專利名稱：由hla－b44分子提呈的腫瘤排斥抗原及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及從腫瘤排斥抗原前體衍生而來并由HLA分子特別是HLA-B44提呈的分離的肽及其應用。另外，本發明涉及鑒別這樣的個體的能力，所述的個體已被診斷患有特征為細胞異常的病情，其異常細胞提呈這些肽和HLA分子的復合物，本發明還涉及所提呈的肽及其應用。
背景技術：
哺乳動物免疫系統識別外來物并與其反應的過程是一個復雜的過程，這一系統的一個重要方面是T細胞應答，這種應答需要T細胞識別細胞表面分子(稱作人白細胞抗原(“HLA”)或主要組織相容性復合物(“MHC”))與肽的復合物并與之相互作用。所述的肽來自較大的分子，這些較大分子由也提呈HLA/MHC分子的細胞加工。關于這一點參見Male等人，高級免疫學(J.P.Lipincott Company，1987)，特別是第6-10章。T細胞與HLA/肽的復合物的相互作用是受限制的，需要特異于HLA分子和肽的特定組合的T細胞。如果不存在特異性T細胞，即使存在其配對復合物也不會有T細胞應答。類似地，如果不存在特異性復合物僅存在T細胞也不會有應答。這一機制參與免疫系統對外來物的應答、參與自身免疫疾病以及參與對細胞異常的應答。最近許多研究工作集中于將蛋白質加工成HLA結合肽的機制，關于這一點參見，Barinaga，科學257880(1992)；Fremont等人，科學257919(1992)；Latron等人，科學257964(1992)。
T細胞識別細胞異常的機制也在癌癥中有應用，例如，在1992年5月22日申請、1992年11月26日公開的PCT申請PCT/US92/04354(引入本文作參考)中公開了一個基因家族，其被加工成肽，所述肽隨即在細胞表面上表達，其可導致腫瘤細胞被特異性CTL溶解，這些基因據稱編碼“腫瘤排斥抗原前體”或稱“TRAP”分子，由其衍生的肽稱作“腫瘤排斥抗原”或稱“TRA”。關于這一家族基因的進一步信息見Traversari等人，免疫遺傳學35145(1992)；van der Bruggen等人，科學2541643(1991)，還可參見美國專利5,342,774(引入本文作參考)。
在美國專利5,405,940中(引入本文作參考)教導了一種與HLA-A1分子結合的九肽，這一參考文獻指出，如果已知特定肽對特定HLA分子的特異性，則可預期該特定肽與一種HLA分子結合，而不與其它HLA分子結合。這一點是重要的，因為不同的個體具有不同的HLA表型，結果是盡管鑒定一種特定肽是一種特異性HLA分子的配對物這一點具有診斷和治療作用，但是這些僅與具有該特定HLA表型的個體有關。在這一領域需要進一步的研究工作，因為細胞異常不僅限于一種特定HLA表型，定向治療需要所針對的異常細胞表型的一些知識。
酪氨酸酶催化將酪氨酸轉化成脫羥苯丙氨酸或稱“DOPA”的反應并似乎選擇性地在黑素細胞中表達(Muller等人，EMBO J72715(1988))，關于這一人類酶的cDNA的早期報道見Kwon，美國專利4,898,814，由Bouchard等人，實驗醫學雜志1692029(1989)的稍晚的報道描述了一略有不同的序列。已進行了許多努力來鑒別此酶的抑制劑，因為其參與色素沉積疾病，這些文獻的一些例子包括Jinbow，WO9116302；Mishima等人，美國專利5,077,059以及Nazzaropor，美國專利4,818,768。本領域熟練技術人員熟知教導類似物質的其它參考文獻。
1993年6月23日申請的美國專利申請08/081,673(引入本文作參考)教導了酪氨酸酶可以以類似于外來抗原或TRAP分子的方式進行處理，即在某些細胞異常如黑素瘤中發現酪氨酸酶被加工，并且由其衍生的肽與某些異常細胞上的HLA分子形成復合物。發現這些復合物被胞溶性T細胞(“CTL”)識別，隨后CTL溶解提呈細胞。已討論了這一令人驚奇和未預料到的現象的細節。現已發現其它的也能作為由HLA-A2分子提呈的腫瘤排斥抗原的肽，這些均在1994年2月28日申請的系列號08/203,054中有描述(該文獻引入本文作參考)。
1994年4月26日申請的美國專利申請系列號08/233,305(該文獻引入本文作參考)描述了酪氨酸酶也被加工成由HLA-B44分子提呈的抗原，這一發現是重要的，因為不是所有的個體均是HLA-A2+的。但是，酪氨酸酶被加工成HLA-B44提呈肽這一事實并未提供一種診斷和治療所有HLA-B44+腫瘤的通用手段，因為酪氨酸酶的表達不是通有的。而且酪氨酸酶由正常細胞及腫瘤細胞表達這一事實也提示在治療領域需謹慎。
Khanna等人，實驗醫學雜志176169-179(1992年7月)公開了一種HLA-B44結合肽，其在上文有進一步討論。Khanna肽與本申請要求保護的肽不相關。
Kita等人，Hepatology18(5)1039-1044(1993)教導了一種20個氨基酸的肽，據稱其結合HLA-B44并激發溶解。
Thorpe等人，免疫遺傳學40303-305(1994)討論了兩種結合HLA-B44的肽的序列對比，揭示出一通用的結合基序。Thorpe公開文獻描述了在2位的帶負電荷的氨基酸，以及在9位的可能是疏水性的或帶正電荷的氨基酸。
Fleischhauer等人，組織抗原44311-317(1994)刊登了HLA-B44結合肽的綜述。
現已發現MAGE-3也表達一種腫瘤排斥抗原前體，該前體被加工成至少一種由HLA-B44分子提呈的腫瘤排斥抗原。令人感興趣的是這種肽與也是從MAGE-3衍生的并已知結合HLA-A1的肽不同，其不同之處在于在N-末端有一單一的附加氨基酸。其特別是以下將描述的本發明的主題。
附圖簡要說明

圖1示出使用三種不同細胞系(LB33-MELc1，LB33 EBV-B和K562)以及胞溶性T細胞克隆159/5的鉻釋放分析的結果，以效應子/靶比率對溶解百分率表示數據。
圖2示出鑒別細胞變異體“A-”、“B-”和“A-，B-”的溶解研究的結果，同樣使用了鉻釋放分析。細胞系LB33-MELcl是A+B+，因為用兩個CTL細胞系測試均呈陽性溶解，CTL159/93是抗A的，而CTL159/5是抗B的。
圖3示出當用HLA-A28、HLA-B44和HLA-Cw7的編碼序列轉染變異體A-B-時與對照細胞系相比獲得的結果。該結果是以靈敏TNF釋放分析(pg/ml)描繪的，其中使用了CTL159/5。
圖4示出由CTL159/5導致的TNF釋放，其中COS細胞用HLA-B44或HLA-B44加本發明的核酸分子轉染。
圖5A示出了當與CTL159/5接觸時EBV-B細胞中的51Cr釋放。
圖5B類似于圖5A，只是其中使用了LB33-MEL B-細胞。在圖5A和圖5B中，本發明的抗原肽在與CTL接觸前與細胞接觸。
圖6示出了各種自體CTL克隆對從黑素瘤克隆細胞系LB33.MEL.A-1衍生的抗原喪失變異體的溶解活性。
圖7表示LB33.MEL.A-1的抗原喪失變異體表達HLA-A24、A28和B13分子的結果。腫瘤細胞與針對各特定HLA分子的小鼠抗體保溫，然后用熒光素標記的山羊抗小鼠抗體標記。
圖8示出了由抗原喪失變異體刺激的CTL克隆產生的腫瘤壞死因子(TNF)的量，其中所述的抗原喪失變異體被各種HLA等位基因轉染。使用未轉染的LB33-MEL.A-1細胞作為對照。所用的CTL克隆為159/3、159/5和204/26，分別對應于抗A、抗B和抗C的CTL。
圖9給出了從自體混合淋巴細胞-腫瘤細胞培養物中得到的有關淋巴細胞的胞溶活性的數據。血單核細胞是在1990年3月或1994年1月從患者LB33中分離的。細胞系LB33-MEL.A是在1988年手術后獲得的，細胞系LB33-MEL.B是在1993年該患者發生的轉移中獲得的。
圖10A示出了抗E的CTL克隆LB33-CTL-269/1對自體黑素瘤細胞的溶解活性，而圖10B示出了在由LB33-MEL.B-1細胞刺激后由該CTL克隆產生的TNF的量。刺激細胞(10,000個/孔)與3000個CTL保溫16小時。用TNF敏感性WEHI-164c13細胞測定由CTL釋放的TNF的濃度。通過添加1/100稀釋的得自接種有雜交瘤細胞的小鼠的腹水，用抗HLA-A24單克隆抗體C7709A2抑制CTL刺激。
圖11A和圖11B示出分析結果，其中SEQ ID NOS17、18、19和3在競爭結合分析中進行測試。
圖12描繪了當SEQ ID NO17與天然提呈HLA-B44的細胞聯合用于51Cr釋放分析中時得到的結果。
圖13總結了靶細胞為天然HLA-B44陽性如癌細胞系時的51Cr釋放分析的結果。
優選實施方案的詳細描述實施例1在下列實驗中使用研究人員已應用許多年的黑素瘤細胞系LB33-MEL，還使用了從該細胞系衍生的一個克隆，該克隆以下稱為LB33-MELc1。
從患者LB33取含有單核血細胞的樣品，將黑素瘤細胞系與該含有單核血細胞的樣品接觸，觀察混合物中黑素瘤細胞系的溶解，這一溶解指示在樣品中存在特異于肽和由黑素瘤細胞提呈的HLA分子的復合物的胞溶性T細胞(CTL)。
所用的溶解分析為Herin等人，國際癌癥雜志39390-396(1987)(該文引入本文作參考)所述的鉻釋放分析。在此描述一下該分析體外培養靶黑素瘤細胞，然后以107個細胞/ml重懸于補加10mM HEPES和30％FCS(即胎牛血清)的DMEM中，在37℃與200μCi/ml Na(51Cr)O4保溫45分鐘。標記的細胞用補加10mMHepes的DMEM洗三次，然后將其重懸于補加10mM Hepes和10％FCS的DMEM中，之后將含103個細胞的100微升等份分加至96孔微滴板。加入在100微升相同培養基中的PBL樣品，分析以雙份重復進行。在100g離心板4分鐘，然后在5.5％CO2氣氛下于37℃保溫4小時。
再次離心板，收集100微升等份上清并計數。51Cr釋放百分率如下計算
其中ER是觀察到的實驗51Cr釋放，SR是通過將103個標記細胞在200微升培養基中單獨保溫測得的自發釋放，MR是通過將100微升0.3％ Triton X-100加入到靶細胞中得到的最大釋放。
通過限制稀釋將那些顯示高CTL活性的單核血細胞樣品進行擴增和克隆，并使用相同方法再次篩選。
用相同的方法測試靶K562細胞。當使用EBV-B細胞時，唯一的改變是用補加5％ FCS的Hank’s培養基代替DMEM培養基。
這些實驗導致分離了CTL克隆LB33-CTL-159/5。圖1示出這一克隆溶解腫瘤細胞，但不溶解EBV-B細胞或K562細胞。
按照相同的程序分離了第二個CTL克隆，即LB33-CTL-159/3，這些細胞系分別被稱為“159/5”和“159/3”。這一第二個CTL的特異性與159/5不同，這一點通過分離了兩種抗原喪失變異體而確證，所述的兩種抗原喪失變異體為(i)被159/5溶解但不被159/3溶解以及(ii)不被159/5溶解但被159/3溶解。這些變異體分別稱為A-和B-。
然后用159/5免疫篩選A-變異體，獲得了第三個變異體，其即不被159/5溶解也不被159/3溶解，這一變異體稱為A-B-。圖2總結了溶解分析的結果，導致變異體的分離。
實施例2令人感興趣的是確定變異體A-B-的HLA表達模式。衍生出母細胞系LB33-MEL的患者被分型為HLA-A24、A28、B13、B44、Cw6、Cw7。當進行PCR表達分析時，發現LB33-MELcl和B-變異體均表達所有6個等位基因，而A-B-變異體不表達HLA-A28、B44和Cw7。因此可以得出結論，這些HLA分子中的一個代表能被CTL溶解的抗原。下述實施例進一步探討了這一點。
實施例3用質粒pcDNA-I/AmpI轉染A-B-變異體的樣品，該質粒克隆有HLA-A28、HLA-B44或HLA-Cw7中的一種。篩選后根據Traversari等人，免疫遺傳學35145-152(1992)(該文引入本文作參考)所述在TNF釋放分析中測試細胞。結果如圖3所示，表明HLA-B44明顯地參與抗原的提呈。
實施例4鑒別出提呈HLA分子后，進行研究以鑒別被稱為“腫瘤排斥抗原前體”或稱“TRAP”的作為被提呈的肽的來源的分子。
為此，從細胞系LB33-MELc1中分離總mRNA，使用寡dT結合試劑盒根據熟知的技術分離信使RNA。獲得信使RNA后將其轉錄成cDNA，同樣應用的是標準方法。然后根據廠商指導將cDNA與EcoRI銜接頭連接并克隆進質粒pcDNA-I/Amp的EcoRI位點。然后將該重組質粒電穿孔進DH5αE.coli(電穿孔條件25微法拉弟、2500V，1個脈沖)。
用氨芐青霉素(50μg/ml)篩選轉染的細菌，然后分成各100個細菌的集合，每一集合代表約50個不同的cDNA，因為分析顯示約50％的質粒含有一插入片段。將每一集合擴增至飽和，根據Maniatis等人，分子克隆實驗手冊(冷泉港，紐約，1982)所述經堿裂解、醋酸鈉沉淀和苯酚抽提分離質粒DNA，未使用銫梯度離心。
然后用擴增的質粒轉染真核細胞。用補加10％胎牛血清的Dulbeco’s改良的Eagles培養基(“DMEM”)以15,000個細胞/孔的密度將COS-7細胞的樣品接種在平底組織培養微孔中，在37℃培養細胞過夜，除去培養基，然后代之以30μl/孔含10％ Nu血清、400μg/ml DEAE-葡聚糖、100μM氯喹和100ng含來自LB33的HLA-B44的cDNA的質粒的DMEM。37℃保溫4小時后除去培養基，代之以50μl含10％DMSO的PBS，兩分鐘后除去這一培養基，代之以200μl補加10％FCS的DMEM。
如上所述更換培養基后，在37℃保溫COS細胞48小時，然后棄去培養基，加入在100μl含10％庫集人血清和25U/ml IL-2的Iscove’s培養基中的2000個159/5細胞。24小時后取上清，并根據Traversari等人，免疫遺傳學35145-152(1992)(該文引入本文作參考)所述在WEHI細胞上進行分析而確定TNF含量。一個集合刺激高于背景的TNF釋放，克隆這些細菌并用于下述實驗中。
實施例5從實施例4中克隆的細菌中抽提質粒DNA，以上述相同的方式轉染進新鮮的COS細胞樣品中，再次測試該細胞對159/5的刺激。在克隆350/2中發現一陽性克隆，如圖4A總結的數據所示。
為確證這一結果，使用美國典型培養物保藏中心供應的人絨毛膜癌細胞系JAR，這一細胞系不表達HLA分子，也不被CTL 159/5識別。當JAR被HLA-B44 cDNA轉染后，其仍不能被CTL 159/5識別，然而用HLA-B44 cDNA和350/2 cDNA共轉染卻導致溶解，如圖4B所示。
從這一陽性克隆中提取質粒，并用本領域已知方法測序，資料表明該質粒插入片段為1896bp長，并與數據庫中的任何序列均不同源，這一核苷酸序列列于SEQ ID NO1。
實施例6為確定哪一個肽為腫瘤排斥抗原，通過PCR擴增平均約為300bp的SEQ ID NO1的各個片段，克隆進pcDNA-1/Amp中，然后按照前述實施例的程序與編碼HLA-B44的質粒共轉染進COS細胞。這些實驗的結果是鑒別了相應于SEQ ID NO1的683-955位氨基酸殘基的區域為編碼抗原肽的區域，將這一區域與Khanna等人，實驗醫學雜志176169-176(7/92)所述的肽相比較，在1994年4月26日申請的系列號08/233,305中描述的肽，即Glu Glu Lys Leu Ile Val Val Leu Phe對應于這些殘基。因此，合成了相應于這一序列的肽，并用于敏化HLA-B44+細胞系，結果如圖6A和6B所示，這兩幅圖描繪了使用EBV轉化的B細胞(圖6A)和上述B-變異體(圖6B)的51Cr釋放分析的結果。在37℃將細胞與各種濃度的肽保溫30分鐘，然后加入CTL 159/5(效應子/靶比率為10∶1)。用100-200ng/ml肽獲得了半最大溶解。
實施例7上述實施例1-6描述了使用細胞系LB33-Melc1的研究工作。從患者LB33的皮膚轉移中還衍生了其它的細胞系，其中一種為LB33-MEL.A-1，該細胞系用于以下的實施例中。
首先，以實施例1-6的細胞系所使用的相同的方式使用上述細胞系(Herin等人，文獻同上)。用在2ml Iscove’s培養基(補加10％庫集人血清、天冬氨酸-谷氨酰胺-精氨酸(分別為36mg/ml、216mg/ml、116mg/ml)、2-巰基乙醇(0.05mM)和5U/ml人IL-4)中的輻照過的腫瘤細胞(3/105個細胞/孔)刺激血單核細胞(106個細胞/孔)，在培養的第3天加入IL-2(10U/ml)。如實施例1所述測定腫瘤細胞對自體CTL的敏感性。這一實驗得到了82個穩定的胞溶性T淋巴細胞，其是從7個獨立的培養物中衍生的。所有這些CTL均是CD8+，它們特異于腫瘤細胞，因為它們溶解LB33-MEL.A-1細胞，但不溶解K562或自體的EBV轉化細胞。
實施例8LB33-MEL.A-1細胞被自體CTL溶解這一事實提示了下一實驗，其用來鑒別被所建立的抗原喪失變異體識別的抗原。
為此，如上所述用自體CTL克隆LB33-CTL159/3篩選該細胞系樣品4次，每一輪篩選均包括以上述相同的方式將2-3×107個粘附腫瘤細胞與類似數目的CTL保溫2-6小時。在每一輪中，保溫后將CTL洗掉，擴增存活的粘附腫瘤細胞，然后進行下一輪篩選。
這一程序得到了一個抗CTL 159/3的克隆，然而用其它的自體CTL檢測時，發現上述的CTL 159/5確實溶解這一抗原喪失變異體，其它的CTL克隆如204/26和202/1也溶解這一抗原喪失變異體。請參見圖6，標為“MEL.A-1.1”的一列。類似地，建立了其它的細胞系，這些細胞系不被這四個CTL克隆中的一個溶解，但被其它三個克隆溶解，見圖6。因此，發現至少4個不同的抗原被提呈至LB33-MEL.A-1的表面，因為鑒別了4個獨立的抗原喪失變異體。如圖6所示，相對于抗原表達，LB33-MEL.A-1被認為是“A+B+C+D+”(被CTL 159/3、159/5、204/26和202/1溶解)；MEL.A-1.1是A-B+C+D+(不被159/3溶解，被其它克隆溶解)；MEL.A-1.2是A+B-C+D+(不被159/5溶解，被其它克隆溶解)；MEL.A-1.3是A+B+C-D+(不被204/26溶解，被其它克隆溶解)；MEL.A-1.4是A-B+C+D-(不被202/1或159/3溶解)。另外還分離了細胞系MEL.A-1.1.1，其是A-B-C+D-(僅被204/26溶解)。
當在這些細胞系上測試由實施例7鑒別的82個CTL時，鑒別了29個抗A、29個抗B、10個抗C和14個抗D克隆，提示沒有其它抗原被提呈。
用抗DCTL克隆202/1篩選導致鑒別了一個細胞系，該細胞系也對抗ACTL克隆(159/3)有抗性，用抗B CTL篩選也是如此(即得到A-B-C+D+細胞系)。這一結果提示A-D-和A-B-D-抗原喪失變異體實際上是HLA喪失變異體，抗原A、B和D共用相同的HLA提呈分子，或者不同的I類分子與抗原喪失變異體一起喪失。下述實驗討論了這一問題。
實施例9
開發出LB33細胞系的患者以前已經血清學分型為HLA-A24、A28、B13、B44、Cw6、Cw7，然后進行研究以確定該細胞系對HLAI類基因的表達。
建立了用于DNA擴增的半定量條件，以評價不同的LB33-MEL腫瘤細胞克隆對6個I類等位基因中每一個的表達。使用由Browning等人提議的耐擴增突變系統(ARMS)PCR方法，該方法基于在引物3’末端需要完全配對的核苷酸以保證DNA擴增的特異性，參見Browning等人，美國科學院院刊902842(1993)，該文引入本文作參考。基于在LB33分型時獲得的序列，合成等位基因特異性引物(5’引物在先，然后是3’引物)，這些引物能將6個等位基因中的每一個與其它五個區分開。
針對A24的引物5’-GCCGGAGTATTGGGACGA和5’-GGCCGCCTCCCACTTGC(SEQ ID NO5和6)針對A28的引物5’-GGAGTATTGGGACCGGAAG和5’-GGCCGCCTCCCACTTGT(SEQ ID NO7和8)針對B13的引物5’-CGCCACGAGTCCGAGGAT和5’-CCTTGCCGTCGTAGGCTA(SEQ ID NO9和10)針對B44的引物5’-CGCCACGAGTCCGAGGAA和5’-CCTTGCCGTCGTAGGCGT(SEQ ID NO11和12)針對Cw6的引物
5’-CCGAGTGAACCTGCGGAAA和5’-GGTCGCAGCCATACATCCA(SEQ ID NO13和14)針對Cw7的引物5’-TACAAGCGCCAGGCACAGG和5’-CTCCAGGTAGGCTCTGTC(SEQ ID NO15和16)為進行表達的半定量測量，用每套引物進行27輪反轉錄RNA的PCR擴增，在所觀察的線性范圍內發現DNA擴增。用溴乙錠染色的瓊脂糖凝膠肉眼評估擴增的DNA量。將這些量與用含來自LB33-MEL.A-1細胞的系列稀釋的RNA的RT-PCR擴增產物的標準曲線獲得的量比較。通過考慮β-肌動蛋白的表達水平而將樣品表達量根據RNA完整性而標準化，結果以相對于LB33-MEL.A-1細胞的表達水平而表示。這一工作的結果見下表1，“+++”表示表達水平高于LB33-MEL.A-1細胞表達水平的一半，“++”表示表達水平在LB33-MEL.A-1細胞表達水平的1/8至1/2之間，“+”表示表達水平低于LB33-MEL.A-1細胞表達水平的1/8，“-”表示無表達。
表1 衍生自LB33-MEL.A-1細胞的抗原喪失變異體對HLAI類分子的表達下述分子 LB33-MEL.A-1抗原喪失變異體的表達 A-B-C-A-D-A-B-D-A. 基因表達A24+++ +++ +++ - ++ +++A28+++ +++ +++ +++ + -B13+++ +++ +++ + +++ +++B44+++ +++ +++ +++ ++ -Cw6+++ +++ +++ + +++ +++Cw7+++ ++ +++ +++ + -
如上所示，MEL.A-1細胞和B-變異體均表達類似水平的所有6個HLA等位基因，A-變異體表達Cw7的水平約下降4倍，其余的抗原喪失變異體顯示表達三種等位基因的水平下降。對于C-細胞，發現HLA-A24、B13和Cw6的表達水平下降，而A-D-和A-B-D-變異體顯示A28、B44和Cw7表達下降，這提示A24-B13-Cw6以及A28-B44-Cw7組成了患者LB33的兩種HLA I類單元型，這些單元型的表達降低很可能導致免疫篩選的腫瘤細胞的抗原表達喪失。
實施例10下一實驗設計用來證實HLA基因表達和CTL的溶解之間的相關性。為此，將如上所述測定的給定HLA基因的表達水平與用標準抗體分析獲得的結果相比較，僅用特異于A24、A28和B13的鼠抗體測試這些分子(C7709A1抗A24，2.28M1抗A28，T48抗B13)。通過與抗體保溫、洗滌、然后與熒光素綴合的山羊抗鼠Ig抗體接觸而測定抗體的結合。然后通過一種標準技術即流式細胞計數分析細胞。
表2給出了結果，該結果也示于圖7中。在下表2中，標出的HLA表達水平相應于圖6中所示的平均熒光強度。以相對于LB33-MEL.A-1細胞中發現的水平表達數值。
從這些結果可以看出，當預計HLA表達水平為LB33-MEL.A-1細胞表達水平的1/8以下時，不能檢測到HLA表面分子或者僅達到可檢水平，因此提示向CTL提呈抗原對于給定的HLA分子不是必然的。
鑒于此，并假定所選擇的C-、A-D-、A-B-D-細胞由于缺乏HLA分子而喪失抗原表達，似乎抗原A的I類提呈分子是A28或Cw7，抗原B的I類提呈分子是B44，抗原C的I類提呈分子是A24或B13或Cw6，抗原D的I類提呈分子是A28或Cw7。
表2下述分子 LB33-MEL.A-1抗原喪失變異體的表達 A-B-C-A-D-A-B-D-表面抗原的表達A24 100 33134 41 95A28 100 29143 11B13 100 27221 40 230實施例11以上詳細描述的實驗之后繼續進行研究工作以明確地確定由LB33-MEL.A細胞表達的抗原的提呈分子。為此，用其中已克隆了特定的I類cDNA的表達載體pcDNA3經常規的磷酸鈣沉淀法轉染已喪失了該特定HLAI類分子的表達的腫瘤細胞，這一載體含有neo標記。用1.5mg/ml G418篩選轉染子，然后將其用于刺激CTL克隆，所用方法為前述實施例所述的TNF分析。
圖8給出了這些結果。通過用攜帶HLA-B44的質粒轉染在A-B-D-細胞中恢復了抗原B的表達，而用含HLA-A28或HLA-Cw7的質粒轉染未在A-B-D-細胞中恢復抗原B的表達。用HLA B13轉染在C-細胞中恢復了抗原C的表達，4個其它抗C CTL克隆也識別C-細胞，但包括所示的CTL 179C/50在內的5個其它抗C CTL克隆不識別C-細胞，反而這些CTL識別用HLA-Cw6轉染的C-細胞。因此，可能可以得出結論，即存在兩組抗C CTL克隆，其中一組識別由HLA-B13提呈的抗原，另一組識別由HLA-Cw6提呈的抗原。對于抗原D，通過用HLA-A28轉染使A-D-細胞恢復成A-D+細胞。盡管很清楚抗原A由HLA I類分子提呈，但是沒有一種cDNA(即所測的A28、B44、Cw7)恢復抗原A的表達，因為抗A CTL的溶解作用被抗I類單克隆抗體W6/32完全抑制。可能是這一抗原被非A、B、C的I類分子所提呈，其中兩種等位基因存在于患者LB33中，其中一種喪失，具有A-D-細胞、A-B-D-細胞中的A28-B44-Cw7單元型。
針對抗原C的盡管導致了命名學的改變，以下將兩種抗原稱為抗原Ca和抗原Cb。
實施例12在進一步的實驗中，提出了這一問題，即是否LB33-MEL.B細胞系可被自體細胞系識別。
以上述文獻相同的方式(Herin等人)使用照射過的LB33-MEL.B.1細胞，以刺激自體淋巴細胞。在1990年或1994年從患者LB33中取淋巴細胞。
如圖9所示，僅有1994年的淋巴細胞溶解LB33-MEL.B-1細胞，然而它們不溶解LB33-MEL.A細胞。因此LB33-MEL.B-1細胞系提呈一種在LB33-MEL.A中未發現的抗原。
本文描述的實驗與上述文獻描述的實驗是平行的，在以前的實驗中建立了另一組CD8+CTL克隆。圖10A中顯示了CTL 269/1的反應性。注意是與“MEL.B-1”反應，而非與“MEL.A-1”反應。由此鑒定的新抗原命名為LB33-E。
在抗體抑制實驗中，針對HLA-A24的單克隆抗體抑制溶解，見圖10B所示，因此“E”抗原由HLA-A24提呈。
實施例13Fleischhauer等人，組織抗原44311-317(1994)(該文獻引入本文作參考)教導了一種用于HLA-B44結合的共有基序，據描述這一基序為九個氨基酸或十個氨基酸的多肽，其中在第二位為Glu，在最后一位(第9或10位)為Tyr或Phe，在第三位為疏水氨基酸殘基如Met。
MAGE-3TRAP氨基酸序列在167-176位含有一段與這一基序相對應的氨基酸，這一氨基酸序列為Met Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr(SEQ ID NO17)已知HLA-B44基序含有至少兩種主要亞型，稱為HLA-B*4402和HLA-B*4403，這一MHC分子在23％的白種人中出現。當將這一數字與黑素瘤的標準分析結合時，得出結論15％的白種黑素瘤患者應在其黑素瘤細胞表面提呈HLA-B44。因此特別感興趣的是確定是否SEQ ID NO17的肽或相關分子確實能用于識別HLA-B44細胞并在與MHC分子結合后能激發其溶解。如在以前的實施例中描述的，顯示SEQ ID NO2的肽能結合HLA-B44陽性細胞。設計一種類似于SEQ ID NO2的肽，只是在第8位為Ala而非Leu，在一與SEQ ID NO17的競爭分析中測試了這一新肽，即Glu Glu Lys Leu Ile Val Val Ala Phe(SEQ ID NO18)參照未在本文報道的實驗中獲得的結果使用此肽。簡單地說，制備SEQ ID NO17的衍生物，其中每種衍生物在未被SEQ ID NO17中的Ala占據的位置含有一Ala。CTL克隆159/5識別含SEQ IDNO18的復合物要比識別含SEQ ID NO17的復合物稍好，從而使其成為競爭分析的極佳試劑。如Storkus等人，免疫學雜志1381657-1659(1987)所述用ClR細胞進行競爭試驗，這些ClR細胞是MHC I類陰性的淋巴母樣細胞。根據上述文獻給出的相同方法，用HLA-B*4402或HLA-B*4403的cDNA轉染ClR細胞，HLA-B*4402的cDNA由Fleischhauer等人，組織抗原44311-317(1994)描述，HLA-B*4403的cDNA由Fleischhauer等人，(1990)新英格蘭醫學雜志3231818-1822(1990)給出，兩篇論文均引入本文作參考。
在抗HLA I類單克隆抗體W6/32(30％(v/v)雜交瘤細胞培養物培養基)存在下，用51Cr在37℃標記細胞1小時，這能增強細胞提呈抗原肽給T細胞的能力。
洗滌標記細胞并在無血清培養基中與各種濃度的競爭肽在20℃保溫30分鐘。這些肽包括上述文獻描述的結合HLA-B44分子的肽Ser Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe(SEQ ID NO3)；由EBV基因EBNA-3A編碼的與HLA-B8結合的肽Phe Leu Arg Gly ArgAla Tyr Gly Leu(SEQ ID NO19)(Burrows，實驗醫學雜志171345-349(1990))以及SEQ ID NO17。
然后將SEQ ID NO18的肽加入到無血清培養基中至終濃度為45ng/ml(ClR-B4402+細胞)或160ng/ml(ClR-B4403+細胞)，將細胞在20℃保溫30分鐘，在Iscove’s培養基加2％胎牛血清中洗兩次。以E∶T比率為20加入在Iscove’s培養基和10％人血清中的CTL克隆LB33-CTL 159/5，三小時后測量51Cr釋放，結果示于圖11A和圖11B，分別相應于ClR-B*4402細胞和ClR-B*4403細胞。圖11中的數據清楚地證明有競爭作用。
實施例14實施例13實驗進行完畢后進行下列實驗。
胞溶性T細胞克隆(CTL)是從兩個個體LB816和LB822衍生的，這些個體沒有癌癥。
用密度梯度離心從這些個體分離血單核細胞(BMC)，通過使用綿羊血紅細胞經花結試驗(rosetting)純化BMC中的T淋巴細胞，然后用與磁微珠偶聯的抗CD8單克隆抗體標記，其中所述的綿羊血紅細胞已用aminoethylisothiouronium bromide處理。通過流經磁化區分選CD8+細胞，然后在補加10％人血清、116mg/ml L-精氨酸、36mg/ml L-天冬氨酸和216mg/ml L-谷氨酰胺、0.05M 2-巰基乙醇和10％ DMSO的Iscove’s培養基中于-80℃保存。
其余未花結試驗的BMC在37℃于組織培養平板上粘附2小時，棄去未粘附的細胞，在IL-4(50U/ml)和GM-CSF(100ng/ml)存在下培養粘附細胞7天。富集得到的細胞群中的抗原提呈細胞(“APC”，在此例中為樹狀細胞或巨噬細胞)，然后將5×105-106個這些細胞在2毫升孔中的400μl補加2.5μg/ml人β2微球蛋白和50μg/ml SEQ ID NO17的肽的Iscove’s培養基中于37℃培養4小時。然后在5000rad照射粘附的肽脈沖的細胞并洗滌。接著加入在補加1000U/ml IL-6和5ng/ml IL-12的培養物培養基中的2×106個自體CD8+T細胞。
7天后，用如上所述肽脈沖的粘附的自體BMC再刺激淋巴細胞。5×106個BMC在37℃下于400μl含β2微球蛋白和SEQ ID NO17的肽的Iscove’s培養基中如上所述粘附2小時，照射所有肽脈沖的粘附細胞并洗滌，然后加入在補加10U/ml IL-2和5ng/ml IL-7的培養物培養基中的應答細胞。
在第14天，用經SEQ ID NO17脈沖的自體BMC再刺激淋巴細胞，以2×107個細胞/ml在如上所述的補加后的Iscove’s培養基(但不含10％DMSO)中保溫BMC，保溫(20℃)2小時后，照射肽脈沖的BMC并洗滌，以2×106個細胞/ml重懸于如上所述的補加IL-2和IL-7的培養基中。將這些刺激細胞(2×106)的樣品加入到含有應答細胞的每個孔中。
在第21天克隆應答淋巴細胞，在補加50U/ml IL-2和5U/ml IL-4的培養基中將細胞以10-0.3個細胞/孔的密度接種在微孔中，然后通過加入同種EBV轉化的B細胞(LG2-EBV)刺激這些細胞，在10000rad以每孔20000個細胞照射下述細胞中的一種(i)同種EBV轉化的B細胞，(ii)肽脈沖的HLA-B4402+細胞，或(iii)肽脈沖的HLA-B4403+細胞。對于(ii)或(iii)，照射在15000rad，以每孔8000個細胞進行。
每周均按在第21天相同的方式再刺激微培養物，一點改變是在第28和35天，每孔分別加入40000和60000個EBV-B細胞，而非第21天的20000個細胞。
在第41天和52天之間，將增殖的微培養物等份樣品轉移至V型底微孔中以測試針對用SEQ ID NO17脈沖或未脈沖的HLA-B4402+或HLA-B4403+靶細胞的溶解活性。
在補加50U/ml IL-2和5U/ml IL-4的800μl培養基中，用5×104個照射的肽脈沖的B4402+或B4403-細胞加5×105個照射的LG2-EBV-B細胞再刺激任何顯示有抗肽溶解活性的微培養物。
7天后，每周用2×105個照射的肽脈沖的B4402+或B4403+細胞與106個照射的LG2-EBV-B細胞如上所述再刺激CTL克隆。以這種方式獲得了CTL LB 816-CTL-340 A/1和LB822-CTL-346A/1，這些CTL分別特異于SEQ IDNO17和HLA-B*4402或HLA-B4403的復合物。
實施例15在一系列進一步的實驗中，根據Brodsky等人，免疫學雜志128135(1982)所述，在單克隆抗體W6/32存在下，在37℃用51Cr標記不表達MAGE-3的HLA-B4402+或HLA-B4403+EBV轉化的B細胞，標記時間為1小時。洗滌細胞并在無血清培養基中用各種濃度的SEQ ID NO17于20℃保溫30分鐘。在51Cr釋放分析中測試實施例14中所述的每個CTL，4小時后測量鉻釋放。
圖12所示結果顯示該肽確實激發溶解。
實施例16在下述實驗中，檢測了另外的HLA-B44陽性腫瘤細胞系。
在37℃用51Cr標記所有被測細胞系1小時，然后將這些細胞以Iscove’s培養基加2％胎牛血清加入到各種數量的實施例14中所述的兩個CTL克隆中。4小時后測量51Cr釋放量。如圖13所示，還使用了對照。注意在分析前將細胞系LB33-MEL用IFN-γ(50U/ml)保溫48小時。
這些實驗的結果示于圖13。CTL克隆LB816-CTL-340A/1和LB822-CTL-346 A/1溶解表達MAGE-3的腫瘤細胞，但不溶解不表達MAGE基因的LB33-EBV B細胞。CTL克隆LB822-346 A/1溶解表達MAGE-3的HLA-B*4403+腫瘤細胞系MZ2-MEL，但不溶解抗原喪失變異體MZ2-MEL.61.2D-。
實施例17為最終確定與HLA-B44形成復合物的SEQ ID NO17的肽是否刺激CTL，進行實驗以確定腫瘤壞死因子釋放是否被刺激。
首先，根據Gaugler等人，實驗醫學雜志179921-930(1994)所述，用在表達載體pcDNA-1/AMP中的編碼MAGE-3的cDNA轉染COS-7細胞，其中HLA-B*4402 cDNA克隆在載體pcDNA3中，HLA-B4403 cDNA克隆在pcDNA1/AMP中，使用的是Aruffo，美國科學院院刊843365-3369(1987)所述的DEAE葡聚糖氯喹法。
在37℃保溫轉染子24小時，然后加入3000個CTL/孔，在37℃保溫這些實驗材料18小時，之后收集上清，根據Espevik等人，免疫學方法雜志9599-105(1986)所述方法，通過測試在TNF敏感性WEHI-16克隆13細胞上的溶胞效果而確定TNF含量。
下述表2顯示了結果，其中TNF的表達以pg/ml計。在分析前將LB33-MEL和LB494 MEL與100U/ml的IFNγ保溫24小時。還測試了腫瘤細胞系LB33-MEL、LB494-MEL和MZ2-MEL，這些細胞系均表達MAGE-3 cDNA，并且是HLA-B*4402+(LB33-MEL，LB494-MEL)或HLA-B*4403+(MZ2-MEL)，因此不需對這些細胞進行轉染。結果顯示有TNF釋放。因此可以得出結論，SEQ ID NO17被HLA-B44 MHC分子提呈，并且這些復合物激發CTL活性。
表2 抗MAGE-3.B44 CTL克隆的產生CTL克隆 刺激細胞 TNF(pg/ml)A LB816-CTL-340A/1 COS 0.7(B4402) COS+MAGE-30.6COS+HLA-B44020.5COS+HLA-B4402+MAGE-3 33.7LB33-MEL(B4402，MAGE-3+++) 74.9LB494-MEL(B4402，MAGE-3+++) 32.3B LB822-CTL-346A/1 COS1.2(B4403) COS+MAGE-3 1COS+HLA-B44031.2COS+HLA-B4403+MAGE-3 26.6MZ2-MEL(B4403，MAGE-3+++) 67.3上述實驗描述了編碼腫瘤排斥抗原前體“TRAP”分子的分離的核酸分子，這些核酸分子編碼的蛋白分子在細胞內以這樣的方式被加工，以至于產生至少一種被HLA-B44分子提呈的腫瘤排斥抗原或稱“TRA”。盡管以前已觀察到HLA-B44分子提呈由酪氨酸酶衍生的肽，但是本發明的核酸分子不編碼酪氨酸酶，并且所述的TRA不是酪氨酸酶衍生的。
本發明的腫瘤排斥抗原是分離的九肽，其在第2位為Glu殘基，在第9或10位為Phe或Tyr殘基。特別優選的是SEQ ID NO2的九聚體，即Glu Glu Lys Leu Ile Val Val Leu Phe以及下述九聚體Glu Glu Lys Leu Ile Val Val Ala Phe(SEQ ID NO18)
和十聚體Met Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr(SEQ ID NO17)。
其它有用的是這樣的九聚體，即除了在第2位和第9或10位具有所需的殘基外，還具有一或多個如下定義的殘基位置1Glu或Met位置3Lys或Val位置4Leu或Asp位置5Ile或Pro位置6Val或Ile位置7Val或Gly位置8Leu，Ala或His位置9Leu(當肽為十聚體時)特別感興趣的是滿足某些特定基序的肽，這些基序包括Xaa Glu(Xaa)3Val(Xaa)2Phe和Xaa Glu(Xaa)4Val Xaa Phe其中Xaa是任意氨基酸，這些基序還包括下述共有基序Xaa Glu(Xaa)2.3Ile(Xaa)3Xaa其中第1、2和3種Xaa指任意氨基酸，第4種Xaa即羧基端氨基酸代表酪氨酸或苯丙氨酸。特別優選的是SEQ ID NOS17和18的肽，以及上述討論的各種變化。
本發明的肽類似于已轉讓給本申請的受讓人的美國專利系列號08/233,305中公開的肽，即Ser Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe(SEQ ID NO3)Khanna等人，文獻同上教導了一種十聚體，即
Glu Glu Asn Leu Leu Asp Phe Val Arg Phe(SEQ ID NO4)但是沒有討論如何修飾該十聚體而得到有效的九聚體。
因此，本發明涉及與HLA-B44分子結合并激發CTL的溶解作用的腫瘤排斥抗原。
如上所述，TRA和HLA分子的復合物激發胞溶性T細胞應答，因此腫瘤排斥抗原和HLA-B44分子的分離的復合物也包含在本發明范圍內，由以前描述的核酸分子編碼的分離的腫瘤排斥抗原前體也屬于本發明的范圍。如果已知結合特異性，則還可使用肽簡便地鑒別HLA-B44陽性細胞。
本發明有許多用途，在此描述其中一些用途。首先，對由HLA-B44分子特異提呈的腫瘤排斥抗原以及編碼其平行腫瘤排斥抗原前體的核酸分子的鑒定使得本領域技術人員能夠診斷以該TRAP的表達為特征的疾病，這些方法包括確定TRAP基因的表達，和/或由此衍生的TRA(如由HLA分子提呈的TRA)的表達。從本發明的TRAP也可衍生其它的TRA并由不同的HLA分子提呈。在前一種情況下，可以經任何標準核酸確定分析進行確定，包括聚合酶鏈反應，或用標記雜交探針分析。在后一種情況下，特別優選的是用TRA和HLA的復合物的結合配對物如抗體進行分析。
對TRAP基因的分離也使得能分離TRAP分子本身，特別是含有SEQ ID NO1的氨基酸序列的TRAP分子。當被提呈為TRA或TRA和HLA-B44的復合物時，這些分離的分子的肽片段可以與佐劑等材料聯合生產疫苗，用于治療以該TRAP分子的表達為特征的疾病。另外，可以從在其表面提呈TRA/HLA復合物的細胞如非增殖性癌細胞、非增殖性轉染子等制備疫苗。在細胞用作疫苗的所有情況下，這些細胞可以是用保證CTL應答所需的兩種組分或其中一種組分的編碼序列轉染的細胞，或者是不需轉染而表達兩種分子的細胞。另外，TRAP分子、其相關TRA以及TRA和HLA的復合物可以用于經本領域熟知的標準技術生產抗體。
本文所用術語“疾病”是指任何表達腫瘤排斥抗原前體的病理狀態，這種疾病的一個例子是癌癥，特別是黑素瘤。
基于本發明的治療途徑是以個體的免疫系統應答為前提，從而導致溶解TRA提呈細胞，如提呈相關HLA分子的細胞。一種治療途徑是給予具有異常細胞表型的個體以特異于該復合物的CTL，體外開發這種CTL屬于本領域技術人員的技術范疇內。具體地說，將細胞樣品如血細胞與提呈復合物并能激發特異CTL增殖的細胞接觸，靶細胞可以是轉染子，如上述的COS細胞類型，這些轉染子在其表面提呈所需的復合物，并且當與感興趣的CTL合并時能殘基其增殖。本文所用的COS細胞和其它合適的宿主細胞是廣泛可得的。
稱為過繼轉移的治療方法(Greenberg，免疫學雜志136(5)1917(1986)；Reddel等人，科學257238(7-10-92)；Lynch等人，歐洲免疫學雜志21；1403-1410(1991)；Kast等人，細胞59603-614(11-17-89))是將提呈所需復合物的細胞與CTL合并，導致特異于該細胞的CTL增殖，然后將增殖的CTL給予具有細胞異常的個體，所述的細胞異常是以某些提呈該特定復合物的異常細胞為特征。隨后CTL溶解異常細胞，由此達到所需的治療目的。
上述療法假定個體的至少某些異常細胞提呈HLA/TRA復合物，這一點很容易確定，因為本領域很熟悉鑒別提呈特定HLA分子的細胞的方法，以及鑒別表達含所指序列的DNA的細胞的方法。一旦分離了這些細胞，可以將這些細胞與個體的異常細胞樣品一起應用以體外確定溶解作用，如果觀察到溶解作用，則將特異性CTL用于這種療法可以減輕與該異常細胞相關的病癥。一種不太復雜的方法能夠用標準分析檢測異常細胞以分析HLA表型，并經PCR擴增確定表達。
過繼轉移不是本發明的療法的唯一形式，還可以用一些方法體內激發CTL。其中一種方法即使用表達復合物的非增殖性細胞已在上文有描述，用于這種方法的細胞可以是正常表達復合物的細胞，如照射的黑素瘤細胞，或者是用提呈復合物所需的一種基因或兩種基因轉染的細胞。Chen等人，美國科學院院刊88110-114(1991年1月)描述了這一方法，其在治療方案中使用了表達HPVE7肽的轉染細胞。可以使用各種類型的細胞，類似地攜帶一種或兩種感興趣基因的載體也可應用，特別優選的是病毒或細菌載體。在這些系統中，感興趣的基因由例如痘苗病毒或細菌BCG攜帶，這些材料“感染”宿主細胞，得到的細胞提呈感興趣的復合物并被自體CTL識別，這些CTL隨后增殖。通過將腫瘤排斥抗原或前體與能有助于摻入提呈感興趣的HLA分子的細胞的佐劑聯合應用也能達到類似的效果。TRAP需加工產生HLA分子的肽配對物，而TRA不需進一步加工而被提呈。
本發明的其它方面對于本領域熟練技術人員是清楚的，不需在此重復。
本文所采用的術語和表達法是描述性的而非限制性的，使用這些術語和表達法無意排除任何所示和所述特征或其部分的等價物，應理解的是在本發明范圍內可以有各種修飾。
序列表(1)一般信息(i)申請人皮埃爾·庫利，蒂爾瑞·博恩-法勒爾(ii)發明名稱由HLA-B44分子提呈的腫瘤排斥抗原及其應用(iii)序列數目19(iv)通信地址(A)收信人Felfe&Lynch(B)街道805第三大道(C)城市紐約市(D)州紐約(E)郵政編碼10022(v)計算機可讀形式(A)介質類型磁盤，3.5英寸，360kb存儲量(B)計算機IBM(C)操作系統PC-DOS(D)軟件Wordperfect(vi)當前申請數據(A)申請號(B)申請日(C)分類435(vi)在先申請數據(A)申請號08/531,864(B)申請日1995年9月21日(viii)律師/代理人資料(A)姓名Hanson，Norman D.
(B)登記號30,946(C)檔案號LUD 5378.3-PCT(ix)電訊資料(A)電話(212)688-9200(B)電傳(212)838-3884(2) SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度1896個堿基對(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO1GCGGCGGTGG CGGAGGCGGA CACATTGGCG TGAGACCTGG GAGTACGTTG TGCCAAATCA 60TTGCCACTTG CCACATGAGT GTAAATGATG GCGGATGCAA GTATGTCCTC TGCCGATGGG120AAAAGCGATT ATGGCCTGCG AAGGTGACAG CCATTATTCT GTAACTTCAG GACTTAGAAA180TGACTTTCGG GTGACAAGTA AAATCTTGAT CAGGAGATAC CTAGGATTTG CTTCAGTGAA240ATAATTGAGC CAGAACACGG TTGGCACTGA TTCTCGTTCC CCATTTAATG GGGTTTTGGT300CTAGTGCTTC CAAGGTTACA CTTCCAGAAA TGTCTTTTTT TTTTCACACT AAAAAAAAAA360AAAAGAATCA GCTGTAAAAA GGCATGTAAG GCTGTAACTC AAGGAAAGAT CTGGCAAGCA420GCCCTGTGAT AGTAAATTAT GGTCGTGTTC AGGGAATGCT TTCCAGCAAT TCAGTAGACA480GTGCTCAGCT GCAATGCAAA AGCCCAGGTC CTTGTCTTTG TCTGCCACTG GCCTCTCATG540CCTCAGTTTC CCCATCTGTG AAACAATGGG GATTGGACCA AATATCTGAA ATCCCATGGT600TATAGGCCTT CAGGATTACC TGCTGCATTT GTGCTAAAGT TTGCCACTGT TTCTCACTGT660CAGCTGTTGT AATAACAAGG ATTTTCTTTT GTTTTAAATG TAGGTTTTGG CCCGAACCGC720GACTTCAACA AAAAATAAGA GAAGAAAGGA ATATTTTCTA GCTGTGCAAA TCCTCTCCCT780AGAGGAAAAG TTAATTGTTG TGTTGTTTTA ATACTGTTTT TTCCCGTGTA GATTTCTGAT840ACTTCAATCC CCTACTCCCC CAAAACAGTT GAAGCCCAGC CCACTCTTAA TGGGCTTATT900CACCATTTGT GTAATTCATT AATGCTCATA ATAACCTCAT GAGAAAGCAA CTAGTTTGAT960TTTATGTCAG TTTGGAAGCT GAAGATCCAA ACGAGGCATT CTGTGAGATC TATGGAGAGA 1020TTGGTACAAA CACTGAATAC ATGTAAATTA TACTCAGGGT AGACCCTATT TGTGGTTAAA 1080ATAGGGATAT TTCCTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTGACTGT TTCTTAATCA GTGCCATGCC 1140AGGAAAATAG GGATGTTTCC TTCCCAGAGA TCTGTGTGTC TTTTTTCAGA AACGTCTGTG 1200ACAGGCCCAT CAATTTTGAA ATATTTGGTT TTTGAGCCTG TCACTCTAAA CCAGCGTTTA 1260ACGTTCAAAA GGCAAATAAC TGATGACCAG GCGGCACATT GTTCTGCTCC GTGAGTGTCT 1320GGCACTGGGA AAGGTGTAGA TTGTCTAGAA TGACAGCAAT TCCGACGCCC CAGTCAGTCC 1380TGCGTGATTG TGGCGAGGGC GCGTCTGGCA CCGGGAAGGT GTAGATCATC TAGAATGACG 1440GCGATTCCGA CGCCCCGGTC AGTCCTGCGT GATTGGCGAG GGTGCATCTG TCGTGAGAAT 1500TCCCAGTTCT GAAGAGAGCA AGGAGACTGA TCCCGCGTAG TCCAAGGCAT TGGCTCCCCT 1560GTTGCTCTTC CTTGTGGAGC TCCCCCTGCC CCACTCCCTC CTGCCTGCAT CTTCAGAGCT 1620GCCTCTGAAG CTCGCTTGGT CCCTAGCTCA CACTTTCCCT GCGGCTGGGA AGGTAATTGA 1680ATACTCGAGT TTAAAAGGAA AGCACATCCT TTTAAACCAA AACACACCTG CTGGGCTGTA 1740AACAGCTTTT AGTGACATTA CCATCTACTC TGAAAATCTA ACAAAGGAGT GATTTGTGCA 1800GTTGAAAGTA GGATTTGCTT CATAAAAGTC ACAATTTGAA TTCATTTTTG CTTTTAAATC 1860CAGCCAACCT TTTCTGTCTT AAAAGGAAAA AAAAAA1896(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO2Glu Glu Lys Leu Ile Val Val Leu Phe5(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(ix)特征(A)名稱/關鍵HLA-B44結合肽(xi)序列描述SEQ ID NO3Ser Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe5(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度10個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(ix)特征(A)名稱/關鍵Khanna肽(xi)序列描述SEQ ID NO4Glu Glu Asn Leu Leu Asp Phe Val Arg Phe5 10(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度18個堿基對(B)類型核酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型核酸(ix)特征(A)名稱/關鍵PCR引物(xi)序列描述SEQ ID NO5GCCGGAGTAT TGGGACGA 18(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度17個堿基對(B)類型核酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型核酸(ix)特征(A)名稱/關鍵PCR引物(xi)序列描述SEQ ID NO6GGCCGCCTCC CACTTGC 17(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長度19個堿基對(B)類型核酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型核酸(ix)特征(A)名稱/關鍵PCR引物(xi)序列描述SEQ ID NO7GGAGTATTGG GACCGGAAG 19(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征
(A)長度18個堿基對(B)類型核酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型核酸(ix)特征(A)名稱/關鍵PCR引物(xi)序列描述SEQ ID NO8GGCCGCCTCC CACTTGT 18(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長度18個堿基對(B)類型核酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型核酸(ix)特征(A)名稱/關鍵PCR引物(xi)序列描述SEQ ID NO9CGCCACGAGT CCGAGGAT 18(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)長度18個堿基對(B)類型核酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型核酸(ix)特征(A)名稱/關鍵PCR引物(xi)序列描述SEQ ID NO10CCTTGCCGTC GTAGGCTA 18(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)長度18個堿基對(B)類型核酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型核酸(ix)特征(A)名稱/關鍵PCR引物(xi)序列描述SEQ ID NO11CGCCACGAGT CCGAGGAA 18(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)長度18個堿基對(B)類型核酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型核酸(ix)特征(A)名稱/關鍵PCR引物(xi)序列描述SEQ ID NO12CCTTGCCGTC GTAGGCGT 18(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)長度19個堿基對(B)類型核酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型核酸(ix)特征(A)名稱/關鍵PCR引物(xi)序列描述SEQ ID NO13CCGAGTGAAC CTGCGGAAA 19(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)長度19個堿基對(B)類型核酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型核酸(ix)特征(A)名稱/關鍵PCR引物(xi)序列描述SEQ ID NO14GGTCGCAGCC ATACATCCA 19(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)長度19個堿基對(B)類型核酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型核酸(ix)特征(A)名稱/關鍵PCR引物(xi)序列描述SEQ ID NO15TACAAGCGCC AGGCACAGG 19(2)SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)長度18個堿基對(B)類型核酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型核酸(ix)特征(A)名稱/關鍵PCR引物(xi)序列描述SEQ ID NO16CTCCAGGTAG GCTCTGTC 18(2)SEQ ID NO17的信息(i)序列特征(A)長度10個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO17Met Glu Val Asp Pro Ile G1y His Leu Tyr5 10(2)SEQ ID NO18的信息(i)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO18Glu Glu Lys Leu Ile Val Val Ala Phe5(2)SEQ ID NO.19的信息(i)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(xi)序列描述SEQ ID NO19Phe Leu Arg Gly Arg Ala Tyr Gly Leu5
權利要求書按照條約第19條的修改1、與HLA-B44分子結合的九肽或十肽，該肽具有選自如下一組的氨基酸序列Xaa Glu Xaa Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Tyr，Xaa Glu Xaa Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Phe，Xaa Glu Xaa Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Tyr，Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Tyr，和Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Phe其中，Xaa是任意氨基酸。
2、權利要求1所述的分離肽，由SEQ ID NO17組成。
3、權利要求1所述的分離肽，由SEQ ID NO18組成。
4、特異于HLA-B44和權利要求1的分離肽的復合物的分離的胞溶性T細胞系。
5、特異于HLA-B44和權利要求2的分離肽的復合物的分離的胞溶性T細胞系。
6、特異于HLA-B44和權利要求3的分離肽的復合物的分離的胞溶性T細胞系。
7、一種用于鑒定樣品中的HLA-B44陽性細胞的方法，所述的方法包括將所述的樣品與權利要求1的分離的肽接觸，確定所述肽的結合以確定所述樣品中HLA-B44陽性細胞。
權利要求
1.與HLA-B44分子結合的分離的肽，該肽由以下氨基酸序列組成Xaa Glu(Xaa)2.3Ile(Xaa)3Xaa其中，第一、第二和第三個Xaa是任意氨基酸，末端Xaa是酪氨酸或苯丙氨酸，所述的肽是九聚體或十聚體。
2.權利要求1所述的分離肽，由SEQ ID NO17組成。
3.權利要求1所述的分離肽，由SEQ ID NO18組成。
4.特異于HLA-B44和權利要求1的分離肽的復合物的分離的胞溶性T細胞系。
5.特異于HLA-B44和權利要求2的分離肽的復合物的分離的胞溶性T細胞系。
6.特異于HLA-B44和權利要求3的分離肽的復合物的分離的胞溶性T細胞系。
7.一種用于鑒定樣品中的HLA-B44陽性細胞的方法，所述的方法包括將所述的樣品與權利要求1的分離的肽接觸，確定所述肽的結合以確定所述樣品中HLA-B44陽性細胞。
全文摘要
本發明描述了由HLA－B44分子提呈的腫瘤排斥抗原,這些肽可用于診斷和治療方法中。這些腫瘤排斥抗原不是從酪氨酸酶衍生的,所述的酪氨酸酶在以前已被鑒別為一種能加工成由HLA－B44提呈的抗原的腫瘤排斥抗原前體。
文檔編號G01N33/50GK1197393SQ96197130
公開日1998年10月28日 申請日期1996年9月19日 優先權日1995年9月21日
發明者讓·赫爾曼, 皮埃爾·庫利, 皮埃爾·范德布魯根, 蒂爾瑞·博思－法勒爾 申請人:路德維格癌癥研究所