專利名稱：核酸向細胞的胞外體轉移的制作方法
核酸向細胞的胞外體轉移 相關申請的交叉參考
本申請要求于2006年5月3日提交的第60〃97,149號美國臨 時申請的優先權，在此引入作為參考。
背景技術：
發明領域
本發明是基于釋放到細胞外環境的胞外體能從親本細胞攜帶 選擇性RNA的意外發現。根據本發明，該發現可以用于通過胞外 體向受體細胞轉移遺傳物質。通過向受體細胞轉移核酸，胞外體 會影響其它細胞(受體細胞)的蛋白質機能，并因此影響蛋白質 內含物。本發明首次證明利用胞外體能夠將核酸，如RNA、 DNA 在細胞或器官之間有意地轉移，從而可以用于哺乳動物細胞的基 因調控和治療。
相關技術描述
胞外體是由多泡體與質膜融合后釋放到細胞外環境中的內吞 源性的小膜囊泡。胞外體的直徑大小在30和100nm之間。其表面 由來自供體細胞細胞膜的脂雙層構成，而且其含有來自產生該胞 外體的細胞的胞漿，并且從表面的親本細胞表達膜蛋白。胞外體根據其衍生細胞的細胞類型而表現不同的組成和功
能。不存在"胞外體特異性"蛋白；然而在這些囊泡內鑒定出的幾種 蛋白質與反映其來源的內含體和溶酶體有關。多數胞外體富含 MHC I和MHC II (主要組織相容性復合體I和II;其對于將抗原 提呈給如T-淋巴細胞等免疫活性細胞很重要)、四跨膜蛋白 (tetraspanins)、幾種熱休克蛋白、細胞骨架成分(如肌動蛋白和 微管蛋白)、細胞膜融合相關蛋白、信號轉導蛋白和胞漿酶。
胞外體由多種細胞產生，包括上皮細胞、B淋巴細胞和T淋 巴細胞、肥大細胞(MC)及樹突細胞(DC)。在人類中，胞外體 已經在血漿、尿、支氣管肺泡灌洗液、腸上皮細胞和腫瘤組織中 發現。
胞外體的所有功能并未全部闡明，但數據強烈顯示了它們介 導細胞間通訊。這種通訊能以不同方式發生。首先，胞外體能以 細胞與細胞間相互作用相似的方式結合到細胞表面受體。其次， 胞外體能粘附至細胞膜上并為細胞提供新的受體和特性。因此， 胞外體也能與靶細胞融合并在兩種細胞類型間交換膜蛋白和胞 槳。
我們對了解特定的由肥大細胞釋放的胞外體的內含物及生物 學功能方面做了特別的努力。在蛋白質組分析中，我們發現這些 胞外體含有比先前所了解的更多的蛋白質。然而，我們研究中的
獨特發現是我們發現源自肥大細胞的胞外體中含有大量選擇性 RNA。此外，不同的受體細胞的使用表現出胞外體RNA的吸收， 這表明了遺傳物質從胞外體向受體細胞內的轉移，這種轉移將次導致靶細胞內特定蛋白質的翻譯。
考慮到胞外體蛋白內含物及其與不同受體細胞通訊的能力， 尤為有用的是能夠修改胞外體的基因內含物，以便添加或調節受 體細胞的基因。本申請描述了利用胞外體攜帶特定遺傳物質和將 其轉移到受體細胞的能力的方法。在該方法中，受體的功能及其 保持存活、進一步發育、增殖或成熟的能力受到影響。
該方法獨特，且不同于任何先前所描述的方法。 一些專利和 專利申請經由胞外體蛋白與免疫細胞之間的相互作用，通過其刺 激或抑制功能利用胞外體來影響免疫系統，并通過影響免疫系統 來治療病毒性疾病。已經表明胞外體蛋白質能通過突變來修飾以 影響免疫系統。然而，我們尚未發現任何專利或專利申請或任何 公開可用的信息描述或表明了胞外體向細胞轉移遺傳物質或核酸 的用途。
發明概述
本發明公幵了通過胞外體向受體細胞遞送核酸構建體的新方
法。本發明的方法包括利用親本細胞將RNA和DNA構建體轉移 到胞外體內(親本細胞的轉化、轉染、或修飾)，或使用如轉化和 轉染等傳統方法，直接將核酸引入胞外體。本發明的方法是一種 非常好的基因治療手段，該手段通過向受體細胞引入遺傳物質來 補償異常基因或引入產生蛋白質的RNA或DNA，該蛋白質影響 受體細胞功能或存活能力或發育能力或成熟能力。對于基因治療 來說，通常使用病毒或脂質體作為載體來轉移遺傳物質，這是由于它們能通過感染細胞來遞送新的基因。與傳統方法相比，使用 胞外體有很多優勢，最重要地是，胞外體源自細胞，甚至可能是 受體本身的細胞，因此對于免疫系統來說不是外來個體，從而能 避免不利的免疫反應。因此對于用于基因調控和治療來說，胞外 體容易產生、分離和修飾。
通過以下內容和隨附的權利要求書，本發明的其它目的和特 征將更加明顯。
發明詳細說明及其優選實施方式
正如本發明所述，利用胞外體囊泡向細胞的胞質或核轉移遺 傳物質、核酸能治療遺傳疾病、細胞或身體功能障礙、誘導或抑 制細胞死亡(細胞凋亡)、改變細胞老化、誘導耐受、重新導向現 有的免疫應答、改變胞內活性或細胞行為。它還能用于遺傳病癥、 惡性腫瘤疾病或涉及如下細胞的疾病的各種基因治療免疫細胞 或身體內的任何其它細胞類型，包括脈管組織、上皮細胞、間質 細胞、肌肉組織、骨骼系統、神經系統、肝細胞、腎細胞、腸細 胞、肺細胞、皮膚細胞或身體內的任何其它細胞。
本發明中描述的能通過胞外體轉移的遺傳物質是:microRNA、 mRNA、 tRNA、 rRNA、 siRNA、調節RNA、非編碼和編碼RNA、 DNA片段、和DNA質粒，包括各類核酸。將遺傳物質(DNA或 RNA的構建體、或各類核酸)直接轉移至胞外體的方法是轉化、 轉染和顯微注射。
遺傳性不同的胞外體可以利用其供體細胞或者通過向其中引入特定核酸進行分離，以用于進一步向受體細胞遞送。產生含有 一組遺傳物質的不同方法描述如下。
利用胞外體產生細胞來產生遺傳性不同的胞外體以用于進一 步向受體細胞遞送的不同過程包括
(a) 來自不同供體細胞的胞外體 含有不同組遺傳物質的胞外體可以從不同的供體細胞分離
(如B淋巴細胞和T淋巴細胞、肥大細胞和樹突細胞)以用于進
一步向受體細胞遞送。由于供體細胞的作用和環境不同而引起其 基因型不同，因此來自不同細胞類型的分離胞外體產生了不同基 因型的胞外體。
(b) 來自不同條件的胞外體
胞外體產生細胞在某種條件下的生長會引起細胞改變，隨后 形成經遺傳修飾的胞外體。然后這些胞外體可用于將一組核酸轉 移到受體細胞。
(c) 來自不同人或疾病的胞外體
來自不同人或疾病的胞外體包含不同組的核酸。由于供體細 胞來源和條件不同使得胞外體的基因型不同。含有單一組核酸的 胞外體能被分離以用于進一步向受體細胞遞送核酸。
(d) 來自經遺傳修飾的供體細胞的胞外體 胞外體產生細胞內的基因破壞或突變引起經遺傳修飾的胞外
體，這種胞外體能用于向受體細胞遞送其核酸。胞外體內存在的 各種核酸的表達可能受到胞外體產生細胞的基因操作的影響(消 除或上調/下調)。例如，胞外體產生細胞內的基因破壞導致胞外體內缺少相應的mRNA。同時，胞外體產生細胞內基因的上調或下 調影響胞外體內相應mRNA的量。
特定核酸構建體(克隆基因、DNA片段和質粒、microRNA、 siRNA、編碼或非編碼的DNA和RNA)能通過經遺傳修飾的胞外 體轉移到受體細胞。核酸構建體可以使用標準技術來制造，如克 隆、分離和RNA或DNA序列的擴增，以用于進一步到向胞外體 內轉化。
(a) 利用其供體細胞將特定構建體插入胞外體 新的構建體(RNA和DNA)能利用其供體細胞而引入胞外體。
核酸構建體能被引入供體細胞(胞外體產生細胞)，從而通過細胞 內功能將其自身的轉錄物或構建體轉位至胞外體內。
(b) 特定構建體直接插入胞外體 胞外體能從不同的來源分離，如體外生長的細胞、人體或源
于人和動物的細胞。RNA或DNA的基因構建體能通過如體外轉 化、轉染和顯微注射等傳統的分子生物技術直接引入這些胞外體。 經遺傳修飾的胞外體能進一步用于向受體細胞轉移核酸。
本發明還涉及不包含任何實質量核酸的空胞外體。這些胞外 體可以用來插入感興趣的DNA。
本發明還涉及包含至少一種外加異源核酸的胞外體，此處"異 源"一詞表示添加的核酸或酸不是衍自原胞外體本身。因此添加的 核酸可能源自其它物種；或來自胞外體以外的其它器官或組織或 來自不同供體細胞、不同條件下、不同人或疾病或來自經遺傳修 飾的供體細胞。核酸可以是上述能被轉移的任何遺傳物質。
本發明還涉及包含至少一種外加異源核酸的胞外體在制備藥 物中的應用。
制備經遺傳修飾的胞外體的方法
遺傳物質轉化或轉染至胞外體內
在分子生物學中，術語"轉化"和"轉染"更普遍地用于描述
DNA和RNA轉移的機制，其是1944年由Oswald Avery、 Colin Macleod禾口 Maclyn McCarty首次提出(Lederberg J.， Genetics. 1944 Feb; 136(2):423畫6)。
(a) 電穿孔
利用這種方法，通過經由100-200V/cm的電場短暫電擊，在 細胞或胞外體上形成許多孔。DNA/RNA能通過電場形成的孔進入 細胞或胞外體。
(b) 脂質體轉染
該方法通常稱作轉染，能用于經含有期望基因構建體的囊泡 介導的DNA/RNA的細胞或胞外體轉化。囊泡與細胞膜融合(類 似于肉湯表面兩個油滴的融合)且囊泡與細胞中的內含物相結合。 市場上有許多即可使用的轉染試劑盒，如來自Panomics的 DeliverX siRNA轉染試劑盒(目錄號DX0002)、來自Roche的 FuGENE HD轉染試劑和來自Invitrogen的LIPOFECTAMINE 2000 (目錄號11668-027)。
(c) 利用熱激轉化在二價陽離子如Ca2+ (在CaCb中)存在下冷卻細胞/胞外體， 使其膜對于RNA或DNA質粒/片段具有滲透性。將細胞/胞外體與 DNA—起孵育，然后短暫熱激(42°C， 30~120秒)使DNA進入 細胞。該方法對環狀質粒DNA效果更好。
以上方法簡單描述了如何實現經遺傳修飾的胞外體向受體細 胞轉移RNA和DNA。分離含有RNA/DNA或經修飾含有感興趣 基因的胞外體并將其移位到受體細胞以影響其生物學功能或存 活。因此，胞外體將其中的內含物釋放到靶細胞的細胞質中，這 繼而導致mRNA在靶細胞內通過細胞自身蛋白機器翻譯為特定蛋 白質。此外，胞外體能夠攜帶并轉移編碼和非編碼的小RNA，如 能調控特定基因翻譯的microRNA和siRNA。
本發明所述的作為DNA或RNA載體囊泡的胞外體可以用來 治療造血、非造血、干細胞和器官的遺傳性疾病。胞外體囊泡還 能用作DNA或RNA構建體的載體以用于治療人或動物的微生物 感染或疾病或功能障礙，或轉移任何生物膜的遺傳物質。
由于人CD4T細胞是HIV感染的靶細胞，可以用胞外體向被 感染的T細胞運載和轉移的，尤其被設計用于沉默病毒RNA翻譯 的RNA或DNA構建體(siRNA、 RNAi或DNA)來治療被感染 細胞。因此，本發明公開了能將其核酸轉移到CD4 T細胞的胞外 體可以用于治療HIV感染的T細胞及T細胞惡性瘤如淋巴瘤或淋 巴細胞性白血病。
通過改變胞外體產生細胞的條件來改變或修飾胞外體的遺傳 物質是通過改變PH、溫度、生長條件，或使用針對胞外體產生細胞的抗體/化學品來實現的。這會導致核酸內含物的變化。另外， 胞外體產生細胞中細胞因子、趨化因子及其它基因的過度表達或 抑制可用于改變或修飾胞外體的基因內含物。
利用胞外體囊泡向特定細胞轉移正義或反義RNA來關閉基因
而不是添加新的基因引起特定基因下調(減緩)或翻譯的阻止。
這種方法稱作RNA干擾(siRNA)。
本發明使得在給病人或受體人或動物給藥干細胞之前，在體 外將遺傳物質傳遞到從患者或供體獲得的干細胞成為可能。
為了將核酸給予受體細胞或組織，可以通過將胞外體添加至 體外細胞培養物中或靜脈注射這些胞外體或以該領域已知的任何 其它體內途徑將含有DNA或RNA的胞外體給予細胞。胞外體能 靶向體內的任何細胞，包括心血管系統細胞、骨骼肌細胞、關節 細胞、神經細胞、腸細胞、肺細胞、肝細胞或腎細胞、或免疫系 統細胞、或人或動物體內具有任何功能或功能障礙的各種類型細 胞，包括惡性腫瘤細胞。
如本發明所公開的，胞外體可用來遞送遺傳物質到受體細胞， 以便在人或動物的任何細胞中利用細胞本身的蛋白質機能產生任 何藥物或任何藥物前體，或者影響任何藥物的功能或代謝。
為了避免不期望的或無關遺傳物質的干擾，優選利用不含遺 傳物質的胞外體。空胞外體可用于直接轉移到受體細胞或者將特 定基因(RNA或DNA)直接轉染或轉化到胞外體中。
源自肥大細胞的胞外體的檢測分離自鼠肥大細胞系MC/9 (ATCC Manassas, VA, USA,編號: CRL-8306)釋放的胞外體，將其吸附在經碳涂覆的柵格上，用電 子顯微鏡進行檢測。為了檢測胞外體特異性表面蛋白CD63，還從 原代骨髓肥大細胞(BMMC)和細胞系MC/9 二者中純化了胞外 體。胞外體粘附在醛珠上并用CD63抗體，隨后用連接PE的二抗 染色。使用流式細胞儀分析這些珠子，確定在源自BMMC和MC9 的胞外體二者的表面均存在CD63。
胞外體蛋白的鑒定
為了解源自肥大細胞的胞外體的生物學功能，利用nano-flow LC-MS/MS分析蛋白質內含物。從分離的胞外體中提取總蛋白質 內含物并在SDS-PAGE膠上收集。將蛋白質帶進行胰蛋白酶切后 通過LC-MS/MS分析。通過MASCOT (Matrix Science, London ) 程序檢索所有串聯質譜的結果來鑒定。結果顯示，這些胞外體含 有比先前所知的更大量的蛋白質。約鑒定出150種蛋白，其中的 許多與細胞轉錄、翻譯和蛋白質折疊有關。鑒定出的蛋白包括一 些核糖體蛋白以及熱休克蛋白、分子伴侶、膜聯蛋白(annexin)、 細胞骨架蛋白、膜結合蛋白質，如CD63、 CD54、 CD43和I類 MHC。
源自肥大細胞的胞外體的DNA和RNA的檢測
由于一定數目的鑒定蛋白與RNA和轉錄機制有關，我們假設 胞外體中也含有DNA和/或RNA。為了驗證這一點，我們進行了對胞外體和完整的胞外體產生肥大細胞中的RNA和DNA提取。 利用分光光度技術并在瓊脂凝膠上檢測DNA和RNA的存在。在 胞外體樣品中未檢測到DNA，但是卻能從胞外體中檢測到大量的 選擇性RNA。具體地，胞外體RNA中含有極低量或檢測不出的 核糖體RNA，這表示存在其它類型的RNA，即mRNA。
胞外體RNA的微陣列分析
為了表征源自肥大細胞的胞外體中的RNA，使用來自肥大細 胞及其胞外體的RNA來施用Affymetrix小鼠DNA微陣列 (Affymetrix)。結果顯示胞外體攜帶來自約2500種基因的mRNA， 其是在母肥大細胞中表達的基因的約10%。此外，基因圖譜分析 顯示胞外體與其親本細胞之間的mRNA有實質不同。胞外體中最 豐富的轉錄物與其親本細胞中豐富的轉錄物不同，這顯示了胞外 體RNA的選擇性。有趣的是，胞外體攜帶了來自180種轉錄物在 其母肥大細胞中并不存在的基因的mRNA。結果表明mRNA以高 度選擇的方式被轉運至胞外體，并且親本細胞似乎只表達一定數 目專門用于胞外體運載的基因。
來自BMMC胞外體的RNA的檢測
為了鑒定來自非細胞系源的胞外體中的RNA，從小鼠中收獲 骨髓細胞，培養成肥大細胞(骨髓源性肥大細胞BMMC)達4 周。在最后48小時，細胞在放射性尿嘧啶存在下培養(參見實施 例1)。分離來自培養物的胞外體，用閃爍計數檢測經由放射性標記的RNA。結果表明在胞外體中能檢測到結合到細胞RNA的放 射性尿嘧啶。源自骨髓的胞外體的RNA量不如肥大細胞系中的豐 富，這可以通過用于收獲的BMMC細胞數量較少以及這些細胞的 體外生長條件來解釋。
通過胞外體在細胞間轉移RNA
為了驗證胞外體是否能將其所含的mRNA轉移到另一細胞， 將含有放射性尿嘧啶mRNA的源自肥大細胞的胞外體添加到培養 的樹突細胞(DC)、 CD4T細胞和MC/9肥大細胞中。在不同的間 隔時間取培養物樣品，并通過離心分離并洗滌細胞。分離來自受 體細胞的RNA并用閃爍體測定放射性尿嘧啶。最重要的是，暴露 于胞外體的DC、 CD4和MC/9含有增加量的放射性尿嘧啶，因此 是從胞外體吸收的。結果表明源自肥大細胞的胞外體能將RNA轉 移至其它細胞，例如DC、 CD4和MC/9細胞。
數據顯示mRNA能通過胞外體在兩個哺乳動物細胞間轉移。 生物學上，這表示一個細胞能通過經由胞外體的信號影響其它細 胞蛋白質的產生。由于胞外體可用作載體將mRNA或DNA探針 遞送到革E細胞，如惡性腫瘤細胞或免疫系統細胞，因此這具有實 質性的生物技術用途。因此，根據本發明，胞外體提供了一種基 因調控和治療的載體，其可能沒有其它基因治療載體的副作用， 如病毒或其它類型的脂質體。
參考以下實施例將更清楚地理解本發明的特征，但不能解釋 為對本發明的限定。實施例l 細胞制備
按照制造商的建議培養MC/9細胞(ATCC)，用Ti70轉子 (Beckman optima LE國80k超速離心機)在120，000g超速離心90 分鐘來去除血清、大鼠T-Stim和FBS中存在的胞外體。人肥大細 胞系HMC-l (Joseph Butterfield醫生，梅奧診所(Mayo Clinic), USA)在含有10% FBS、 100 U/ml青霉素、100昭/ml鏈霉素、2 mM L-谷氨酰胺和1.2 mM a-硫代甘油的IMDM中培養。將HMC-1細 胞在lpM鈣離子載體存在下培養30min以釋放胞外體。按照先前 所述白勺方》去(Razin, E. et al. Interleukin 3: A differentiation and growth factor for the mouse mast cell that contains chondroitin sulfate E proteoglycan. J7附ww"o/. 132,1479隱1486(1984))通過在IL隱3(R&D 系統)存在下培養來自7~10周齡的雄性BALB/c的股骨的骨髓細 胞來制備骨髓肥大細胞(BMMC)。培養4周后收獲細胞，根據形 態分析其中含有96。/。的純MCs。在最后48小時，在完全培養基中 以3xl()S個細胞/ml培養BMMC，該完全培養基中含有補充了 10ng/mlIL-4 (R&D-系統)的經超速離心的FBS，在一些實驗中存 在lpl/ml的311-尿嘧啶(Amersham Biosciences)。為培養CD4+T 細胞，收集小鼠脾臟，通過70pm的過濾器，然后通過30iim的過 濾器。按照制造商的說明書，通過使用富含SPINCEP⑧小鼠CD4+T 細胞的雞尾酒(Stemcell Technologies)的陰性選擇純化CD4+T細 胞。通過流式細胞儀分析，CD4+T細胞的純度介于89 91。/。之間。在平底48孔板上，在含有10% FBS、 100U/ml青霉素和100jig/ml 鏈霉素的RPMI 1640中以lxl()S個細胞/ml來培養這些細胞。
實施例2 胞外體純化
按照先前所描述的方法(Raposo, G. et al. B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles. / Me<i. 183, 1161-1172(1996))， 通 過差速離心自MC/9、 BMMC和HMC-1的上清液制備胞外體。收 獲細胞，在500g離心lOmin去除細胞，然后在16,500g離心20min， 隨后通過0.22pm的過濾器除去細胞碎片。通過在120,000g超速離 心(Beckman Ti70轉子)70min使胞外體形成小球。將胞外體小 球用PBS洗滌一次以用于質譜。利用BCATM蛋白檢測試劑盒 (Pierce)測定胞外體中蛋白質的含量。將120,000g胞外體小球懸 浮在蔗糖梯度液中(0.25 2M蔗糖，20mMHepes/NaOH， PH7.2) 進行密度梯度實驗。將胞外體溶解在2.5M蔗糖中，并將梯度液置 于胞外體懸浮液上。按照(Rapsoetal 1996)將梯度液在lOO，OOOg 離心15h。簡單地，從試管底部快速收集梯度部分(10x3.8ml)，用 10ml PBS稀釋后在150,000g超速離心2h (Beckman Ti70轉子)， 通過Trizol (Invitrogen)提取小球。
實施例3
RNA、 DNA和蛋白質的分離按照制造商的方案，用Trizol (Invitrogen)或RNEASY 小 型試劑盒(Qiagen)分離RNA、 DNA和蛋白質。對于microRNA和 總RNA的共純化，先后用Trizol和RNEASY⑧小型試劑盒提取 RNA。將細胞和胞外體在RLT緩沖液(Qiagen)中破壞并均質化， 向樣品中添加3.5體積的100%甲醇，然后使用RNEASY 小型旋 轉柱。其它過程按照制造商的方案進行。
實施例4
向胞外體中引入DNA/RNA片段或構建體
特定構建體直接插入胞外體
胞外體能從不同的來源分離得到，如體外生長細胞、人體、 或源自人或動物的細胞。可以利用傳統分子生物學技術(如體外 轉化、轉染和顯微注射)將RNA或DNA的基因構建體直接引入 這些胞外體中。
實施例5
將含有DNA或RNA的胞外體給予細胞 轉移實驗
在分離胞外體前，細胞在補充有lfil/mPH-尿嘧啶的完全培養 基中培養72h以標記MC/9胞外體RNA。按照分離方案分離胞外 體，通過超濾(10kDa,Millipore)洗滌除去游離的核苷。標記開始 時以供體細胞與受體之間8 : 1的比率將胞外體添加到MC/9、 CD4+和HMC-1細胞中。在0 h和24 h收獲細胞并將其洗滌兩次，通過RNEASY 小型試劑盒分離RNA，并用閃爍計數測量放射性 RNA的信號。不使用補充有lpl/ml SH-尿嘧啶的培養基的供體細胞 用相同的方法處理，并用作陰性對照。
在生物體外翻譯
總胞外體RNA用RNEASY⑧小型試劑盒純化，其中0.5pg用 于翻譯。按照制造商的建議，使用體外兔裂解物翻譯試劑盒
(Promega Corporation)將胞外體mRNA翻譯成蛋白質。不含胞 外體RNA的樣品以同樣的方式處理，并用作陰性對照。翻譯過程 完成后，用丙酮沉淀總蛋白質，并用RCDC蛋白質檢測(BioRad) 進行測定。利用2D-PAGE、 BioRad儀器(Mini-protean 3cell)及 建議比較樣品(含有和不含胞外體RNA)的蛋白質內含物。用 SyproRuby (BioRad)使2D-溶膠顯像，并用磷光影像分析儀
(phosphoimager)使其數字化。比較樣品的蛋白質點，并用 LC-MS/MS和MASCOT先后對新產生蛋白質的選擇物進行切割、 胰蛋白酶切和鑒定。比較小鼠來源的新產生蛋白質與DNA微陣列 分析鑒定出的基因。
在生物體內翻譯
在三個不同時間點(0h、 3h、 6h)，將MC/9胞外體(1000嗎) 添加到HMC-1細胞(8xl0"中，并將細胞培養約24h。收獲HMC-1 細胞，洗滌，根據蛋白質組核心設施(Proteomics Core facility)通 過2D-PAGE分離細胞的總蛋白質。不含胞外體的樣品做相同處理，并用作陰性對照。用PDQUEST檢測新產生的蛋白質，切出96個 點，用MALDI-tof進行鑒定，然后根據蛋白質組核心設施(哥德 堡大學)通過MASCOT程序檢索。
隨后胞外體將核酸遞送至受體細胞，從而影響它們的生物學 功能或存活。
實施例6
不含遺傳物質的胞外體的制備
空胞外體用于直接向受體細胞轉移或將特定基因(RNA或 DNA)直接轉染/轉化到胞外體內。如本領域技術人員所知，制備 空胞外體(不含遺傳物質)的方法有多種，包括紫外曝露、攜帶 RNA進入胞外體的蛋白質的突變，以及電穿孔和化學處理以胞外 體膜上開孔。這些方法包括能修飾任何核酸向胞外體的運載的任 何蛋白質的突變/缺失。
實施例7
小鼠MC/9胞外體轉移后在人肥大細胞中產生小鼠蛋白
為了測試轉移小鼠MC/9胞外體后能否在人肥大細胞內產生 小鼠蛋白，我們先后用2D-PAGE和MALDI-tof測定了受體細胞中 小鼠蛋白的存在。將人細胞與小鼠MC/9胞外體一起培養24h后， 鑒定出96個新的或增強的點。有趣的是，從人細胞中鑒定出三種 在MC/9胞外體中不存在的明顯的小鼠蛋白。這三種蛋白質是小 鼠CDC6(089033)、 小鼠鋅指蛋白 271(P15620)禾卩小鼠CX7A2(P48771)。前兩種蛋白的mRNA出現在兩個微陣列實驗中， 最后一種蛋白出現在實施的所有四個微陣列中，這暗示胞外體向 受體細胞遞送的mRNA能被翻譯成蛋白質。
人肥大細胞HMC-1與小鼠MC/9胞外體共同孵育不到24小 時時，MC/9胞外體向HMC-1細胞遞送的蛋白質組結果表明小鼠 蛋白能在人肥大細胞中產生。將兩種凝膠間的蛋白質進行比對， 通過MALDI-tof鑒定出96種新產生的蛋白質，并且小鼠蛋白是由 胞外體mRNA生成的。
實施例8
胞外體用作惡性腫瘤疾病的基因治療
胞外體是由取自患有惡性腫瘤疾病患者的惡性細胞產生的。 這些胞外體經過處理包含各種類型或特異性的基因構建體以重新 導入患者。然后來自惡性腫瘤細胞的胞外體優選與同類型的將 DNA和/或RNA構建體特異性遞送到惡性腫瘤細胞的細胞融合， 從而作為惡性腫瘤疾病的基因治療。該過程按照實施例1-6進行， 但胞外體是由惡性腫瘤細胞產生的。
盡管本發明通過引用具體實施方式
進行了描述，應該了解允 許有大量的變換、修改和實施方式；相應地，所有這些變換、修 改和實施方式應被看作是在本發明的精神和范圍內。
權利要求
1、一種轉移遺傳物質的方法，包括a)提供含有選擇的遺傳物質的胞外體；和b)將選擇的遺傳物質從胞外體轉移到受體細胞。
2、 如權利要求l的方法，其中，所述選擇的遺傳物質選自由mRNA、 tRNA、 rRNA、 siRNA、調節RNA、非編碼和編碼的RNA、 DNA片段、和DNA質粒組成的組。
3、 如權利要求l的方法，其中，所使用的受體細胞選自由來 自患有造血、非造血、干細胞和器官的遺傳性疾病的受體的細胞 組成的組。
4、 如權利要求l的方法，其中，所述選擇的物質包括核酸且 所述受體細胞包括用于治療HIV感染的T-細胞的CD4 T-細胞。
5、 如權利要求l的方法，其中，所述選擇的遺傳物質被轉移 以用于治療疾病、誘導或抑制細胞死亡、改變細胞老化、誘導耐 受、重新導向現有的免疫應答或改變胞內活性或細胞行為。
6、 如權利要求l的方法，其中，提供胞外體還包括a)制備不 含遺傳物質的胞外體；和b)向不含遺傳物質的胞外體中添加選擇 的遺傳物質。
7、 如權利要求6的方法，其中，所述選擇的遺傳物質選自由 mRNA、 tRNA、 rRNA、 siRNA、調節RNA、非編碼和編碼的RNA 或、DNA片段和DNA質粒組成的組。
8、 如權利要求7的方法，其中，使用選自由下列方法組成的 組的方法將所述選擇的遺傳物質添加到不含遺傳物質的胞外體中將挑選的遺傳物質轉化、轉染和顯微注射至胞外體內。
9、 如權利要求l的方法，其中，所述胞外體是通過選自由下 列方法組成的組的方法制備的從選擇的供體細胞類型中分離； 從患特定疾病或病況的人分離；從經遺傳修飾的供體細胞分離。
10、 如權利要求9的方法，還包括遺傳修飾供體細胞以消除 核酸的產物，或上調或下調核酸的產物。
11、 如權利要求1的方法，還包括通過將選擇的遺傳物質引 入供體細胞，然后通過遺傳物質的胞內轉位進入胞外體來將選擇 的遺傳物質引入胞外體。
12、 如權利要求1的方法，還包括使用選自由下列方法組成的組的方法將選擇的遺傳物質引入胞外體將選擇的遺傳物質轉 化、轉染和顯微注射至胞外體內。
13、 如權利要求1的方法，其中，通過選自由下列方法組成 的組的方法將選擇的遺傳物質轉移到受體細胞添加胞外體至體 外細胞培養物；靜脈注射胞外體；體內給藥和耙向體內特定細胞 的給藥。
14、 如權利要求1的方法，其中，所述含有選擇的遺傳物質 的胞外體取自患有惡性腫瘤疾病的患者；且經進一步處理以包含 特定的基因構建體，然后重新導入患者。
15、 一種空胞外體，其特征在于，不含任何實質量的核酸。
16、 一種胞外體，其特征在于，其包含至少一種外加的異源 核酸。
17、 一種包含至少一種外加的異源核酸的胞外體在制備藥物 中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種通過胞外體將核酸引入細胞的方法，該方法用于如基因沉默的基因調控與治療，并且將遺傳物質引入細胞以補償異常基因、或誘導或抑制在受體細胞中的進程。
文檔編號C12N15/87GK101432432SQ200780015469
公開日2009年5月13日 申請日期2007年5月2日 優先權日2006年5月3日
發明者哈迪·瓦拉迪, 揚·奧洛夫·洛特溫爾 申請人:揚·奧洛夫·洛特溫爾;哈迪·瓦拉迪