專利名稱：用于將核酸引入真核生物細胞內的配制品的制作方法
技術領域：
本發明涉及將核酸引入真核生物細胞內的藥物配制品，其特征在于該配制品具有在pH6.0至pH7.4范圍內的pH值，及/或在5至100毫摩爾/升范圍內的陰離子濃度及/或具有濃度在10至500微摩爾/升范圍內的非甾體抗炎藥物。
背景技術：
解譯人類基因組的一項實質目標為鑒定出致病基因(以其產物之作用方式為基礎)及/或鑒定這些基因構造中的致病性變化(多態性(polymorphisms))且將其歸入一種疾病譜。若認可這些疾病是由一明確數目的基因產物表達太強、表達太若或不正確地表達所引起之時，此種研究即可對多種疾病帶來更接近的原因性治療。事實上，對于整個系列的遺傳性疾病(例如粘液粘稠病(mucoviscidosis))，一般性單基因缺陷(單基因性疾病(monogenetic disease))是已知的；不過，對于其它疾病(例如高血壓)的情勢顯著地更為復雜。這些疾病明顯地不是單基因缺陷而是多重基因缺陷(多基因性疾病(polygenetic disease))的結果，其決定了受累者在暴露于某些環境因素之時發展出該疾病。不管是否存在此種限制，對于一或多種基因的表達之目標導向性干預確實可提供對因治療而非僅僅對癥治療的機會。
根據現有科學知識狀態，對于此種“基因療法”可有四種抉擇。例如，如今已經可以順利地將一替代基因經由使用基因-載體引入體細胞內且使其經由該細胞本身的蛋白質合成機制轉錄成為對應的蛋白質(質粒的脂質體轉移，瞬時表達及/或將此基因整合到目標細胞的基因組之內(病毒基因轉移、穩定表達)。不過，在目標細胞的正確尋址(addressing)、轉移效率及于需要處經轉移基因的打開(switching on)與關閉(switching off)等之中仍然會遭遇到重大的困難。再者，目前所使用的脂質體轉移系統和病毒轉移系統時常具有細胞傷害效應或者會觸動潛在地戲劇性、免疫學決定性的不耐受反應。
為了阻止致病基因的表達，與基因轉移技術不同的是，此基因可以，首次地，于所謂的信使RNA(mRNA)翻譯成對應的蛋白質之中予以特異地阻斷。使用此種反義技術，將短的單鏈DNA(通常包括15-25核苷酸)引入目標細胞之內，其提供與其目標-mRNA呈互補之堿序列。反義寡核苷酸沉積在相似的單鏈上(DNA-RNA-雜交)導致翻譯的中斷。相反地，使用此類別的第二種選擇，所謂的RNA-干擾(RNA-interference)(RNAi)，可將包括正好21堿基對的RNA-雙鏈引入細胞之內，該RNA-雙鏈的序列相同于編碼目標蛋白質的一段mRNA所具序列。其后，在該目標細胞內形成一至今尚未詳細知悉的蛋白質復合物；此復合物會特異地分解目標mRNA且因此阻止其翻譯。此兩種技術都有一項共同的問題單DNA股和雙DNA股個別地都顯示不能任意地被吸收到目標細胞之內，而是必須，像顯著地更大的質粒(通常為數千堿基對長者)一般，被轉染到細胞內。為了此項目地，通常要將其包裝到作為運載介質的脂質體之內。
對基因表達進行目標導向入性干預所用的第三種方法使用短的DNA雙鏈，所謂的誘餌寡核苷酸(decoy polynucleotide)。基因表達中的第一階段將染色體上的相應DNA節段轉錄到一RNA單鏈內。所謂的轉錄因子對于轉錄的起始具有關鍵性。這些調節性蛋白質會結合到基因的起始區(啟動子區)且通過RNA聚合酶起始基因的轉錄。結合到DNA的轉錄因子也可能阻斷此種轉錄程序。誘餌寡核苷酸都是短的DNA雙鏈(通常包括15-25堿基對)，其可模擬序列基序(motif)，而目標轉錄因子可在其(它們的)目標基因(多目標基因)所含起始區中結合到這些基序。每一轉錄因子只能辨識出其對應的序列基序；于此方式中，誘餌寡核苷酸做法具有特異性。
由于誘餌寡核苷酸在細胞質內或在細胞核內的存在使得轉錄因子被中和，其后果為其不再能夠誘導或阻斷其(它們的)目標基因(多目標基因)之表達。
所以，迫切需要一種簡單的，不會將細胞或生物置于壓力(stress)下的引入核酸之手段。
此目標是由本申請權利要求所界定的主題所達到。


本發明要參照下列附圖予以更詳細地解說。
圖1系舉例顯示出針對轉錄因子C/EBP的經FITC-標記的誘餌寡核苷酸(10微摩爾/升；圖1a)與一針對轉錄因子AP-1的經FITC-標記的誘餌寡核苷酸(10微摩爾/升；圖1b)在業經在細胞培養基中培育過的人類培養內皮細胞內的時間相關性吸收之結果。經熒光-染料-標記核酸的吸收系利用熒光顯微鏡(放大400x)展現出。
圖2以條圖形式顯示出在人類培養內皮細胞中于1小時期間內，反義寡核苷酸(AS)-支持的小窩蛋白-1(caveolin-1)的蛋白質表達減低(對照的37±10％，n＝3)對于經FITC-標記C/EBP誘餌寡核苷酸(10微摩爾/升)的吸收之影響。統計學分析(n＝3-4，相對于誘餌寡核苷酸在未處理對照細胞內的吸收之百分比；*P＜0.05相對于對照，P＜0.05相對于AS)。SCR(混雜)表示的是使用與該反義寡核苷酸有相同的堿基組成但不同的序列之寡核苷酸處理內皮細胞所得結果。
圖3以條圖形式顯示出在人類培養內皮細胞中于1小時期間，細胞外pH-值變化對于經FITC-標記C/EBP誘餌寡核苷酸(10微摩爾/升)的吸收之影響。統計學分析(n＝4-5，相對于誘餌寡核苷酸在pH值7.35的吸收之百分比；*P＜0.05)。
圖4以條圖形式顯示出在人類培養內皮細胞中于1小時期間內，反義寡核苷酸(AS)-支持的還原葉酸載體的蛋白質表達減低(對照的37±10％，n＝3)對于經FITC-標記C/EBP誘餌寡核苷酸(10微摩爾/升)的吸收之影響。統計學分析(n＝3-4，相對于誘餌寡核苷酸在未處理對照細胞內的吸收之百分比；*P＜0.05相對于對照，P＜0.05相對于AS)。SCR(混雜)表示使用無活性反義寡核苷酸處理內皮細胞所得結果。
圖5以條圖形式(a)顯示出在人類培養內皮細胞中于1小時期間，細胞外氯離子濃度變化(逐漸以羥乙基磺酸鹽取代)對于經FITC-標記C/EBP誘餌寡核苷酸(10微摩爾/升)的吸收之影響。統計學分析(n＝4，相對于誘餌寡核苷酸在156毫摩爾/升 Cl-的吸收之百分比；*P＜0.05)。圖5(b)舉例說明人類培養內皮細胞中于1小時期間，細胞外氯離子濃度從156至11毫摩爾/升的變化對于經FITC-標記STAT-1誘餌寡核苷酸的吸收之影響。(熒光顯微鏡影像，放大200x)。
圖6以條圖形式(a)顯示出使用氟比洛芬(flurbiprofen)或吲哚洛芬(indoprofen)(各100微摩爾/升)共溫育，在人類培養內皮細胞中于1小時期間對于經FITC-標記C/EBP誘餌寡核苷酸(10微摩爾/升)的吸收之影響。統計學分析(n＝4，相對于誘餌寡核苷酸在未處理細胞內的吸收之百分比；*P＜0.05)。
圖7以條圖形式(a，b)與代表性Western印跡分析(Western-blot analysis)(c)顯示出(a)細胞培養基(n＝3)和(b，c)未改良與各改良的(mod)Ringer氏液(Ringer’s solution)(11毫摩爾/升氯離子，pH7.0)作為溫育培養基對于在人類培養內皮細胞中STAT-1誘餌寡核苷酸-媒介的細胞因子刺激((100單位/毫升(U/ml)腫瘤壞死因子a(tumour necrosis factor a)[TNFa]加上1000單位/毫升的干擾素-γ(interferon-γ)[IFNγ]，10小時)的CD40蛋白質表達之影響(相對于細胞因子刺激細胞中的蛋白質之量的百分比[T/I])*P＜0.05相對于T/I；b，統計學分析，n＝6；c，使用β-肌動蛋白(β-actin)作為內標準品的代表性Western印跡分析。于暴露于細胞因子之前，將內皮細胞與未標記的誘餌寡核苷酸(10微摩爾/升)預溫育30分鐘。
具體實施例方式
與質粒，反義和RNAi寡核苷酸不同，誘餌寡核苷酸(雙鏈DNA寡核苷酸)顯然地可以不必用到輔助劑(轉染劑(transfection agents))就能進入相關的目標細胞。在此運載之下的機制至今為止仍屬未知。本發明人于今已可成功地解說此機制。以在本文中所得知識為基礎，提出用以將核酸導到真核細胞，尤其是哺乳動物細胞且特別是人類細胞之內之新的配制品。
術語“配制品”或“藥物配制品”，在本文件中是指藥物制劑形式，例如，用于一藥物或一接種培養基，其要在體內(in vivo)施用到人類或動物，或體外(in vitro)或離體(ex vivo)施用到器官、組織或細胞，且其包括一或多種活性成分和輔助配制劑。根據本發明的活性成分為核酸。
術語“輔助配制劑”如本文件中是指上面所提及的藥物制劑中除了活性成分之外的所有成分。輔助配制劑可為，例如，生理鹽溶液，緩沖溶液，水，防腐劑，離子，酸類，堿類，器官移植用的保存溶液，血液置換液，吸入、輸注和注射用溶液與藥物。
本發明涉及將核酸引入真核生物細胞內的新的配制品，其特征在于該配制品具有的pH-值在pH6.0到pH7.4，優選地在從約pH6.2到約pH7.0范圍內，且特別優選地為pH6.5或pH7.0，及/或具有的陰離子濃度在約5至約100毫摩爾/升范圍內，優選地在約5至約50毫摩爾/升范圍內，且特別優選地為在約5至約10毫摩爾/升范圍內，且優選地為氯離子濃度，及/或非甾體抗炎藥物，例如，氟比洛芬(flurbiprofen)或吲哚洛芬(indoprofen)，其濃度在約10至約500微摩爾/升范圍內，優選地在約50至約250微摩爾/升范圍內，且特別優選地其濃度為約100微摩爾/升。再者，除了上面所述活性成分和特點之外，該配制品也可以包含一或多種適當的緩沖劑。適當的緩沖劑之例子為改良Ringer氏液，含有145毫摩爾/升的Na+，5毫摩爾/升的K+，11毫摩爾/升的Cl-，2毫摩爾/升的Ca2+，1毫摩爾/升的Mg2+，10毫摩爾/升的Hepes，145毫摩爾/升的羥乙基磺酸鹽(isethionate)，10毫摩爾/升D-葡萄糖，其中的pH-值在從6.5至7.0的范圍之內，優選地為6.5或7.0。
最初，本發明人觀察到被所探討的人類內皮細胞吸收到的經熒光-染料-標記誘餌寡核苷酸之細胞內分布是不均勻的。除了在囊泡狀構造中積聚，還顯示出對細胞質和細胞核有更強的彌漫性標記。特別者，核酸在囊泡中的積聚支持該吸收程序可能為受體介導的，細胞內吞樣作用程序(endocytosis-like process)。
隨后證明，如同血管平滑肌細胞或單核細胞一般，人類內皮細胞會表達一或兩種葉酸受體的變異體，其為將核酸吸收到細胞內所用的潛在候選物。此種受體優選地系集中在細胞膜內的所謂小窩(caveolae)中。小窩的破壞-透過膽固醇的抽取或對小窩蛋白-1表達的抑制(圖2)-會導致誘餌寡核苷酸的吸收之明顯限制。
不同的是，將細胞外pH-值降低有利于受體介導的葉酸結合(親和性)且對于誘餌寡核苷酸吸收到人類內皮細胞內也顯示出此種pH-相關性(圖3)。在葉酸結合到受體之后，小窩即被內部化(internalised)(細胞攝液作用(potocytosis；RGW Anderson(1998)Annu.Rev.Biochem，67，199)。為了將包封在這些囊泡內的葉酸釋放到細胞質之內，需要一種陰離子轉運體(載體)，此可能被4-(二丙基氨磺酰基)苯甲酸(probenicid)所抑制(Kamen et al.(1991)J.Clin.Invest.87，1442)且此與系面所述及的還原葉酸載體hFRC不相同。事實上，誘餌寡核苷酸在人類內皮細胞內的積聚也是4-(二丙基氨磺酰基)苯甲酸敏感性的。
所以，本發明涉及一種具有pH值在從約pH6.0至約pH7.4范圍內之配制品。該pH值優選地系在pH6.2至約pH7.0的范圍之內且特別優選地為約pH6.5或7.0。
除了受體介導的細胞攝液作用，葉酸進入哺乳動物細胞內的主要轉運途徑系通過還原-葉酸載體hRFC(LH Matherly(2001)Prog.NucleicAcid Res.Mol.Biol.67，131)。原則上，此種轉運體必須能夠被進行細胞分裂的每一體細胞所用，因為葉酸系DNA合成所必需者(也請參考Whetstine et al.(2002)Biochem.J.Jul 29(epub ahead of print))。人類內皮細胞也會表達hFRC。反義寡核苷酸支持的將hFRC蛋白質的表達縮減到這些細胞的三分之一之結果導致45％的誘餌-寡核苷酸吸收被抑制(圖4)。進一步提示這些轉運系統參與誘餌-寡核苷酸吸收(參考在LH Matherly(2001)Prog.Nucleic Acid Res.Mol.Biol.67，131中所述的hFRC之特性)的是，與葉酸比較之下，抗葉酸藥氨甲喋呤(氨甲喋呤)可顯著改進其抑制，以及對陰離子-交換抑制劑DIDS(4，4’-二異硫氰酸基-2，2’-二苯乙烯-二磺酸(4，4’diisothiocyano-2，2’-stilben-disulfonic acid))的高度敏感性。
事實上，對于hFRC-媒介的陰離子葉酸進入哺乳動物細胞內之吸收，需要使一陰離子，優選地氯離子，以對抗方式，離開細胞(反向共同運輸(antiport))及/或使一陽離子，優選地一質子(H+)共同運輸到細胞之內(同向共同運輸(symport))。無論如何，由于在7.5的準生理pH-值下，載體對于葉酸及/或氨甲喋呤具有最大的親和性，細胞外pH的降低(亦即，質子濃度的提高)無法透過此種運輸途徑達到降低核酸吸收的合意效用。助成將氯離子從細胞運送出來是更為有希望者，例如，經由減低細胞外氯離子濃度(典型者120毫摩爾/升)，優選地低于細胞內值(12毫摩爾/升)，藉此造成對于氯離子的向外導向濃度梯度。如圖5中所顯示者，細胞外氯離子濃度的減低確實可導致在誘餌-寡核苷酸吸收到人類內皮細胞內上的明顯改善。
簡言之。上面所報告的發現所肯定者為，與pH-敏感性葉酸-受體介導的細胞攝液作用一起者，核酸進入人類細胞內的吸收作用也通過還原葉酸載體而發生，且此運載途徑的效率可以經由降低細胞外陰離子濃度，尤其是氯離子濃度而顯著地增加。
所以，根據本發明的配制品涉及一種配制品，其陰離子濃度，優選地氯離子濃度，在約5至約100毫摩爾/升范圍內，優選地在約5至約50毫摩爾/升范圍內，且特別優選地從約5至約10毫摩爾/升范圍內。再者，可以經由，例如，添加等摩爾量的羥乙基磺酸鹽而達到氯離子的生理學取代。
除了物質的吸收，其排出也對其在細胞內的短暫濃度及/或利用度起著重要作用。抗炎性藥物(非甾體抗炎藥物)，例如，氟比洛芬(flurbiprofen)或吲哚洛芬(indoprofen)，可抑制葉酸從哺乳動物細胞運載出的途徑已經述及(M Saxena，GB Henderson(1996)Biochem.Pharmacol.51，974)。如圖6中所顯示，誘餌寡核苷酸也通過此種運載途徑從人類細胞移出；也就是說，細胞內的核酸濃度可以經由此種運載途徑的阻斷而明顯地增加。
根據本發明的配制品因而也涉及一種包括非甾體抗炎藥物的配制品，該非甾體抗炎藥物例如氟比洛芬或吲哚洛芬的濃度在約10至約500微摩爾/升的范圍，優選地在約50至約250微摩爾/升范圍內，且特別優選地為約100微摩爾/升。
除了誘餌寡核苷酸，上面所述的運載途徑也可能為其它核酸，例如單鏈RNA/DNA寡核苷酸或雙鏈RNA寡核苷酸，所使用到可相比的程度，且不限于內皮細胞。例如，經FITC-標記單鏈DNA寡核苷酸可以與相應的雙鏈(誘餌)寡核苷酸一樣有效地運載到人類內皮細胞之內，且誘餌寡核苷酸進入人類內皮細胞和血管平滑肌細胞內的吸收速率通常是相同的。
除了一般的條件，例如，誘餌寡核苷酸有效地中和其目標轉錄因子，對于核酸的治療效率至關重要的是，要在不需要潛在地具有胞毒性的輔助劑之下快速地且足夠地吸收到目標細胞內。于此方面，施用這些核酸的本發明的優選的方法包括使用恰當的緩沖劑，所述緩沖劑1.具有的pH值在約pH6.0至pH7.4范圍內，優選地在約pH6.2至pH7.0范圍內，且特別優選地為約pH6.5或7.0，及/或2.具有的細胞外陰離子濃度，優選地氯離子濃度(例如，通過添加羥乙基磺酸鹽)，在約5至約100毫摩爾/升范圍內，優選地在約5至約50毫摩爾/升范圍內，且特別優選地在約5至約10毫摩爾/升范圍內，及/或3.具有非甾體抗炎藥物，優選地氟比洛芬或吲哚洛芬，其濃度在約10至約500微摩爾/升的范圍內，優選地在約50至約250微摩爾/升的范圍內，且特別優選地為約100微摩爾/升。
再者，本發明涉及一種用以將核酸引入真核細胞內之配制品，其中可以組合二或更多項的上述特征。圖7顯示出其結果所達到的核酸生物學活性增加之一例子。一優選的配制品包括調整根據本發明的pH-值與氯離子-濃度之組合。
于一優選的具體實施方式
中，一要用來與目標細胞接觸的根據本發明之配制品只包含核酸(濃度為從0.01至100微摩爾/升)和緩沖劑。可以使用一或更多種恰當的緩沖劑。此類型的緩沖劑的一個例子為改良Ringer氏液，其包含145毫摩爾/升的Na+，5毫摩爾/升的K+，11毫摩爾/升的Cl-，2毫摩爾/升的Ca2+，1毫摩爾/升的Mg2+，10毫摩爾/升的Hepes，145毫摩爾/升的羥乙基磺酸鹽，10毫摩爾/升D-葡萄糖，pH為6.5或7.0，如在圖7所示實驗中所使用者。
在根據本發明方法中所使用的配制品優選地系經由注射、輸注、吸入或任何其它施用形式的局部施用。在本發明方法之內使用的配制品之活體外施用(血管、組織或細胞的溫育)也可以促成局部進入。其目標為使含核酸的混合物盡可能地接近要處理的細胞且創造出——在最短時間內——用于將核酸吸收到目標細胞內的最優細胞外環境。
下面諸實施例僅作為解說之用而無意用來限制本發明的范圍。
1.細胞培養人類內皮細胞系從臍靜脈(umbilical veins)使用1.6單位/毫升的分散酶(dispase)在Hepes-改良Tyrode溶液中在37℃處理30分鐘而分離，且在明膠包被的6孔組織培養皿上(2毫克/毫升明膠于0.1M HCl中室溫下30分鐘)于1.5毫升M199培養基(Gibco Life Technologies，Karlsruhe，Germany)內培養，該培養基含有20％胎牛血清，50單位/毫升的青霉素，50微克/毫升的鏈霉素，10單位/毫升的制霉菌素，5mM HEPES和5mM TES，1微克/毫升的肝素與40微克/毫升的內皮細胞生長因子(endothelialgrowth factor)。該細胞通過如下方面進行鑒定典型的鋪路石形態學(pavement morphology)，對von Willebrandt-Factor(vWF)的陽性免疫染色，PECAM-1(CD31)的陽性熒光分析展示(FACS)，以及對平滑肌α-肌動蛋白(α-actin)的陰性免疫染色(Krzesz et al.(1999)FEBS Lett.453，191)。
人類血管平滑肌細胞分離自切下的胸腺之靜脈。在移除掉粘附的結締組織和脂肪組織之后，使用解剖刀將血管機械地細分。其后，將組織置于一消化溶液(5％胎牛血清，5毫摩爾/升HEPES，5毫摩爾/升TES，50單位/毫升青霉素，50微克/毫升鏈霉素，10單位/毫升制霉菌素和0.15％膠原酶(collagenase)(溶組織梭菌(Clostridium histolyticum)，Sigma-Aldrich，Deisenhofen)于DMEM培養基內；Gibco Life Technologies)中在37℃與5％CO2溫育14-16小時。于將細胞懸浮液在室溫下以1000rpm離心5分鐘之后，將細胞沉淀懸浮于2-3毫升的生長培養基之內(SmoothMuscle Cell Growth Medium 2，PomoCell GmbH，Heidelberg)，且鋪平到組織培養皿之內，所述培養皿事先已經使用明膠在室溫下包被至少30分鐘(2毫克明膠每毫升0.1N HCl)，且使用該培養基洗滌過兩次。2天之后，于無菌條件之下，置換生長培養基且使用該培養基略為洗滌細胞。于后續期間中，每隔4天更換該培養基。
將人類單核細胞系THP-1(ATCC TIB 202)置于RPMI 1640培養基(Gibco Life Technologies)中培養，該培養基含有10％胎牛血清，50單位/毫升的青霉素，50微克/毫升的鏈霉素與10單位/毫升的制霉菌素。
2.誘餌寡核苷酸合成雙鏈誘餌寡核苷酸從互補的單鏈，經熒光素異硫氰酸酯(FITC)-標記的寡核苷酸(Eurogentec，Kln，Germany)按照在Krzesz et al.(1999)FEBS Lett.453，191中所述制備。該寡核苷酸的單鏈序列如下(底下劃線者代表經硫代磷酸酯連接的堿基(phosphorothioate-coupled bases)AP-1，5’-CGCTTGATGACTCAGCCGGAA-3’(SEQ ID NO1)C/EBP，5’-TGCAGATTGCGCAATCTGCA-3’(SEQ ID NO2)STAT-1，5’-CATGTTATGCATATTCCTGTAAGTG-3(SEQ ID NO3)3.反義寡核苷酸的合成與溫育對于一反義混合物，將3％脂質體轉染試劑(Lipofectin)(v/v)(GibcoLife Technologies)添加到1毫升培養基中，且在室溫(RT)下溫育60分鐘。其后，添加相應的反義或對照寡核苷酸(Eurogentec，Kln，Germany)，到最終濃度為0.5微摩爾/升，且在室溫下繼續溫育30分鐘。于實驗起始時，加入相應量的肝素和內皮細胞生長因子，且使用反義脂質體轉染試劑培養基置換常規的內皮細胞培養物的細胞培養基。于6小時之后，取出反義脂質體轉染試劑培養基并改換以新鮮的細胞培養基；于轉染24小時之后，進行誘餌-寡核苷酸吸收的Western印跡分析及/或熒光-顯微鏡分析。
小窩蛋白-1的反義寡核苷酸所具序列(硫代磷酸酯鍵標記為*)為5’-A*T*G*TCCCTCCGAGT*C*T*A-3’(SEQ ID NO4)；作為對照，使用具有與反義寡核苷酸相同的堿基組成但是不同的序列之混雜寡核苷酸(5’-C*T*C*GATCCTGACTA*C*T*G-3’)(SEQ ID NO5)。還原葉酸載體(hRFC)的反義寡核苷酸所具序列為5’-C*A*A*A*GG*T*A*GC*A*C*A*CG*A*G-3’(SEQ ID NO6)。在此同樣使用一混雜寡核苷酸作為對照(5’-A*C*A*T*GG*A*C*A*CG*A*A*GC*A*G-3’)(SEQ ID NO7)。
4.RT-PCR分析總細胞RNA是使用Qiagen RNeasy Kit(Qiagen，Hilden，Germany)分離的；其后，使用最大量3微克的RNA和200單位的SuperscriptTMII逆轉錄酶(Gibco Life Technologies)，以20微升的總體積，根據制造商的說明實施cDNA-合成。對于后續的聚合酶鏈反應(PCR)，在50微升的總體積中使用5微升的cDNA和1單位的Taq DNA聚合酶(Gibco LifeTechnologies)。將PCR產物在含有0.1％的溴化乙錠(ethidium bromide)之1.5％瓊脂凝膠上分離，使用CCD攝影機系統以光密度測量法測量分離帶的強度并且使用Scanalytics(Billerica，MA，USA)所制造的One-Dscan凝膠分析軟件予以記錄。
所有的PCR反應都針對每一引物配對(primer pair)在Tpersonal Cycler(Biometra，Gttingen，Germany)中個別地進行
hFR1(葉酸受體α)，產物大小181bp，37循環，添加溫度60℃，(正向引物)，5’-CAAGGTCAGCAACTACAGCCGAGGG-3’(SEQ IDNO8)，(反向引物)5’-TGAGCAGCCACAGCAGCATTAGGG-3’(SEQ IDNO9)。
hFR2(葉酸受體b)，產物大小385bp，37循環，添加溫度61℃，(正向引物)，5’-CTGTGTAGCCACCATGTGCAGTGC-3’(SEQ IDNO；10)，(反向引物)5’-TGTGACAATCCTCCCACCAGCG-3’)(SEQ IDNO11)。
h1FRC，產物大小333bp，37循環，添加溫度60℃，(正向引物)，5’-CCAAGCGCAGCCTCTTCTTCTTCAACC-3’(SEQ ID NO12)，(反向引物)5’-CCAGCAGCTGGAGGCAGCATCTGCC-3’(SEQ ID NO13)；Sprecher et al.，(1998)Arch.Dermatol.Res.290，656)。
h2FRC2，產物大小167bp，37循環，添加溫度56℃，(正向引物)，5’-CCATCGCCACCTTTCAGATTGC-3’(SEQ ID NO14)，反向引物5’-CGGAGTATAACTGGAACTGCTTGCG-3’(SEQ ID NO15)。
所有PCR產物的特性都以后續的測序分析于以確定。
5.Western印跡分析將人類臍靜脈內皮細胞經由置于液氮中與在37℃解凍連續5次的處理以使之破裂。按照Hecker et al.(1994)Biochem J.299，247中所述制造蛋白質提取物。將20-30微克的蛋白質使用10％聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis)，在存在SDS的變性條件下根據標準程序予以分離，且轉移到BioTraceTM聚偏二氟乙烯轉移膜(polyvinylidene fluoride transfer membrane)之上(Pall Corporation，Rossdorf，Germany)。使用得自BD Biosciences，Heidelberg，Germany的多克隆抗-人類抗體進行小窩蛋白-1的免疫學實證。使用一多克隆抗-人類抗體(感謝Dr.Hamid M.Said，Veterans Affairs Medical Center，Long Beach，California USA的慷慨提供)進行hFRC蛋白質的免疫學實證。對CD40蛋白質，使用一多克隆抗-人類抗體(Research Diagnostics Inc.，Flanders，New Jersey，USA)予以檢測。對于蛋白質分離帶，通過在添加過氧化物酶-偶合抗-小鼠IgG(peroxidase-coupled anti-mouse IgG)及/或抗-兔IgG(1∶3000，Sigma，Deisenhofen，Germany)之后，使用化學發光法(SuperSignal Chemiluminescent Substrate；Pierce Chemical，Rockford，IL，USA)且隨后進行放射自顯術(autoradiography)(HyperfilmTMMP，Amersham Pharmacia Biotech，Buckinghamshire，England)予以顯形。在“剝開”轉移膜(5分鐘0.2N NaOH，接著用H2O洗滌3×10分鐘)之后，經由使用單克隆抗體與過氧化物酶-偶合抗-小鼠IgG(兩者皆得自Sigma-Aldrich，1∶3000稀釋)，展示相同的β-肌動蛋白蛋白質分離帶，從而證明有相同蛋白質量的施加與轉移。
6.熒光顯微鏡于實驗起始之前，將在24孔細胞培養板中培養的內皮細胞使用37℃Ringer氏液(組成145毫摩爾/升Na+，5毫摩爾/升K+，156毫摩爾/升C1-，2毫摩爾/升Ca2+，1毫摩爾/升Mg2+，10毫摩爾/升Hepes，10毫摩爾/升D-葡萄糖，pH7.35)洗滌一次。其后，在37℃下，依照實驗混合物而定，施加150微升經改良或分別地未-改良Ringer氏液于細胞，且添加經FITC-標記的誘餌寡核苷酸，其終濃度為10微摩爾/升。于在37℃下和環境空氣中溫育長達180分鐘的期間之后，使用1毫升溫的未-改良Ringer氏液洗滌細胞3次。使用連接到Axiovert S100TV顯微鏡(Zeiss，Gttingen，Germany)的MicroMax CCD-攝影機(PrincetonInstruments Inc.，Trenton，NJ，USA)以494nm的激發波長，518nm的發射波長與200x的放大倍率記錄熒光強度。熒光影像(對每一份實驗混合物采取一幅影像)與后續的定量分析系使用MetaMorph V3.0 Software(UniversalImaging West Chester，PA，USA)實施。對于定量分析，首先將一實驗混合物的所有熒光影像校準到相同的量度和對比水平。其后，使用該軟件測定對每一影像跨過諸個別像素積分的整體亮度作為熒光強度的量度，由是呈現出誘餌寡核苷酸的細胞內濃度。
7.統計學分析除非有另外不相同的指明，否則附圖中所有的數據都是顯示為n個實驗的平均值±SEM。使用單變量方差分析(one-sided variance analysis)(ANOVA)，隨后進行Dunnett Post Test而進行統計評定系。采用＜0.05的P-值作為有統計學顯著差異。
序 列 表<110>亞文塔克有限公司<120>用于將核酸引入真核生物細胞內的配制品<130>HEC-007 PCT<140>Unknown<141>2003-09-02<150>102 40 418.6<151>2002-09-02<160>15<170>Patent version 3.1<210>1<211>21<212>DNA<213>Synthetic sequence<220>
<221>Decoy oligonucleotide<222>(1)..(21)<223>
<400>1cgcttgatga ctcagccgga a 21<210>2<211>20<212>DNA<213>Synthetic sequence<220>
<221>Decoy oligonucleotide
<222>(1)..(20)<223>
<400>2tgcagattgc gcaatctgca 20<210>3<211>25<212>DNA<213>Synthetic sequence<220>
<221>Decoy oligonucleotide<222>(1)..(25)<223>
<400>3catgttatgc atattcctgt aagtg 25<210>4<211>17<212>DNA<213>Synthetic sequence<220>
<221>Antisense oligonucleotide<222>(1)..(17)<223>
<400>4atgtccctcc gagtcta17<210>5<211>17<212>DNA<213>Synthetic sequence<220>
<221>Antisense oligonucleotide<222>(1)..(17)<223>
<400>5ctcgatcctg actactg17<210>6<211>17<212>DNA<213>Synthetic sequence<220>
<221>Antisense oligonucleotide<222>(1)..(17)<223>
<400>6caaaggtagc acacgag17<210>7<211>17<212>DNA<213>Synthetic sequence<220>
<221>Antisense oligonucleotide<222>(1)..(17)<223>
<400>7acatggacac gaagcag 17<210>8<211>25<212>DNA<213>Synthetic sequence<220>
<221>Primer
<222>(1)..(25)<223>
<400>8caaggtcagc aactacagcc gaggg 25<210>9<211>24<212>DNA<213>Synthetic sequence<220>
<221>primer<222>(1)..(24)<223>
<400>9tgagcagcca cagcagcatt aggg24<210>10<211>24<212>DNA<213>Synthetic sequence<220>
<221>Primer<222>(1)..(24)<223>
<400>10ctgtgtagcc accatgtgca gtgc 24<210>11<211>22<212>DNA<213>Synthetic sequence<220>
<221>Primer
<222>(1)..(22)<223>
<400>11tgtgacaatc ctcccaccag cg 22<210>12<211>24<212>DNA<213>Synthetic sequence<220>
<221>Primer<222>(1)..(24)<223>
<400>12ccaagcgcag cctcttcttc aacc 24<210>13<211>26212>DNA<213>Synthetic sequence<220>
<221>Primer<222>(1)..(26)<223>
<400>13ccagcagcgt ggaggcagca tctgcc 26<210>14<211>22<212>DNA<213>Synthetic sequence<220>
<221>Primer<222>(1)..(22)<223>
<400>14ccatcgccac ctttcagatt gc 22<210>15<211>25<212>DNA<213>Synthetic sequence<220>
<221>Primer<222>(1)..(25)<223>
<400>15cggagtataa ctggaactgc ttgcg 2權利要求
1.一種用于將核酸引入真核細胞內的藥物配制品，其特征在于該配制品具有的pH-值在pH 6.0至pH 7.4范圍內，及/或具有的陰離子濃度在5至100毫摩爾/升范圍內，及/或提供濃度在10至500微摩爾/升范圍內的非甾體抗炎藥物。
2.根據權利要求1的配制品，其中該pH值在6.2至7.0范圍內。
3.根據權利要求1或2的配制品，其中該pH值為6.5或7.0。
4.根據權利要求1至3中任一項的配制品，其中陰離子濃度在5至50毫摩爾/升范圍內。
5.根據權利要求1至4中任一項的配制品，其中陰離子濃度在5至10毫摩爾/升范圍內。
6.根據權利要求1至5中任一項的配制品，其中陰離子是氯離子。
7.根據權利要求1至6中任一項的配制品，其中非甾體抗炎藥物的濃度在50至250微摩爾/升范圍內。
8.根據權利要求1至7中任一項的配制品，其中非甾體抗炎藥物的濃度為100微摩爾/升。
9.根據權利要求1至8中任一項的配制品，其中該非甾體抗炎藥物為氟比洛芬或吲哚洛芬。
10.根據權利要求1至9中任一項的配制品，其進一步包括核酸、載體物質和添加劑。
全文摘要
本發明涉及將核酸引入真核生物細胞內的藥物配制品，其特征在于該配制品具有在pH 6.0至pH 7.4范圍內的pH－值，及/或在從5至100毫摩爾/升范圍內的陰離子濃度及/或提供具有在從10至500微摩爾/升范圍內的濃度之非甾體抗炎藥物。
文檔編號A61K48/00GK1694714SQ03824892
公開日2005年11月9日 申請日期2003年9月2日 優先權日2002年9月2日
發明者馬庫斯·海克, 安德烈·H.·華格納 申請人:亞文塔克有限公司