一種單克隆抗體及其應用
【專利說明】
[00011 本發明是申請號20,申請日為2014-01-22,發明名稱為抗CD24單克隆 抗體、其可變區序列及其應用的分案申請。
技術領域
[0002]本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種能特異性結合人白細胞分化抗原CD24的 單克隆抗體、其可變區序列及其應用。
【背景技術】
[0003] 人白細胞分化抗原⑶24(cluster of differentiation 24)是一種新近發現并重 點研究的腫瘤標志物。
[0004] 當前研究表明，CD24分子是表觀分子量介于30~70kDa之間的高度糖基化唾液酸 糖蛋白。CD24包含33個氨基酸殘基組成的核心蛋白骨架結構，具有16個潛在的0-或N-糖基 化位點，與小鼠熱穩定抗原高度同源；其成熟多肽能夠通過羧基端的磷脂酰肌醇 (glycosyl-phosphatidyl-inositol，GPI)錨定在細胞膜的表面。
[0005] 在生理情況下，CD24分子僅在未成熟B細胞、成熟粒細胞以及少數上皮細胞和神經 細胞上低水平表達;而當機體處于病理狀態時，多數惡性腫瘤細胞的表面均能檢測到顯著 高水平表達的CD24分子，其表達水平的高低與腫瘤的發生和發展密切相關。
[0006] P選擇素表達于活化的血小板與內皮細胞表面，⑶24是其配體之一。CD24分子高表 達增強了腫瘤細胞對血小板及內皮細胞的粘附作用，促進了腫瘤的復發與轉移。當然，作為 細胞膜表面信號轉導分子，CD24能夠通過多種作用機制介導腫瘤細胞的的增殖、粘附、轉移 和侵襲。研究進一步發現，CD24表達與肝癌細胞的干性緊密相關，CD24可能成為一種新的肝 癌干細胞表面標志物。
[0007] 由此可見，CD24有望成為研究腫瘤發生機制及開發相關診斷試劑的新靶標。

【發明內容】

[0008] 本發明目的一在于提供一種抗⑶24單克隆抗體制備方法。
[0009] 本發明目的二在于提供了一種抗CD24單克隆抗體。
[0010]本發明目的三在于提供抗⑶24單克隆抗體的可變區氨基酸序列。
[0011] 本發明以⑶24核心區多肽與血藍蛋白KLH偶聯物(CD24-KLH)作為免疫原，免疫注 射BALB/c小鼠，取免疫小鼠脾臟細胞并將其與骨髓瘤細胞融合，獲得了可表達抗CD24抗體 的雜交瘤細胞株，此細胞株可用于制備抗CD24單克隆抗體。
[0012] 本發明克隆的抗體重鏈、輕鏈可變區氨基酸序列及其高變區如有SEQ ID No. 1~ 16所示。
[0013]本發明的單克隆抗體可與CD24特異性結合。
【附圖說明】
[0014] 圖1為SDS-PAGE檢測Protein G親和層析柱純化產物結果。泳道Μ為標準分子量蛋 白；泳道1為腹水樣品；泳道2為上樣收集液;泳道3為20mM磷酸鈉緩沖液洗柱收集液;泳道4 ~6為100mM甘氨酸緩沖液(pH 3.5)洗脫收集液(每分鐘收集lml，共收集3ml)，泳道7~10為 100mM甘氨酸緩沖液(pH 2.7)洗脫收集液(每分鐘收集lml，共收集4ml)。
[0015]圖2為Western Blot鑒定純化后抗體與⑶24之間相互作用。泳道Μ為標準分子量蛋 白；泳道1市售⑶24-Fc(購自北京義翹神州）；泳道2為市售Fc(購自北京義翹神州）。
[0016] 圖3為PCR擴增抗體重輕鏈可變區基因瓊脂糖電泳結果。泳道Μ為標準分子量DNA; 泳道1為PCR擴增抗體重鏈可變區基因產物;泳道2為PCR擴增抗體輕鏈可變區基因產物。
[0017] 圖4為競爭性ELISA測定單克隆抗體67、厶7』4、65』4親和力。
【具體實施方式】
[0018] 實施例1抗CD24單克隆抗體雜交瘤細胞的制備
[0019] 1.免疫原
[0020]⑶24核心區由33個氨基酸殘基組成，其分子量約為3.2kD，免疫原性較弱。本發明 將抗原肽⑶24與血藍蛋白KLH偶聯，以偶聯物⑶24-KLH作為免疫原，增強了⑶24核心區多肽 的免疫原性。本發明所用⑶24-KLH由生工生物(上海)有限公司合成，純度>90%。
[0021] 2.免疫動物
[0022]本發明所用免疫動物為BALB/c小鼠，為SPF級別，由揚州大學比較醫學院提供。免 疫佐劑為QuickAntibody，購自北京康碧泉公司。免疫流程參照QuickAntibody說明書進行， [0023] 具體如表1所示。
[0024]表1.免疫途徑與周期
[0025]
[0026] 3.細胞融合
[0027] 1)細胞準備
[0028] A.飼養層細胞
[0029]于融合前一天取ICR小鼠（SPF級，購自揚州大學比較醫學院）腹腔巨噬細胞，重懸 于HAT培養液(購自GIBC0公司，含有黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶脫氧核苷）。接種于96孔 板，置37 °C，5 % C02培養箱中培養24h。
[0030] B.骨髓瘤細胞
[0031] 小鼠骨髓瘤細胞株SP20-Agl4(本實驗室保存)不合成和分泌任何一種小鼠免疫球 蛋白重鏈和輕鏈，此細胞對8-氮雜鳥嘌呤具有抗性，而在HAT選擇性培養基不能生長。融合 前一個星期，用普通的DMEM完全培養基(含15%FBS，購自GIBC0公司）分瓶培養雜交瘤細胞， 以使細胞能生長良好。每一個融合準備250ml生長密度為2Xl0 6cellS/ml處于對數生長中 期的健康細胞。
[0032] C.免疫小鼠脾臟細胞
[0033]處死免疫的小鼠，用酒精浸潤后取出脾臟。預先準備好10cm2無菌培養皿，放入細 胞篩網，并加入l〇ml無血清DMEM培養基。把脾臟置于細胞篩網上，并用無菌手術剪將脾臟剪 成碎片。注射器內芯擠壓研磨脾臟后，用5ml DMEM不完全培養基沖洗，使細胞通過過篩網進 入50ml離心管中。收集脾臟細胞懸液，用于融合。
[0034] 2)融合
[0035] A.準備20ml無血清的DMEM培養基和lml PEG1450(購自Sigma公司）放于37°C保溫。 [0036] B.收集骨髓瘤細胞及脾臟細胞，常溫下1500rpm離心5min，用無血清培養基洗兩 次，然后將其懸浮于l〇ml無血清培養基中。將5 X 108脾細胞和1 X 108骨髓瘤細胞充分混合， 1500rpm離心5min，棄上清。輕輕敲擊管子底部使細胞松散。
[0037] C.取出在37 °C預熱的培養基和PEG，把細胞置于37 °C水浴中，lmin內勻速緩慢逐滴 加 lml PEG，加完后及時用無血清的培養基終止。離心棄上清并用50ml HAT培養液重懸細 胞，輕輕混勻。
[0038] D.將細胞加入5塊已鋪有滋養細胞的96孔板中，每孔100μΙ。置37°C，5%⑶2培養箱 中培養4天。根據細胞生長狀態，在篩選前用HAT培養液半換液1~3次，避免孔內培養基變 黃。
[0039] E.融合后7天后，改用含有HT培養液全換液。24h后，吸取細胞培養上清，間接ELISA 檢測篩選陽性克隆。
[0040] 3)雜交瘤的單克隆化
[0041] 挑選陽性值較高的克隆孔，采用有限稀釋法將孔中的細胞分別稀釋至每毫升含5、 10和50個細胞，然后接種于96孔板中，每孔接種10(^1。37°(：、5%⑶ 2濕潤培養7~10天，出現 肉眼可見的克隆即可檢測細胞培養上清。在倒置顯微鏡下觀察，標出只有單個克隆生長的 孔，取上清作抗體檢測。取抗體檢測陽性孔的細胞擴大培養，并凍存。
[0042] 實施例2⑶24特異性抗體的制備和純化
[0043] 1.腹水收集
[0044]提前一周用0.5ml石蠟油（購自Sigma公司）注射小鼠腹腔。致敏一周后，將生長旺 盛的雜交瘤細胞離心棄去培養基，用PBS或者不完全培養基重懸，調整細胞濃度至2 X 106cellS/ml，注射0.5ml細胞懸液至小鼠腹腔中。7~10天后小鼠腹腔明顯腫大，此時采集 腹水。4°C，5000g離心20min，去除腹水中細胞碎片與油脂，然后加入等體積甘油保存于-20 Γ。
[0045] 2.⑶24特異性抗體的純化
[0046] 采用Protein G親和層析柱純化抗體。具體步驟如下：A .用10倍柱體積水清洗 ProteinG親和層析柱。B.用10倍柱體積20mM磷酸鈉緩沖液(pH 7.0)沖洗ProteinG親和層析 柱。C.將所需純化樣品栗入層析柱。D.用100mM甘氨酸緩沖液(pH 3.5，pH 2.7)洗脫，收集洗 脫峰;并用1M Tris緩沖液(pH 9.0)中和收集物。E.lOmM pH 7.2緩沖液透析脫鹽。F.用SDS-pGAGE電泳初步鑒定抗體，圖l結果顯示50kD及25kD處出現目的條帶。
[0047] 3.⑶24特異性抗體的特征分析
[0048] 1)免疫球蛋白亞型鑒定
[0049] 采用武漢三鷹生物技術有限公司的小鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒，鑒定細胞株 G7、A7、E4、G5、B4分泌抗體亞型，結果為：此5株細胞株分泌的免疫球蛋白重鏈亞型均為 IgGl，輕鏈亞型均為Kappa。<