專利名稱：抗病毒和抗腫瘤的含CpG單鏈脫氧寡核苷酸的制作方法
技術領域：
本發明涉及數種含CpG單鏈脫氧寡核苷酸，特別是涉及對腫瘤性疾病和病毒感染性病疾具有治療作用的含CpG單鏈脫氧寡核苷酸，以及這些含CpG單鏈脫氧寡核苷酸用于制備治療腫瘤性疾病和病毒感染性疾病的藥物的用途。
背景技術：
100多年前，Coley在世界上第一個開展了應用細菌提取物治療細菌感染性疾病的實驗，他得出結論細菌的提取物是一種可以用于治療傳染性疾病的制劑。
1984年，Tokunaga T等發現從卡介苗(BCG)提取的DNA能抑制多種動物腫瘤的生長，具有激活人外周血單個核細胞和小鼠脾臟天然殺傷(NK)細胞的活性，誘導干擾素(IFN)的產生。非脊椎動物的DNA有上述功能，脊椎動物和植物的DNA則不然，這些功能依賴于DNA分子中CpG結構(Tokunaga T，Antitumor activity of deoxyribonucleic acidfraction from Mycobacterium bovis BCG.I.Isolation，physicochemicalcharacterization，and antitumor activity，JNCI，72955.1984)。
CpG是由胞嘧啶和鳥嘌呤通過磷酸連接成的二核苷酸。C代表胞嘧啶，G代表鳥嘌呤，p代表磷酸，胞嘧啶位于5’端。多種具有CpG結構的細菌和病毒DNA對脊椎動物的免疫系統均為危險的信號，可激活多種免疫細胞啟動對細菌和病毒的抵抗機制。近年來的研究表明，人工合成的含一個或多個CpG的寡核苷酸單鏈DNA(CpG ODN)也可表現強效的免疫增強和免疫調節作用。CpG ODN可強力增強B細胞、T細胞、NK細胞、抗原提呈細胞(單核細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞)和中性粒細胞的功能，表現出明顯的臨床應用前景(Weiner GJ，Theimmunobiology and clinical potential of immunostimulatory CpGoligodeoxynucleotides.J Leukoc Biol 2000 Oct；68(4)455-63)。
由于序列，尤其是CpG兩側的序列的不同，CpG ODN可有多種多樣的形式，表現不同性質、不同強度的免疫增強和免疫調節作用。有些CpG ODN可表現出種屬依賴性，即對一種動物表現免疫增強功能的CpGODN，在另一種動物或人則未必表現出同樣的或等效的免疫增強功能(Kamstrup S，et al.Response of porcine peripheral blood mononuclear cellsto CpG-containing oligodeoxynucleotides，Vet Microbiol 2001 Feb 26；78(4)352-62；Gunther Hartmann，et al.Delineation of a CpG PhosphorothioateOligodeoxynucleotide for Activating Primate Immune Responses In Vitro and InVivol The Journal of Immunology，2000，1641617-1624)。
CpG-DNA具有廣泛的免疫調節作用。CpG-DNA作用于TLR-9，對巨噬細胞、樹突狀細胞和B細胞有很強的刺激作用。CpG是細菌感染引起炎癥的重要因子。原發小膠質細胞表達TLR-9 mRNA.在體外CpG-DNA激活小膠質細胞產生TNF-α，IL-12p40，IL-12p70和NO.此外，還可上調MHC II類分子，使B7-1，B7-2和CD40分子上調，吞噬活性增強。腦室內注射CpG-DNA，刺激小膠質細胞表達TNF-α和IL-12p40 tmRNA(Alexander H.Dalpke et al.Immunostimulatory CpG-DNA Activates MurineMicroglia1The Journal of Immunology，2002，1684854-4863)。
PDC和B細胞(而非單核細胞(monocytes))，NK細胞或T細胞是外周血CpG ODN的靶細胞。TLR9是PDC和B細胞識別CpG ODN的受體(Veit Hornung，et al.Quantitative Expression of Toll-Like Receptor 1-10 mRNA in Cellular Subsets of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells andSensitivity to CpG Oligodeoxynucleotides1The Journal of Immunology，2002，1684531-4537)。
在人的外周血單個核細胞中有天然殺傷細胞(NK)。NK是一類無吞噬作用的非粘附性細胞，胞質內有許多嗜苯胺顆粒，是一種起源于骨髓的大顆粒淋巴細胞。具有廣譜的抗腫瘤作用，能殺傷同系、同種及異種的腫瘤細胞，尤其對淋巴瘤和白血病最為有效。
干擾素(interferon，IFN)是最先發現的細胞因子。I型干擾素是一種重要的抗病毒細胞因子。受到病毒感染的細胞可合成和分泌IFN，這些IFN可刺激鄰近的細胞合成抑制RNA及DNA病毒復制的酶類使其進入抗病毒狀態，從而使這些細胞受到保護。

發明內容
發明概述本發明的目的之一是提供系列含CpG單鏈脫氧核苷酸，特別是刺激人天然殺傷細胞活性和誘生α干擾素的含CpG單鏈脫氧核苷酸。它們由含一個或多個CpG的寡核苷酸單鏈DNA分子構成，其磷酸二酯鍵可以是部分硫化的，全部硫化的，也可以是未硫化的。
優選地，本發明的含CpG單鏈脫氧寡核苷酸具有SEQ ID NO1-95所示的序列。
本發明的目的之二是提供本發明的含CpG單鏈脫氧寡核苷酸用于制備治療腫瘤性疾病和病毒感染性疾病的藥物的用途。
另外，需要指出的是，在本申請的上下文的公開內容的基礎上，本發明的其它具有實質性特點的方面和創造性的有益效果對本領域的普通技術人員來說是可以直接推知的。
具體實施例方式
在本發明的上下文中，所使用的術語除非另外說明，一般具有本領域的普通技術人員通常理解的含義。特別地，下列術語具有如下的含義優選地，本發明的含CpG單鏈脫氧寡核苷酸具有如下所示的序列101 5’-TcgTCgAgggCgCCggTgAC-3’102 5’-TCgTCgCCggTgggggTgTg-3’103 5’-TCgTCgTACgCAATTgTCTT-3’104 5’-TCgCCTCgTCgCCTTCgAgC-3’201 5’-TCgCCCACCggTgggggggg-3’202 5’-TCgTCgCAgACCggTCTgggg-3’203 5’-gggggACgTCgCCggggggg-3’
204 5’-ggATCCgTACgCATgggggg-3’205 5’-TCgTCgCggCCggCgCCCCC-3’206 5’-TCgTCgCggCCgCgAggggg-3’301 5’-TCgTCgTTACCgATgACgTCgCCgT-3’302 5’-TCgTCgggTgCgACgTCgCAgggggg-3’303 5’-TCgTCgggTgCgACgATCgTCgggggg-3’304 5’-TCgTCgTTTgCATCgATgCAgTCgTCgTT-3’305 5’-TCgTCgTTTgCATCgATgCAggggggg-3’306 5’-ACCggTATCgATgCCggTgggggg-3’307 5’-ggggTCCATgACgTTCCTgAAgggggg-3’308 5’-TCgTCgTTTTgACgATCgTCgggggg-3’309 5’-TTCgTCgTTTgATCgATgTTCgTTgggggg-3’310 5’-TTCgTCgTTgTgATCgATgggggg-3’311 5’-TATCgATgTTTTCgTCgTCgTTgggggg-3’312 5’-TTCgTTgCATCgATgCATCgTTgggggg-3’313 5’-TTCgCTTCgCTTTTCgCTTCgCTT-3’601 5’-TCgAggACAAgATTCTCgTgC-3’602 5’-TCgAggACAAgATTCTCgTgCAggCC-3’603 5’-TCgTgCAggCCAACgAggCCg-3’604 5’-ACCgCCAAggAgAAgCCgCAggAggg-3’605 5’-TCgTTgCCgTCggCCC-3’606 5’-TACAACggCgAggAATACC-3 ’607 5’-TCggCACgCgACgTgCTggCCgTCgTTTCC-3’608 5’-gTACAACggCgAggAATACCT-3’609 5’-ACCgTCgTTgCCgTCggCCC-3’610 5’-TgCTggCCgTCgTT-3’611 5’-gTCggCACgCgACg-3’612 5’-gTCggCACgCgACgggggg-3’613 5’-gTCggCACgCgACgCCCCCC-3’614 5’-TCgTTgCCgTCggCCCCCCCCC-3’
615 5’-TCgTTgCCgTCggCCCCCC-3’616 5’-TCgTTgCCgTCggCCCCC-3’617 5’-TCgTTgCCgTCggCCCC-3’618 5’-TCgTTgCCgTCggCCCCCCC-3’619 5’-TCgTTgCCgTCgg-3’620 5’-TCgTTgCCgTCggg-3’621 5’-TCgTTgCCgTCgggg-3’622 5’-TCgTTgCCgTCggggg-3’623 5’-TCgTTgCCgTCgggggg-3’624 5’-TCgTTgCCgTCggggggg-3’625 5’-TCgTTgCCgTCgggggggg-3’626 5’-TCgTTgCCgTCggggggggg-3’627 5’-TCgAggACAAgATTCTCgT-3’628 5’-TCCCgCTggACgTT-3’629 5’-TCggCACgCgACgTgCTggCCgTCgTT-3’631 5’-TCgTCgCgCCgTCACgggggg-3’632 5’-TCgTgTgCgTgCCgTTggg-3’633 5’-TCgTCgCCgTTgggCggg-3’634 5’-TCgTCgACgTCgTTgggCggg-3’635 5’-TCgCAgTTgTCgTAACgTTgggCggg-3’636 5’-TTACCggTTAACgTTggCCggCC-3’637 5’-ACCggTTAACgTTgTCCCCgggg-3’638 5’-TCgTCgTTggTATgTT-3’639 5’-TCgTCgTCgTCgTTgTCgTT-3’640 5’-TCgTCgTCgTCgTTgTCgTTgggg-3’641 5’-TCgTTCggggTgCCg-3’642 5’-TCgTTCggggTAACgATT-3’643 5’-TCgTTCggggTAACgTT-3’644 5’-TCgTTCggggTACCgAT-3’645 5’-TCgTTCggggTACCgATgggg-3’
646 5’-TCgTTgCgCTCCCATgCCgggggg-3’647 5’-TCgTCgTTTCgTCgTTgggg-3’648 5’-TCgTTgTCgTTTCgCTgCCggCggggg-3’649 5’-CgTTgACgATCgTCCCATggCggg-3’650 5’-TCTgCggCCTTCgTCg-3’651 5’-TAgTAACCggTCCggCgCCCCC-3’652 5’-TTgCAgCgCTgCCggTggg-3’653 5’-TCgTACggCCgCCgTACggCggg-3’654 5’-CggCCCATCgAgggCgACggC-3’655 5’-TCgCgTCgACTCCCCTCgAgggg-3’656 5’-TCgTCgTCgACTCgTggTCggggg-3’657 5’-TCgggCgCCCgATCgggggg-3’658 5’-TCgTCggTCTTTCgAAATT-3’659 5’-TCgTgACgTCCTCgAgTT-3’660 5’-ggACgATCgATCgTgggggg-3’661 5’-gggATgCATCgATgCATCgggggg-3’662 5’-gggggAATCgATTCgggggg-3’663 5’-ggTgCgACgTCgCAgggggg-3’664 5’-TCgTCgggTgCATCgATgCAgggggg-3’665 5’-ggTgCATCgTACgATgCAgggggg-3’666 5’-gggACgTACgTCgggggg-3’667 5’-TCggggACgATCgTCgggggg-3’668 5’-gggggATCgATATCgATCgggggg-3’669 5’-gggggATCgACgTCgATCgggggg-3’670 5’-ggTgCATCgATCgATgCAgggggg-3’671 5’-ggATCgATCgATCgATgggggg-3’672 5’-ggCgATCgATCgATCggggggg-3’673 5’-ggggTCgATCgATCgAgggggg-3’674 5’-ggTgCgATCgATCgCAgggggg-3’675 5’-ggTCgCgATCgCgAgggggg-3’
676 5’-TCgTCTTTCgACTCgTTCTC-3’677 5’-TCgTCgTTTTgCgTTCTC-3’678 5’-TCATCgACTCTCgAgCgTTC-3’679 5’-ATCgTCgACTCTCgTgTTCTC-3’680 5’-TCgACTTTCgTCgTTCTgTT-3’681 5’-TCgTCgTTTCgTCgTTCTC-3’682 5’-TCgTCgTCgTCgTTgTCgTT-3’683 5’-TCgTTCTCgACTCgTTCTC-3’684 5’-TCgACgTTCgTCgTTCgTCgTTC-3’685 5’-TCgTCgACgTCgTTCgTTCTC-3’其中的磷酸二酯鍵可以是部分硫化的，全部硫化的，也可以是未硫化的。
本發明的CpG單鏈脫氧核苷酸可通過已知的方法生產，例如采用固相亞磷酰胺三酯法進行生產。以下的實施例詳細地例舉了一種生產本發明的CpG單鏈脫氧核苷酸的方法。
在這些含CpG單鏈脫氧寡核苷酸用于制備用于制備治療腫瘤性疾病和病毒感染性疾病的藥物的用途中，與治療腫瘤性疾病和病毒感染性疾病的藥物的使用量的比例為1∶1-100∶1(摩爾比)。
本發明的含CpG單鏈脫氧寡核苷酸的使用方式包括單獨應用、兩種或兩種以上的CpG單鏈脫氧寡核苷酸聯合應用、與治療腫瘤性疾病和病毒感染性疾病的藥物混合使用，與治療腫瘤性疾病和病毒感染性疾病的藥物通過交聯劑共價偶聯使用；應用方式包括皮下應用、鼻腔粘膜應用、肌肉應用、胃腸應用、腹腔應用、靜脈注射等常用的方式。
CpG單鏈脫氧寡核苷酸使用時間可在使用治療腫瘤性疾病和病毒感染性疾病的藥物之前應用、與治療腫瘤性疾病和病毒感染性疾病的藥物同時應用、在治療腫瘤性疾病和病毒感染性疾病的藥物后應用。
在小鼠試驗中CpG單鏈脫氧寡核苷酸的使用量為0-500微克/小鼠，如進行人體試驗則按標準的換算方法進行換算。
下面結合具體的制備實施例和生物學效果實施例，并參照數據進一步詳細地描述本發明。應理解，這些實施例只是為了舉例說明本發明，而非以任何方式限制本發明的范圍。
實施例在如下實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領域中公知的常規方法，例如合成采用固相亞磷酰胺三酯法。
在如下實施例中，所用試劑的來源、商品名和/或有必要列出其組成成分者，均只標明一次。在其后所用相同試劑如無特殊說明，不在贅述上述內容。
實施例1CpG單鏈脫氧核苷酸的制備(上海生工合成)合成采用固相亞磷酰胺三酯法，合成方法(上海生工提供)如下材料和方法三氯乙酸(Trichloroacetic Acid，TCA)、可控多孔玻璃(ControlledPore Glass)、DMT(二甲氧基三苯甲基)、四氮唑活化劑、乙酸酐、N-甲基咪唑、ABI DNA合成儀、高效液相色譜層析儀等。
A、T、C、G四種核苷酸單體合成所用單體為核苷亞磷酰胺，是經過化學修飾的核苷酸，含下面幾個功能基團1.3’位P上二異丙胺基，縮合所用的功能基2.3’位P上晴乙基，保護基，合成完畢后脫去。
3.5’-Dmt，保護基，縮合前脫去。
4.A和C的雜環氨基上的苯甲酸保護基，合成完畢后脫去。
5.G上嘌呤環氨基上的異丙酰保護基，合成完畢后脫去。
具體的反應步驟如下一、脫保護基用三氯乙酸(Trichloroacetic Acid，TCA)脫去連結在可控多孔玻璃(Controlled Pore Glass)上的核苷酸的保護基團二甲氧基三苯甲基(DMT)，獲得游離的5’-羥基端，以供下一步縮合反應。
二、活化將亞磷酰胺保護的核苷酸單體與四氮唑活化劑混合并進入合成柱，形成亞磷酰胺四唑活性中間體(其3’-端已被活化，但5’-端仍受DMT保護)，此中間體將與可控多孔玻璃上的已脫保護基的核苷酸發生縮合反應。
三、連接亞磷酰胺四唑活性中間體遇到可控多孔玻璃上已脫保護基的核苷酸時，將與其5’-羥基發生親合反應，縮合并脫去四唑，此時合成的寡核苷酸鏈向前延長一個堿基。
四、封閉縮合反應后為了防止連在可控多孔玻璃上的未參與反應的5’-羥基在隨后的循環反應中被延伸，常通過乙酰化來封閉此端羥基，一般乙酰化試劑是用乙酸酐和N-甲基咪唑等混合形成的。
五、氧化縮合反應時核苷酸單體是通過亞磷酯鍵與連在可控多孔玻璃上的寡核苷酸連接，而亞磷酯鍵不穩定，易被酸、堿水解，此時常用碘的四氫呋喃溶液將亞磷酰轉化為磷酸三酯，得到穩定的寡核苷酸。
經過以上五個步驟后，一個脫氧核苷酸就被連到可控多孔玻璃的核苷酸上，同樣再用三氯乙酸脫去新連上的脫氧核苷酸5’-羥基上的保護基團DMT后，重復以上的活化、連接、封閉、氧化過程即可得到一DNA片段粗品。最后對其進行切割、脫保護基(一般對A、C堿基采用苯甲酰基保護；G堿基用異丁酰基保護；T堿基不必保護；亞磷酸用腈乙基保護)、純化(常用的有HAP，PAGE，HPLC，C18，OPC等方法)、定量等合成后處理即可得到符合實驗要求的寡核苷酸片段。
未硫化的CpG單鏈脫氧寡核苷酸在ABI 3900 DNA合成儀上合成(上海生工生物技術服務有限公司)，全硫化及部分硫化CpG單鏈脫氧寡核苷酸的合成采用置換法，在ABI 394 DNA合成儀上合成(上海生工生物技術服務有限公司)。
實施例2人外周血單個核細胞殺傷人白血病細胞(K562細胞)一、K562細胞的培養試劑和材料K562細胞為人的白血病細胞株(美國ATCC CCL-243)。細胞培養常用的儀器設備低溫冰箱、二氧化碳孵箱、超凈工作臺、倒置顯微鏡、液氮罐、蒸餾水器、真空泵、細胞培養瓶、濾菌器、濾過瓶、各種規格的吸管、加樣器、滴管等。
RPMI1640培養液含L-谷氨酰胺的RPMI1640(GIBCOBRL) 10.4克碳酸氫鈉 2.0克慶大霉素 10萬單位加三蒸水至體積1000毫升0.22微米的濾膜真空泵抽濾除菌、分裝。
小牛血清滅活小牛血清(Invitrogen)-20℃取出，4℃冰箱融化后，56℃水浴30min。
10％小牛血清的RPMI1640滅活的小牛血清10毫升RPMT 1640培養液 90毫升凍存液的配制200微升小牛血清，100微升二甲基亞砜(DMSO)，700微升無血清RPMI1640培養基。
方法1.K562細胞的復蘇從液氮罐中取出凍存的K562細胞，37℃水浴迅速融化，加5毫升RPMI1640培養液稀釋，水平離心機以1,000Xg離心3min，棄上清，加入10％小牛血清的RPMI1640 2毫升，滴管吹打均勻，轉移至50毫升培養瓶中，補加RPMI1640培養液至終體積5毫升。
2.K562細胞的培養帶10％小牛血清的RPMI1640作為培養基，50毫升細胞培養瓶，37℃ 5％二氧化碳孵箱培養。
3.K562細胞的傳代生長至一定密度的K562細胞，滴管輕輕吹打均勻，轉移至10毫升離心管中，水平離心機以1,000Xg離心力離心3min，棄上清，加入10％小牛血清的RPMI1640 2毫升，滴管吹打均勻，分別轉移到兩個50毫升培養瓶中，分別補加培養液至終體積5毫升，37℃5％二氧化碳孵箱培養。
4.K562細胞的凍存生長良好的細胞，滴管輕輕吹打均勻，轉移至10毫升離心管中，水平離心機以1,000Xg離心力離心3min，棄上清，凍存液1毫升，滴管輕輕吹打均勻，轉移至凍存管中，梯度降溫(降溫1℃/1-2h)，降至-70℃左右，然后，轉移到液氮罐中。
二、人外周血單個核細胞的分離1、試劑和材料肝素抗凝的人全血長春市中心血站。
聚蔗糖-泛影葡胺比重1.077±0.001，北京鼎國生物技術有限公司。
細胞培養常用的儀器設備低溫冰箱、二氧化碳孵箱、超凈工作臺、倒置顯微鏡、液氮罐、蒸餾水器、真空泵、細胞培養瓶、濾菌器、濾過瓶、各種規格的吸管、加樣器、滴管、血球計數板、水平式離心機等。
RPMI1640培養液含L-谷氨酰胺的RPMI1640(GIBCOBRL) 10.4克碳酸氫鈉 2.0克慶大霉素 10萬單位加三蒸水至體積1000毫升0.22微米的濾膜真空泵抽濾除菌、分裝。
小牛血清滅活小牛血清(Invitrogen)-20℃取出，4℃冰箱融化后，56℃水浴30min。
10％小牛血清的RPMI1640滅活的小牛血清10毫升RPMI 1640培養液 90毫升Hank’s液(無鈣離子、鎂離子)的配制氯化鈉8.0克氯化鉀0.4克磷酸氫二鈉(帶一個結晶水) 0.06克磷酸二氫鉀0.06克碳酸氫鈉 0.35克葡萄糖1.0克酚紅 0.02克加入雙蒸水至1000毫升。
將上列成分混合后溶化，8磅15min滅菌，4℃冰箱保存。臨用時用7.4％NaHCO3調pH至7.3～7.6。
2％臺酚蘭染色液臺酚蘭 2克生理鹽水 100毫升2、方法肝素抗凝的人外周血緩慢沿管壁緩慢加于比重為1.077±0.001的聚蔗糖-泛影葡胺淋巴細胞分層液面上，分離液與外周血的比例約為2∶1。
水平離心機離心1,000xg 15-20min，離心后管內分為3層，用吸管吸取白色云霧層狹窄帶，置入另一管中。
加入等倍或以上體積的Hank’s液(無血清)，800-1,000xg 10-15min，棄上清，加入Hank’s液，洗滌細胞兩次。
末次離心后，棄上清，加入培養基2ml，重懸細胞。
取一滴細胞懸液與一滴0.2％臺盼蘭染液混合，于血球計數板計數四個大方格內的細胞總數，單個核細胞濃度(細胞數/1毫升細胞懸液)＝4個大方格內細胞總數/4×104×2(稀釋倍數)。
三、K562細胞的標記試劑和材料細胞培養常用的儀器設備低溫冰箱、二氧化碳孵箱、超凈工作臺、倒置顯微鏡、液氮罐、蒸餾水器、真空泵、細胞培養瓶、各種規格的吸管、加樣器、滴管等。
放射性同位素鎘51(51Cr)(美國PerkinElmer公司)γ射線計數器(美國Beckman公司)、同位素標記管RPMI1640培養液含L-谷氨酰胺的RPMI1640(GIBCOBRL) 10.4克碳酸氫鈉 2.0克慶大霉素 10萬單位加三蒸水至體積1000毫升0.22微米的濾膜真空泵抽濾除菌、分裝。
小牛血清滅活小牛血清(Invitrogen)-20℃取出，4℃冰箱融化后，56℃水浴30min。
10％小牛血清的RPMI1640滅活的小牛血清10毫升RPMI 1640培養液 90毫升方法1.取生長良好的K562細胞，吸管吹打均勻后吸到10毫升離心管中，水平離心機以800Xg離心力離心5min，棄上清，加入1毫升培養基，吸管吹打均勻，取少量計數，調節細胞濃度為1×107個/毫升。
2.吸取100微升(1×106個細胞)放入塑料管中，加入100微升放射性同位素鎘51。
3.放入37℃ 5％二氧化碳孵箱中培養1h，每隔5-8min混勻一次。
4.用10％小牛血清的RPMI1640洗滌三次，然后10％小牛血清的RPMI1640重懸細胞。
四、殺傷K562細胞的實驗試劑和材料細胞培養常用的儀器設備低溫冰箱、二氧化碳孵箱、超凈工作臺、倒置顯微鏡、液氮罐、蒸餾水器、真空泵、細胞培養瓶、各種規格的吸管、加樣器、滴管等。
RPMI1640培養液含L-谷氨酰胺的RPMI1640(GIBCOBRL) 10.4克碳酸氫鈉 2.0克慶大霉素 10萬單位加三蒸水至體積1000毫升0.22微米的濾膜真空泵抽濾除菌、分裝。
小牛血清滅活小牛血清(Invitrogen)-20℃取出，4℃冰箱融化后，56℃水浴30min。
10％小牛血清的RPMI1640滅活的小牛血清 10毫升RPMI 1640培養液 90毫升TE緩沖液10毫摩爾Tris，1毫摩爾EDTA，鹽酸調節pH值7.0。1摩爾/升的鹽酸鹽酸10毫升，加三蒸水至終體積100毫升方法1.用10％小牛血清的RPMI1640培養基調節人外周血單個核細胞至終濃度為2×106個/毫升，96孔板每孔加入100微升，即每孔細胞數為2×105個。
2.加入用TE緩沖液稀釋的CpG單鏈脫氧核苷酸至每孔終濃度120微克/毫升，每種CpG單鏈脫氧核苷酸三個復孔，設一不加CpG單鏈脫氧核苷酸的對照孔。
3.設最大釋放孔6復孔，最大釋放組每孔加100微升1摩爾/升的鹽酸，自發釋放孔6復孔，每孔加100微升10％小牛血清的RPMI1640培養基，混勻。
4.37℃ 5％二氧化碳孵箱中培養至18h。取標記好的K562細胞，用10％小牛血清的RPMI1640培養基調節細胞濃度至1×105個/毫升。
5.在96孔板中每孔加100微升，設最大釋放組和自發釋放組，37℃5％二氧化碳孵箱中培養4h。
6.水平離心機1,000Xg離心5min每孔取上清150微升，加入塑閃瓶中，再加3-5毫升液閃液，測量CPM值。
7.計算殺傷率殺傷率＝(實驗組CPM值-自發釋放組CPM值)/(最大釋放組CPM值-自發釋放組CPM值)×100％實驗結果(見下表)表明，CpG ODN對人外周血單個核細胞殺傷K562細胞用明顯的刺激作用。
第一組實驗的結果
序列號 CpG單鏈脫氧核苷酸結構 殺傷率(％)對照孔 無 17.5301 5’-TCgTCgTTACCgATgACgTCgCCgT-3’42.1302 5’-TCgTCgggTgCgACgTCgCAgggggg-3’ 41.2303 5’-TCgTCgggTgCgACgATCgTCgggggg-3’46.8304 5’-TCgTCgTTTgCATCgATgCAgTCgTCgTT-3’35.7305 5’-TCgTCgTTTgCATCgATgCAggggggg-3’43.1306 5’-ACCggTATCgATgCCggTgggggg-3’ 55.6307 5’-ggggTCCATgACgTTCCTgAAgggggg-3’27.8308 5’-TCgTCgTTTTgACgATCgTCgggggg-3’ 35.8309 5’-TTCgTCgTTTgATCgATgTTCgTTgggggg-3’ 33.4310 5’-TTCgTCgTTgTgATCgATgggggg-3’ 48.1311 5’-TATCgATgTTTTCgTCgTCgTTgggggg-3’ 46.0312 5’-TTCgTTgCATCgATgCATCgTTgggggg-3’ 28.2313 5’-TTCgCTTCgCTTTTCgCTTCgCTT-3’ 27.8序列號 CpG單鏈脫氧核苷酸結構 殺傷率(％)601 5’-TCgAggACAAgATTCTCgTgC-3’ 60.1602 5’-TCgAggACAAgATTCTCgTgCAggCC-3’ 21.7603 5’-TCgTgCAggCCAACgAggCCg-3’ 77604 5’-ACCgCCAAggAgAAgCCgCAggAggg-3’ 81605 5’-TCgTTgCCgTCggCCC-3’ 103606 5’-TACAACggCgAggAATACC-3’ 78607 5’-TCggCACgCgACgTgCTggCCgTCgTTTCC-3’ 91608 5’-gTACAACggCgAggAATACCT-3’ 99609 5’-ACCgTCgTTgCCgTCggCCC-3’ 88
6105’-TgCTggCCgTCgTT-3’736115’-gTCggCACgCgACg-3’766125’-gTCggCACgCgACgggggg-3’ 616135’-gTCggCACgCgACgCCCCCC-3’ 516145’-TCgTTgCCgTCggCCCCCCCCC-3’ 456155’-TCgTTgCCgTCggCCCCCC-3’ 686165’-TCgTTgCCgTCggCCCCC-3’ 1106175’-TCgTTgCCgTCggCCCC-3’ 94.56185’-TCgTTgCCgTCggCCCCCCC-3’ 65.56195’-TCgTTgCCgTCgg-3’ 65.86205’-TCgTTgCCgTCggg-3’ 90.86215’-TCgTTgCCgTCgggg-3’ 72.36225’-TCgTTgCCgTCggggg-3’ 36.16235’-TCgTTgCCgTCgggggg-3’ 68.16245’-TCgTTgCCgTCggggggg-3’ 77.36255’-TCgTTgCCgTCgggggggg-3’ 79.36265’-TCgTTgCCgTCggggggggg-3’ 46.76275’-TCgAggACAAgATTCTCgT-3’ 38.36285’-TCCCgCTggACgTT-3’ 62.36295’-TCggCACgCgACgTgCTggCCgTCgTT-3’ 67.5序列號CpG單鏈脫氧核苷酸結構 殺傷率(％)6315’-TCgTCgCgCCgTCACgggggg-3’ 53.26325’-TCgTgTgCgTgCCgTTggg-3’ 67.26335’-TCgTCgCCgTTgggCggg-3’ 86.66345’-TCgTCgACgTCgTTgggCggg-3’ 67.46355’-TCgCAgTTgTCgTAACgTTgggCggg-3’ 62.46365’-TTACCggTTAACgTTggCCggCC-3’ 61.96375’-ACCggTTAACgTTgTCCCCgggg-3’ 64.2
638 5’-TCgTCgTTggTATgTT-3’ 65.2639 5’-TCgTCgTCgTCgTTgTCgTT -3’66.7640 5 ’-TCgTCgTCgTCgTTgTCgTTgggg-3 ’ 71.1641 5’-TCgTTCggggTgCCg-3’63.4642 5 ’-TCgTTCggggTAACgATT-3 ’ 66.3643 5’-TCgTTCggggTAACgTT-3’57.9644 5’-TCgTTCggggTACCgAT -3’ 61.3645 5’-TCgTTCggggTACCgATgggg-3’72.5646 5’-TCgTTgCgCTCCCATgCCgggggg-3’ 74.5647 5’-TCgTCgTTTCgTCgTTgggg-3’ 70.2648 5’-TCgTTgTCgTTTCgCTgCCggCggggg-3’65.8649 5’-CgTTgACgATCgTCCCATggCggg-3’ 57.9650 5’-TCTgCggCCTTCgTCg-3’ 72.4651 5’-TAgTAACCggTCCggCgCCCCC-3’ 66.3652 5 ’-TTgCAgCgCTgCCggTggg-3 ’78.6653 5’-TCgTACggCCgCCgTACggCggg-3’88.1654 5’-CggCCCATCgAgggCgACggC-3’81.8655 5’-TCgCgTCgACTCCCCTCgAgggg-3’65.8656 5’-TCgTCgTCgACTCgTggTCggggg-3’ 77657 5’-TCgggCgCCCgATCgggggg-3 ’63.3658 5’-TCgTCggTCTTTCgAAATT-3’76.6659 5 ’-TCgTgACgTCCTCgAgTT-3 ’ 80.9第二組實驗的結果


實施例3CpG ODN刺激產生人干擾素(HIFNα)本實驗采用PBL Biomedical Laboratories檢測人IFNα試劑盒(批號1755)進行。
一.人外周血單個核細胞的分離1、試劑和材料肝素抗凝的人全血長春市中心血站。
聚蔗糖-泛影葡胺比重1.077±0.001，北京鼎國生物技術有限公司。
細胞培養常用的儀器設備低溫冰箱、二氧化碳孵箱、超凈工作臺、倒置顯微鏡、液氮罐、蒸餾水器、真空泵、細胞培養瓶、濾菌器、濾過瓶、各種規格的吸管、加樣器、滴管、血球計數板、水平式離心機等。
RPMI1640培養液含L-谷氨酰胺的RPMI1640(GIBCOBRL) 10.4克碳酸氫鈉 2.0克慶大霉素 10萬單位加三蒸水至體積1000毫升
0.22微米的濾膜真空泵抽濾除菌、分裝。
小牛血清滅活小牛血清(Invitrogen)-20℃取出，4℃冰箱融化后，56℃水浴30min。
10％小牛血清的RPMI1640滅活的小牛血清 10毫升RPMI 1640培養液 90毫升Hank’s液(無鈣離子、鎂離子)的配制氯化鈉 8.0克氯化鉀 0.4克磷酸氫二鈉(帶一個結晶水)0.06克磷酸二氫鉀 0.06克碳酸氫鈉0.35克葡萄糖 1.0克酚紅0.02克加入雙蒸水至1000毫升。
將上列成分混合后溶化，8磅15min滅菌，4℃冰箱保存。臨用時用7.4％NaHCO3調pH至7.3～7.6。
2％臺酚蘭染色液臺酚蘭 2克生理鹽水100毫升2、方法肝素抗凝的人外周血緩慢沿管壁緩慢加于比重為1.077±0.001的聚蔗糖-泛影葡胺淋巴細胞分層液面上，分離液與外周血的比例約為2∶1。
水平離心機離心1,000xg 15-20min，離心后管內分為3層，用吸管吸取白色云霧層狹窄帶，置入另一管中。
加入等倍或以上體積的Hank’s液(無血清)，800-1,000xg 10-15min，棄上清，加入Hank’s液，洗滌細胞兩次。
末次離心后，棄上清，加入培養基2ml，重懸細胞。
取一滴細胞懸液與一滴0.2％臺盼蘭染液混合，于血球計數板計數四個大方格內的細胞總數，單個核細胞濃度(細胞數/1毫升細胞懸液)＝4個大方格內細胞總數/4×104×2(稀釋倍數)。人外周血單個核細胞的分離二.人干擾素(HIFNα)的檢測試劑和材料細胞培養常用的儀器設備低溫冰箱、二氧化碳孵箱、超凈工作臺、倒置顯微鏡、液氮罐、蒸餾水器、真空泵、細胞培養瓶、各種規格的吸管、加樣器、滴管等。
RPMI1640培養液含L-谷氨酰胺的RPMI1640(GIBCOBRL) 10.4克碳酸氫鈉 2.0克慶大霉素 10萬單位加三蒸水至體積1000毫升0.22微米的濾膜真空泵抽濾除菌、分裝。
小牛血清滅活小牛血清(Invitrogen)-20℃取出，4℃冰箱融化后，56℃水浴30min。
10％小牛血清的RPMI1640滅活的小牛血清10毫升RPMI 1640培養液 90毫升24孔板(平底)(Costar)。
方法1.用10％小牛血清的RPMI1640培養基調節人外周血單個核細胞至終濃度為2×106個/毫升。
2.24孔板每孔加入1000微升，即每孔細胞數為2×106個。加入用TE緩沖液稀釋的CpG單鏈脫氧核苷酸至每孔終濃度6微克/毫升。
3.37℃ 5％二氧化碳孵箱中培養至24小時，收上清200微升。
4.繼續培養24小時，收上清200微升。
5.采用PBL Biomedical Laboratories檢測人IFNα試劑盒(批號1755)進行IFNα的檢測。
HIFNα的檢測試劑準備A瓶濃縮洗液(50ml)B(小)瓶HIFNα標準品(1.5ml)C瓶稀釋緩沖液(50ml)D(小)瓶抗體濃縮液(0.25ml)E(小)瓶辣根過氧化物酶試劑(HRP)濃縮液(20μl)F瓶辣根過氧化物酶試劑(HRP)稀釋液(25ml)G瓶辣根過氧化物酶底物反應液(TMB)(25ml)H瓶終止液(25ml)步驟(1)配制稀釋洗液(工作液)A(瓶)液 50ml雙蒸水加到 1000ml 即成工作洗液此工作洗液配制后應存放與4℃冰箱中，用前須充分混勻。沖洗步驟均應在室溫(24℃)下用冷洗液(2-6℃)進行沖洗。
(2)繪制標準曲線系列稀釋HIFNα標準品HIFNα標準品(小瓶B，1.5ml)加稀釋緩沖液(C瓶)，使之配成0-500pg/ml(高敏度)或0-5000pg/ml(廣范圍)系列稀釋液。所提供的樣品曲線謹供參考。
方法標記7個聚丙烯小管(分別為S6-S1以及BK)，所有稀釋步驟均在其中進行，槍頭須每次更換。干擾素濃度待測的樣品亦須用同樣方法稀釋。
(3)設計并確定96孔微量板上測試樣品所需孔數建議選16個孔用于HIFNα標準品。其中空白對照(BK，只加緩沖液BK)4個孔，HIFNα標準品(S6-S1)12個孔(各二復孔)。另選16個孔用于干擾素濃度待測的樣品。去掉多余的微量板條塊，封于錫箔袋內置冰箱(2-6℃)待用。
(4)精確汲取100μl步驟(2)中配制的HIFNα標準品稀釋液及待測的樣品稀釋液，加入到選定的微量板各復孔中(包括標準品和待測的樣品)。
(5)加蓋，室溫(24℃)下孵育1h.避免干燥及其他溫度的影響。
(6)此間，可配制抗體溶液，以便在步驟(8)中使用。為了避免丟失，可先將抗體濃縮液(小瓶D)離心幾秒鐘，使液體集中于瓶底。
方法(高敏感度)抗體濃縮液(小瓶D) 6.7μl或(廣范圍)抗體濃縮液(小瓶D) 2.2μl加稀釋緩沖液(C瓶)1ml此量為單排孔用量。復排用量倍增。
(7)孵育后，去掉孔內液體，用步驟(1)中配制的工作洗液沖洗每個孔一次。沖洗時每孔應充滿。最好使用自動沖洗器(如NuncImmunowasher)，盡量不用手工操縱的移液器沖洗。沖洗后將微量板翻轉，置于脫纖維吸水紙上，輕輕叩打，令其干燥。樣品中如含有害物質，須采取防護措施。
(8)沖洗后，每孔加100μl步驟(6)中所配制的抗體溶液，加蓋，室溫下孵育1h.。
(9)在此孵育期間，配制濃縮的HRP溶液，以便下一步步驟(10)使用。為了避免丟失，可先將小瓶E離心幾秒鐘，使液體集中于瓶底。具體配制方法如下HRP原液(小瓶E) 20μl加入HRP稀釋液(F瓶) 140μl輕輕混勻，必要時可再次離心。此即濃縮的HRP溶液。
(10)配制HRP稀釋液取步驟(9)中所配制的濃縮的HRP溶液1μl(如為高敏)加入(F瓶)HRP稀釋液1ml即成(高敏)稀釋液(如為廣范圍)則需將HRP濃縮液進一步稀釋。
將經步驟(9)稀釋的HRP溶液存放于-70℃待用，未經稀釋的HRP濃縮液則放在4℃冰箱中。
(11)孵育后，去掉微量板孔內液體，用步驟(1)中配制的工作洗液沖洗，每個孔洗3次，同步驟(7)。洗后，將微量板翻轉，置于脫纖維吸水紙上，輕輕叩打，令其干燥。樣品中如含有害物質，須采取防護措施。
(12)每孔加入稀釋的HRP溶液100μl，封蓋，室溫孵育1h。
(13)室溫下(24℃)預溫TMB底物溶液(G瓶)。
(14)孵育后去掉微量板孔內液體，用步驟(1)中配制的工作洗液沖洗，每個孔洗4次，同步驟(7)，去掉微量板孔內液體，用步驟(1)中配制的工作洗液沖洗每個孔三次，同步驟(7)。洗后，將微量板翻轉，置于脫纖維吸水紙上，輕輕叩打，令其干燥。樣品中如含有害物質，須采取防護措施。
(15)每孔加TMB底物溶液(G瓶)100μl，封蓋，室溫暗處孵育15min.。
(16)孵育后，每孔加終止液(H瓶)100μl，渦旋或叩打輕輕，令其混勻。
(17)酶標儀于450nm處5min內測出吸收值。
(18)繪出標準曲線。待測樣品中HIFNα的滴度可從標準曲線上求出。所提供的標準曲線可供參考。
由于樣品中干擾素的滴度是根據標準測得的，因此其單位可以是units/ml或pg/ml，轉換系數為3-5pg/unit。這個轉換系數只是一個近似值。
三、結果見下表CpG 24h 48hOD450 α干擾素(pg) OD450 α干擾素(pg)6600.419 214.820.4335223.36610.207 90.7950.195 83.7756620.212 93.72 0.276 131.166630.159 62.7150.117 38.1456640.883 486.260.899 495.626650.2465113.9 0.167567.6886660.070510.9430.176 72.666670.831 455.840.7505408.746680.4375225.640.3865195.86690.19 80.85 0.18 75
6700.227 102.5 0.215595.7686710.802 438.870.789 431.276720.5065266 0.475 247.586730.3655183.520.3595180.016740.233 106.010.23 104.256750.471 245.240.5335281.83021.3785776.121.227 687.56470.074 12.99 0.08 16.5TE 0.072 11.82 0.078 15.33注CpG縱列CpG ODN的編號，其序列如前文表所示。
24h OD450縱列代表用CpG縱列所示的CpG ODN刺激人外周血單個核細胞24h收獲上清中α干擾素測定實驗中測得的光密度值(波長為450nm)。
24hα干擾素(pg)縱列代表用CpG縱列所示的CpG ODN刺激人外周血單個核細胞24h收獲上清中α干擾素的含量。
48h OD450縱列代表用CpG縱列所示的CpG ODN刺激人外周血單個核細胞48h收獲上清中α干擾素測定實驗中測得的光密度值(波長為450nm)。
48hα干擾素(pg)縱列代表用CpG縱列所示的CpG ODN刺激人外周血單個核細胞48h小時收獲上清中α干擾素的含量。
SEQUENCE LISTING<110>長春華普生物技術有限公司<120>抗病毒和抗腫瘤的含CpG單鏈脫氧寡核苷酸<130>I030021<160>107<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>20<212>DNA
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<212>DNA<213>Artificial<400>59tcgtcgttgg tatgtt16<210>60<211>20<212>DNA<213>Artificial<400>60tcgtcgtcgt cgttgtcgtt20<210>61<211>24<212>DNA
<213>Artificial<400>61tcgtcgtcgt cgttgtcgtt gggg24<210>62<211>15<212>DNA<213>Artificial<400>62tcgttcgggg tgccg 15<210>63<211>18<212>DNA<213>Artificial
<400>63tcgttcgggg taacgatt18<210>64<211>17<212>DNA<213>Artificial<400>64tcgttcgggg taacgtt 17<210>65<211>17<212>DNA<213>Artificial
<400>65tcgttcgggg taccgat17<210>66<211>21<212>DNA<213>Artificial<400>66tcgttcgggg taccgatggg g 21<210>67<211>24<212>DNA<213>Artificial<400>67tcgttgcgct cccatgccgg gggg24
<210>68<211>20<212>DNA<213>Artificial<400>68tcgtcgtttc gtcgttgggg20<210>69<211>27<212>DNA<213>Artificial<400>69tcgttgtcgt ttcgctgccg gcggggg27
<210>70<211>24<212>DNA<213>Artificial<400>70cgttgacgat cgtcccatgg cggg 24<210>71<211>16<212>DNA<213>Artificial<400>71tctgcggcct tcgtcg16<210>72
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<212>DNA<213>Artificial<400>104tcgtcgtcgt cgttgtcgtt 20<210>105<211>19<212>DNA<213>Artificial<400>105tcgttctcga ctcgttctc19<210>106<211>23<212>DNA
<213>Artificial<400>106tcgacgttcg tcgttcgtcg ttc 23<210>107<211>21<212>DNA<213>Artificial<400>107tcgtcgacgt cgttcgttct c2權利要求
1.含CpG單鏈脫氧核苷酸，它們由含一個或多個CpG的寡核苷酸單鏈DNA分子構成。
2.按照權利要求1所述的單鏈脫氧核苷酸，它們的磷酸二酯鍵可以是非硫化的，部分硫化的，也可以是完全硫化的。
3.按照權利要求1所述的含CpG單鏈脫氧核苷酸，它們具有SEQ IDNO1-107任一所示的序列。
4.按照權利要求1-3中任一項所述的含CpG單鏈脫氧核苷酸用于制備用于激活人外周單個核細胞殺傷人白血病細胞的藥物的用途。
5.按照權利要求1-3中任一項所述的含CpG單鏈脫氧核苷酸用于制備用于誘導人外周單個核細胞產生α干擾素的藥物的用途。
6.按照權利要求1-3中任一項所述的含CpG單鏈脫氧核苷酸用于制備用于治療腫瘤性疾病的藥物的用途。
7.按照權利要求1-3中任一項所述的含CpG單鏈脫氧核苷酸用于制備用于治療病毒感染性疾病的藥物的用途。
全文摘要
本發明提供了系列含CpG單鏈脫氧寡核苷酸，它們由含一個或多個CpG的脫氧寡核苷酸單鏈DNA分子構成，其能夠刺激人外周血單個核細胞(PBMC)殺傷人的白血病細胞和刺激人外周血單個核細胞產生α干擾素；以及這些含CpG單鏈脫氧寡核苷酸用于制備治療腫瘤性疾病和病毒感染性疾病的藥物的用途。
文檔編號C07H19/02GK1526718SQ03119840
公開日2004年9月8日 申請日期2003年3月5日 優先權日2003年3月5日
發明者王麗穎, 包木勝, 于永利 申請人:長春華普生物技術有限公司