一種快速檢測農作物中咪唑乙煙酸含量的試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及酶聯免疫檢測技術領域，特別是檢測咪唑乙煙酸的酶聯免疫試劑盒。
【背景技術】
[0002]咪唑乙煙酸為咪唑啉酮類除草劑，是側鏈氨基酸合成抑制劑，對大豆田和其他豆科植物田的禾本科雜草和某些闊葉雜草有優異的防效。目前，咪唑乙煙酸的測定方法主要有高效液相色譜法、氣相色譜法等，其檢測結果準確可靠，但儀器設備比較昂貴，且樣本前處理過程相對復雜。酶聯免疫吸附法是一種準確、可靠、快速、特異的檢測方法，適合于大批樣品的快速篩選，近年來已廣泛應用于農產品安全檢測行業。本發明旨在建立一種檢測咪唑乙煙酸的酶聯免疫試劑盒及其檢測方法。

【發明內容】

[0003]為了克服色譜法的不足，本發明提供一種檢測咪唑乙煙酸的酶聯免疫試劑盒及其檢測方法。該方法靈敏、準確、快速，操作簡便、特異性強，適用于大批樣品的快速檢測。
[0004]本發明檢測咪唑乙煙酸的酶聯免疫試劑盒，包括咪唑乙煙酸酶標板、咪唑乙煙酸標準品、咪唑乙煙酸抗體工作液、咪唑乙煙酸酶標二抗工作液、底物液A、底物液B、終止液、濃縮稀釋液和濃縮洗滌液。
[0005]本發明檢測咪唑乙煙酸的酶聯免疫試劑盒的制備，包括以下步驟:酶標板的制備、咪唑乙煙酸標準品的制備、咪唑乙煙酸抗體工作液的制備、咪唑乙煙酸酶標二抗工作液的制備、底物液A的制備、底物液B的制備、終止液的制備、濃縮稀釋液的制備和濃縮洗滌液的制備。
[0006]咪唑乙煙酸包被抗原是將咪唑乙煙酸半抗原與載體蛋白偶聯得到的，該載體蛋白為牛血清白蛋白(BSA);用0.05 mol/L pH 9.6的碳酸鹽(CBS)緩沖液作為包被液，將咪唑乙煙酸抗原稀釋成1:20000比例，10yL /孔，37°C放置2 h，取出酶標板甩掉板內液體，用稀釋后的濃縮洗滌液300 μ L/孔，洗板2次，30 s/次；然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封閉，150yL /孔，37°C放置1.5 h，棄去封閉液，拍干后的酶標板放置恒溫間(25°C)晾干；抽檢合格后將酶標板真空密封后置4°C下保存。
[0007]咪唑乙煙酸標準品濃度分別為O ng/mL、0.5 ng/mL、1.5 ng/mL、4.5 ng/mL、13.5ng/mL、40.5ng/mL。
[0008]咪唑乙煙酸抗體工作液是采用咪唑乙煙酸人工抗原免疫小鼠得到單克隆抗體，用抗體稀釋液稀釋成1:50000比例制備。
[0009]咪唑乙煙酸酶標二抗工作液用酶標二抗稀釋液稀釋成1:5000比例；底物液A為含有0.5 mmol/L的過氧化氫脲的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液；底物液B為四甲基聯苯二胺的乙醇溶液；終止液為2 mol/L的硫酸；濃縮洗滌液是10倍濃縮洗滌液，其包含0.5%吐溫-20，0.01 mol/L 的 PBST，pH 值范圍 7.0-7.5 之間。
[0010]咪唑乙煙酸的ELISA試劑盒的檢測方法包括以下步驟: (1)預處理待測樣品，即將待測試的樣品處理為液體樣品，或者用有機溶劑提取待測樣品，并將其復溶于樣品稀釋液工作液中；
(2)將所需試劑從冷藏環境中取出，置于室溫(20?25°C)平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻；
(3)取包被有咪唑乙煙酸抗原的酶標板，加標準品/樣本50μ L /孔到對應的微孔中；
(4)加入咪唑乙煙酸酶標二抗工作液，50μ L /孔，然后加入咪唑乙煙酸抗體工作液，50μ L /孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置室溫25°C避光環境中反應30 min ；
(5)小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，用洗滌工作液250μL /孔，充分洗滌4~5次，每次間隔10 S，用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破)；
(6)加入底物液A50 μ L /孔,底物液B 50 μ L /孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置25 °C避光環境中反應15min ；
(7)加入終止液50μ L /孔，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450 nm處或雙波長450/630nm檢測，測定每孔吸光度值(請在5 min內讀完數據)；
(8)以標準品測試的吸光度值與標準品的濃度對數值繪制標準曲線，對照標準曲線計算樣品中咪唑乙煙酸的含量。
[0011]待測樣品用以下方法進行預處理:
(1)配制乙腈-水溶液(體積比為1:1);
(2)研磨代表性樣品(使50%的樣品可以通過一個20目的濾網)；
(3)稱量20g研磨過濾后的樣品加入40 mL乙腈-水溶液，樣品稀釋比為1:2(w/v)；
(4)在密封的容器里混合，震蕩渦旋Imin ；
(5)室溫離心4000r/min以上，1min;取Iml上清液到離心管中，50 ~60 °〇水浴氮氣吹干；
(6)加入ImL稀釋后的樣品稀釋液充分振蕩混合30 S，混勻待測。
【附圖說明】
[0012]圖1為咪唑乙煙酸的標準曲線。
【具體實施方式】
[0013]咪唑乙煙酸蛋白質偶聯物的制備:
采用琥珀酸酐法得到帶羧基的咪唑乙煙酸半抗原衍生物，之后取0.05 mmol與載體蛋白BSA按10:1的結合比混合在0.05 mol/L pH 9.6的碳酸鹽緩沖液(CBS)中，然后加入
0.15 mmol碳二亞胺，攪拌置室溫反應24 h，最后于0.2 mol/L pH 7.6的PBS緩沖液中透析兩天，除去未反應的半抗原，將得到的蛋白質偶聯物溶液于_20°C保存備用。
[0014]咪唑乙煙酸抗體的制備:
選用健康成年純種BALA/C小鼠，取與蛋白質偶聯制備的免疫抗原50μ g與等量完全弗氏佐劑混合采用腹腔注射進行初次免疫，之后每隔3周用相同劑量免疫抗原加等量不完全弗氏佐劑采用腹腔注射進行二次、三次免疫，每次免疫6天后尾靜脈采血測定抗血清效價至一定滴度后，用相同劑量不加佐劑進行末次免疫，3天后取脾制備脾細胞懸浮液與骨髓瘤細胞進行細胞融合，篩選出所需要的雜交瘤細胞系進行克隆化，選擇處于對數生長期的雜交瘤細胞進行凍存，用于腹水制備，先腹腔注射0.5 mL液體石蠟于BALB/C鼠致敏，2周后腹腔注射IXlO6個雜交瘤細胞，接種細胞7-10天后可產生腹水，待腹水盡可能多時用注射器抽取腹水，反復收集數次，4000 rpm離心15 min,收集上清，采用辛酸-硫酸銨法純化腹水對單克隆抗體進行純化，冷凍干燥得凍干粉后于-20 °C保存備用。
[0015]制備包被有咪唑乙煙酸包被抗原的酶標板:
咪唑乙煙酸包被抗原是將咪唑乙煙酸半抗原與載體蛋白偶聯得到的，該載體蛋白為牛血清白蛋白(BSA);用0.05 mol/L pH 9.6的碳酸鹽(CBS)緩沖液作為包被液，將咪唑乙煙酸抗原稀釋成1:20000比例，10yL /孔，37°C放置2 h，取出酶標板甩掉板內液體，用稀釋后的濃縮洗滌液300yL /孔，洗板2次，30 s/次；然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封閉，150 μ L /孔，37°〇放置1.5 h，棄去封閉液，拍干后的酶標板放置恒溫間(25°C)晾干；抽檢合格后將酶標板真空密封后置4°C下保存。
[0016]咪唑乙煙酸標準品配制濃度分別為O ng/mL、0.5 ng/mL>1.5 ng/mL、4.5 ng/mL、
13.5ng/mL、40.5ng/mL。
[0017]咪唑乙煙酸抗體工作液是采用咪唑乙煙酸人工抗原免疫小鼠得到單克隆抗體，用抗體稀釋液稀釋成1:50000比例制備。
[0018]咪唑乙煙酸酶標二抗工作液用酶標二抗稀釋液稀釋成1:5000比例；底物液A為含有0.5 mmol/L的過氧化氫脲的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液；底物液B為四甲基聯苯二胺的乙醇溶液；終止液為2 mol/L的硫酸；濃縮洗滌液是10倍濃縮洗滌液，其包含0.5%吐溫-20，0.01 mol/L 的 PBST，pH 值范圍 7.0-7.5