一種快速檢測鉛的免疫分析方法與試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種快速檢測鉛的免疫分析方法，包括：(1)將鉛完全抗原包被至固相載體表面，4?6℃包被14?16h，洗滌固相載體，隨后加入封閉緩沖液封閉固相載體表面的空白位置，37?40℃封閉1?3h，隨后洗滌固相載體；(2)取待測樣品和酶標記抗體復合物，加入至步驟(1)獲得的固相載體中；37?40℃避光環境中反應30?50min；隨后用洗滌緩沖液洗滌固相載體；(3)在步驟(2)得到的固相載體中加入辣根過氧化物酶顯色劑進行顯色反應并測定光密度值或通過加入辣根過氧化物酶發光劑進行發光反應并測定光信號，根據光密度值或光信號與鉛濃度的標準曲線，計算待測樣品中鉛的含量。本發明提供的方法簡便、快速且能夠高通量檢測。本發明還提供了一種可快速檢測鉛的試劑盒。
【專利說明】
一種快速檢測鉛的免疫分析方法與試劑盒
技術領域
[0001]本發明涉及免疫分析方法，尤其涉及一種快速檢測鉛的免疫分析方法與試劑盒。
【背景技術】
[0002]鉛在自然界中多以硫化物形式存在，是土壤和水體污染中較普遍的元素。鉛污染源主要來自汽油里添加抗爆劑一烷基鉛，在公路邊進行汽車尾氣的監測表明，有50%的鉛降落在公路兩側數百米范圍內，余下的50%則以極細的顆粒飄塵向遠處擴散另外。此外鉛字印刷廠、金屬冶煉、礦山開采、鉛蓄電池工業等也是重要的污染源。
[0003]鉛對動物的危害則是慢性累積中毒。人體中鉛能與多種酶結合從而干擾有機體多方面的生理活動，對成人神經系統、消化系統及心血管系統造成損害，其中神經系統比其它系統更谷易遭受鉛毒害。
[0004]目前，在食品安全檢測和環境監測中，重金屬鉛的檢測大都采用儀器法，如原子吸收光譜法、電感耦合等離子體質譜分析法等，以及化學顯色法。儀器法，其檢測結果精確，但是普遍存在儀器昂貴、對檢測樣品要求高、需專業技術人員操作和在大量樣品檢測時耗費時間長等問題。而化學顯色法，其靈敏度不夠高、較易受樣品中其他物質的干擾，在檢測大量樣品時，存在所需耗材較多和所需時間較長等問題。因此，在突發性食品安全和環境污染問題以及需要大規模食品安全普查和環境狀況監測時，需要一種更簡便、快速和高通量的檢測方法。

【發明內容】

[0005]為解決上述問題，本發明提供了一種快速檢測鉛的免疫分析方法，該方法簡便、快速以及能夠高通量的檢測環境中的鉛含量。本發明還提供了一種快速檢測鉛的免疫分析檢測試劑盒。
[0006]本發明第一方面提供了一種快速檢測鉛的免疫分析方法，包括以下步驟:
[0007](I)取濃度為100_200ng/ml的鉛完全抗原，將所述鉛完全抗原包被至固相載體表面，4-6 °C包被14-16h，洗滌所述固相載體，隨后加入封閉緩沖液封閉所述固相載體表面的空白位置，37-40 °C封閉l_3h，隨后洗滌所述固相載體；
[0008](2)取待測樣品和濃度為50-100ng/ml的酶標記抗體復合物，所述待測樣品中的鉛離子與螯合劑通過化學鍵連接，加入至步驟(I)獲得的固相載體中，輕輕振蕩混勻，然后在37-40 °(:避光環境中反應30-50min;隨后用洗滌緩沖液洗滌所述固相載體;所述酶標記抗體復合物為辣根過氧化物酶和單克隆抗體的偶聯復合物；
[0009](3)在步驟(2)得到的固相載體中加入辣根過氧化物酶顯色劑進行顯色反應并測定光密度值或通過加入辣根過氧化物酶發光劑進行發光反應并測定光信號，根據光密度值或光信號與鉛濃度的標準曲線，計算所述待測樣品中鉛的含量。
[0010]其中，所述鉛完全抗原由具有硫氰基的雙功能螯合劑連接鉛離子與載體蛋白形成，所述雙功能螯合劑的一端與所述鉛離子通過化學鍵連接，所述雙功能螯合劑的另一端的硫氰基與所述載體蛋白的氨基偶聯。
[0011]其中，所述具有硫氰基的雙功能螯合劑為1-(4-異硫氰芐基)乙烯基二胺-N，N，N，N-四乙酸或p-SCN-Bn-DTPA，所述載體蛋白為牛血清白蛋白或卵清蛋白。
[0012]其中，步驟(I)中所述鉛完全抗原的制備方法為:
[0013]將含有鉛離子的溶液逐滴加入到所述1-(4-異硫氰芐基)乙烯基二胺-N，N，N，N_四乙酸溶液中，室溫下攪拌反應3_5h，超濾除去未反應的1-(4-異硫氰芐基)乙烯基二胺-N，N，N，N-四乙酸和鉛離子，重懸后，制得鉛離子-雙功能螯合劑復合物；
[0014]將所述鉛離子-雙功能螯合劑復合物逐滴加入到含有載體蛋白的緩沖體系中制得反應混合液，室溫下反應24h，反應結束后離心超濾或透析除去未反應的鉛離子和雙功能螯合劑，制得鉛完全抗原，所述鉛完全抗原由具有硫氰基的雙功能螯合劑連接鉛離子與載體蛋白形成，所述雙功能螯合劑的一端與所述鉛離子通過化學鍵連接，所述雙功能螯合劑的另一端的硫氰基與所述載體蛋白的氨基偶聯。其中，步驟(I)中鉛完全抗原的制備方法為:
[0015]將所述雙功能螯合劑p-SCN-Bn-DTPA與所述載體蛋白反應24h，反應后超濾除去未反應的P-SCN-Bn-DTPA，重懸后，制得雙功能螯合劑-載體蛋白復合物；
[0016]在所述雙功能螯合劑-載體蛋白復合物中逐滴加入含有鉛離子的溶液反應l-3h，超濾去除未螯合的鉛離子，制得鉛完全抗原，所述鉛完全抗原由具有硫氰基的雙功能螯合劑連接鉛離子與載體蛋白形成，所述雙功能螯合劑的一端與所述鉛離子通過化學鍵連接，所述雙功能螯合劑的另一端的硫氰基與所述載體蛋白的氨基偶聯。
[0017]其中，所述酶標記抗體復合物的制備方法為:
[0018](I)稱取辣根過氧化物酶，溶解制得辣根過氧化物酶溶液;將Na14溶液逐滴加入到辣根過氧化物酶溶液中，室溫避光攪拌30-40min后，透析過夜；
[0019](2)收集透析液，調節所述透析液的pH值至9.0-9.5，然后加入溶有單克隆抗體的碳酸鹽緩沖液，室溫避光條件下，緩慢攪拌反應2-4h;隨后加入NaBH4溶液，充分混勻后，于4°C靜置2-4h;透析過夜，純化后制得所述酶標記抗體復合物。
[0020]其中，所述辣根過氧化物酶顯色劑為3，3’，5，5’_四甲基聯苯胺，所述辣根過氧化物酶發光劑為3-氨基鄰苯二甲酰肼或4-氨基鄰苯二甲酰肼。
[0021]其中，步驟(2)中加入100-200μ1濃度為100ng/ml的所述酶標記抗體復合物。
[0022]其中，在步驟(I)之前，采用棋盤滴定法確定抗原抗體的最佳反應濃度。
[0023]本發明第一方面提供的一種快速檢測鉛的免疫分析方法，首次通過待測樣品與鉛完全抗原競爭結合辣根過氧化物酶標記的單克隆抗體并通過顯色反應放大信號實現對待測樣品中鉛含量的檢測，以單克隆抗體為基礎建立的免疫分析方法，具有特異性高，穩定性好的特點，本發明實施例提供的檢測鉛的免疫分析方法為一步法競爭酶聯免疫分析方法，簡便、快速且能夠高通量檢測。
[0024]本發明第二方面提供了一種快速檢測鉛的免疫分析檢測試劑盒，包括:包被有鉛完全抗原的固相載體、鉛標準溶液和辣根過氧化物酶標記的抗鉛的單克隆抗體，以及包括辣根過氧化物酶顯色劑或辣根過氧化物酶發光劑。
[0025]本發明實施例第二方面中所述鉛完全抗原、所述固相載體、所述辣根過氧化物酶標記的抗鉛的單克隆抗體、所述辣根過氧化物酶顯色劑和所述辣根過氧化物酶發光劑均如第一方面所述。
[0026]本發明第二方面提供的快速檢測鉛的免疫分析檢測試劑盒，能夠用于快速檢測鉛，應用較為簡便。
[0027]綜上，本發明有益效果包括以下幾個方面:
[0028]1、本發明提供的一種快速檢測鉛的免疫分析方法，通過待測樣品與鉛完全抗原競爭結合辣根過氧化物酶標記的單克隆抗體并通過顯色反應放大信號實現對待測樣品中鉛含量的檢測，方法簡便、快速且能夠高通量檢測待測樣品中的鉛；
[0029]2、本發明還提供了一種快速檢測鉛的免疫分析檢測試劑盒，能夠用于快速檢測鉛，應用較為簡便。
【具體實施方式】
[0030]以下所述是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也視為本發明的保護范圍。
[0031]本發明第一方面提供了一種快速檢測鉛的免疫分析方法，包括以下步驟:
[0032](I)取濃度為100-200ng/ml的鉛完全抗原，將鉛完全抗原包被至固相載體表面，4-6°C包被14-16h，洗滌固相載體，隨后加入封閉緩沖液封閉固相載體表面的空白位置，37-40°C封閉l_3h，隨后洗滌固相載體；
[0033](2)取待測樣品和濃度為50-100ng/ml的酶標記抗體復合物，待測樣品中的鉛離子與螯合劑通過化學鍵連接，加入至步驟(I)獲得的固相載體中，輕輕振蕩混勻，然后在37-40°(:避光環境中反應30-50min;隨后用洗滌緩沖液洗滌固相載體;酶標記抗體復合物為辣根過氧化物酶和單克隆抗體的偶聯復合物；
[0034](3)在步驟(2)得到的固相載體中加入辣根過氧化物酶顯色劑進行顯色反應并測定光密度值或通過加入辣根過氧化物酶發光劑進行發光反應并測定光信號，根據光密度值或光信號與鉛濃度的標準曲線，計算待測樣品中鉛的含量。
[0035]本發明一實施方式中，在步驟(I)之前，采用棋盤滴定法確定抗原抗體的最佳反應濃度。
[0036]本發明一實施方式中，棋盤滴定法的操作方法，包括以下步驟:
[0037](I)用包被緩沖液，將鉛完全抗原梯度稀釋為2000，1000，500，250，100，50ng/ml，每孔10yL加入到96-微孔板中；該包被緩沖液為濃度為0.05M，pH 9.6的碳酸鹽緩沖液；
[0038](2)將微孔板置于密封袋中，防止孔內液體揮發，4°C包被16h;
[0039](3)傾去孔內液體，加入PBS-T(PBS-T為濃度為0.015M，pH 7.4的磷酸鹽緩沖液，其中含0.05 % Tween 20)，放置I Os，然后棄板孔液并置于干凈的吸水紙上使板孔內液體吸干，重復3次；
[0040](4)每孔中加入200yL封閉緩沖液，將微孔板密封后，置于37 °C封閉Ih;
[0041 ] (5)重復洗板操作(3);
[0042](6)取出需要數目的微孔，將梯度稀釋的酶標記抗體復合物(濃度分別為1000，500，250，100,50,25,10,5ng/ml)加入到相應地微孔板中，輕輕振蕩混勻，密封后置于37°C避光環境中反應30min;
[0043](7)重復操作(3);
[0044](8)依次加入TMB底物顯色液A液與底物液B液各50yL于微孔中，振蕩混勻，置室溫避光環境中反應1min;
[0045](9)每孔中加入50yL終止液(2M硫酸溶液)，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450nm處測定每孔OD值，根據每孔OD值，確定抗原抗體的最佳反應濃度。
[0046]本發明一實施方式中，鉛完全抗原由具有硫氰基的雙功能螯合劑連接鉛離子與載體蛋白形成，雙功能螯合劑的一端與鉛離子通過化學鍵連接，雙功能螯合劑的另一端的硫氰基與載體蛋白的氨基偶聯。
[0047]本發明一實施方式中，具有硫氰基的雙功能螯合劑為1-(4-異硫氰芐基)乙烯基二胺-N，N，N，N-四乙酸(iEDTA)或p-SCN-Bn-DTPA，載體蛋白為牛血清白蛋白(BSA)或卵清蛋白(OVA)0
[0048]本發明一實施方式中，步驟(I)中鉛完全抗原的制備方法為:
[0049]將含有鉛離子的溶液逐滴加入到1-(4-異硫氰芐基)乙烯基二胺-N，N，N，N_四乙酸溶液中，室溫下攪拌反應3-5h，超濾除去未反應的1-(4-異硫氰芐基)乙烯基二胺-N，N，N，N-四乙酸和鉛離子，重懸后，制得鉛離子-雙功能螯合劑復合物；
[0050]將鉛離子-雙功能螯合劑復合物逐滴加入到含有載體蛋白的緩沖體系中制得反應混合液，室溫下反應24-26h，反應結束后離心超濾或透析除去未反應的鉛離子和雙功能螯合劑，制得鉛完全抗原，鉛完全抗原由具有硫氰基的雙功能螯合劑連接鉛離子與載體蛋白形成，雙功能螯合劑的一端與鉛離子通過化學鍵連接，雙功能螯合劑的另一端的硫氰基與載體蛋白的氣基偶聯。
[0051 ]本發明一優選實施方式中，鉛離子與1-(4-異硫氰芐基)乙烯基二胺-N，N，N，N_四乙酸(iEDTA)的摩爾比為1:1。
[0052]本發明一優選實施方式中，1-(4-異硫氰芐基)乙烯基二胺-N，N，N，N_四乙酸溶液為將1-(4-異硫氰芐基)乙烯基二胺-N，N，N，N-四乙酸溶解在二甲基亞砜中制得。
[0053]本發明一優選實施方式中，攪拌速度為125rpm。
[0054]本發明一優選實施方式中，加入三乙胺溶液，調節反應混合液的pH為9.0-9.5。
[0055]本發明一優選實施方式中，含有載體蛋白的緩沖體系為載體蛋白溶解于pH值為7.4的Tris-HCl緩沖液中制得，Tris-HCl緩沖液的摩爾濃度為0.lmol/L。
[0056]本發明一優選實施方式中，牛血清白蛋白與鉛離子的摩爾比為1:44-50。
[0057]本發明一優選實施方式中，卵清蛋白與鉛離子的摩爾比為1:17-20。
[0058]本發明一實施方式中，步驟(I)中鉛完全抗原的制備方法為:
[0059]將雙功能螯合劑p-SCN-Bn-DTPA與載體蛋白反應24_26h，反應后超濾除去未反應的p-SCN-Bn-DTPA，重懸后，制得雙功能螯合劑-載體蛋白復合物；
[0060]在雙功能螯合劑-載體蛋白復合物中逐滴加入含有鉛離子的溶液反應l-3h，超濾去除未螯合的鉛離子，制得鉛完全抗原，鉛完全抗原由具有硫氰基的雙功能螯合劑連接鉛離子與載體蛋白形成，雙功能螯合劑的一端與鉛離子通過化學鍵連接，雙功能螯合劑的另一端的硫氛基與載體蛋白的氣基偶聯。
[0061 ]本發明一優選實施方式中，將雙功能螯合劑p-SCN-Bn-DTPA與載體蛋白在緩沖體系中反應，緩沖體系為pH值為9.4的HEPES緩沖液。
[0062]本發明一優選實施方式中，超濾條件為4°C且6000r/min。
[0063]本發明一優選實施方式中，載體蛋白為牛血清白蛋白或卵清蛋白。
[0064]本發明一優選實施方式中，牛血清白蛋白與鉛離子的摩爾比為1:44-50。
[0065]本發明一優選實施方式中，卵清蛋白與鉛離子的摩爾比為1:17-20。
[0066]本發明一優選實施方式中，雙功能螯合劑p-SCN-Bn-DTPA和卵清蛋白的質量比為1:3-4。
[0067]本發明一優選實施方式中，固相載體為聚苯乙烯酶標板、聚苯乙烯珠、尼龍膜、聚偏氟乙烯膜、硝酸纖維素膜或磁性微珠。
[0068]本發明一優選實施方式中，步驟(I)中的封閉緩沖液為含有質量濃度為3%的小牛血清白蛋白或質量濃度為5 %的脫脂奶粉，封閉緩沖液的pH值為7.4。
[0069]本發明一優選實施方式中，步驟(I)中洗滌緩沖液為濃度為0.015M且pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液，該磷酸鹽緩沖液中還含有質量濃度為0.05 %的吐溫20。
[0070]本發明一優選實施方式中，待測樣品為含有鉛離子的環境樣品。
[0071]本發明一優選實施方式中，將環境樣品進行常規的預處理，然后加入EDTA螯合形成Pb2+-EDTA,將該待測樣品進行免疫分析以檢測待測樣品中的鉛含量。
[0072]本發明一優選實施方式中，步驟(I)中鉛完全抗原的制備方法為:
[0073]稱取0.5mg iEDTA，用10yLDMSO溶解；隨后將10yL含有I.ΟμΜ Pb2+的溶液逐滴加入到iEDTA溶液中，25 °C、125rpm反應3h，形成金屬-螯合劑復合物;然后將金屬-螯合劑復合物逐滴加入到5mg OVA溶液(用800yL，0.lM，pH7.4Tris-HCl緩沖液)中，加入三乙胺溶液，調節反應混合液的pH為9.0-9.5；250C、125rpm反應24h；反應結束后，用反應液加入到已經用
0.1M EDTA.2Na預處理的超濾管中，5000g離心超濾5次，每次lOmin，除去未偶聯上的金屬和螯合劑;最后用PBS緩沖液重懸截留物，得到總體積為ImL的抗原溶液，經鑒定后分裝，置于-20 °C保存備用。
[0074]本發明一優選實施方式中，加入100_200μ1濃度為100ng/ml的酶標記抗體復合物。
[0075]本發明一優選實施方式中，單克隆抗體為小鼠制備的抗Pb2+-EDTA的單克隆抗體4B7。
[0076]本發明一優選實施方式中，酶標記抗體復合物的制備方法為:
[0077](I)稱取辣根過氧化物酶，溶解制得辣根過氧化物酶溶液;將Na14溶液逐滴加入到辣根過氧化物酶溶液中，室溫避光攪拌30-40min后，透析過夜；
[0078](2)收集透析液，調節透析液的pH值至9.0-9.5，然后加入溶有單克隆抗體的碳酸鹽緩沖液，室溫避光條件下，緩慢攪拌反應2-4h;隨后加入NaBH4溶液，充分混勻后，于4°C靜置2-4h;透析過夜，純化后制得酶標記抗體復合物。
[0079]本發明一優選實施方式中，上述步驟(2)純化的步驟為:收集透析液，置于4°C層析柜中，在攪拌狀態下，逐滴加入等體積的飽和硫酸銨溶液，混勻后，靜置過夜;4°C，7500rpm離心30min后，棄上層清液，用磷酸鹽緩沖液重懸沉淀;將重懸后的溶液裝入透析袋，用磷酸鹽緩沖液，4°C透析，以去除小分子物質，將收集的透析液于4°C，1000rpm離心30min后，收集上層清液即為酶標記抗體復合物。
[0080]本發明一實施方式中，步驟(5)中，辣根過氧化物酶顯色劑為3，3’，5，5’_四甲基聯苯胺(TMB)，辣根過氧化物酶發光劑為3-氨基鄰苯二甲酰肼或4-氨基鄰苯二甲酰肼。顯色反應為先加入辣根過氧化物酶顯色劑再加入終止液終止顯色，隨后用酶標儀測定光密度。發光反應為先加入辣根過氧化物酶發光劑再加入終止液終止發光，隨后用熒光檢測儀測定發光強度。
[0081 ]本發明一優選實施方式中，對TMB的來源不做特殊限定，可購買得到。
[0082]本發明一優選實施方式中，標準曲線的制作方法和本發明第一方面提供的檢測鉛的免疫分析方法相同，區別僅在于步驟(2)中在固相載體加入按濃度梯度稀釋的鉛標準溶液而不是待測樣品；根據鉛標準溶液的濃度和光密度值或光信號的線性關系，繪制標準曲線。
[0083]本發明一優選實施方式中，鉛標準溶液為鉛離子-螯合劑復合物(Pb2+-EDTA)。
[0084]本發明一優選實施方式中，鉛標準溶液的濃度梯度為200,100,50,25,10,5,2.5,
I,Ong/mlo
[0085]本發明一實施方式中，碳酸鹽緩沖液的濃度為0.05M且pH值為9.6，洗滌緩沖液含有濃度為0.015M且pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液和質量濃度為0.05%的吐溫20，稀釋緩沖液為pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液。
[0086]本發明第一方面提供的本發明實施例提供了一種檢測鉛的免疫分析方法，通過待測樣品與鉛完全抗原競爭結合辣根過氧化物酶標記的抗鉛的單克隆抗體并通過顯色反應放大信號實現對待測樣品中鉛含量的檢測。本發明實施例提供的一種檢測鉛的免疫分析方法為一步法競爭酶聯免疫分析方法，簡便、快速且能夠高通量檢測。
[0087]本發明第二方面提供了一種快速檢測鉛的免疫分析檢測試劑盒，包括:包被有鉛完全抗原的固相載體、鉛標準溶液和辣根過氧化物酶標記的抗鉛的單克隆抗體，以及包括辣根過氧化物酶顯色劑或辣根過氧化物酶發光劑。
[0088]本發明實施例第二方面中鉛完全抗原、固相載體、辣根過氧化物酶標記的抗鉛的單克隆抗體、辣根過氧化物酶顯色劑和辣根過氧化物酶發光劑均如第一方面。
[0089]本發明一優選實施方式中，鉛標準溶液為鉛離子-螯合劑復合物(Pb2+-EDTA)。
[0090]本發明第二方面提供的快速檢測鉛的免疫分析檢測試劑盒，能夠用于快速檢測鉛，應用較為簡便。
[0091 ] 實施例一
[0092]一種鉛完全抗原的制備方法，包括以下步驟:
[0093]稱取0.5mgiEDTA，用10yL DMSO溶解，制得iEDTA溶液；隨后將10yL含有1.0ymolPb2+的溶液逐滴加入到iEDTA溶液中，25°C、125rpm反應3h，制得Pb2+_iEDTA復合物。將1.5mgBSA溶解于800yL，0.1M，pH值為7.4Tris_HCl緩沖液中制得含有BSA的緩沖體系;然后將Pb2+-1EDTA復合物逐滴加入到含有BSA的緩沖體系中制得反應混合液;加入三乙胺溶液調節反應混合液的pH值為9.0，25°C、125rpm反應24h ；反應結束后，用反應混合液加入到已經用0.1MEDTA.2Na預處理的超濾管中，5000g離心超濾5次，每次lOmin，除去未偶聯上的Pb2+和iEDTA。收集離心超濾的截留物即為鉛完全抗原。最后可用PBS緩沖液重懸截留物，得到總體積為ImL的鉛完全抗原溶液。鉛完全抗原溶液可經鑒定后分裝，置于-20°C保存備用。
[0094]實施例二
[0095]一種鉛完全抗原的制備方法，包括以下步驟:
[0096]稱取0.5mgiEDTA，用10yL DMSO溶解，制得iEDTA溶液；隨后將10yL含有1.0ymolPb2+的溶液逐滴加入到iEDTA溶液中，25°C、125rpm反應3h，制得Pb2+-1EDTA復合物。將5mgOVA溶解于800yL，0.1M，pH值為7.4Tris_HCl緩沖液中制得含有BSA的緩沖體系;然后將Pb2+-1EDTA復合物逐滴加入到含有OVA的緩沖體系中制得反應混合液;加入三乙胺溶液調節反應混合液的pH值為9.0，25°C、125rpm反應24h ；反應結束后，用反應液加入到已經用0.1MEDTA.2Na預處理的超濾管中，5000g離心超濾5次，每次lOmin，除去未偶聯上的Pb2+和iEDTA;收集離心超濾的截留物即為鉛完全抗原;最后可用PBS緩沖液重懸截留物，得到總體積為ImL的鉛完全抗原溶液;鉛完全抗原溶液可經鑒定后分裝，置于-20°C保存備用。
[0097]實施例三
[0098]一種鉛完全抗原的制備方法，包括以下步驟:
[0099]先將2mg的p-SCN-Bn-DTPA和4.0mg的BSA蛋白在pH值為9.4的HEPES緩沖液中反應24h后，在4°C、6000r/min的條件下，超濾5min去除未偶聯上的p-SCN-Bn-DTPA，再用pH值為7.4的HEPES緩沖液洗取截留物，然后逐滴加入10yL含有3.0ymol Pb2+的溶液，室溫反應Ih后，超濾去除未螯合的Pb2+;收集超濾的截留物即為鉛完全抗原;可再用反應緩沖液稀釋截留物，最終得到2mL的溶液。使用前，用lOOmmol/L DTPA和0.lmol/L，pH7.4的HEPES緩沖液對超濾離心管預處理。
[0100]實施例四
[0101]—種鉛完全抗原的制備方法，包括以下步驟:
[0102]先將2mg的p-SCN-Bn-DTPA和6.5mg的OVA蛋白在pH值為9.4的HEPES緩沖液中反應24h后，在4°C、6000r/min的條件下，超濾5min去除未偶聯上的p-SCN-Bn-DTPA，再用pH值為7.4的HEPES緩沖液洗取截留物，然后逐滴加入10yL含有3.0ymol Pb2+的溶液，室溫反應Ih后，超濾去除未螯合的Pb2+;收集超濾的截留物即為鉛完全抗原;可再用反應緩沖液稀釋截留物，最終得到2mL的溶液;使用前，用lOOmmol/L DTPA和0.lmol/L，pH7.4的HEPES緩沖液對超濾離心管預處理。
[0103]實施例五
[0104]—種酶標記抗體復合物的制備方法，包括以下步驟:
[0105](I)稱取2mg辣根過氧化物酶，溶解于ImL去離子水中制得辣根過氧化物酶溶液;將200yL 0.1M Na14溶液(現配)逐滴加入到辣根過氧化物酶溶液中，室溫避光攪拌30min得到反應液;隨后將反應液裝入透析袋中，用lmM，pH值為4.4醋酸鈉緩沖液在4°C條件下透析過夜；
[0106](2)收集透析袋中的透析液，用0.05M，pH值為9.6的碳酸鹽緩沖液調節透析液的pH值至9.0-9.5，然后立即加入ImL溶有50yg抗鉛的單克隆抗體的碳酸鹽緩沖液，室溫避光條件下，緩慢攪拌反應2h;隨后加入10yL，4mg/mL NaBH4溶液(現配)，充分混勻后，于4 °C靜置2h;然后將反應液裝入透析袋中，用0.015M pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液在4°C條件下透析過夜；
[0107](3)收集透析液，置于4°C層析柜中，在攪拌狀態下，逐滴加入等體積的飽和硫酸銨溶液，混勻后，靜置過夜；4°C，7500rpm離心30min后，棄上層清液，用磷酸鹽緩沖液重懸沉淀;將重懸后的溶液裝入透析袋，用磷酸鹽緩沖液，4°C透析，以去除小分子物質，將收集的透析液于4°C，1000rpm離心30min后，收集上層清液，制得酶標記抗體復合物。經鑒定后分裝，置于-20°C保存。
[0108]實施例六[0109 ] —種快速檢測鉛的免疫分析方法，包括以下步驟:
[0110](—)、棋盤滴定確定抗原抗體的最佳反應濃度
[0111](I)用包被緩沖液(0.05M，pH 9.6碳酸鹽緩沖液)將檢測抗原梯度稀釋(2000，1000，500，250，100，50ng/ml)，每孔10yL加入到96-微孔板中；
[0112](2)將板置于密封袋中，防止孔內液體揮發，4°C包被16h;
[0113](3)傾去孔內液體，加入PBS-T(0.015M，pH 7.4磷酸鹽緩沖液，含0.05 % Tween20)，放置10s，然后棄板孔液并置于干凈的吸水紙上使板孔內液體吸干，重復3次；
[0114](4)每孔中加入200yL封閉緩沖液(5%脫脂奶粉)，將板密封后，置于37°C封閉Ih;
[0115](5)重復洗板操作(3);
[0116](6)取出需要數目的微孔，將梯度稀釋的純化辣根過氧化物酶和單克隆抗體偶聯復合物(1000,500,250,100,50,25,10,5ng)加入到相應地微孔板中，輕輕振蕩混勻，密封后置于37°C避光環境中反應30min;
[0117](7)重復操作(3);
[0118](8)依次加入TMB底物顯色液A液與底物液B液各50yL于微孔中，振蕩混勻，置室溫避光環境中反應1min;
[0119](9)每孔中加入50yL終止液(2M硫酸溶液)，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450nm處測定每孔OD值。
[0120](二)、快速檢測鉛的免疫分析方法
[0121](I)用包被緩沖液(0.05M，pH 9.6碳酸鹽緩沖液)將最佳濃度的檢測抗原稀釋(200ng/ml)，每孔10yL加入到96-微孔板中；
[0122](2)將板置于密封袋中，防止孔內液體揮發，4°C包被16h;
[0123](3)傾去孔內液體，加入PBS_T(0.015M，pH 7.4磷酸鹽緩沖液，含0.05 % Tween20)，放置10s，然后棄板孔液并置于干凈的吸水紙上使板孔內液體吸干，重復3次；
[0124](4)每孔中加入200yL封閉緩沖液(5%脫脂奶粉)，將板密封后，置于37°C封閉Ih;
[0125](5)重復洗板操作(3);
[0126](6)取出需要數目的微孔，將梯度稀釋的小分子抗原標準品(Pb2+-EDTA,200，100，50,25,10,5,2.5,1 ,Ong)加入到相應地微孔板中，同時將樣品加入到樣品微孔板中，再往標準品和樣品微孔板中均加入ΙΟΟμΙ辣根過氧化物酶和單克隆抗體偶聯復合物(100ng/ml)輕輕振蕩混勻，密封后置于37°C避光環境中反應30min;
[0127](7)重復操作(3);
[0128](8)依次加入TMB底物顯色液A液與底物液B液各50yL于微孔中，振蕩混勻，置室溫避光環境中反應1min;
[0129](9)每孔中加入50yL終止液(2M硫酸溶液)，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450nm處測定每孔OD值。
[0130](10)通過測得的OD值，繪制標準曲線，通過標準曲線計算樣品中重金屬鉛的濃度。
[0131]以上所述實施例僅表達了本發明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對本發明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發明的保護范圍。因此，本發明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。
【主權項】
1.一種快速檢測鉛的免疫分析方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)取濃度為100-200ng/ml的鉛完全抗原，將所述鉛完全抗原包被至固相載體表面，4-6°C包被14-16h，洗滌所述固相載體，隨后加入封閉緩沖液封閉所述固相載體表面的空白位置，37-40 0C封閉l_3h，隨后洗滌所述固相載體； (2)取待測樣品和濃度為50-100ng/ml的酶標記抗體復合物，所述待測樣品中的鉛離子與螯合劑通過化學鍵連接，加入至步驟(I)獲得的固相載體中，輕輕振蕩混勻，然后在37-40°(:避光環境中反應30-50min;隨后用洗滌緩沖液洗滌所述固相載體;所述酶標記抗體復合物為辣根過氧化物酶和單克隆抗體的偶聯復合物； (3)在步驟(2)得到的固相載體中加入辣根過氧化物酶顯色劑進行顯色反應并測定光密度值或通過加入辣根過氧化物酶發光劑進行發光反應并測定光信號，根據光密度值或光信號與鉛濃度的標準曲線，計算所述待測樣品中鉛的含量。2.如權利要求1所述的快速檢測鉛的免疫分析方法，其特征在于，所述鉛完全抗原由具有硫氰基的雙功能螯合劑連接鉛離子與載體蛋白形成，所述雙功能螯合劑的一端與所述鉛離子通過化學鍵連接，所述雙功能螯合劑的另一端的硫氰基與所述載體蛋白的氨基偶聯。3.如權利要求2所述的快速檢測鉛的免疫分析方法，其特征在于，所述具有硫氰基的雙功能螯合劑為1_( 4-異硫氰芐基)乙烯基二胺-N，N，N，N-四乙酸或p-SCN-Bn-DTPA，所述載體蛋白為牛血清白蛋白或卵清蛋白。4.如權利要求1-3任一項所述的快速檢測鉛的免疫分析方法，其特征在于，步驟(I)中所述鉛完全抗原的制備方法為: 將含有鉛離子的溶液逐滴加入到所述1-(4-異硫氰芐基)乙烯基二胺-N，N，N，N-四乙酸溶液中，室溫下攪拌反應3-5h，超濾除去未反應的1-(4-異硫氰芐基)乙烯基二胺-N，N，N，N-四乙酸和鉛離子，重懸后，制得鉛離子-雙功能螯合劑復合物； 將所述鉛離子-雙功能螯合劑復合物逐滴加入到含有載體蛋白的緩沖體系中制得反應混合液，室溫下反應24-26h，反應結束后離心超濾或透析除去未反應的鉛離子和雙功能螯合劑，制得鉛完全抗原，所述鉛完全抗原由具有硫氰基的雙功能螯合劑連接鉛離子與載體蛋白形成，所述雙功能螯合劑的一端與所述鉛離子通過化學鍵連接，所述雙功能螯合劑的另一端的硫氰基與所述載體蛋白的氨基偶聯。5.如權利要求1-3任一項所述的快速檢測鉛的免疫分析方法，其特征在于，步驟(I)中鉛完全抗原的制備方法為: 將所述雙功能螯合劑P-SCN-Bn-DTPA與所述載體蛋白反應24_26h，反應后超濾除去未反應的P-SCN-Bn-DTPA，重懸后，制得雙功能螯合劑-載體蛋白復合物； 在所述雙功能螯合劑-載體蛋白復合物中逐滴加入含有鉛離子的溶液反應l_3h，超濾去除未螯合的鉛離子，制得鉛完全抗原，所述鉛完全抗原由具有硫氰基的雙功能螯合劑連接鉛離子與載體蛋白形成，所述雙功能螯合劑的一端與所述鉛離子通過化學鍵連接，所述雙功能螯合劑的另一端的硫氰基與所述載體蛋白的氨基偶聯。6.如權利要求1所述的快速檢測鉛的免疫分析方法，其特征在于，所述酶標記抗體復合物的制備方法為: (I)稱取辣根過氧化物酶，溶解制得辣根過氧化物酶溶液;將Na14溶液逐滴加入到所述辣根過氧化物酶溶液中，室溫避光攪拌30-40min后，透析過夜； (2)收集透析液，調節所述透析液的pH值至9.0-9.5，然后加入溶有單克隆抗體的碳酸鹽緩沖液，室溫避光條件下，緩慢攪拌反應2-4h;隨后加入NaBH4溶液，充分混勻后，于4°C靜置2-4h;透析過夜，純化后制得所述酶標記抗體復合物。7.如權利要求1所述的快速檢測鉛的免疫分析方法，其特征在于，所述辣根過氧化物酶顯色劑為3，3 ’，5，5 ’ -四甲基聯苯胺，所述辣根過氧化物酶發光劑為3-氨基鄰苯二甲酰肼或4-氨基鄰苯二甲酰肼。8.如權利要求1所述的快速檢測鉛的免疫分析方法，其特征在于，步驟(2)中加入100-200μ1濃度為100ng/ml的所述酶標記抗體復合物。9.如權利要求1所述的快速檢測鉛的免疫分析方法，其特征在于，在步驟(I)之前，采用棋盤滴定法確定抗原抗體的最佳反應濃度。10.一種快速檢測鉛的免疫分析檢測試劑盒，其特征在于，包括包被有鉛完全抗原的固相載體、鉛標準溶液和酶標記抗體復合物、以及包括辣根過氧化物酶顯色劑或辣根過氧化物酶發光劑。
【文檔編號】G01N33/535GK105823881SQ201610329693
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年5月18日
【發明人】王蒲, 鄭威, 盧曉華
【申請人】深圳先進技術研究院