專利名稱：分離的酪氨酸酶衍生肽及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及衍生自酪氨酸酶，并由HLA-A2及HLA-B44分子呈遞的分離肽及其應用，另外本發明還涉及鑒別那些診斷具有細胞異常特征的疾病的個體的能力，這些異常細胞呈遞這些肽與HLA-A2及HLA-B44的復合物，本發明還涉及被呈遞的肽及其應用。
背景及現技術哺乳動物免疫系統識別并與外來物或異物反應的過程是一種復雜過程。該系統的一重要方面是T細胞應答。該應答要求T細胞識別并與細胞表面分子-稱作人白細胞抗原(HLA)或主要組織相容性復合物(MHCS)-和肽的復合物相互作用。這種肽衍生自較大分子，其由也呈遞HLA/MHC分子的細胞加工，參見Male等，《免疫學進展》(J.P.Lipincott Company,1987)尤其第6-10章所述。T細胞與HLA/肽的復合物的相互作用是受限的，要求對某一HLA分子和一種肽的組合是特異性的T細胞。如果不存在特異性T細胞，即使存在其配體復合體也不產生T細胞應答。相似地，如果沒有特異性復合物而只有T細胞，同樣也不能產生應答。這種機制參與免疫系統對外來物的應答，自身免疫病理學及對細胞異常的應答中。近來有許多工作致力于將蛋白質加工成HLA結合肽的機制。可見于Barinaga，科學257:880(1992)；Fremont等，科學25:919(1992)；Matsumura等，科學257:927(1992)；Latron等，科學257:964(1992)。
由T細胞識別細胞異常的機理也包含于癌癥中。例如，在1992年5月22日申請，公布于1992年11月26日的PCT申請PCT/US92/04354中(引入本文作參考)，揭示了一個基因家族，其被加工成肽，進而在細胞表面表達，并能導致由特異性CTL對腫瘤細胞的溶解。據稱這些基因編碼“腫瘤排斥抗原前體”或“TRAP”分子，且衍生自其中的肽被稱作“腫瘤排斥抗原”或“TRA”。可參見Traversari et al.，免疫遺傳學，35:145(1992)；van der Bruggen等，科學254:1643(1991)，對該基因家族的進一步報道。
在美國專利5,405,940及5,462,871(其內容并入本文作參考)中，教導了與HLA-A1分子結合的九肽。該參考文獻指出給定特定肽對特定的HLA分子的已知特異性，可以預期一種特定的肽只與一種HLA分子而不與其它分子結合。這是很重要的，因為不同的個體具有不同的HLA表型。結果，盡管鑒別某一特定的肽作為某一特異性HLA分子的配體具有診斷和治療作用，但是這些只與具有該特定的HLA表型的個體相關。在這一領域需進一步研究，是由于細胞異常不限于一種特定HLA表型，且定向治療要求對異常細胞的表型的認識。
酪氨酸酶催化反應使酪氨酸轉化為脫羥苯丙氨酸或“DOPA”，并呈現在黑素細胞中選擇性表達(Muller et al.,EMBOJ7:2715(1988))。對該人類酶cDNA的早期報道可見于Kwon，美國專利4,898,814。稍晚由Bouchard等，J.Exp.Med.169:2029(1989)的報道介紹了一種稍有不同的序列。有大量的工作致力于識別這種酶的抑制劑，是由于其在色素沉著性疾病中具有一定影響。該專題文獻的實例可包括Jinbow,WO9116302；Mishima et al.,U.S.Patent No.5,077,059，及Nazzaropor,U.S.Patent No.4,818,768。技術人員對其它教導相似物質的參考文獻也是通曉的。
并入本文作參考的美國專利申請08/081,673,(申請日1993年6月23日)教導酪氨酸酶可以以與外來抗原或TRAP分子相似的方式進行處理，即發現在某些細胞異常如黑素瘤中，酪氨酸酶被加工并且衍生自其中的肽與HLA分子在某些異常細胞表面形成復合物。這些復合物可被胞溶性T細胞(“CTL”)識別，CTL然后溶解呈遞細胞。這令人驚奇的未預料到的現象的應用已被討論。現已發現其它的肽也可作為由HLA-A2分子呈遞的腫瘤排斥抗原。這些可參考1994年2月28日申請的08/203,054中所述(引入本文作參考)。
現已發現衍生自酪氨酸酶的其它肽是腫瘤排斥抗原，因為其由MHC分子HLA-B44呈遞，并被胞溶性T細胞溶解。
附圖簡述

圖1集中描述了細胞溶解研究，尤其圖1A顯示了細胞系LB24-MEL的溶解；圖1B顯示了細胞系SK29-MEL的溶解；圖1C顯示了細胞系LB4.MEL的溶解；圖1D顯示了細胞系SK23.MEL的溶解；圖1E顯示了細胞系LE516.MEL的溶解；圖1F顯示了喪失HLA-A2表達的細胞系SK29-MEL.1.22的溶解；圖1G顯示了MZ2-MEL溶解的喪失；圖1H顯示了在NK靶K562上的溶解研究；圖1I顯示了在用HLA-A2基因轉染后的圖1F中的喪失變異體的溶解；圖1J顯示了來自病人SK29的自體EBV轉化的B細胞的溶解。
圖2顯示了CTL IVSB的TNF釋放的研究。
圖3描述了CTL210/9的TNF釋放的研究。
圖4描述了由胞溶性T細胞克隆CTL-IVSB而非胞溶性T細胞克隆CTL2/9對SEQ ID NO:2肽的識別。
圖5顯示了SEQ ID NO:2肽不被胞溶性T細胞克隆CTL 210/9識別。
圖6顯示了在各種細胞，包括那些在其表面呈遞HLA-B44的細胞上進行TNF釋放分析時得到的結果。
圖7集中顯示了利用本發明所述肽在三種不同細胞系進行的一系列鉻釋放分析。
圖7A顯示了使用SEQ ID NO:4肽所進行的實驗。
圖7B顯示了使用SEQ ID NO:5肽的結果。
圖7C闡述了使用SEQ ID NO:2所得結果。
在圖7中，符號“○”用于代表細胞系T2，“□”用于代表不呈遞HLA-A2的MZ2-MEL，且“○”用于代表已被轉染成呈遞HLA-A2的MZ2-MEL。實施例12詳盡論述了這些試驗。
圖8A和8B顯示了使用呈遞MHC分子HLA-B44的細胞系及胞溶性T細胞克隆22/31(后文稱作CTL 22/31)的研究工作。在圖8A中，細胞系(“Rosi EBV”)與單克隆抗體W6/32預培養，而在圖8B中未經預培養。
圖9A和9B顯示了當用CTL克隆22/3及IVSB作用于表達HLA-A2和/或HLA-B44 MHC分子的靶細胞時所獲得的結果。
圖10闡述了使用對HLA-B*4402細胞特異性的CTL克隆329B/5及對HLA-B*4403細胞系特異性的CTL22/31的溶解研究。
圖11闡述了在涉及CTL 329B/5的分析中TNF釋放的刺激作用的實驗結果。其顯示出CTL克隆329B/5對HLA-B*4402呈遞細胞具有高度特異性。
優選實施方案詳述實施例1將研究者已使用多年的黑素瘤細胞系SK29-MEL(也稱作SKMEL-29)和LB24-MEL用于以下實驗。
含血單核細胞的樣品取自患者SK29(AV)及LB24(這些病人也分別是SK29-MEL和LB24-MEL的來源)。將黑素瘤細胞系與含血單核細胞的樣品相接觸，觀察混合物的黑素瘤細胞系的溶解，該溶解表示對由黑素瘤細胞呈遞的肽和HLA分子的復合物具有特異性的胞溶性T細胞(“CTL”)存在于樣品中。
所采用的溶解分析是參考Hem et al.,Int.J.Cancer 39:390-396(1987)中的一種鉻釋放分析(該文引入本文作參考)。但本文仍詳述該分析法。黑素瘤靶細胞在體外生長，然后在補加10mM HEPES和30％FCS的DMEM中以107個細胞/ml重懸浮，并在37℃與200μCi/ml的Na(51Cr)O4溫育45分鐘。用補加10mM Hepes的DMEM將標記的細胞沖洗三次，然后將這些細胞在補加10mM Hepes及10％FCS的DMEM中重懸浮。之后將含103個細胞的100μl相同培養基加入，以雙份重復進行分析實驗。以100g離心板4分鐘，在37℃在含5.5％CO2的氣氛下溫育4小時。
將板再離心，收集100μl上清液等份并計數。51Cr釋放百分率用下列公式計算
其中ER是觀測到的實驗51Cr釋放，SR是經200μl培養基中溫育103個標記細胞而測定的自發釋放，MR是向靶細胞中加入100μl0.3％Triton X-100而得到的最大釋放。
將那些呈高CTL活性的血單核細胞樣品擴增并經有限稀釋克隆，用相同方法再篩選。
使用相同方法測試K562靶細胞。當使用EBV轉化的B細胞(EBV-B細胞)時，唯一的改變是用Hank’s培養基代替DMEM培養基。
這些實驗導致來自SK29(AV)病人的CTL克隆“IVSB”及來自LB24病人的CTL克隆210/9的分離。
在圖1A、B、G、I呈現了這些分析結果。具體地，可見兩種CTLs溶解兩種黑素瘤細胞系，而K562及EBV-B細胞系沒有溶解。
實施例2測試所述CTL對其它黑素瘤細胞系的作用以檢測其它黑素瘤細胞系是否共有其靶。用實施例1所述的溶解方法研究LB4.MEL，SK23.MEL(也稱作SK MEL-23)及LE516.MEL。圖1C、D、E顯示這些克隆不能溶解這些細胞系。
這些受試細胞系已知是HLA-A2型，結果提示CTL對肽和HLA-A2的復合物具有特異性。這一提示可通過測試已喪失HLA-A2表達的SK29-MEL的一種變異體來證實。圖1F顯示了這些結果。兩組克隆都不能溶解喪失HLA的變異體。當這些變異體用SK29-MEL的HLA-A2基因轉染后再測試時，可觀測到發生溶解。這樣可推斷出呈遞分子是HLA-A2。
實施例3一旦鑒別出呈遞HLA分子，則進行研究以鑒別后文稱作“腫瘤排斥抗原前體”或“TRAP”分子，該分子是被呈遞的肽的來源。
為進行此項工作，從SK29-MEL.1細胞系-其是SK29-MEL的亞克隆-中分離出總RNA。RNA遵循熟知的技術使用一種寡脫氧胸苷酸結合試劑盒進行分離。總RNA一經得到則利用標準方法將其轉錄成cDNA。然后將cDNA與EcoRI銜接子連接，并按照廠商指導克隆進pcDNA-I/Amp質粒的EcoRⅠ位點。再將重組質粒電穿孔進JM101E.coli(電穿孔條件2500V,25μ法拉弟1脈沖)。
用氨芐青霉素(50μg/ml)篩選轉染的細菌，然后分成每個庫含200個克隆的700個庫。每個庫相當于大約100個不同的cDNA，且分析顯示大約50％質粒含有插入片段。將每個庫擴增至飽和，并經堿裂解，乙酸鉀沉淀及苯酚抽提[參見Maniatis et.al，分子克隆實驗手冊(coldSpnng Harbor,N.Y.1987)]分離出質粒DNA。不使用銫梯度離心。
實施例4將擴增的質粒轉染入真核細胞。將COS-7細胞的樣品在補加10％胎牛血清的Dulbecco’s改良的Eagles培養基(“DMEM”)中以15,000個細胞/孔種入組織培養平底微孔中。在37℃將細胞溫育過夜，除去培養基然后用30μl/孔含10％Nu血清，400μg/ml DEAE葡聚糖，100μM氯喹，100ng pcDNA-I/Amp-A2質粒及1000ng前述cDNA文庫的1個庫的DNA的DMEM培養基替換。pcDNA-I/Amp-A2質粒含有來自SK29-MEL的HLA-A2基因。在37℃溫育4小時后，除去培養基，用含10％DMSO的50μl PBS替換。2分鐘后除去該培養基并換以200μl的補加10％FCS的DMEM。
經過培養基的變化之后，在37℃將COS細胞溫育48小時。然后將培養基除去，以含10％濃集人血清的100μl的Iscove’s培養基加入每個所述的CTL克隆的2000個細胞。當使用210/9克隆時，用25U/ml的IL-2補加培養基。24小時后除去上清液，并參考如Traversari等，免疫遺傳學35:145～152(1992)所述，在WEHI細胞上分析以檢測TNF含量〔該文引入本文作參考〕。
在用IVSB測試的700個孔中，696個孔呈每ml TNF含量0.6～4pg，剩下的4孔中TNF含量在10～20pg/ml之間。用CTL210/9測試的同源孔呈相似的略高的值。圖2、3示出了這些數據。
實施例5選擇經鑒定為高生產者的4個庫中的3個庫(編號為“123”,“181”及“384”)進行進一步試驗。具體地，克隆細菌，且從每個庫中測試570個細菌。從中提取質粒DNA，并將其以如上所述的相同方式轉染進COS細胞的一新樣品中，并重新測試該細胞對CTL 210/9及CTL IVSB的刺激作用。在123庫中發現一陽性克隆(“p123.B2”)，在384庫中也發現一個(“p384.C6)”。進行一對照試驗。其中COS細胞經cDNA和HLA-A2基因轉染及只經HLA-A2轉染，可得到一確證轉染的細胞由CTL識別。TNF在CTL上清液中的釋放可經在WEHI細胞上測試其加以測定。用MTT測定存活WEHI細胞的光密度，結果見表1表1cDNA(123.B2)+HLA-A2 DNA無cDNA+HLA-A2第1輪0.087 0.502第2輪0.108 0.562WEHI光密度值相當于經cDNA及HLA-A2轉染的24pg/mlTNF，對照組為2.3pg/ml。
將得自陽性克隆的質粒提出，并用本領域技術人員熟知的技術測序。序列檢索顯示該質粒插入片段與Bouchard.et al.,J.Exp.Med.169:2029(1989)中所述的人酪氨酸酶的cDNA幾近相同。因此正常產生的分子(如酪氨酸酶)可作為腫瘤排斥抗原前體，并可加工成可在細胞表面呈遞的腫瘤排斥抗原肽，從而與HLA-A2結合刺激由CTL克隆的溶解。該鑒定的分子的核酸序列見SEQ ID NO:1。
實施例6由Chomez等在免疫遺傳學，35:241(1992)報道的前期研究顯示含編碼一抗原肽的序列的小基學因片段引起該肽的表達。該研究工作(引入本文作參考)提示克隆到如上所述并在SEQ ID NO:1中的人酪氨酸酶cDNA的小部分。使用如實施例1-5所述的方法，將各種cDNA片段與HLA-A2基因共轉染進COS-7細胞，并進行TNF釋放分析。這些實驗導致鑒定了一個近400堿基對的片段，當其用于共轉染實驗中時激發從如上所述的胞溶性T細胞克隆CTL IVSB釋放TNF，顯示對HLA-A2呈遞細胞的特異性。所用的約400堿基對片段相應于SEQ ID NO:1的第711-1152位堿基。該片段編碼的氨基酸可推導出，然后將該序列與Hunt等在科學，255:1261(1992)，及Falk等在自然，351:290(1991)中所提供的資料相對比，(兩篇文獻均引入本文作參考)，這些參考文獻討論了HLA-A2呈遞肽的共有序列。具體地，Hunt揭示了九肽，其中在第二位總是發現Leu或Ile,Leu是“主要殘基”。第九位殘基始終是帶脂族烴側鏈的殘基，Val是該位的主要殘基。Hunt揭示了在第二位的Leu的強信號及Met的中等信號，在第6位的Val,Leu,Ile或Thr中之一，及在第9位的Val或Leu，其中Val特別強。在對比的基礎上，合成九肽然后進行測試以觀察它們是否能敏化HLA-A2呈遞細胞。為此要使用酪氨酸酶喪失變異體細胞系SK29-MEL1.218及T202LB。將各種濃度的受試肽與胞溶性T細胞克隆CTL IVSB或胞溶性T細胞克隆CTL210/9一起加入細胞系中。如上所述的早期研究已證實前一克隆可溶解呈遞HLA-A2的表達酪氨酸酶的細胞，而后者不能。
將酪氨酸酶喪失變異體與或不與用于穩定空HLA-A2分子的抗HLA-A2抗體MA2.1在含51Cr的溶液中在37℃溫育一小時。在試驗中將細胞沖洗4次，然后與各種稀釋度的肽(從100μM至0.01μM)溫育。30分鐘后以E/T為40/t的比率加入效應細胞，4小時后，收集100μl上清液并計數放射性。
圖4顯示了用九肽Tyr Met Asn Gly Thr Met Ser Gln Val(SEQ IDNO:2)所得結果。
后文稱作SEQ ID NO:2的該肽，相當于SEQ ID NO:1的酪氨酸酶cDNA序列的第1129-1155位殘基。HLA-A2及該肽的復合物由CTL克隆IVSB識別。
在一平行實驗中，顯示衍生自LB24病人的CTL克隆CTL210/9不能識別HLA-A2與SEQ ID NO:2肽的復合物，盡管其可識別HLA-A2與酪氨酸酶衍生肽的復合物。因此，酪氨酸酶被加工成至少一種額外的肽，當該肽由HLA-A2分子呈遞時被CTL克隆識別。
實施例7在以下試驗中使用一種不編碼SEQ ID NO:2肽的第二種基因片段。該片段起自SEQ ID NO:1的堿基1，終于堿基1101(即EcoRⅠ-SphⅠ片段)。以如上所述相同方式測試上述胞溶性T細胞克隆CTL210/9對用該片段轉染的COS-7細胞的作用。同時也測試了CTL IVSB。這些結果顯示CTL 210/9可識別在用該片段轉染的表達HLA-A2的細胞表面的抗原，而CTL IVSB不能。因此酪氨酸酶衍生了第二種腫瘤排斥抗原肽。
實施例8為進一步闡明由CTL 210/9識別的腫瘤排斥抗原而進行下列實驗。
將相當于SEQ ID NO:1的第451-1158位堿基的第二種片段與HLA-A2基因一起轉染進COS細胞，并進行TNF釋放分析。該序列可激發TNF從克隆CTL IVSB的釋放(20pg/ml)，而不能激發從CTL210/9中釋放TNF(3.8pg/ml)。這些結果證實該兩種CTL克隆識別不同的肽，且由LB24-CTL 210/9識別的肽必須由第1-451位堿基區域編碼。
實施例9分析由第1-451位cDNA片段編碼的酪氨酸酶衍生肽的已知與HLA-A2結合的共有序列。合成相應于這些共有序列的肽，并測試它們對HLA-A2呈遞細胞的敏化能力。為此要使用二種酪氨酸酶陰性黑素瘤細胞系(如NA8-MEL，及用HLA-A2轉染的MZ2-MEL2.2)及Salter等在免疫遺傳學，21:235-246(1985)中所述的細胞系T2。
將細胞用51Cr及HLA-A2特異性單克隆抗體MA2.1在37℃溫育50分鐘，隨后進行沖洗(見Bodmer等，自然，342:443-446(1989)，其并入本文作參考)。將靶細胞與各種濃度的肽及LB24-CTL克隆210/5或210/9溫育。溫育4小時后測定鉻釋放百分率。
可發現肽Met Leu Leu Ala Val Leu Tyr Cys Leu Leu(SEQ ID NO:3)具有活性。
在進一步實驗中，先前顯示可識別SEQ ID NO:2的CTL-IVSB不能識別SEQ ID NO:3。結果可見如下表2-4中概括所示。
肽SEQ ID NO:2SEQ ID NO:3CTL-IVSB + +CTL-210/5 - +CTL-210/9 - +用酪氨酸酶肽敏化的MZ2-2.2-A2由LB24-CTL210/5及210/9及SK29-CTLIVSB的溶解
*靶細胞用Cr51及單抗MA2.1(抗-HLA-A2)溫育50分鐘，后沖洗3次。
將其用不同濃度的肽溫育30分鐘。
將CTL細胞以所示比率(E∶T)加入溫育4小時后測定特異性Cr51釋放百分率表4由LB24-CTL210/5及210/9或SK29-CTL IVSB識別的酪氨酸酶肽的測試(％Cr51特異性釋放)
實施例10使用CTL克隆22/31進行另外的實驗。該克隆已顯示可溶解來自自體黑素瘤細胞系MZ2-MEL的亞系MZ2-MEL.43，但不能溶解其它亞系，如MZ2-MEL3.0及MZ2-MEL61.2，也不能溶解自身EBV轉化的B細胞或殺傷細胞系K562(見Van den Eynde et.al.,Int.J.Cancer44:634-640(1989)。由MZ2-MEL.43呈遞的抗原稱作抗原C。
在包括本申請的母申請的現有技術中，已發現酪氨酸酶基因編碼由自體CTLS識別的在大部分表達HLA-A2的黑素瘤上的抗原。用PCR擴增測試該基因在MZ2-MEL細胞系亞系的表達，發現MZ2-MEL.43克隆是陽性的而其它MZ2-MEL克隆如MZ2-MEL.3.0是陰性的。酪氨酸酶基因的表達與抗原MZ2-C的相關性提示MZ2-C可能是衍生自酪氨酸酶并由MZ2-MEL表達的HLA分子呈遞的腫瘤排斥抗原。該細胞系不表達HLA-A2，表明如果一種酪氨酸酶衍生肽被呈遞為TRA，則第二種HLA分子參與其中。
進行研究以鑒別哪種HLA分子將抗原C呈遞給CTL22/31。為確定這一點，將已知在細胞表面的HLA分子如HLA-A29,HLA-B37,HLA-B44.02及HLA-C克隆10的cDNA克隆從MZ2-MEL.43cDNA文庫中分離出，然后克隆進表達載體pc DNA I/Amp中。然后用這些構建物之一或含HLA-A1的構建物加上編碼酪氨酸酶的eDNA(SEQ ID NO:1)轉染受體COS7細胞。共轉染方法可參考上述方法。一天后加入CTL 22/31,24小時后，參考Traversari等如上所述，通過測試對WEHI-164-13的胞毒性而測定TNF的釋放。圖6示出只在HLA-B44和酪氨酸酶一起轉染的細胞存在下CTL22/31才釋放TNF。得出結論是HLA-B44呈遞一種酪氨酸酶衍生的腫瘤排斥抗原。
實施例11前述實驗示出SEQ ID NO:3的十聚體有效誘導HLA-A2呈遞細胞的溶解。廣泛接受的是MHC分子呈遞九肽。為此進行實驗，其中測試了兩種九聚體，其是基于確定給出陽性結果的十肽。具體地，除去第一個或第十個氨基酸以產生兩種肽。
Met Leu Leu Ala Val Leu Tyr Cys Leu(SEQ ID NO:4)Leu Leu Ala Val Leu Tyr Cys Leu Leu(SEQ ID NO:5)將這些肽在濃度為10μM～1nM范圍以前例所述測試十肽的相同方式進行檢測。使用三種呈遞細胞。如下表5概括所示，“T2”是一種突變的人細胞系“CEMX721.174T2”，見Salter在免疫遺傳學，21:235(1985)所述。該細胞系呈遞HLA-A2。“G2.2”是一種MZ2-MEL細胞系的變體。該變體已經用編碼HLA-A2的基因轉染。縮寫“G2.2.5”代表一種不表達HLA-A2的變體。在與胞溶性T細胞克隆接觸之前將所有細胞與單克隆抗體MA2.1溫育。盡管產生機理還不十分知曉并且使用效應器CTL210/5及210/9，但該步驟可以穩定所謂的“空”MHC分子。結果見下表5。其示出在濃度為10μM，當與CTL克隆210/5一起應用時SEQ ID NO:4的九聚體溶解效率為2倍，當與CTL克隆210/9一起應用時，溶解效率為4倍，而SEQ ID NO:5的九聚體對誘導溶解無效。
表5
表5(續)
表5(續)
實施例12在進一步實驗中，使用SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5以及SEQID NO:2的肽進行鉻釋放分析。靶細胞是已預先經HLA-A2轉染的同種異體黑素瘤細胞即MZ2-MEL，及可呈遞HLA-A2但具有一抗原加工缺陷(其可導致呈遞外源肽能力增加)的細胞系T2(Cerundoloet cl.,Nature 345:449(1990))。將所有細胞用單克隆抗體MA2.1預處理50分鐘。將細胞與不同濃度的選擇的肽溫育30分鐘。然后將CTL克隆210/9及ISVB之一以效應器靶細胞為60的比率加入。4小時后以前述方法測定鉻釋放。
結果見圖7所示，即圖7A-7C。SEQ ID NO:4肽使細胞對CTL210/9敏化，而SEQ ID NO:5不能。SEQ ID NO:2使細胞對CTLIVSB敏化，如前例闡述。
實施例13接著進行實施例10中描述的實驗之后的研究，以致力于闡明由HLA-B44呈遞的抗原肽。為此將相應于酪氨酸酶cDNA序列的片段的cDNA序列與編碼HLA-B44的基因一起共轉染進COS-7細胞。方法基本上與前述實施例6相同。使用前述胞溶性T細胞克隆22/31檢測TNF的釋放。有二種片段即1-611堿基片段及427-1134堿基片段可誘導TNF釋放。這提示呈遞的肽處于重疊區域。根據該結果，測試較短的片段。相應于574-831及385-612位核苷酸的片段能誘導TNF釋放。這些數據提示相應于574-612位核苷酸的片段編碼相關的肽。結果是，合成由574-612位核苷酸編碼的13個氨基酸的肽。然后將該肽用于實驗以檢測其是否誘導CTL22/31導致的溶解。下表6示出該13聚體可使兩種表達HLA-B44的EBV轉染細胞系對溶解敏化。
表610F94-tyros 13-mer zur EBV-1
相比之下，九聚體Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe A1a(SEQ IDNO:8)不被識別。下表7闡明了這些結果，其也見圖8所示。
如Burrows et al.,J.Virlo 64:3974(1990)報道的與HLA-B44結合的另一種肽僅是Glu Glu Asn Leu Leu Asp Phe Val Arg Phe(SEQ IDNO:9)。由前述數據提示第二位的G1u及第九位的Phe可能代表HLA-B44的錨殘基。
表
實施例14如前實施例5所述，分離自SK29-MEL的酪氨酸酶cDNA與已經鑒定的酪氨酸酶cDNA幾乎相同。共有三個不同之處其一是在相應于SEQ ID NO:7的N-末端絲氨酸的密碼子內。具體地，SK29-MEL酪氨酸酶包括在第537-539位的ATG，在第575-577位的TCT，及在1207位的CAA。Kwon等與此不同，他們示出在第575-577位為TAT，而Bouchard等示出在所列位置為ATC,TAT及CGA。這種改變導致在N-末端的是酪氨酸而非絲氨酸。最終使用SEQ IDNO:10進行實驗，即Tyr Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe。如Giebel等在Nucl.Acids Res.18:3103(1990)，及Johnston等在Nucl.Acds Res.20:143(1992)所述，該等位基因大約存在于50％高加索白人中。重要的是確定SEQ ID NO:10是否能敏化CTL。
將SEQ ID NO:10肽以前述實施例12及13的相同方式，用CTL22/31進行測試。發現所需的用于激發CTL22/31 50％最大溶解的SEQ ID NO:10量與SEQ ID NO:7所需量幾近相同。圖9A和9B示出其中一些數據，顯示出當將CTL 22/31及CTL IVSB用于同時表達HLA-A2及HLA-B44的靶細胞時所得的結果。MZ2-MEL.43細胞系表達HLA-B44而不表達HLA-A2,SK29-MEL.1細胞系經測試對HLA-B44及HLA-A2都是陽性的。稱作“MZ2-MEL.43+HLA-A2”的細胞系是一種用編碼HLA-A*0201的DNA轉染過的MZ2-MEL.43細胞。
這些結果的一令人感興趣的特征是CTL 22/31不識別SK29-MEL.1刺激的細胞，而CTL IVSB能識別(卻不識別MZ2-MEL.43)。該發現引出下列實驗。
實施例15還衍生了一個進一步的CTL克隆，即CTL克隆329B/5，盡管有某些之處不同于前述兩種CTL克隆。
為衍生CTL克隆329B/5，將來自健康的HLA-B*4402陽性個體的外周單核細胞(自身巨噬細胞及樹狀細胞)的粘附細胞在補加10％胎牛血清(“FCS”)，IL-4(50U/ml)及GM-CSF(100ng/ml)的RPMI培養基中生長一周。然后將該細胞用前述SEQ ID NO:7肽(50μM)在β2微球蛋白存在條件下(2.5μg/ml)進行脈沖4小時。照射該粘附細胞，并將二百萬個CD8+分選的T淋巴細胞加入至終體積為2ml的補加10％人血清，1000U/ml IL-6及5ng/ml IL-12的Iscove’s培養基中。在第7天和第14天，在補加10U/ml IL-2及5ng/mlIL-7的培養基中，用已用SEQ ID NO:7脈沖的粘附細胞刺激應答細胞。在第21天在含已用SEQ ID NO:8(1μM)脈沖的HLA-B44陽性的照射的LB33-MEL.A細胞(104個細胞/微孔)及作為飼養細胞的2×104個經照射的LG2-EBV淋巴母樣細胞的微孔中以有限稀釋法克隆應答淋巴細胞。
遵循相同步驟，每7天刺激一次微培養物。
5周后，將CTL克隆329B/5在24孔內培養，并每周用2×105個經照射的已用SEQ ID NO:7脈沖的LB33-MEL.A細胞及106個經照射的LG2-EBV細胞在補加IL-2(50U/ml)及IL-4(5U/ml)的培養基中刺激一次。
將CTL克隆329B/5用于后面的一些實驗中。
實施例16導致實施例14的結果的一可能原因是HLA亞型的不同。已知有兩種主要的HLA-B44亞型，即HLA-B*4402及HLA-B*4403。黑素瘤細胞系SK29-MEL表達HLA-B*4402，而MZ2-MEL表達HLA-B*4403。
為檢測該可能性，取自三個不同病人(LB17,LB33，及B12)的并經Epstein Barr病毒(EBV)轉化的淋巴母樣細胞系用于都已用SEQID NO:7脈沖的所有亞型，然后用前述方法測試對CTL 22/31溶解的敏感性。所用的還有實施例15所述的CTL克隆329B/5。
圖10示出這些實驗的結果。所有HLA-B*4403陽性細胞都被CTLS 22/31溶解得很完全，而當使用CTL 22/31時，在HLA-B*4402系上的溶解很少。結論是CTL能區分并受限于HLA亞型。
實施例17還進行了另外的實驗以檢測可與HLA-B*4403復合然后刺激CTL的SEQID NO:7是否也能由HLA-B*4402細胞呈遞。
Coulie等在Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:7976-7980(1995)描述了肽Glu Glu Lys Leu Ile Val Val Leu Phe(SEQ ID NO:11)作為一種與HLA-B*4402分子復合的肽。SEQ ID NO:10肽與SEQ ID NO:11肽確實有效競爭，表明事實上它可與HLA-B*4402分子結合。
實施例18將CTL克隆329B/5進行前述類型的溶解試驗。測試二種HLA-B*4403陽性細胞系(MZ2-MEL.43和LG2-MEL)及三種HLA-B*4402陽性細胞系(SK29-MEL,LB494-MEL及LB33-MEL.B)的TNF釋放分析。所有細胞系均表達酪氨酸酶。結果見圖11。注意到HLA-B*4402黑素瘤細胞系的TNF釋放刺激作用較高。
實施例19SEQ ID NO:7及SEQ ID NO:10都可與HLA-B44分子結合并誘發CTL溶解作用的事實提示N-末端不是與HLA-B44結合的關鍵殘基。進行另外的研究以確定其它殘基是否關鍵。
在這些實驗中，合成肽，其中在SEQ ID NO:7的九個位置的氨基酸的-個被丙氨酸取代。然后將CIR-B4403細胞在抗MHC Ⅰ類抗體W6/32(30％v/v雜交瘤細胞培養基)存在條件下在37℃用鉻標記-小時。然后沖洗。將標記的細胞(1000個/孔)在20℃用不同濃度的肽溫育30分鐘。然后以E∶T(效應器∶靶細胞)為10∶1的比率加入CTL22/31。4小時后測鉻釋放。
以下結果以相對抗原活性表示。這是由獲得50％最大溶解所需的未取代肽的濃度除以產生50％最大溶解所需的變體肽的濃度而計算出的。對未取代肽SEQ ID NO:8而言，獲得50％最大溶解的濃度為3nM。
該結果顯示除1位外肽中每位氨基酸都是識別所需的。肽 相對抗原活性Ser Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe (SEQ ID NO: 7) 1Ala 1Ala 0Ala 0.066Ala 0Ala0Ala 0Ala 0Ala 0.15Ala 0前述實驗證實酪氨酸酶作為腫瘤排斥抗原前體被加工，導致得到的腫瘤排斥抗原與在至少某些異常細胞上的分子形成復合物，所述異常細胞例如具有HLA-A2或HLA-B44表型的黑素瘤細胞。這些腫瘤排斥抗原可用式Xaa Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe(SEQ ID NO:12)表示，其中Xaa可以是任何氨基酸。Xaa是絲氨酸的一種抗原已在母申請中公開，因而不是本發明權利要求的一部分。本文揭示的是一些特殊抗原，其中Xaa是Tyr或Ala。復合物可由CTL識別并且呈遞細胞溶解。該發現具有治療及診斷意義是本發明的一個特征。在治療方面可生產對呈遞前述復合物的異常細胞具有特異性的CTL這一觀察提示了各種治療途徑，其一可以將特異于該復合物的CTL給予具有所述表型的異常細胞的患者。本領域技術人員可在體外開發這種CTL。具體地，將細胞樣品如血細胞與呈遞復合物的細胞接觸，并誘發特異性CTL增殖。靶細胞可以是如前述COS細胞類型的轉染子。這些轉染子在其表面呈遞所述復合物，并且當與相應的CTL合并時可刺激其增殖。為使本領域技術人員能生產這些CTL，含相應基因的載體，即pc DNA-1/Amp 1(HLA-A2)及p123.B2(人酪氨酸酶)，已根據布達佩斯條約保藏在巴斯德研究所，保藏號分別為I1275及I1276。本文所用的COS細胞與其它合適的宿主細胞廣泛可得。
稱作過繼轉移的治療方法(Greenberg,J.Immunol.136(5):1917(1986)；Reddel et al.,Science 257:238(7-10-92)；Lynch et al.,Eur.J.Immunol.21:1403-1410(1991),Kast et al.,Cell 59:603-614(11-17-89))，是將呈遞所需復合物的細胞與CTL結合以導致特異于其的CTL增殖。然后將增殖的CTL給予細胞異常的病人，這些病人的特征在于某些異常細胞呈遞特定的復合物。CTL然后溶解異常細胞，從而達到所需治療目的。
以前的治療假定至少某些患者的異常細胞呈遞一種或多種HLA/酪氨酸酶衍生肽的復合物。這非常易于確定。如可用前述轉染子鑒別CTL，且一且分離出可與患者異常細胞的樣品用于檢測在體外的溶解。如果觀察到溶解，然后在這種治療中應用特異性CTL可以緩解與異常細胞相關疾病病情。一種不太復雜的方法是使用標準分析檢測異常細胞的HLA表型，用如PCR擴增檢測酪氨酸酶的表達。許多不同的HLA分子呈遞衍生自酪氨酸酶的TRA這一事實提高了適于本文所述治療方法的患者數。
過繼轉移不是根據本發明治療的唯一方式。CTL也可在體內用一系列方法激發。一種是如上所述使用表達復合物的非增殖細胞。用于該方法的細胞可以是那些正常表達復合物的細胞，如照射的黑素瘤細胞或用一種或二種呈遞復合物所需的基因轉染過的細胞。Chen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:110～114(January,1991)闡述了該方法，顯示了在治療方案中使用表達HPVE7肽的轉染細胞。可以使用各種細胞類型。類似地可以使用攜帶一種或二種相應基因的載體。特別優選病毒或細菌載體。在這些系統中相應基因是由如痘苗病毒或細菌BCG攜帶的，并去“感染”宿主細胞。所得細胞呈遞相應復合物，并可由隨后增殖的自身CTL識別。通過將酪氨酸酶本身與一種促進摻入HLA-A2呈遞細胞中的佐劑聯合也可達到類似效果。然后將酶加工以產生HLA分子的肽配體。
前文敘述指出了“異常細胞”與“細胞異常”，這些術語使用其最寬釋義，是指細胞呈至少一種區別于其特異性類型正常細胞的性能的任何情況。異常性能的實例包括形態及生化改變，如細胞異常包括腫瘤如黑素瘤、自身免疫缺陷等。
本發明還提供了一種鑒定針對CTL靶的前體的方法。當靶細胞是腫瘤時這些前體是指腫瘤排斥抗原，但必須指出的是當細胞異常不是腫瘤時，將該分子指作腫瘤排斥抗原則導致歧義。重要的是，本方法包含鑒定一種是前述類型的胞溶性T細胞的靶的細胞。一旦該細胞被鑒定，將總RNA轉變為cDNA文庫，然后將其轉染進可呈遞與相關HLA分子形成復合物的抗原的細胞樣品中。將轉染子與前述CTL接觸，同樣觀察CTL所致的定向(溶解和/或TNF產生)。隨后處理溶解的轉染子以提取cDNA并測序，以該方式可鑒定異常情況下的前體如腫瘤排斥抗原前體。
本發明的其它方面將為本領域技術人員所熟知，在這不需要重復。
本文所用術語及表達法是用作闡述術語而非限制，且在應用這些術語及表達法時沒有排斥其它等價特征的意圖，可以確證，在本發明范圍內可做適當修改。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人伯恩納德·萊特，文森特·布里夏爾，阿蘭·范佩爾，蒂爾瑞·博恩-法勒爾(ⅱ)發明名稱分離的酪氨酸酶衍生肽及其應用(ⅲ)序列數13(ⅳ)通訊地址(A)收信人Felfe & Lynch(B)街道805 Third Avenue(C)城市紐約市(D)州紐約州(E)國家美國(F)郵編10022(ⅴ)計算機可讀形式(A)媒介類型3.5英寸軟盤，360kb存儲(B)計算機IBM PS/2(C)操作系統PC-DOS(D)軟件Wordperfect(ⅵ)本申請資料(A)申請號(B)申請日(C)分類(ⅶ)在先申請資料(A)申請號08/587,391(B)申請日1996年1月17日(C)分類514(ⅶ)在先申請資料(A)申請號08/233,305(B)申請日1994年4月26日(C)分類514(ⅶ)在先申請資料(A)申請號08/203,054(B)申請日1994年2月28日(ⅶ)在先申請資料(A)申請號08/081,673
(B)申請日1993年6月23日(ⅶ)在先申請資料(A)申請號08/054,714(B)申請日1993年4月28日(ⅶ)在先申請資料(A)申請號07/994,928(B)申請日1992年12月22日(ⅷ)律師/代理人信息(A)姓名NormanD.Hanson(B)注冊號30,946(C)卷號LUD 5341-PCT(ⅸ)電訊信息(A)電話(212)688-9200(B)電傳(212)838-3884
(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度1894bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結構線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1GGA AGA ATG CTC CTG GCT GTT TTG TAC TGC CTG CTG TGG AGT TTC CAG 48Gly Arg Met Leu Leu Ala Val Leu Tyr Cys Leu Leu Trp Ser Phe Gln-15 -10 -5ACC TCC GCT GGC CAT TTC CCT AGA GCC TGT GTC TCC TCT AAG AAC CTG 96Thr Ser Ala Gly His Phe Pro Arg Ala Cys Val Ser Ser Lys Asn Leu1 5 10ATG GAG AAG GAA TGC TGT CCA CCG TGG AGC GGG GAC AGG AGT CCC TGT 144Met Gly Lys Glu Cys Cys Pro Pro Trp Ser Gly Asp Arg Ser Pro Cys15 20 25 30GGC CAG CTT TCA GGC AGA GGT TCC TGT CAG AAT ATC CTT CTG TCC AAT 192Gly Gln Leu Ser Gly Arg Gly Ser Cys Gln Asn Ile Leu Leu Ser Asn35 40 45GCA CCA CTT GGG CCT CAA TTT CCC TTC ACA GGG GTG GAT GAC CGG GAG 240Ala Pro Leu Gly Pro Gln Phe Pro Phe Thr Gly Val Asp Asp Arg Glu50 55 60TCG TGG CCT TCC GTC TTT TAT AAT AGG ACC TGC CAG TGC TCT GGC AAC 288Ser Trp Pro Ser Val Phe Tyr Asn Arg Thr Cys Gln Cys Ser Gly Asn65 70 75TTC ATG GGA TTC AAC TGT GGA AAC TGC AAG TTT GGC TTT TGG GGA CCA 336Phe Met Gly Phe Asn Cys Gly Asn Cys Lys Phe Gly Phe Trp Gly Pro80 85 90AAC TGC ACA GAG AGA CGA CTC TTG GTG AGA AGA AAC ATC TTC GAT TTG 384Asn Cys Thr Glu Arg Arg Leu Leu Val Arg Arg Asn Ile Phe Asp Leu95 100 105 110AGT GCC CCA GAG AAG GAC AAA TTT TTT GCC TAC CTC ACT TTA GCA AAG 432Ser Ala Pro Glu Lys Asp Lys Phe Phe Ala Tyr Leu Thr Leu Ala Lys115 120 125CAT ACC ATC AGC TCA GAC TAT GTC ATC CCC ATA GGG ACC TAT GGC CAA 480His Thr Ile Ser Ser Asp Tyr Val Ile Pro Ile Gly Thr Tyr Gly Gln130 135 140ATG AAA AAT GGA TCA ACA CCC ATG TTT AAC GAC ATC AAT ATT TAT GAC 528Met Lys Asn Gly Ser Thr Pro Met Phe Asn Asp Ile Asn Ile Tyr Asp145 150 155CTC TTT GTC TGG ATG CAT TAT TAT GTG TCA ATG GAT GCA CTG CTT GGG 576Leu Phe Val Trp Ile His Tyr Tyr Val Ser Met Asp Ala Leu Leu Gly160 165 170GGA TCT GAA ATC TGG AGA GAC ATT GAT TTT GCC CAT GAA GCA CCA GCT 624Gly Tyr Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe Ala His Glu Ala Pro Ala175 180 185 190TTT CTG CCT TGG CAT AGA CTC TTC TTG TTG CGG TGG GAA CAA GAA ATC 672Phe Leu Pro Trp His Arg Leu Phe Leu Leu Arg Trp Glu Gln Gly Ile195 200 205CAG AAG CTG ACA GGA GAT GAA AAC TTC ACT ATT CCA TAT TGG GAC TGG 720Gln Lys Leu Thr Gly Asp Gly Asn Phe Thr Ile Pro Tyr Trp Asp Trp210 215 220CGG GAT GCA GAA AAG TGT GAC ATT TGC ACA GAT GAG TAC ATG GGA GGT 768Arg Asp Ala Glu Lys Cys Asp Ile Cys Thr Asp Gly Tyr Met Gly Gly225 230 235CAG CAC CCC ACA AAT CCT AAC TTA CTC AGC CCA GCA TCA TTC TTC TCC 816Gln His Pro Thr Asn Pro Asn Leu Leu Ser Pro Ala Ser Phe Phe Ser240 245 250TCT TGG CAG ATT GTC TGT AGC CGA TTG GAG GAG TAC AAC AGC CAT CAG 864Ser Trp Gln Ile Val Cys Ser Arg Leu Glu Glu Tyr Asn Ser His Gln255 260 265 270TCT TTA TGC AAT GGA ACG CCC GAG GGA CCT TTA CGG CGT AAT CCT GGA 912Ser Leu Cys Asn Gly Thr Pro Glu Gly Pro Leu Arg Arg Asn Pro Gly275 280 285AAC CAT GAC AAA TCC AGA ACC CCA AGG CTC CCC TCT TCA GCT GAT GTA 960Asn His Asp Lys Ser Arg Thr Pro Arg Leu Pro Ser Ser Ala Asp Val290 295 300GAA TTT TGC CTG AGT TTG ACC CAA TAT GAA TCT GGT TCC ATG GAT AAA 1008Glu Phe Cys Leu Ser Leu Thr Gln Tyr Glu Ser Gly Ser Met Asp Lys305 310 315GCT GCC AAT TTC AGC TTT AGA AAT ACA CTG GAA GGA TTT GCT AGT CCA 1056Ala Ala Asn Phe Ser Phe Arg Ash Thr Leu Glu Gly Phe Als Ser Pro320 325 330CTT ACT GGG ATA GCG GAT GCC TCT CAA AGC AGC ATG CAC AAT GCC TTG 1104Leu Thr Gly Ile Ala Asp Ala Ser Gln Ser Ser Met His Asn Ala Leu335 340 345 350CAC ATC TAT ATG AAT GGA ACA ATG TCC CAG GTA CAG GGA TCT GCC AAC 1152His Ile Tyr Met Asn Gly Thr Met Ser Gln Met Gln Gly Ser Ala Asn355 360 365GAT CCT ATC TTC CTT CTT CAC CAT GCA TTT GTT GAC AGT ATT TTT GAG 1200Asp Pro Ile Phe Leu Leu His His Ala Phe Val Asp Ser Ile Phe Glu370 375 380CAG TGG CTC CAA AGG CAC CGT CCT CTT CAA GAA GTT TAT CCA GAA GCC 1248Gln Trp Leu Arg Arg His Arg Pro Leu Gln Glu Val Tyr Pro Glu Ala385 390 395AAT GCA CCC ATT GGA CAT AAC CGG GAA TCC TAC ATG GTT CCT TTT ATA 1296Asn Ala Pro Ile Gly His Asn Arg Glu Ser Tyr Met Val Pro Phe Ile400 405 410CCA CTG TAC AGA AAT GGT GAT TTC TTT ATT TCA TCC AAA GAT CTG GGC 1344Pro Leu Tyr Arg Asn Gly Asp Phe Phe Ile Ser Ser Lys Asp Leu Gly415 420 425 430TAT GAC TAT AGC TAT CTA CAA GAT TCA GAC CCA GAC TCT TTT CAA GAC 1392Tyr Asp Tyr Ser Tyr Leu Gln Asp Ser Asp Pro Asp Ser Phe Gln Asp435 440 445TAC ATT AAG TCC TAT TTG GAA CAA GCG AGT CGG ATC TGG TCA TGG CTC 1440Tyr Ile Lys Ser Tyr Leu Gly Gln Ala Ser Arg Ile Trp Ser Trp Leu450 455 460CTT GGG GCG GCG ATG GTA GGG GCC GTC CTC ACT GCC CTG CTG GCA GGG 1488Leu Gly Ala Ala Met Val Gly Ala Val Leu Thr Ala Leu Leu Ala Gly465 470 475CTT GTG AGC TTG CTG TGT CGT CAC AAG AGA AAG CAG CTT CCT GAA GAA 1536Leu Val Ser Leu Leu Cys Arg His Lys Arg Lys Gln Leu Pro Glu Glu480 485 490AAG CAG CCA CTC CTC ATG GAG AAA GAG GAT TAC CAC AGC TTG TAT CAG 1584Lys Gln Pro Leu Leu Met Glu Lys Glu Asp Tyr His Ser Leu Tyr Gln495 500 505 510AGC CAT TTA1593Ser His Leu513TAAAAGGCTT AGGCAATAGA GTAGGGCCAA AAAGCCTGAC CTCACTCTAA CTCAAAGTAA 1653TGTCCAGGTT CCCAGAGAAT ATCTGCTGGT ATTTTTCTGT AAAGACCATT TGCAAAATTG 1713TAACCTAATA CAAAGTGTAG CCTTCTTCCA ACTCAGGTAG AACACACCTG TCTTTGTCTT 1773GCTGTTTTCA CTCAGCCCTT TTAACATTTT CCCCTAAGCC CATATGTCTA AGGAAAGGAT 1833GCTATTTGGT AATGAGGAAC TGTTATTTGT ATGTGAATTA AAGTGCTCTT ATTTTAAAAA 1893A 1894(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓樸結構線性(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO:2Tyr Met Asn Gly Thr Met Ser Gln Val5(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征(A)長度10個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓樸結構線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3Met Leu Leu Ala Val Leu Tyr Cys Leu Leu5 10(2)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓樸結構線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4Met Leu Leu Ala Val Leu Tyr Cys Leu5(2)SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓樸結構線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5Leu Leu Ala Val Leu Tyr Cys Leu Leu5(2)SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)序列特征(A)長度13個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓樸結構線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6Ser Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe Ala His Glu Ala5 10(2)SEQ ID NO:7的信息(ⅰ)序列特征(A)長度10個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓樸結構線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7Ser Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe Ala5 10(2)SEQ ID NO:8的信息(ⅰ)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓樸結構線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8Ser Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe5(2)SEQ ID NO:9的信息(ⅰ)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸
(D)拓樸結構線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:9Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe Ala5(2)SEQ ID NO:10的信息(ⅰ)序列特征(A)長度10個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓樸結構線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:10Glu Glu Asn Leu Leu Asp Phe Val Arg Phe5 10(2)SEQ ID NO:11的信息(ⅰ)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓樸結構線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:11Tyr Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe5(2)SEQ ID NO:12的信息(ⅰ)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓樸結構線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:12Glu Glu Lys Leu Ile Val Val Leu Phe5(2)SEQ ID NO:13的信息(ⅰ)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓樸結構線性(ⅸ)特征(D)其它特征Xaa可以是任何氨基酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:13Xaa Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe權利要求
1.鑒定作為用特異于HLA-B44分子與式為Xaa Glu Ile Trp ArgAsp Ile Asp Phe(SEQ ID NO:12)肽的復合物的治療劑進行治療的候選者的方法，其中Xaa可以是除絲氨酸外的任何氨基酸，該方法包括(ⅰ)將取自病人的異常細胞樣品與特異于所述復合物的胞溶性T細胞接觸，以及(ⅱ)確定所述異常細胞樣品的至少部分溶解，以作為所述治療候選者的指征。
2.如權利要求1的方法，其中所述MHC分子是HLA-B*4402。
3.如權利要求1的方法，其中所述MHC分子是HLA-B*4403。
4.治療細胞異常病人的方法，包括給予所述病人一定量的制劑，該制劑可誘發胞溶性T細胞對在其表面呈遞HLA-B44分子與式為Xaa Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe(SEQ ID NO:12)的復合物的細胞的應答，其中Xaa可以是除絲氨酸外的任何氨基酸，所述的量足以誘發對在其表面呈遞所述復合物的異常細胞的應答。
5.如權利要求4的方法，其中所述MHC分子HLA-B*4402。
6.如權利要求4的方法，其中所述MHC分子HLA-B*4403。
7.如權利要求4的方法，其中所述制劑包括編碼人酪氨酸酶的載體。
8.如權利要求7的方法，其中所述制劑還包括編碼HLA-B44分子的第二種載體。
9.如權利要求7的方法，其中所述載體也編碼HLA-B44分子。
10.如權利要求4的方法，其中所述制劑是一種在其表面呈遞所述復合物的非增殖性細胞樣品。
11.治療細胞異常的方法，包括給予患有特征在于在異常細胞表面呈遞HLA-B44分子與式為Xaa Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe(SEQID NO:12)肽的復合物的細胞異常患者一定量的特異于所述復合物的胞溶性T細胞，所述的量足以溶解所述異常細胞，其中Xaa可以是除絲氨酸外的任何氨基酸。
12.如權利要求11的方法，其中所述胞溶性T細胞是自身的。
13.分離的特異于HLA-B44分子與式為Xaa Glu Ile Trp Arg AspIle Asp Phe(SEQ ID NO:12)肽的復合物的胞溶性T細胞，其中Xaa是除絲氨酸外的任何氨基酸。
14.鑒定在其表面呈遞HLA-B44分子與式為Xaa Glu Ile Trp ArgAsp Ile Asp Phe(SEQ IN NO:12)肽的復合物的異常細胞的方法，其中Xaa是除絲氨酸外的任何氨基酸，該方法包括將異常細胞樣品與特異于所述復合物的胞溶性T細胞接觸，并檢測所述異常細胞的溶解，以作為呈遞所述復合物的細胞的指征。
15.式為Xaa Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe(SEQ ID NO:12)的分離的肽，其中Xaa是除絲氨酸外的任何氨基酸。
16.如權利要求15的分離的肽，其中Xaa是Tyr。
17.如權利要求15的分離的肽，其中Xaa是Ala。
全文摘要
本發明涉及鑒別在異常細胞表面的人白細胞抗原分子和酪氨酸酶衍生肽的復合物的方法。這一觀察的治療和診斷應用是本發明的主題。
文檔編號G01N33/50GK1209876SQ97191765
公開日1999年3月3日 申請日期1997年1月14日 優先權日1996年1月17日
發明者伯恩納德·萊特, 文森特·布里夏爾, 阿蘭·范佩爾, 蒂爾瑞·博恩-法勒爾, 托馬斯·沃爾費爾 申請人:路德維格癌癥研究所