用于預測對錯配的人白細胞抗原的免疫應答的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及用于預測移植之后對人白細胞抗原（HLA)的免疫應答的方法，所述方 法包括使供體和/或供體材料和受體HLA分型以測定HLA錯配以及測定預測的間接識別的 HLA抗原決定部位（PIRCHES)的數量。所以本發明提供了用于選擇和/或篩選異源移植用 供體材料的方法，例如從錯配的，優選非親緣供體中選擇具有可容許的錯配的供體材料的 方法。在優選的實施方式中，該方法涉及移植前預測可在移植異源的干細胞、不同來源的造 血干細胞、臍帶血、腎和/或其他細胞、組織或器官之后出現的不想要的同種異體反應性。
【背景技術】
[0002] 異源細胞、組織和器官的移植是一種進化療法。其逐漸成為有吸引力的治療選擇。 預期在不久的將來，接收來自非親緣供體移植物的患者數量將翻番。移植之后的同種異體 反應性對臨床結果具有大的影響，具有病理學以及有益的作用。已知HLA錯配誘導移植之 后的免疫反應，但是不十分了解與預測不想要的免疫反應的風險相關的因素。
[0003] 誥血干細朐務棺
[0004] 造血干細胞移植（HSCT)是快速生長治療選擇的一個例子。HSCT的主要限制因素 仍是移植物抗宿主疾病（GVHD)，和因為預期接收HSCT的患者數量將增加，必須加速提供預 防GVHD的方法。為了克服GVHD的風險，患者優選地用所有HLA-等位基因完全匹配的供體 移植。但是，由于群體中HLA分子的多樣性，這些完全匹配的供體對于約40%的患者不可 用。當完全匹配的供體不可用時，臨床醫生通常必須面對決定從錯配的供體中選擇最佳供 體（即攜帶最低GVHD風險的供體）的困難。直到現在，測定哪個供體最合適，依賴于需要 多達14天實驗室工作的費勁試驗。
[0005] 歷史上，認為HSCT之后的同種異體反應性主要由于供體T細胞直接識別HLA差異 而誘發。這意味著移植物T細胞識別作為完整的分子在宿主細胞的細胞表面上表達的錯配 的HLA。本發明尤其基于間接識別。當源自錯配的宿主HLA等位基因的肽被加工和呈現在 共享的HLA并且從而被供體T細胞識別時，可誘發同種異體反應性。
[0006] 造血干細胞移植（HSCT)之后的同種異體反應性對于臨床結果有大的影響，具有 病理學以及有益的作用。同種異體反應性的病理學作用反映在移植物抗宿主病（GVHD)。急 性GVHD (aGVHD)的風險取決于HLA-A、-B、-C、-DRBl和-DQBl等位基因的錯配水平，最佳匹 配是五個基因座的完全匹配（10/10匹配）。
[0007] 與單個錯配的供體的受體相比，匹配的非親緣HSCT的受體的嚴重aGVHD累積發生 率減少24% (參考文獻la)。盡管當與具有一個HLA-C等位基因錯配的供體的HSCT相比 時，10/10匹配HSCT的受體增加白血病復發的風險比（HR)為47% (參考文獻2a)，但是移植 方案優選選擇10/10匹配供體，因為部分匹配的非親緣供體中的總體存活率顯著更差（參 考文獻la)。但是，完全匹配的非親緣供體并不是對所有的患者可用；在40%的情況下，單 個HLA錯配的供體（9/10匹配）是最佳可用的可選方案（參考文獻3a)。
[0008] 在這些情況下，限定最佳-容許的錯配可有助于防止GVHD以及隨后更差的結果。 最近，基于流行病學鑒定了某些特異性非容許的錯配，與增加的形成嚴重aGVHD的風險相 關（參考文獻4a)。具有這些非容許錯配的HSCT之后，增加 GVHD風險的機理仍不清楚。
[0009] 功能上，用細胞毒素 T-淋巴細胞前體頻率（CTLpf)試驗測定更好-容許的錯配。 大于1/105的CTLpf預測為形成嚴重的aGVHD (參考文獻5a)。而且，小于或等于1/10 6PBL的 CTLpf與更好的總體存活率相關（參考文獻：Heemskerk等（2007)骨髓移植（Bone Marrow 移植），40，193-200)。因此，這些標準可用于區分潛在錯配的供體。但是，（：1'14^試驗是費 力的、延誤移植的時間，所以在大部分移植中心不使用。另外，來自潛在供體的材料在用于 移植之前需要被運輸和測試。目前沒有有效的方式可用來基于消除可能產生不利結果的樣 品，進行遞送前直接供體選擇。
[0010] 為了尋找CTLpf試驗的可選方案，已經進行了多個迄今未成功的嘗試，使用兩個 一般可用的預測程序，HLAMatchmaker和Hi stoCheck預測非容許的錯配。HLAMatchmaker測 定抗體潛在的抗原決定部位并且已經證明其有效用于實體-器官移植（參考文獻6a，7a)。 HLAMatchmaker考慮HLA上作為抗原決定部位的氨基酸三聯體的差異。盡管抗體潛在地在 形成GVHD中起作用，但是基于HLAMatchmaker的預測與同種異體反應性不相關（參考文獻 la)。HistoCheck是基于直接識別HLA偏離的概念，即，供體T細胞識別裝載非多態肽的完 整的錯配的HLA分子（參考文獻9a)。HistoCheck測定接觸T-細胞受體的肽-結合凹槽 或區域中HLA分子的結構差異（參考文獻IOa)。通過測定這些結構差異，其目的是預測直 接識別HLA偏離的可能性。HistoCheck獲得的差異分數也與同種異體反應性不相關（參考 文獻 11a，12a)。
[0011] 鑒于先前存在的技術，需要更可靠的用于預測HLA錯配的移植用供體材料是否增 加導致失敗的移植的風險（例如形成GVHD)和/或增加死亡率。
[0012] 腎務棺
[0013] 人白細胞抗原（HLA)的錯配顯著改善了腎移植的結果（參考文獻Ib)。但是，由于 各種HLA基因座的高水平的多態性和有限數量的供體，供體和受體之間的HLA錯配存在于 約85%的尸腎移植（歐洲移植數據庫；//www. eurotransplant· org，2012年4月24 日訪問）。明顯地，這些HLA錯配經常導致產生HLA-特異性抗體，其縮短移植物存活率（參 考文獻2b)和減少再移植選擇。為了防止針對HLA的抗體形成，最佳腎移植物是與受體相 同的HLA，或表達不誘導抗體形成的可接受的HLA錯配。至有限的程度，這些可接受的錯配 可用HLAMatchmaker算法鑒定。
[0014] HLAMatchmaker限定HLA分子上的多態抗原決定部位，稱為抗原決定部位聯體 (印let)，其被HLA抗體可用并且減去患者自身HLA上出現的那些抗原決定部位聯體（參考 文獻3b，4b)。在腎移植物上沒有留下待識別的抗原決定部位聯體的情況下，不能預期抗體 應答（參考文獻5b)。盡管HLAMatchmaker預測哪種HLA-抗原可潛在地誘導HLA抗體形 成，但是其不能預測針對異源HLA的T-細胞反應性（參考文獻6b)。
[0015] 在之前的研宄中，已經顯示效應器的HLA-DR表型影響產生Bw4特異性抗體和I型 抗體敏化等級（參考文獻7b，8b)。這提示了間接識別源自供體的HLA肽對患者抗原呈遞細 胞的HLA II型分子的作用。該現象將解釋導致產生IgG同種型的供體特異性抗體（DSA) 的Thelper-2-細胞應答（參考文獻9b) 〇
[0016] 肽與HLA分子的結合
[0017] 肽與HLA分子的結合是可預測的。預測的結合親和力和實驗測量之間的差異已經 顯示如不同實驗室之間測量的差異一樣小（參考文獻l〇b)。對于HLA I型分子，可預測性 尤其高，因為這些分子對于九個氨基酸長的肽（9-mers)具有更嚴格的偏好并且需要具體 的氨基酸作為在清楚限定的錨定位置的錨定殘基（參考文獻lib)。對于HLA II型分子，可 預測性更低，因為不同長度的肽可使用不同位置作為錨定殘基結合（參考文獻12b)。所以， 難以測定肽如何與HLA II型結合凹槽對齊，以及肽中的哪個氨基酸殘基優選作為錨。為了 解決該問題，Nielsen等使用所謂的核心預測指標，以評估II型結合凹槽中的肽位置（參 考文獻23a)。核心預測指標使得能夠開發精確的HLA II型預測指標，稱為NetMHCII (參考 文獻24a)。
[0018] 盡管在預測與I型和II型HLA分子結合的肽方面的進步，但是就評估涉及同種異 體反應性和產生供體特異性抗體（DSA)因素而言，仍有很大的不確定性。考慮目前可用于 預測腎移植之后不想要的免疫應答的工具，需要提供更可靠的方法用于評估移植后的潛在 不利反應。
[0019] 間接識別錯配的HLA抗原
[0020] 概念上，錯配的HLA定向的T-細胞同種異體反應性可源自直接和間接識別HLA差 異。迄今為止，目的在于闡釋和預測針對錯配的HLA的臨床同種異體反應性的研宄主要關 注直接識別HLA差異。直接識別涉及供體T細胞，其識別具有非多態肽的完整的錯配的HLA 分子（參考文獻9a)。當HLA等位基因的多態性導致肽-結合凹槽的差異時，存在的HLA分 子的肽集合可根本上不同。這些不同的肽集合可導致T-細胞應答。HistoCheck算法測定 接觸T-細胞受體的肽-結合凹槽或區域的HLA分子的結構差異，從而預測差異分數（參考 文獻10a)。但是，HistoCheck獲得的分數在體外（參考文獻6c)以及在體內（參考文獻 7c，11a，12a)都與同種異體反應性不相關。
[0021] T-細胞相關的同種異體反應性也可潛在地被間接識別錯配的HLA等位基因誘發。 對于次要組織相容性（H)抗原，更詳細研宄了間接識別。這些HLA呈遞多態蛋白的錯配與 增加的aGVHD風險（參考文獻13a)和下降的復發風險相關（參考文獻14a，15a)。與源自 次要H錯配的肽類似，源自錯配的HLA分子的肽可也由HLA呈遞。
[0022] 間接識別錯配的HLA抗原可導致T細胞相關的同種異體反應性。在間接HLA識別 期間，T細胞識別由共享（匹配）的HLA分子呈遞的源自多態HLA抗原的肽。源自錯配的 HLA分子的肽經常由HLA呈遞（參考文獻10c)。這些間接可識別的HLA抗原決定部位已經 與實體器官移植的急性和慢性移植物衰竭相關（參考文獻11c，12c，13c，14c)。所以，在自 身HLA背景下，間接識別HLA錯配的T細胞可在臨床同種異體反應性中起重要作用。
[0023] 利用今天鑒定的約8800個HLA等位基因（參考文獻15c)，實驗測定所有潛在的所 有HLA抗原中呈遞的HLA起源的抗原決定部位是大量的和幾乎不可能的工作。為了利于識 別這些間接可識別的HLA抗原決定部位，已經開發了新的方法。該方法基于有效的預測工 具（參考文獻 18a，19a，21a，20a，20c)。
[0024] 本發明指出了預測作為預測間接可識別的HLA抗原決定部位（PIRCHES)呈遞 的HLA起源的抗原決定部位。本發明識別了分別由共享的HLA I型（PIRCHE-I)和II型 (PIRCHE-II)呈遞的PIRCHES。PIRCHE-II顯示為在腎移植之后誘導同種異體反應性； HLA-DR呈遞的PIRCHES與供體特異性HLA IgG抗體的從新形成相關（參考文獻21c)。
[0025] 因此，本發明基于發現識別HLA起源的肽對HLA錯配的HSCT之后的臨床同種異體 反應性起作用。為了該目的，可評估預測的PIRCHE-I和PIRCHE-II的數量和評估它們HSCT 的不利臨床作用。基于該研宄，本發明描述了普遍適用的方法，其可在HSCT和其他細胞或 器官移植物之前預測非容許的HLA錯配。

【發明內容】

[0026] 鑒于現有技術，本發明的技術問題是提供在經歷移植程序的患者中預測不想要的 免疫應答、預測移植的治療結果（例如存活、GVHD、復發、植入，移植物排斥）的方式或用于 選擇適于異源移植的具有低不利反應風險的供體細胞或組織制品的另外方式。
[0027] 該問題通過獨立權利要求的特征來解決。獨立權利要求提供了本發明的優選實施 方式。
[0028] 因此，本發明涉及用于預測在移植之后對人白細胞抗原（HLA)的免疫應答的方 法，其中所述免疫應答與供體和受體之間的HLA錯配相關，所述方法包括：
[0029] -使供體和/或供體材料和受體HLA分型以測定HLA錯配；以及
[0030] -測定預測的間接識別的HLA抗原決定部位（PIRCHES)的數量，其中所述PIRCHES 是來自錯配的受體-HLA等位基因的受體特異性或供體特異性的HLA起源的肽，并且預測為 由共享（匹配）的HLA分子呈遞，
[0031] -其中PIRCHES的數量與所述免疫應答的可能性