針對分化簇3(cd3)的人源化的抗體的制作方法
【專利說明】針對分化簇3 (CD3)的人源化的抗體
[0001] 優先權聲明
[0002] 本申請要求2012年6月14日提交的美國臨時申請序列號61/659, 717的權益。前 述的全部內容通過引用并入本文。 發明領域
[0003] 本發明涉及特異性結合人CD3 (分化簇3)的人源化的單克隆抗體，和其片段，任選 地包括至少可變區，所述可變區包括特定框架突變和特定CDR。本發明還公開了用于產生和 使用公開的抗體的藥物組合物和方法。
【背景技術】
[0004] 涉及通過抗原特異性T細胞受體（TCR)的抗體誘導信號傳導的免疫治療策略 已經被顯示改善自身免疫性和炎性疾病，其可能是通過調節對自身抗原的免疫應答。 0)3 (Cluster of Differentiation 3，分化簇3)是這樣的受體的一個實例。特別地，注 射的抗CD3單克隆抗體（mAb)治療已經被證明在預防和逆轉NOD小鼠中糖尿病的發作 (Belghith等，Nat Med 9:1202-8,2003)和在治療患有1型糖尿病的受試者中（Herold 等，N Engl J Med 346:1692-82,2002)有效。抗CD3抗體也逆轉了 Lewis大鼠中的實驗性 變應性腦脊髓炎（EAE)，對T輔助1型（Thl)介導的免疫性具有抑制效應（Tran等，Intl Tmmunol 13:1109-20, 2001) oOrthoclone 0KT3 (莫羅單抗_CD3 ;0rtho Biotech Products， Br i dgewater，NJ)是被批準用于治療移植后的移植物排斥的靜脈注射的鼠抗CD31 gG2a mAb (Chatenoud, Nat Rev Immunol 3:123-32, 2003)。注射 0KT3 后，CD3+T 細胞被從循環去 除，這在逆轉在腎、肝和心臟移植接受者的皮質類固醇抗性急性移植物排斥反應中有效。開 發了對CD3特異性的人源化的mAb，其還對Fc γ受體具有減少的結合。這些人源化的抗體 包括 otelixizumab、teplizumab 和 visilizumabo
[0005] 美國專利號7, 883, 703 (Weiner等）公開了，抗⑶3抗體在口服或粘膜施用時用于 自身免疫性疾病的治療中也是有用的。這樣的口服或粘膜施用的成功包括在粘膜免疫系統 中的調節性T細胞（Treg)的活化，其轉而導致了不希望的免疫系統的效應的改善或下調， 因此改善了或至少減少了自身免疫和炎性疾病的病理學。口服或粘膜途徑相對于全身途徑 施用抗⑶3mAb的優勢是避免嚴重不良事件（AE)和與全身施用抗⑶3 mAb相關的泛發的免 疫抑制的能力。
[0006] 發明概述
[0007] 對于提供不具有免疫原性、適合口服或粘膜施用、具有改善的藥學穩定性和具有 生物學活性的結合CD3的改善的mAb和抗體片段存在未滿足的需求。
[0008] 為了產生結合蛋白⑶3的改善的人源化的mAb的目的，意外地發現了，在可變（V) 框架區（FR)中的特定突變與特定的互補決定區（CDR)序列的組合，產生了具有改善的性質 特別是生物活性和藥學穩定性的人源化的mAb。這樣的突變和CDR的組合之前從未被公開、 暗示、或預期。因此，提供了針對CD3的改善的人源化的mAb，以及包含其的藥物組合物，以 及其用于治療容易通過結合至CD3改善的疾病的方法，其中"治療"還可任選地包括預防。
[0009] 根據至少一些實施方案，本發明提供了結合⑶3的mAb或其抗體片段，包括至少V 區，其中所述抗體或抗體片段包括SEQ ID NO: 1-6列出的6個CDR和包括特定的點突變的 人源化的FR，其使得所述mAb更加藥學穩定和生物學活性。
[0010] 根據本發明的一些實施方案，所述的mAb包括人恒定（C)區。
[0011] 根據本發明的一些實施方案，所述的重（H)鏈C區選自以下組成的組：IgGl、IgG2、 IgG3、IgG4、IgA 和 IgM。
[0012] 根據本發明的一些實施方案，所述的mAb包括含有Ser241Pro突變的人IgG4C區。
[0013] 根據一些實施方案，所述的人源化的FR包括相對于SEQ ID NO :7列出的H鏈V區 (VH)的序列的突變：Q5V、A9S、A12K、R13K、K38R、R40A、Q43K、K66R、S75T、T83R、S87T、T108L 和 L109V。
[0014] 根據一些實施方案，所述的人源化的FR包括相對于SEQ ID NO :8列出的輕（L) kappa(K)鏈V 區（Vk)的序列的突變：I10T、M11L、A13L、K18R、V19A、T22S、S40P、T42K、 S43A、A60S、H61R、S70D、S72T、G77S、M78L、E79Q、A80P、A83F、S100G、L104V 和 N107K。
[0015] 根據一些實施方案，所述的人源化的FR包括相對于SEQ ID NO :7列出的VH區的 序列的突變：Q5V、A9S、A12K、R13K、M20V、K38R、R40A、Q43K、K66R、L69I、S75T、Q81E、T83R、 S87T、T108L和L109V;以及相對于SEQIDN0:8列出的Vκ區的序列的突變 ：QlE、I10T、 Ml 1L、A13L、K18R、V19A、M21L、T22S、S40P、T42K、S43A、A60S、H61R、R63S、S70D、S72T、G77S、 M78L、E79Q、A80P、A83F、S100G、L104V 和 N107K。
[0016] 根據一些實施方案，所述的mAb或其片段包括SEQ ID N0:9列出的VH鏈。
[0017] 根據一些實施方案，所述的mAb或其片段包括SEQ ID NO: 10列出的Vk鏈。
[0018] 根據一些實施方案，所述的mAb或其片段包括SEQ ID N0:9列出的VH鏈和SEQ ID NO: 10列出的V κ鏈。
[0019] 根據一些實施方案，所述的mAb或其片段包括根據SEQ ID NO: 11的全長H鏈和根 據SEQ ID NO: 12的全長L鏈。
[0020] 根據一些實施方案，所述的mAb包括與SEQ ID NO :9具有至少95%同一性的H鏈 序列和與SEQ ID NO :10具有至少95%同一性的κ鏈序列。
[0021] 根據一些實施方案，所述的mAb包括分別與SEQ ID NO :9和SEQ ID NO : 10具有至 少96%、97%、98%或99%同一性的VH和Vk鏈序列。每種可能性代表了本發明的獨立的 實施方案。
[0022] 根據一些實施方案，所述的VH鏈是由包括SEQ ID NO: 13列出的序列的多核苷酸 所編碼的。
[0023] 根據一些實施方案，所述的Vk鏈是由包括SEQ ID N0:14列出的序列的多核苷酸 所編碼的。
[0024] 對于本領域技術人員明顯的是，DNA密碼子的冗余是指每個氨基酸是由一個或更 多個密碼子編碼的，這樣在編碼相同多肽的DNA序列中可以有至少30 %可變性。
[0025] 對于本領域技術人員明顯的是，含有內含子的SEQ ID NO: 13和14的DNA序列，以 與不含內含子并也編碼VH和VL的SEQ ID NO: 13和14的相同方式，仍編碼所述的VH和VL 鏈。
[0026] 本發明的范圍還包括包含FR中的特定突變和SEQ ID NO: 1-6的6個⑶R序列的 抗體片段。
[0027] 根據本發明的抗體片段包括至少所述抗體的V區。在一些實施方案中，抗體片段 選自以下組成的組：Fab、Fab'、F(ab'） 2、scFv或dsFv抗體。
[0028] 根據另一方面，本發明提供包括如上所述的針對CD3的mAb作為活性成分，且任選 地包括賦形劑或載體的藥物組合物。
[0029] 在一些實施方案中，所述的藥物組合物還包括藥學上可接受的賦形劑和/或載 體。在一些實施方案中，所述的藥物組合物還包括其他活性或非活性成分。
[0030] 根據一些實施方案，所述藥物組合物被配制為用于選自以下組成的組中的施用途 徑：口服、粘膜、經鼻、鼻內、肺、舌下、含服、直腸、或陰道。
[0031] 根據一些實施方案，提供了適用于口服施用的藥物組合物，其中所述組合物是 以選自以下組成的組的形式：液體口服劑型和固體口服劑型，例如，片劑、膠囊、小膠囊 (caplet)、粉劑、丸劑、顆粒劑、在小藥囊（sachet)中的粉劑、腸溶包衣膠囊、腸溶包衣片、 腸溶包衣珠、包封粉劑、包封丸劑、包封顆粒和腸溶包衣軟凝膠膠囊。
[0032] 根據一些實施方案，所述口服劑型是控釋制劑。
[0033] 根據又一方面，本發明提供了編碼針對CD3的mAb或其片段、鏈或結構域的多肽序 列的多核苷酸序列。
[0034] 根據一些實施方案，提供了包括SEQ ID N0:13列出的序列、或與SEQ ID N0:13具 有至少70%、75%、80%、85%、90 %或95 %同一性的序列的多核苷酸序列，其編碼如SEQ ID NO: 11 中的 mAb H 鏈。
[0035] 根據一些實施方案，提供了包括SEQ ID N0:13列出的序列、或與SEQ ID N0:13具 有至少90%同一性的序列的多核苷酸序列，其編碼如SEQ ID NO: 11中的mAb H鏈。
[0036] 根據一些實施方案，提供了包括SEQ ID NO: 14列出的序列、或與SEQ ID NO: 14具 有至少70%、75%、80%、85%、90 %或95 %同一性的序列的多核苷酸序列，其編碼如SEQ ID NO: 12 中的 mAb L(K)鏈。
[0037] 根據一些實施方案，提供了包括SEQ ID NO: 14列出的序列、或與SEQ ID NO: 14具 有至少90%同一性的序列的多核苷酸序列，其編碼如SEQ ID NO: 12中的mAb L(K)鏈。
[0038] 根據一些實施方案，提供了包括SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14列出的至少一種 序列、或與 SEQ ID N0:13 或 SEQ ID N0:14 具有至少 70%、75%、80%、85%、90%或95%同 一性的序列的多核苷酸序列。
[0039] 本發明的范圍還包括：包含編碼本文所述的mAb或其片段的多肽的至少一種多核 苷酸序列的表達載體、以及包含這些表達載體或多核苷酸序列的宿主細胞和轉基因動物。
[0040] 另一方面涉及包含編碼本文所述的mAb或其片段的表達載體的重組宿主細胞。
[0041] 根據一些實施方案，所述宿主是表達mAb或其片段、鏈或結構域的雜交瘤細胞系。
[0042] 本發明的范圍還包括包含至少V區的根據本發明的mAb或其片段用于治療，例如 本文所述的病癥或疾病，或用于制備藥物的用途。
[0043] 另一方面提供了包括包含至少V區的根據本發明的mAb或其片段，用于治療容易 通過結合CD3改善的疾病或疾患的藥物組合物。
[0044] 根據一些實施方案，所述藥物組合物還包括賦形劑、稀釋劑或載體。
[0045] 根據一些實施方案，所述藥物組合物被配制用于口服或粘膜施用。
[0046] 根據又一方面，本發明提供了用于治療容易通過結合CD3改善的疾病或疾患的方 法，包括向需要其的受試者施用包括根據本發明的包含至少可變區的mAb或其片段的藥物 組合物。
[0047] 根據一些實施方案，所述疾病是自身免疫或炎性疾病。
[0048] 根據具體實施方案，所述疾病是任何病因的肝炎。
[0049] 根據本發明的治療可使用任何施用途徑，包括但不限于選自以下組成的組的施用 途徑：口服、粘膜、經鼻、鼻內、肺、舌下、含服、直腸、或陰道。
[0050] 根據一些實施方案，所述施用是通過口服或粘膜途徑。
[0051] 根據其他實施方案，所述施用途徑選自以下組成的組：經鼻、鼻內、肺、舌下、含服、 直腸、或陰道。
[0052] 根據本發明的藥物組合物可以作為單獨治療施用，或與其他任何治療劑的治療一 起施用。根據本發明的藥物組合物可與其他劑一起施用或單獨地施用。
[0053] 本發明的范圍還包括制備包含至少V區的針對⑶3的mAb或其片段的方法。
[0054] 可通過本領域已知任何適合的方法制備根據本發明的mAb或其片段。這包括從重 組宿主細胞、雜交瘤細胞或其他生物學系統分離，或合成生產。
[0055] 在一些實施方案中，根據本發明的mAb是通過包括以下步驟的方法產生的：
[0056] (a)產生人CD3相關抗原或片段、或包含CD3或片段的細胞、或其融合蛋白的制 品；
[0057] (b)用抗原或片段、或其融合蛋白或包含所述抗原的細胞免疫嚙齒類動物，例如小 鼠；
[0058] (C)在所述小鼠的血清中檢測特異結合性或阻斷性Ab ;
[0059] (d)在來自所述小鼠的淋巴結細胞與骨髓瘤細胞之間產生雜交瘤，以產生Ab ;和
[0060] (e)用抗原特異性結合試驗篩選雜交瘤。
[0061] 在一些實施方案中，用于產生抗體（Ab)的抗原是來自人或類人靈長類物種。
[0062] 在一些實施方案中，用于產生Ab的抗原是表達內源性或重組的全長抗原或抗原 的抗原性片段的原代細胞或細胞系、或全部或部分抗原和其他蛋白的融合蛋白，或所述抗 原是病毒樣顆粒的部分。
[0063] 在一些實施方案中，用于產生Ab的抗原是在細胞表面上。
[0064] 作為步驟b)、c)和d)的替代選擇，包括至少V鏈的抗原或其片段可通過對步驟a) 的抗原進行噬菌體展示以選擇抗體序列而獲得。
[0065] 現有技術中對抗⑶3 Ab已知的或設想的基本上所有的用途都可以通過本發明的 Ab來實現，其表示出具有比先前已知的Ab改善的生物學和藥學特征。這些用途包括預防性 的（預防的）和治療性的應用。
[0066] 除非另有定義，否則本文使用的所有技術和科學術語具有本發明所屬領域的普通 技術人員通常理解的相同的含義。盡管類似于或等同于本文描述的方法和材料的方法和材 料可被用于實踐或試驗本發明，合適的方法和材料在下面被描述。所述材料、方法和實施例 僅是示例性的，并且不旨在用于限制。本發明的其他特征和優點將通過下面的詳細描述以 及權利要求書變得明顯。
[0067] 附圖簡述
[0068] 圖1 :編碼嵌合抗體V κ (左）和VH(右）序列的pA