drug Dev.Res.13:147-155,1988)。
組合物可重復應用于感染皮膚的牛皮癬損害處，如每天一次、兩次或幾次；治療可延續數天，直至達到愈合。其發生毒性和過敏的危險是最小的。
在本發明特別優選的實施方案中，核苷是由2-氯脫氧腺苷、2-氯-2＇-氟阿糖腺苷、6-氮雜尿苷、5-氟尿苷或5-氟脫氧尿苷、鳥苷阿糖苷或二脫氧核苷及局部膏劑組成的，所述局部膏劑是由含聚乙二醇3350、聚乙二醇400和丙二醇或乙二醇的混合物組成的。
核苷類似物是由下列物質組成的胞苷或鳥苷阿糖苷、5-氟脫氧尿苷、5-氟尿苷、6-氮雜尿苷和DNA鏈封端二脫氧核苷，如二脫氧胞苷、二脫氧胸苷、二脫氧鳥苷、二脫氧肌苷，以及二脫氧核苷類似物，如PCT公開WO90/00555中描述的化合物及相關化合物2-氯脫氧腺苷和2-氯-2＇-阿糖氟脫氧腺苷和2-氟阿糖脫氧腺苷。當以一-、二-或三磷酸酯傳遞時，能夠抑制表皮細胞DNA聚合物酶的其它核苷類似物包括2＇-脫氧殺結核菌素、2＇-脫氧間型霉素和2＇-脫氧-(3,4-d)嘧啶。
可用作局部給用治牛皮癬藥的另外的化合物包括下列核糖核苷和脫氧核糖核苷衍生物的一-、二-和三磷酸酯8-氮雜鳥嘌呤、6-巰基嘌呤、6-硫代嘌呤、6-甲基巰基嘌呤，2,6-二氨基嘌呤、8-氮雜黃嘌呤、間型霉素、狹霉素C、德夸菌素A、二甲苯酰腺苷、6-氯嘌呤、6-氮雜尿嘧啶、5-氟胞苷或5-氟胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-碘尿嘧啶和5-溴尿嘧啶；以及包括3＇-脫氧腺苷、脫氧木吡喃糖基胸苷、脫氧葡糖吡喃糖基胸苷和阿糖胞苷(化學結構可參見核苷酸代謝，J.F.Henderson&A.R.P.Paterson,Academic Press,1973,pp.266-271)的一-、二-和三磷酸酯。
局部用藥物評估的測定1．表皮DNA合成抑制測定。由于增加的DNA合成是以牛皮癬皮膚中的表皮增生為特征，所以向利用藥劑治療的皮膚組織中摻入放射性DNA前體已被用于評估由藥劑引起的DNA合成的抑制程度。簡而言之，將局部用載體中的治牛皮癬藥應用于無胸腺小鼠區域中，其中利用本領域中公知技術已將患有牛皮癬的人真皮和表皮移植到所述區域上。類似地，將可將EFAD無毛小鼠模型用在測定中，從而測得抗增生藥物的效果。大約在治療6小時后，切除治療過的組織，將其置于含3H-胸苷脫氧核糖或3H-溴脫氧尿苷的組織培養基中進行0.1-5小時的脈沖標記。然后利用常規方法分離DNA，通過測定所分離DNA中的放射性(cpm/μgDNA)測量摻入到DNA中的3H-胸苷脫氧核糖或3H-溴脫氧尿苷量。通過比較從未治療組織摻入到DNA中的放射性與利用不同治牛皮癬藥的組合物(活性成分的％增加)的DNA放射性，可測定治牛皮癬藥抑制增生的效力。
2．多胺生物合成抑制測定。該測定基于表皮細胞中存在的鳥氨酸脫羧酶(ODC)的量。ODC是在多胺形成中限制速率的酶，所述多胺通常在增生中增加，所述增生包括與牛皮癬有關的表皮增生。通過角質層帶的剝脫(Lesiewicz等人，Models in Dermatology,vol,2,pp112-116(H.I.Maibach&N.J.Lowe,eds.),1985)，或通過應用佛波醇酯(12-O-四癸酰基佛波醇-13-乙酸酯或TPA)，也可引起ODC活性增加。
3．皮膚活組織檢查。在1-15天內利用治牛皮癬藥物治療EFAD無毛小鼠、fsn/fsn易剝落皮膚小鼠或用患牛皮癬的人皮膚移植的無胸腺小鼠，檢查被治療的皮膚，從而得到牛皮癬的粗指征(皮膚的剝落、炎癥的紅腫性等)，然后利用活組織檢查進行分析，在顯微鏡下利用標準組織學方法可計數表皮細胞層的數量。將表皮細胞層的數量與類似的正常未治療牛皮癬皮膚進行比較，從而確定利用治牛皮癬藥物治療的效果。再者，通過測定表皮毛細管中的白血細胞(即中性白細胞和/或單核白細胞)數量及相對于未治療牛皮癬皮膚和正常對照皮膚的毛細管擴張，可以定量組織中的炎癥相對程度。
類似地，利用皮膚活組織檢查和顯微鏡檢查的人臨床試驗可通過使用具有少量應用于大約3cm直徑皮膚區域(如前臂或腿上)的治牛皮癬藥劑的兩側成對比較而進行。特別優選兩側成對比較以避免由治療區域到非治療對照區域的交叉作用的危險。
4．使用易剝落皮膚小鼠。將經受易剝落皮膚的自發突變(fsn/fsn)的近親繁殖的小鼠發展成白色鱗狀皮膚，在斷奶后，該鱗狀皮膚隨著年齡的增長而不斷地增厚，由此形成增生性皮膚疾病，特別是牛皮癬。到42天的年齡時，小鼠顯示出帶有多層底膜和炎癥的表皮增生，這是通過白血細胞和彎曲皮膚血管的增加測定的，所有這些特征均是人牛皮癬的特征。這些小鼠可用作確定利用局部應用核苷磷酸酯的治療效力的人牛皮癬模型。將包括核苷磷酸酯的組合物應用于fsn/fsn小鼠的背側或腹側皮膚的1-5mm部分，并且從12小時至后來的15天內粗略地和顯微地觀察皮膚，從而利用常規皮膚病學和組織學方法確定表皮增生的程度和上述所出現的牛皮癬皮膚的其它癥狀。與未治療的小鼠的類似部分進行相關的比較，與其它未治療的fsn/fsn小鼠進行比較，與利用只含載體成分而沒有核苷磷酸酯的組合物治療的fsn/fsn小鼠進行比較，以及與fsn位點類似治療的非突變小鼠進行比較。
5．角化細胞標記。蛋白質表達的變化和與牛皮癬皮膚相關的增生變化是一致的。用于檢測皮膚異常疾病的兩種分子是角蛋白和細絲蛋白(filaggrm)。基部上表皮中的特別小鼠角蛋白K6的聚集為一般與增生相關的分子變化。在無毛EFAD小鼠或fsn/fsn小鼠中，基于抗體的檢測K6的方法可用于確定基部上表皮中所出現的分子以及該分子的量，因此可用作治療牛皮癬藥物效力的標記。
細絲蛋白是表皮中的一種蛋白質，它通常與顆粒層和過渡細胞中的角質透明蛋白顆粒有關，但這種細絲蛋白在上部角化細胞中消失。然而，在fsn/fsn小鼠中，細絲蛋白仍以過渡細胞的模型特征保持存在于表面細胞層中。正如由抗細絲蛋白抗體檢測和/或通過顯微觀測的那樣，上部角化細胞中存在細絲蛋白是牛皮癬細胞的特征，可用于評估應用于fsn/fsn小鼠皮膚的治療牛皮癬藥物的效力。
合成選擇的嘌呤和嘌呤核苷類似物。本文綜述了合成一些抗增生嘌呤和嘌呤核苷類似物的具體方法，所述嘌呤和嘌呤核苷類似物可用作治療牛皮癬的磷酸酯。另外的化合物和合成方法是本領域技術人員所公知的。有代表性的方法公開在RK Robins和G.D.Kini，抗腫瘤藥化學(TheChemistry of Antitumour Agents)(D.E.V.Wilman編),1990,p299-321中。
(1)嘌呤類似物在高溫下，在1,2,3,4-四氫化萘中利用五硫化磷處理次黃嘌呤，合成6-巰基嘌呤。
在回流吡啶中利用五硫化磷處理鳥嘌呤，可合成6-硫代鳥嘌呤。
通過在咪唑[4,5-c]吡啶環系中閉環適當取代的3,4-二氨基嘧啶，合成3-脫氮腺苷、3-脫氮次黃嘌呤和3-脫氮-6-巰基嘌呤(Robbins,R.K.等人，J.Org.Chem.28:3041,1963)。
當利用三氯氧化磷使得5(4)-氨基甲酰基甲基咪唑-4(5)-羧酸甲酯脫水，制備經液氨處理環化的5(4)-氰基甲基咪唑-4(5)-羧酸甲酯時，可合成3-脫氮鳥嘌呤。
(2)嘌呤核苷利用催化劑氯化汞，縮合6-甲基巰基嘌呤和2,3,5-三-O-乙酰基-D-核糖-呋喃糖基氯，接著進行脫乙酰作用，可合成6-甲基巰基嘌呤核苷。另外，6-甲基巰基嘌呤核苷可由甲基化6-硫代肌苷直接制得(Fox,J.J.等人，J.Am.Chem.Soc.80:1669,1958)。
9-β-D-阿糖呋喃糖基腺嘌呤(ara-A)可由下列步驟合成利用甲磺酰氯處理9-(β-D-木呋喃糖基)腺嘌呤的3＇,5＇-二-O-異亞丙基衍生物，使其轉變成相應的2＇-O-甲磺酰基衍生物，然后由乙酸將該衍生物裂解成9-(2＇-O-甲磺酰基-β-D-木呋喃糖基)腺嘌呤，再在甲醇中用甲醇鈉處理制得2＇,3＇-環氧化物，在含水二甲基甲酰胺中用鈉處理開環，生成ara-A，再結晶純化。
相關化合物9-β-D-阿糖呋喃糖基-2-氟腺嘌呤(2-氟-ara-A)可由下列步驟合成在回流吡啶中，利用乙酐乙酰化2,6-二氨基嘌呤，生成2,6-二乙酰氨基嘌呤，然后與2,3,5-三-O-芐基-α-D-阿糖呋喃糖基氯縮合，生成嵌段β-異頭物核苷；在乙醇中通過利用甲胺處理使其脫乙酰基，生成二氨基核苷，利用含硝酸鈉水溶液的氟硼酸和四氫呋喃混合物處理，使其生成2＇,3＇,5＇-三-O-芐基-β-D-阿糖呋喃糖基-2-氟腺嘌呤，利用三氯化硼處理，生成2-氟-ara-A。
通過稠合2,6-二氯嘌呤和1,3,5-三-O-乙酰基-2-脫氧-D-赤-呋喃戊糖及通過其它方法(Robins和Kini，抗腫瘤藥化學，1990,p308)，可合成2-氯-2＇-脫氧腺苷。
(3)嘌呤環核苷酸和環核苷酸類似物
8-氯-cAMP可由下列步驟合成在氫氧化鈉水溶液存在下，將cAMP溴化成8-溴-cAMP，在高溫下利用硫脲將其處理成8-硫代-cAMP；在HCl甲醇溶液中利用氯氣氯化。
(4)其它與嘌呤相關的抗增生核苷噻唑呋林(2-β-D-核糖呋喃糖基)-噻唑-4-甲酰胺可由下列步驟合成利用溴丙酮酸乙酯處理2,5-脫水-3,4,6-三-O-苯甲酰基-D-阿洛糖基硫代酰胺，促進閉環，生成2-(2,3,5-三-O-苯甲酰基-β-D-核糖呋喃糖基)噻唑-4-羧酸乙酯，為主要產品；然后分離并用甲醇氨處理。
相關化合物硒代噻唑呋林可由下列步驟合成利用液態H2Se處理2,5-脫水-3,4,6-三-O-苯甲酰基-D-阿洛糖腈，生成相應的硒酰胺；與溴丙酮酸乙酯反應，促進閉環，生成2-(2,3,5-三-O-苯甲酰基-β-D-核糖呋喃糖基)硒唑-4-羧酸乙酯，為主要產品；然后分離并用甲醇氨處理。
吡唑霉素(3-(1-β-D-核糖呋喃糖基)-4-羥基吡唑-5-甲酰胺)為天然存在的核苷，可從純白鏈霉菌中分離出來(Gutowski,G.E等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.51:312,1973)。另外，吡唑霉素可如下合成利用肼衍生物處理α-酮酯，生成二偶氮中間體；與乙酐和乙酸鈉加熱，生成環化羥基吡唑核苷；用甲醇氨胺化，然后脫芐基，生成吡唑霉素。
2-脫氧肋間型霉素(8R)-3-(2-脫氧-β-D-赤-呋喃戊糖基)-3,6,7,8-四氫咪唑[4,5-d][1,3]-二氮雜-8-醇可由下列步驟合成將糖苷配基、6,7-二氫咪唑[4,5-d][1,3]-二氮雜-8(3H)-酮與2-脫氧-3,5-二-O-對-甲苯酰-D-赤-呋喃戊糖基氯進行糖基化作用(Chan,E等人，J.Org.Chem.47:3457,1982)。
合成核苷單磷酸酯、二磷酸酯和三磷酸酯及核苷磷酸酯類似物通過核苷與三氯氧化磷反應而合成核苷單磷酸酯的方法描述在公開WO90/00555和WO94/26273以及上文描述的文獻中(Yoshikawa等人，Bull.Chem.Soc.Japan 42:3505-3508,1969；Toorchen,D.和Topal,M.,Carcinogenesis 4:1591-1597,1983)。核苷二磷酸酯可根據Ott,D.G等人的方法制備(Anal.Biochem.21:469-472,1967)。
核苷三磷酸酯可由下述方法制備Seela和Roling的方法(Nuc.Acids Res.20:55-61,1992)；或通過Moffat和Khorana的方法(J.Am.Chem.Soc.83:663,1991)，由核苷單磷酸酯制得；或Hord和Ott的方法(J.Am.Chem.Soc.87:1785-1788,1963)。下列實施例1-3描述了用于制備核苷和核苷類似物的磷酸酯的一些詳細的合成方法。
其它核苷磷酸酯類似物，包括核苷硫代磷酸酯、核苷氨基磷酸酯、核苷膦酸酯和核苷氟代磷酸酯，可通過本領域技術人員公知的方法合成，這些方法已由D.W.Hutchinson綜述(核苷單-、二-、三-和四磷酸酯和核苷酸的合成、反應和性質與磷酰殘基的變化。核苷酸和核苷化學(Chemistry of Nucleotides and Nucleosides),L.Townsend,ed.,1991,pp81-146及其所引用的參考文獻)。通常的合成方法總結如下。
(1)核苷硫代磷酸酯是核苷酸類似物，其中一個或多個磷酰基氧原子被硫取代。早期的合成方法是將被保護的核苷與三(1-咪唑基)膦(phosphane)硫反應，而最近的合成方法是利用硫代磷酰氯(PSCl3)代替后一試劑。通過用氫氧化鈉和二硫化碳處理，核苷苯胺磷酸酯(phosphoranilidate)可轉變成硫代磷酸酯。核苷5＇-硫代磷酸酯可由核苷5＇-亞磷酸酯的直接硫化得到。嘌呤核苷2＇(3＇)-硫代磷酸酯可由下列步驟合成將2＇,3＇-O-二-正丁基甲錫亞烷基衍生物與硫代磷酰氯反應，然后再堿解。
(2)核苷氨基磷酸酯是一種類似物，其中一個或多個磷酰基氧原子被氮取代，形成P-N鍵；即使在中等酸性條件下，該P-N鍵比核苷硫代磷酸酯的P-S鍵更加不穩定。合成這些化合物包括氨基核苷的磷酸化，并利用磷酸三酯處理核苷疊氮化物。親油核苷氨基磷酸酯是特別有用的治療牛皮癬化合物，理由是它們更容易被細胞吸收，然后被水解成生物活性化合物。
(3)核苷膦酸酯是一種化合物，其中磷酰基的氧原子被碳取代，形成穩定的P-C鍵；當由代替氧的給電子的烷基基團取代磷原子時，該化合物具有降低的P-OH基團的酸性。對于本領域技術人員來講，核苷磷酸酯可容易地利用或者Arbusov或者Michaelis-Becker反應，由核苷鹵化物制得。核苷5＇-膦酸酯可利用本領域技術人員熟知的方法由2＇,3＇-被保護的5＇-碘-5＇脫氧核苷合成。等配核苷5＇-膦酸酯(其中5＇-氧被亞甲基基團取代)可通過下列步驟合成偶合適當保護的核苷5＇-醛和三苯基亞正膦基甲基膦酸二苯基酯，得到α,β-不飽和膦酸二酯，然后再還原并在磷酰基殘基上脫保護，得到膦酸酯。等配核苷3＇-膦酸酯可通過下列步驟合成由膦酰化核糖-1氯化物開始，將該化合物與嘌呤或嘧啶的重金屬鹽偶合。膦酸酯的極性通常低于其磷酸酯配對物，因此可用作治牛皮癬藥，理由是局部應用時它們更容易被細胞吸收。
(4)核苷氟代磷酸酯是一種單核苷酸類似物。通過核苷酸的2,4-二硝基苯基酯，利用2,4-二硝基氟苯處理核苷5＇-磷酸酯制得核苷5＇-氟代磷酸酯。
(5)其它核苷磷酸酯類似物包括那些除氧原子之外的原子在核苷二-和三磷酸酯的α,β-磷原子之間或者在核苷三磷酸酯的β,γ-磷原子之間被取代的磷酸酯(包括在D.W.Hutchinson，核苷酸和核苷化學，LTownsend,ed.,1991的第119頁的表Ⅲ中所列的化合物)。通常地，α,β-類似物可通過下列步驟制備借助于DCC縮合2＇,3＇-O-被保護的核苷與焦磷酸酯類似物；或者通過親核置換反應，該反應包括利用亞甲基二膦酸酯離子替代甲苯磺酰基核苷的5＇-位糖殘基上的甲苯磺酰基(tosyl)殘基。β,γ-類似物的制備如實施例4所示。
局部用聚乙烯膏的制備在攪拌下，于70℃將5克核苷磷酸酯溶解于5ml丙二醇和60克聚乙二醇400(兩種試劑均購自Spectrum ChemicalsInc.Los Angeles,CA)中。在攪拌下加入40克聚乙二醇3350(SpectrumChemicals Inc)，直至混合物變得完全清亮。然后將組合物置于管或其它容器中，冷卻至室溫并密封。組合物中活性成分的有效濃度可在0.001gm％至50gm％之間變化，優選為0.01gm％至5gm％。正如本領域普通技術人員所已知，該組合物也可含有其它增強皮膚滲透性的成分(如二甲基亞砜或DMSO)和/或增強組合物儲存期間穩定性的成分。
牛皮癬的治療將治療牛皮癬有效濃度為0.01gm％至10gm％的含治療增生或抗炎的核苷磷酸酯的本發明局部用組合物應用于感染區域，每天1至6次。劑量標準和最佳的活性核苷磷酸酯化合物的濃度可容易地由治療牛皮癬領域的有經驗的醫生確定。
實施例1由單核苷制備核苷三磷酸酯脫氧核糖核苷酸、二脫氧核糖核苷酸及類似物的5＇-三磷酸酯的制備包括下列表述的一系列反應。
單核苷酸的合成描述在共同未決的美國專利申請系列號.08/060,258(1993年5月12日申請)中。在室溫下，核苷酸(Ⅰ)和過量的1,1＇-羰基二咪唑(Ⅱ)反應大約1小時，形成咪唑酯(Ⅲ)(imidazolidate)。在加入過量無機焦磷酸鹽(Ⅳ)之前，用甲醇使未反應的1,1＇-羰基咪唑分解。這消除了無機焦磷酸鹽的形成，該焦磷酸鹽將隨后從反應材料中被除去。在加入無機焦磷酸鹽(Ⅳ)后大約24小時完成磷酰化反應，然后利用DEAE-纖維素的陰離子交換色譜純化核苷三磷酸酯(Ⅴ)產物，接著將產物轉變成鹽如鈉鹽。由于核苷酸(Ⅰ)和咪唑酯(Ⅲ)可在一起反應形成對稱的焦磷酸鹽副產物，所以DEAE-纖維素的陰離子交換色譜應當在更低pH的條件下進行，其中所需產物(Ⅴ)具有比無需副產物更少的電荷，這樣將可以分離這兩種化合物。
用于合成的一種試劑是三丁基銨焦磷酸鹽，該焦磷酸鹽可由下列步驟制備向焦磷酸吡啶鎓水溶液(通過將焦磷酸四鈉十水合物溶液(446ml,1mmol)經過Dowex 50W-X4TM(吡啶鎓)樹脂(17ml)柱制得)中加入三丁胺(0.24ml,1mmol)。真空濃縮溶液，然后通過連續加入并蒸發無水吡啶而干燥殘留物，接著再加入并蒸發兩份10mlN,N-二甲基甲酰胺(DMF)。
核苷三磷酸酯的合成是通過下述方法完成的。向于1ml DMF中的作為無水三丁銨鹽的單低聚核苷酸(0.1mmol)溶液或懸浮液中加入于1mlDMF中的1,1＇-羰基二咪唑(80mg,0.5mmol)。混合組合物30分鐘，然后將其置入室溫下的干燥器中4-12小時，接著用33μl(0.8mmol)甲醇處理并在室溫下反應30分鐘。加入于5ml DMF中的焦磷酸三丁銨(0.5mmol)，劇烈攪拌，然后將混合物置入室溫下的干燥器中大約24小時，使焦磷酸咪唑鎓沉淀。分離沉淀物；通過離心和在DMF中再懸浮，利用4份1ml DMF洗滌，得到大約80-100％的純度。利用等體積的甲醇處理上清液，真空蒸發至干。殘留物在2×20cm含線性梯度碳酸氫三丁銨(梯度為約0至0.4M、pH 5-7.5的3L溶液)的DEAE-纖維素柱上色譜純化，收集餾分，通過分光光度測定來鑒定含核苷三磷酸酯的餾分。真空蒸發適當的餾分，將核苷三磷酸酯三乙銨溶解在甲醇中，至約0.05M的濃度，加入5體積的高氯酸鈉丙酮溶液(15當量)，形成核苷三磷酸酯的鈉鹽沉淀。對于本領域技術人員應當理解，利用適當的沉淀反應，可制得核苷三磷酸酯的其它鹽。通過離心收集沉淀的鹽，用4份1ml丙酮洗滌，用五氧化磷在真空下干燥。
合成核苷三磷酸酯的其它方法是可以得到的，包括下列實施例中所述的方法。實施例2利用2,2,2-三溴乙基偶磷嗎啉代氯化物合成核苷一-、二-和三磷酸酯基本上利用van Boom等人的方法(Trtrehedron Lett 32:2779-2782,1975)，由單個中間體制備核糖核苷及其衍生物的一-、二-和三磷酸酯。一般地，該反應包括將單官能團試劑(2,2,2-三溴乙基偶磷嗎啉代氯化物)與核糖核苷(或其衍生物)反應，生成具有與核糖核苷相連的2,2,2-三溴乙基保護基團的磷酸三酯衍生物(即制備核糖核苷5＇-磷酸嗎啉酯(phosphomorpholidate)或核糖核苷5＇-磷酸嗎啉酯衍生物)。利用酸性解封和中和，由Cu/Zn偶合反應除去保護基團，根據解封步驟中所使用的酸以及在中和步驟中所使用的銨鹽，生成一-、二-和三磷酸酯。也就是說，為了獲得一磷酸酯核糖核苷，可使用HCl和氨；為了獲得二磷酸酯核糖核苷，可使用磷酸的一(三正丁基銨)鹽；為了獲得三磷酸酯核糖核苷，可使用雙(三正丁基銨)焦磷酸鹽。
一般的反應如下列所示
單官能團試劑(Ⅰ)2,2,2-三溴乙基偶磷嗎啉代氯化物可由下列步驟制得在無水乙醚中將2,2,2-三溴乙基偶磷二氯化物與嗎啉反應；利用本領域眾所周知的方法，分離所得反應產物并使用環己烷/正戊烷重結晶。晶體2,2,2-三溴乙基偶磷嗎啉代氯化物的熔點為79℃。
在20℃下，于無水吡啶中將單官能團試劑(2mmol)與1mmol核苷或其衍生物混合48小時；然后通過色譜純化級分反應混合物(B.JHunt & W.Rigby,Chem&Ind.1868,1967)，得到無色核苷固體(Ⅲ)。于20℃，在無水DMF中利用Cu/Zn電偶處理核苷酸10分鐘，接著過濾以除去過量的Cu/Zn，得到核苷磷酸嗎啉酯(phosphoromorphlidate)。
然后利用不同的酸和氨源處理核苷磷酸嗎啉酯，得到一-、二-或三磷酸酯。對于一磷酸酯，可利用0.01N HCl、pH2在20℃下處理磷酸嗎啉酯2小時，然后用氨水(pH9)中和并在Sephadex G-25TM柱上純化。
類似地，核苷5＇-三磷酸酯可通過下列方法獲得在沒有水分的條件下，將于2ml無水DMF中的磷酸嗎啉酯(0.1mmol)與于2ml無水DMF中的0.5mmol雙(三正丁銨)焦磷酸在20℃下反應3小時。將反應產物在真空下濃縮，利用Dowex 50TM(銨形式)處理；利用3L線性梯度0.0至0.3M Et2NH2CO3溶液，在2×25cm DEAE纖維素柱上純化。
核苷5＇-二磷酸酯可通過下列方法獲得在沒有水分的條件下，于4ml無水吡啶中，將磷酸嗎啉酯(0.1mmol)與0.6mmol一(三正丁銨)磷酸在20℃下反應3小時，反應產物進行類似的濃縮和純化。另外，在含一(三正丁銨)磷酸的吡啶溶液中，利用Zn粉處理，可將磷酸三酯衍生物(Ⅲ)直接轉變成相應的核苷二磷酸酯。也就是，在沒有水分的條件下，將1nmol試劑Ⅲ加入到攪拌著的含0.1g細分散Zn粉和12mmol一(三正丁銨)磷酸的15ml無水吡啶溶液中，在20℃下反應48小時。然后將反應混合物離心使Zn成丸狀，利用每步15ml水共蒸上清液三次，然后在DEAE纖維素上純化。實施例3合成7-脫氮嘌呤2＇-脫氧核糖核苷三磷酸酯(1)合成7-脫氮-2＇-脫氧肌苷5＇-三磷酸酯三乙基銨鹽。將7-脫氮-2＇-脫氧肌苷(25mg,0.1mmol)溶解在磷酸三甲酯(250μl,1.07mmol)中，加入POCl3(18.5μl,0.2mmol)。將混合物在0℃下攪拌1.5小時，然后加入于1ml無水DMF和1ml三-正丁胺中的0.5M雙(三正丁銨)焦磷酸混合物，劇烈攪拌1分鐘；利用1M Et2NH2CO3水溶液中和至pH7，真空蒸發至干。利用線性梯度Et2NH2CO3、pH7(11H2O/110.7MTBK)溶液，在2.6×30cm DEAE-Sephadex柱上純化殘留物，得到無色固體，UV(H2O)λmax為258nm。
(2)合成7-脫氮-2＇-脫氧腺苷5＇-三磷酸酯三乙基銨鹽。由7-脫氮-2＇-脫氧腺苷，可類似地制得該化合物，得到無色固體，UV(H2O)λmax為270nm。
(3)合成7-脫氮-2＇-脫氧鳥苷5＇-三磷酸酯三乙基銨鹽。由7-脫氮-2＇-脫氧鳥苷，可類似地制得該化合物，得到無色固體，UV(H2O)λmax為259nm。實施例4合成2-氯脫氧-3腺苷二氧磷基亞甲基二膦酸酯(2CdAPMDP)核苷多磷酸酯已經被合成過，其中核苷三磷酸酯如脫氧腺苷三磷酸酯中β,γ-磷原子之間的原子被不是氧原子的原子替代(T.C.Myers等人，Phosphonic analogues of nncleoside phosphate.I.The synthesis of 5＇-adenylyl methylene diphosphoaate,a phosphonic analogue of ATP.J.Am.Chem.Soc.85:3292-3295,1963；R.G.Yount,ATP analogues Adv Enzymol43:1-56,1975)。這種替代得到了存在于核苷磷酸酯分子中的比P-O鍵更強的鍵。
合成基本上是按照Myers等人描述的方法1或方法2進行的(J.Am.Chem.Soc.85:3292-3295,1963)。在方法1中，2-氯脫氧腺苷5＇-氨基磷酸酯與亞甲基二膦酸反應，生成核苷多磷酸酯的膦酸類似物。另外，利用方法2，使用二環己基碳化二亞胺(DCC)為縮合劑，使2-氯脫氧腺苷一磷酸酯與亞甲基二膦酸反應。
根據方法1，亞甲基二膦酸是通過在濃HCl中水解其四乙酯獲得的，其中四乙酯是通過二碘甲烷與過量的亞磷酸三乙酯反應制得的。利用54ml新蒸鄰氯苯酚處理1,3-二環己基鈲腺苷5＇-氨基磷酸酯(3.6mmol)和亞甲基二膦酸(10.8mmol)；用冰冷卻混合物，加入36ml無水吡啶。在不時振蕩下，將所得溶液在室溫下放置48小時，在冰冷下加入300ml水。利用乙醚提取溶液6次(共850ml)。用1N HCl調節水溶液至pH2，然后用30g酸洗木炭(Norit A)處理并攪拌30分鐘；然后過濾收集木炭，用水(共5L)徹底地洗滌。核苷衍生物由50％水合乙醇-5％的濃縮氫氧化銨(共3L)洗脫，通過在35℃下蒸發，將洗脫液濃縮至400ml體積。濃縮的洗脫液應用于2.7cm×31cm Dowex-2TM(氯化物；8％交聯)柱上；用由混合2L 0.003N HCl(在混合器中)和2L 0.003N HCl和0.45N LiCl(在儲存器中)制得的線性梯度溶液洗脫；收集10ml的餾分；用本領域熟知的方法，利用紙色譜或紫外吸收，鑒定含有2-氯脫氧腺苷-二氧磷基亞甲基二膦酸酯(2CdAPMDP)的餾分。利用1N LiOH中和含2CdATMDP的餾分并在30℃下蒸發濃縮；用250ml丙酮-10％甲醇處理濃縮的溶液，沉淀出固體；通過離心分離該固體，用丙酮-10％甲醇混合物洗滌，直至在洗滌液中檢測不出氯化物為止。2CdATMDP鋰鹽可進一步純化將鹽溶解在100ml用LiOH調節至pH8的水中，利用上述的方法，通過Dowex-2TM柱色譜純化該溶液，在混合室中利用1.5L0.003N HCl梯度溶液洗脫，而在儲存器中利用由1.5L0.003N HCl和0.45N LiCl組成的溶液洗脫；如上述方法處理洗脫液，接著將沉淀溶解在6ml水中，用40ml甲醇將其沉淀。將最終的沉淀物溶解在15ml水中并凍干，得到2CdATMDP四鋰鹽粉末。
利用方法2，將亞甲基二膦酸(11.4mmol)和2-氯脫氧腺苷膦酸酯(2.6mmol)溶解在吡啶(30ml)和水(4ml)中，生成兩相混合物；于室溫劇烈攪拌下在3份等分試樣(反應開始時為29mmol,4小時后為48mmol，以及12小時后為19mmol)加入DCC。24小時后反應完成，濾出沉淀的二環己基脲，用水洗滌。用水將濾液和洗滌液的體積調節至總體積150ml，用乙醚提取5次(共300ml)。將溶液調節至pH 8，在2.5cm×17.5cm Dowex-lTM(甲酸鹽，2％交聯)柱上色譜純化；用1.5 L水洗滌該柱以除去吡啶。通過不斷向混合室中加入含500ml水的下列溶液獲得的梯度溶液洗脫該柱4N甲酸(500ml)、4N甲酸加上0.1M甲酸銨(500ml)和4N甲酸加上0.2M甲酸銨(1500ml)，收集15ml餾分。通過本領域熟知的方法，利用紫外吸收鑒定含有2CdATMDP(大約在試管115-134中)的餾分。將合并的含2CdATMDP的餾分凍干至體積大約為200ml，然后用7g酸洗木炭(Norit A)處理并攪拌15分鐘；過濾收集木炭，用水(共800ml)洗滌。產物用50％水合乙醇-5％濃縮氫氧化銨(共600ml)冼脫，通過在20℃下蒸發將洗脫液濃縮至200ml的體積，過濾除去痕量木炭并凍干成粉末。將粉末溶解在4ml水中，利用過量的1M乙酸鋇處理溶液；通過離心收集所得沉淀，用水洗滌并在0℃下溶解于0.1N HBr中。利用1N NaOH調節溶液至pH6.5，通過離心收集所得沉淀，各用2×2ml水、乙醇和乙醚順序地洗滌。在室溫下用P2O4干燥樣品12小時，得到二鋇2CdATMDP水合物。本發明的其它核苷類似物二氧磷基亞甲基二膦酸酯可類似地制得。實施例5利用EFAD小鼠模型，應用具有抗增生作用的磷酸酯基本上根據實施例2描述的方法制備抗增生核苷類似物的一-、二-和三磷酸酯。正如上文描述，這些化合物各自可形成局部用聚乙烯膏，所述膏含有在丙二醇膏中的0.001gm％至10gm％活性成分、聚乙二醇400和聚乙二醇3350，從而形成膏劑混合物。也可制得含有增強皮膚滲透性成分(如二甲基亞砜或AzoneTM)的類似制劑。
在6小時至5天時間內，以6小時時間間隔，將10μl等分試樣的組合物應用于EFAD無毛小鼠的背側。在每次時間間隔結束時，殺死一只小鼠并切除治療過的組織，將其置于含3H-胸苷脫氧核糖的組織培養基中，進行2小時脈沖標記，從而測定一-、二-和三磷酸酯對皮膚細胞增生的作用。然后利用常規方法從組織中分離出DNA，通過確定所分離的DNA中的放射性(cpm/μgDNA)測定3H-胸苷脫氧核糖向DNA中的摻入。
用于抑制增生的治療牛皮癬組合物的一-、二-和三磷酸酯的效力是通過比較向未治療組織的DNA中放射性摻入與向經不同治牛皮癬藥的制劑治療過的組織的DNA中放射性的摻入而確定的。
用于各試驗皮膚活組織檢查的活性成分的總量是通過所應用的膏劑中活性成分的gm％和小鼠皮膚測定前的給藥次數確定的。對于每次實驗的時間點，通過使用相同小鼠的腹側皮膚測定相應未治療的時間點。3H-胸苷脫氧核糖向背側皮膚DNA和對照腹側皮膚中的摻入的差異被用來計算作為各次給藥的磷酸酯總量函數的細胞增生的總抑制(百分數)。
3H-摻入的結果也可用于確定作為各單個試驗組合物的時間的函數的抑制百分數(比較背側皮膚和腹側皮膚的摻入)。
作為時間的函數和作為給藥活性成分總量的函數，向相應于用磷酸酯治療的背側皮膚的DNA中的3H-摻入遠遠低于向相應未治療腹側皮膚的DNA中的3H-摻入。實施例6應用二脫氧胞苷三磷酸酯抑制小鼠模型中的多胺生物合成多胺生物合成抑制測定是通過測定在利用佛波醇酯12-O-十四酰基佛波醇-13-乙酸酯(TPA；用于增加ODC活性)進行治療之前對小鼠皮膚局部應用二脫氧胞苷三磷酸酯后存在于表皮細胞中的鳥氨酸脫羧酶(ODC)的量而進行的。
簡言之，無胸腺光禿小鼠或EFAD小鼠可利用TPA溶液局部治療，所述TPA溶液可增加表皮組織中的ODC水平并模擬通常存在于與牛皮癬有關的增生中的這種酶的水平升高。在TPA治療后30分鐘至1小時內，將含有作為活性成分的二脫氧胞苷三磷酸酯和用于增強皮膚滲透性的0.01％DMSO的膏劑應用于TPA處理過的皮膚區域。膏劑含有基本上根據實施例2中的方法制得的二脫氧胞苷三磷酸酯，該膏劑是在濃度為5gm％、于可藥用膏中制備的，以20μl的等分試樣應用于皮膚；另外的等分試樣在6小時內每小時應用一次，共應用6次。在6小時之后，利用本領域公知的技術測定皮膚中的ODC水平(J.Lesiewicz等人，Modelsin Dermatology,vol.2(H.I.Maibach&N.J.Lowe,eds.),1985,pp112-116)。作為對照，測驗無胸腺光禿小鼠的未治療皮膚，以確定正常的ODC水平；測驗利用TPA治療過的無胸腺光禿小鼠的皮膚，以確定施用TPA后ODC水平的升高。為了進一步對照，正常和TPA治療過的皮膚同時利用含有DMSO但不含有二脫氧胞苷三磷酸酯的膏劑進行治療。
將利用TPA和含二脫氧胞苷三磷酸酯膏劑治療的皮膚中的ODC水平與正常皮膚的ODC水平以及與利用TPA治療過的皮膚中的ODC水平進行比較。二脫氧胞苷三磷酸酯治療的效力是通過相對于TPA治療皮膚的ODC水平的降低以及通過相對于正常皮膚中的ODC水平而確定的。在利用含二脫氧胞苷三磷酸酯的膏劑進行治療之后，其ODC水平相對于只經過TPA治療而沒有接受膏劑治療或接受不含二脫氧胞苷三磷酸酯活性成分的膏劑治療的ODC水平顯著地降低了。
本領域技術人員可以理解，類似的治療以及利用其它二脫氧核苷磷酸酯進行治療的效力分析可被類似地確定。這些二脫氧核苷磷酸酯包括二脫氧胸苷、二脫氧鳥苷、二脫氧腺苷、二脫氧肌苷和包括疊氮二脫氧胸苷(AZT)和二脫氧二脫水胸苷的二脫氧核苷類似物的一-、二-和三磷酸酯。實施例7利用移植有牛皮癬人皮膚的小鼠，應用具有治療增生作用的5-氟脫氧尿苷和5-氟尿苷的磷酸酯當局部應用于移植到無胸腺小鼠上的人牛皮癬皮膚時，將皮膚活組織檢查用于檢測5-氟脫氧尿苷三磷酸酯和5-氟尿苷三磷酸酯的抗增生作用。利用本領域公知的技術，將直徑大約為1-10mm的人牛皮癬皮膚移植到無胸腺小鼠的背側。在移植物充分愈合后，利用含有活性成分為5-氟脫氧尿苷三磷酸酯、5-氟尿苷三磷酸酯或其一-或二磷酸酯的治牛皮癬藥治療患有牛皮癬的人皮膚。這些化合物基本上是根據實施例1描述的方法制得的。藥物組合物是通過包括存在于如早期文獻公開的局部用聚乙烯膏中的活性成分且活性成分的濃度為0.1gm％至10gm％而制得的。在1-15天內、以6小時時間間隔，將含有活性成分的膏劑以20μl等分試樣應用于移植的皮膚部分。在每隔24小時治療階段后，檢查治療的皮膚以確定牛皮癬的粗略標記(皮膚的剝落和炎癥的紅腫)。在15天后，將皮膚從小鼠中分離開來；利用常規的組織學技術，通過顯微觀測，由活組織檢查確定表皮細胞層的數量和皮膚內的毛細管膨脹的相對程度。
將表皮細胞層的數量與已移植到無胸腺光禿小鼠上的類似檢測的正常和未治療人牛皮癬皮膚進行比較，確定利用含5-氟脫氧尿苷三磷酸酯和5-氟尿苷三磷酸酯的藥物組合物進行治療的效果。通過在適當染色條件下確定表皮毛細管中中性白細胞和單核白細胞的數量，可進行組織中炎癥相對程度的定量。相對于未治療牛皮癬皮膚和正常對照皮膚的毛細管相對膨脹程度是可以察覺的。
表皮中細胞層的數量、炎癥的程度和毛細管膨脹程度是與治療的天數以及由組合物濃度和給藥量確定的活性成分的量相對應的。相對于未治療的牛皮癬皮膚，含有5-氟脫氧尿苷三磷酸酯、5-氟尿苷三磷酸酯或其一-或二磷酸酯的組合物均顯示出牛皮癬癥狀的顯著降低。實施例8在患有牛皮癬的人皮膚上應用具有治療增生作用的7-脫氮嘌呤2＇-脫氧核糖核苷三磷酸酯利用包括基本上如實施例3所述合成的7-脫氮-2＇-脫氧肌苷5＇-三磷酸酯的三乙基銨鹽作為活性成分的膏組合物，對在兩個前臂上具有牛皮癬剝落皮膚斑的自愿者進行治療。在可藥用膏劑如早期文獻中公開的聚乙二醇膏劑中的活性成分的濃度為50gm％。
肉眼檢查兩臂皮膚上的剝落和炎癥，在利用含7-脫氮-2＇-脫氧肌苷5＇-三磷酸酯的膏進行治療之前記錄結果(書面觀察報告和照片)。在14天的時間內、以6小時間隔，將一或兩滴膏劑應用于其中一個前臂上的大約直徑為3cm的牛皮癬皮膚區域。另一個前臂在14天期間內保持不治療。
在14天內，每天用肉眼檢查兩臂上皮膚的剝落和炎癥，記錄結果進行兩側成對比較。如果自愿者具有足夠量的牛皮癬斑，可同時測驗含有濃度為50gm％的7-脫氮-2＇-脫氧腺苷5＇-三磷酸酯和7-脫氮-2＇-脫氧鳥苷5＇-三磷酸酯的三乙基銨鹽的類似組合物治療牛皮癬的活性。
在14天的最后，如實施例7中描述的方法，使用常規組織學方法取出1-2mm直徑的真皮和表皮部分進行活組織檢查和顯微檢查(確定表皮中細胞層的數量、真皮中的炎癥程度和毛細管膨脹程度)。從未治療手臂的牛皮癬皮膚中取出皮膚作為負面對照，從未治療手臂中取出正常皮膚作為正面對照，從利用含有7-脫氮嘌呤-2′-脫氧核糖核苷三磷酸酯的膏劑治療過的區域取出皮膚作為確定相對于對照樣品的活性成分的效力。
在相同自愿者上進行的治療牛皮癬皮膚和未治療牛皮癬皮膚的兩側成對區域的肉眼觀測表明在14天內，利用7-脫氮嘌呤-2′-脫氧核糖核苷三磷酸酯治療的皮膚中的牛皮癬癥狀顯著降低。肉眼觀測的結果得到了由治療和未治療區域取出的皮膚的顯微檢查的支持。類似地，一-和二磷酸酯也顯示出了活性。實施例9在剝落皮膚小鼠的皮膚上應用具有治療增生作用的2-氯脫氧腺苷磷酸酯利用含有基本上是如實施例2所述的方法制得的作為活性成分的2-氯脫氧腺苷的一-、二-或三磷酸酯的藥物組合物治療顯示出具有炎癥性表皮牛皮癬的年齡為35-42天的近交fsn/fsn小鼠。該組合物含有濃度為5gm％的一-、二-或三磷酸酯活性成分。將組合物以5μl等分試樣、以12小時時間間隔應用于fsn/fsn小鼠的腹側皮膚的1-5mm部分；對照fsn/fsn小鼠也類似地用不含活性成分的組合物治療。在第一次給藥12小時后開始每天粗略地和顯微地觀測皮膚，延續至15天之后。利用常規的皮膚學和組織學方法，將觀測結果用于確定牛皮癬皮膚出現的表皮增生程度和炎癥特征。
對于治療后的每個觀測點，治療皮膚與未治療相同小鼠的類似部分以及與僅用載體成分而不用2-氯脫氧腺苷的一-、二-或三磷酸酯進行治療的皮膚進行比較。數日后可觀測到與未治療的皮膚或經不含活性成分的組合物進行治療的皮膚相比，利用含有2-氯脫氧腺苷的一-、二-或三磷酸酯的組合物進行治療的皮膚部分的炎癥和剝落顯著改善。
通過利用含有2-氯-2′-氟阿糖脫氧腺苷的一-、二-或三磷酸酯作為活性成分的組合物進行治療的fsn/fsn小鼠，可進行類似的分析。在14天內使用這些組合物，可觀測到類似的牛皮癬癥狀減少。實施例10在牛皮癬人皮膚上應用具有治療增生作用的6-氮雜尿苷三磷酸酯利用包括基本上如實施例1所述合成的6-氮雜尿苷三磷酸酯作為活性成分的膏劑，對在手臂和腿上具有牛皮癬皮膚斑的自愿者進行治療。在可藥用膏劑如聚乙二醇基膏劑中的活性成分的濃度為25gm％。
肉眼檢查手臂和腿皮膚上的剝落和炎癥，在利用含6-氮雜尿苷三磷酸酯的膏劑進行治療之前記錄觀察結果(書面觀察報告和照片)。在14天的時間內、以3小時間隔，將各為50μl的定量等分試樣應用于其中一個手臂上和其中一條腿上的直徑約為5-10cm的牛皮癬皮膚區域。作為負面對照，另一個手臂和腿在14天期間內保持不治療。
在14天內，每天用肉眼檢查兩臂和兩腿上皮膚的剝落和炎癥，記錄結果進行兩側成對比較。
在14天的最后，如實施例7中描述的方法，利用常規組織學方法取出1-2mm直徑的皮膚(真皮和表皮)部分進行活組織檢查和顯微檢查，確定表皮中的細胞層數量、真皮中的炎癥程度和毛細管膨脹程度。從未治療區域和/或腿的牛皮癬皮膚中取出皮膚作為負面對照，從未治療區域中取出正常皮膚作為正面對照，從利用含有6-氮雜尿苷三磷酸酯的膏劑治療過的區域取出皮膚以確定相對于對照樣品的活性成分的效力。
在相同自愿者上進行的治療牛皮癬皮膚和未治療牛皮癬皮膚的兩側成對區域的肉眼觀測表明在14天內，利用6-氮雜尿苷三磷酸酯治療的皮膚中的牛皮癬癥狀顯著降低。肉眼觀測的結果得到了由治療和未治療區域取出的皮膚的顯微檢查的支持。6-氮雜尿苷的一-和二磷酸酯也可獲得類似的結果。實施例11利用2-氯脫氧腺苷二氧磷基亞甲基二膦酸酯(2CdATMDP)治療人牛皮癬皮膚將移植到無胸腺光禿小鼠上的人牛皮癬皮膚用于檢測局部應用時的2CdATMDP的治療增生的作用。將肉眼觀測和顯微鏡皮膚活組織檢查分析用于檢測治療牛皮癬組合物的效力。
利用本領域熟知的技術，將直徑大約為1-10mm的人牛皮癬皮膚移植到無胸腺小鼠的背側上。在移植物充分愈合后，利用含有活性成分核苷類似物2CdATMDP(基本上由實施例4描述的方法制得)的治療牛皮癬藥物治療患有牛皮癬的人皮膚。藥物組合物包括存在于基本上如早期文獻公開的局部用聚乙烯膏中的活性成分且活性成分的濃度為約0.5gm％至5gm％。在1-30天內、以12小時時間間隔，將含有活性成分的膏劑以10μl等分試樣應用于移植的皮膚部分。在每隔24小時治療階段中，檢查治療的皮膚以確定牛皮癬的粗略指示(如剝落和炎癥)。在15天和30天時，將皮膚從小鼠的移植區域分離開來；利用常規的組織學分析確定表皮細胞層的數量和皮膚真皮內的毛細管膨脹的相對程度。
將表皮細胞層的數量與已移植到無胸腺光禿小鼠上的類似檢測的正常和未治療人牛皮癬皮膚進行比較，確定利用含2CdATMDP的藥物組合物進行治療的效果。除了毛細管膨脹的相對程度，通過確定相對于未治療牛皮癬皮膚和正常對照皮膚的真皮毛細管中中性白細胞和單核白細胞的數量，可進行組織中炎癥的定量。
表皮中細胞層的數量、炎癥的程度和毛細管膨脹程度與治療的天數以及(由組合物濃度和給藥量確定的)活性成分的量相關。在整個治療階段以后，與移植到無胸腺光禿小鼠中的未治療對照牛皮癬皮膚相比，在治療的移植牛皮癬皮膚中可觀測到炎癥和剝落的顯著降低。
利用包含核苷類似物2CdATMDP的藥物組合物，對在兩個前臂上具有牛皮癬皮膚斑的自愿者的一個前臂類似地進行治療，每天兩次(每次治療使用50μl)。每天觀測與另一個前臂對照區域(未治療皮膚或利用不合活性成分的膏狀制劑進行治療的皮膚)相比的治療牛皮癬皮膚的病情，在第15天和第30天取出直徑為約1-3mm的皮膚活組織，按照上文描述的用于小鼠模型的標準組織學分析進行檢測。15天后，與未治療皮膚或利用只是制劑的惰性混合物而無活性成分進行治療的皮膚相比，利用含2CdATMDP的組合物進行治療過的皮膚上觀測到的炎癥減輕。30天后，與另一前臂的皮膚對照斑相比，利用含活性成分的組合物治療的皮膚中觀測到的炎癥和剝落顯著地改變。實施例12利用2-氯-2＇-氟阿糖脫氧腺苷磷酸酯治療人的局部皮炎基本上如實施例2所述的方法合成2-氯-2＇-氟阿糖脫氧腺苷的一-、二-或三磷酸酯。利用含有各濃度為5gm％的2-氯-2＇-氟阿糖脫氧腺苷的一-、二-和三磷酸酯的混合物的洗液組合物治療患有局部皮炎的青春期患者；該局部皮炎未知原因，以在拳頭和脖子上極度瘙癢和濕疹損傷為特征。該洗液應用于皮膚的感染區域，每天可應用多達12次，每次約1-3cc。經1-4周治療后，相對于患者開始出現時，隨皮炎的皮膚瘙癢和炎癥顯著降低。進一步地，在治療之后，治療皮膚上的濕疹損傷正將愈合或已經愈合。由此，該洗液只有在瘙癢復發時才需使用。實施例13利用二脫氧核苷磷酸酯治療扁平苔癬基本上如實施例2所述的方法合成二脫氧胞苷的一-、二-或三磷酸酯。將各二脫氧胞苷的磷酸酯配制成濃度為0.5gm％的基于聚乙二醇的膏劑組合物。將患有以其手臂和腿上具有丘疹炎癥和瘙癢性皮疹為特征的慢性扁平苔癬的自愿者分成三組，每組用一種組合物治療二脫氧胞苷的一-、二-或三磷酸酯。每組使用膏劑僅在一個手臂或腿上應用，留下另一個手臂或腿不進行治療，以進行與治療皮膚的兩側對照。在7天至3個月期間，每約6小時間隔應用大約1cc體積的膏劑。每天用肉眼檢查治療和未治療的區域兩周，之后至少每周檢查一次或根據需要檢查(由治療的醫生確定)。當炎癥和/或丘疹形成似乎減少時，治療醫生還可根據需要減少每天的應用次數，以維持控制疾病。
當治療區域的炎癥似乎減少且瘙癢性皮疹似乎減少時，從自愿者的感染區域的治療肢體和未治療肢體中取出皮膚活組織(大約1-3mm)進行炎癥(如真皮毛細管膨脹)和丘疹特征(如表皮層的數量以及與丘疹有關的帶白色的線或點的跡象)的組織學檢查。
對于這三組中的每一組，與對應未治療肢體的皮膚相比，該組的一些成員在其治療手臂或腿的皮膚上的扁平苔癬的炎癥和瘙癢性皮疹中顯示出了顯著的改善。
本領域技術人員可以理解，本發明的其它核苷磷酸酯類似物以及包括二脫氧胸苷、二脫氧鳥苷、二脫氧腺苷、二脫氧肌苷和二脫氧核苷類似物(包括ATZ和d4T)的二脫氧化合物的類似磷酸酯可類似地用于藥物組合物中。實施例14利用阿昔洛韋磷酸酯治療光化性角化病基本上如實施例1所述合成阿昔洛韋三磷酸酯。利用本領域熟知的方法制備膏劑組合物，該組合物含有0.1-0.5gm％阿昔洛韋三磷酸酯及能夠增強皮膚滲透性的約0.01gm％AzoneTM。
將一組在暴露在太陽下的皮膚(如在鼻、手、臂或腿上)上具有光化性角化病斑的中年人自愿者分成三組一組利用液氮冷凍光化性角化病而殺死細胞；一組利用阿昔洛韋三磷酸酯組合物進行治療；一組為對照組，利用含有惰性成分和AzoneTM而不含有阿昔洛韋三磷酸酯的組合物進行治療。
在多達一個月的時間內，利用含有或不含有阿昔洛韋三磷酸酯的膏劑組合物治療的組每天涂敷膏劑兩次(早晨和晚上)，給藥體積足以覆蓋感染區域(大約0.01-0.5cc)。由臨床醫生每隔一天用肉眼檢查每組治療的皮膚并記錄觀測結果(書面和照片)。治療后，自愿者每隔6個月被檢查治療區域光化性角化病的復發情況。
對于利用含阿昔洛韋三磷酸酯的膏劑治療的組而言，大量患者顯示出角化生長的降低，在治療一個月后感染區域的紅腫減弱。臨床醫生可根據6個月的檢查確定是否需要繼續治療。本領域技術人員應當理解，阿昔洛韋的一-和二磷酸酯也可用于類似的藥物制劑中，而且更昔洛韋或本發明的其它抗增生核苷類似物的一-、二-和三磷酸酯也可用于治療與增生過度有關的皮膚病的具有抗增生活性的組合物中。
對于利用不含阿昔洛韋三磷酸酯的膏劑治療的組而言，1個月后觀測光化性角化病無任何變化，然后將感染區域利用臨床可接受的方法除去。
對于利用液氮冷凍光化性角化病的組而言，所有治療區域的細胞在24小時內全部死亡，接著形成了死亡細胞的腐肉，而且在愈合過程中伴隨疼痛。在有些情況下，在治療區域見到疤痕。
權利要求
1．一種治療以皮膚細胞增生過度為特征的疾病的方法，該方法包括對疾病的皮膚或粘膜損害局部施用含有作為活性成分的具有下式的核苷類似物磷酸酯或其可藥用鹽
其中N為具有抗增生活性的核苷類似物；Z為O或S或NH；以及n為1、2或3。
2．一種治療以皮膚細胞增生過度為特征的疾病的方法，該方法包括對疾病的皮膚或粘膜損害局部施用含有作為活性成分的具有下式的核苷類似物磷酸酯或其可藥用鹽
其中N為具有抗增生活性的核苷或核苷類似物；X為O或CH2或S；Z為O或S或NH；以及n為1或2。
3．權利要求1或2的方法，其中所述核苷或核苷類似物選自阿糖胞苷、阿糖鳥苷(guanosine arabinoside)、5-氟脫氧尿苷、5-氟尿苷、6-氮雜尿苷、2-氯脫氧腺苷、2-氯-2＇-氟阿糖脫氧腺苷、2-氟阿糖脫氧腺苷、6-甲基巰基嘌呤核苷、二脫氧胞苷、二脫氧胸苷、二脫氧鳥苷、二脫氧肌苷、二脫氧腺苷、2＇-脫氧殺結核菌素、2＇-脫氧間型霉素、2＇-脫氧-(3,4-d)嘧啶、阿昔洛韋和更昔洛韋。
4．權利要求1或2的方法，其中所述疾病選自牛皮癬、特應性皮炎、扁平苔癬、光化性角化病、基底細胞癌和鱗狀細胞癌。
5．權利要求4的方法，其中所述疾病為牛皮癬。
6．權利要求1或2的方法，其中組合物中的活性成分濃度為0.001gm％至100gm％。
7．權利要求1或2的方法，其中組合物中的活性成分濃度為0.01gm％至10gm％。
8．權利要求1或2的方法，其中組合物中的活性成分濃度為0.1gm％至5gm％。
9．根權利要求1或2的方法，其中組合物被應用于皮膚區域，每天應用1至10次，每次劑量為0 001gm％至100gm％。
10．權利要求1或2的方法，其中組合物被應用于皮膚區域，每天應用1至10次，每次劑量為0.01gm％至10gm％。
11．權利要求1或2的方法，其中組合物被應用于皮膚區域，每天應用1至10次，每次劑量為0.1gm％至5gm％。
12．一種藥物組合物，該組合物含有作為活性成分的具有下式的核苷類似物磷酸酯或其可藥用鹽
其中N為具有抗增生活性的核苷類似物；Z為O或S或NH；以及n為1、2或3。
13．一種藥物組合物，該組合物含有作為活性成分的具有下式的核苷類似物磷酸酯或其可藥用鹽
其中N為具有抗增生活性的核苷或核苷類似物；X為O或CH2或S；Z為O或S或NH；以及n為1或2。
14．權利要求10或11的藥物組合物，該組合物還含有丙二醇、聚乙二醇400和聚乙二醇3350。
15．權利要求10或11的藥物組合物，該組合物還含有在局部給藥期間增強皮膚滲透性的成分。
16．權利要求10或11的藥物組合物，其中所述核苷類似物選自阿糖胞苷、阿糖鳥苷、5-氟脫氧尿苷、5-氟尿苷、6-氮雜尿苷、2-氯脫氧腺苷、2-氯-2＇-氟阿糖脫氧腺苷、2-氟阿糖脫氧腺苷、6-甲基巰基嘌呤核苷、二脫氧胞苷、二脫氧胸苷、二脫氧鳥苷、二脫氧肌苷、二脫氧腺苷、2＇-脫氧殺結核菌素、2＇-脫氧間型霉素、2＇-脫氧-(3,4-d)嘧啶、阿昔洛韋和更昔洛韋。
17．權利要求10-14中任意一項的藥物組合物，其中活性成分的濃度為0.001gm％至50gm％。
18．權利要求10-14中任意一項的藥物組合物，其中活性成分的濃度為0.01gm％至10gm％。
19．權利要求10-14中任意一項的藥物組合物，其中活性成分的濃度為0.1gm％至5gm％。
20．一種下式的抗增生核苷類似物磷酸酯
其中N為抗增生核苷類似物；Z為S或NH；X為C或S；以及n為1或2。
21．權利要求18的化合物，其中N為2-氯-脫氧腺苷。
22．權利要求19的化合物，其中Z為NH,X為CH2和n=2。
全文摘要
藥物組合物,該組合物含有抗增生核苷類似物、DNA鏈封端的二脫氧核苷類似物及用于局部治療皮膚細胞增生過度疾病包括牛皮癬的其它核苷類似物的一－、二－和三磷酸酯。核苷類似物的有用磷酸酯包括氨基磷酸酯和硫代磷酸酯(phosphothiorate),以及具有C和S橋原子的多磷酸酯。
文檔編號A61K9/06GK1220605SQ96195944
公開日1999年6月23日 申請日期1996年6月6日 優先權日1995年6月7日
發明者卡爾Y·霍斯泰特勒 申請人:卡爾Y·霍斯泰特勒