一種梨果皮組織多糖中單糖含量的測定方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種糖含量測定方法，具體涉及以一種梨果皮組織多糖中單糖含量的測定方法。
【背景技術】
[0002]目前，測定植物多糖中單糖組分的方法技術主要集中在當歸、仙人掌、枸杞、銀耳以及龍眼果肉部分，關于果皮組織多糖中單糖含量的測定方法卻很少。而且這些方法所需樣品量多，步驟繁瑣且所需樣品原材料多，而獲取梨幼果期所產生的果皮樣品費時、費工，對想要探索多糖中不同單糖組分在梨不同時期果皮中變化規律、果皮結構和功能中的作用帶來了困難。
[0003]梨是我國第三大水果產業，為消費者最喜歡的水果之一。梨果皮多糖中單糖組分含量測定不僅有助于果皮結構的研宄，也為分析果皮中營養成分及價值提供理論依據。目前，測定樣品多糖中單糖組分需要試材較多，如果樣品較少，導致提取粗多糖的量較少而無法進行后續工作。因此，開發出一種高效、精確和需樣量少測定梨果皮多糖中單糖組分的方法變得尤為重要。

【發明內容】

[0004]本發明利用高效液相色譜法，測出梨果皮多糖中不同單糖組分的含量，該方法不僅有效提高多糖中單糖組分含量提取率，而且準確度高、重復性好。
[0005]本發明一方面涉及一種梨果皮組織多糖中單糖含量的測定方法，其特征在于，包括如下步驟:
[0006]I)稱取定量果皮，用石油醚提取，過濾，收集濾渣，殘渣用去離子水熱提取，上清液減壓濃縮至初始體積的1/3，加入無水乙醇，混勻，靜置24h，離心得沉淀；沉淀配成水溶液，加入Sevage試劑震蕩，離心，經真空冷凍干燥，得樣品I ;
[0007]2)將樣品I溶于純水中，過0.45 μ m膜，取濾液置于安瓿瓶中，加入三氟乙酸，充隊后封管，100-120°C條件下反應0.5-5h，冷卻至室溫，減壓蒸干后向安瓿瓶中加入甲醇再次蒸干，重復操作2-5次，用純水復溶，過0.45 μ m膜，得樣品II備用；
[0008]3)取樣品II，置于容器中，加入NaOH溶液，PMP甲醇溶液，混勻后反應，反應結束后試管冷卻至室溫，用HCl中和反應體系，加入氯仿充分震蕩，靜置，棄去下層有機相，重復2-5次，加水稀釋后過0.45 μ m濾膜后進行HPLC分析。
[0009]優選地，所述測定方法還包括標準溶液配制步驟，具體為分別配制葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸、甘露糖6種單糖標準品組成的標準儲備液，4°C條件下保存備用，標準品工作液由儲備液進一步稀釋得到6個濃度，過0.45 μ m膜后進行HPLC分析。
[0010]優選地，所述測定方法中，HPLC的分析條件為流動相為20mmol/L磷酸鹽緩沖液-乙腈，優選地，其體積比為83: 17 ;優選地，流速為lmL/min，檢測波長245nm，柱溫30°C，進樣量20yL，檢測時間:30min。
[0011]優選地，所述梨是‘碭山酥梨’(綠皮梨)及其褐皮芽變‘銹酥’(褐皮梨)。
[0012]優選地，所述步驟I)中，石油醚提取的溫度為70°C ;所述步驟I)中，熱提取的溫度為80°C ；
[0013]優選地，所述步驟I)為，稱取定量果皮，用4-8倍體積的石油醚70°C提取l_4h，過濾，收集濾渣，殘渣用8-12倍體積的去離子水進行熱提取2-5次，水浴溫度80°C，每次提取時間l_4h，提取液離心、合并上清液，置旋轉蒸發儀40-60°C減壓濃縮至初始體積的1/3，加入2-5倍濃縮液體積的無水乙醇，混勻，靜置24h，離心得沉淀，沉淀配成5 %的水溶液，加入1/3體積的Sevage試劑，震蕩25min,離心，經真空冷凍干燥，得樣品I。
[0014]最優選地，所述步驟I)為，稱取定量果皮，用6倍體積的石油醚70°C提取2h，過濾，收集濾渣，殘渣用10倍體積的去離子水進行熱提取3次，水浴溫度80°C，每次提取時間2h,提取液離心、合并上清液，置旋轉蒸發儀50°C減壓濃縮至初始體積的1/3，加入4倍濃縮液體積的無水乙醇，混勻，靜置24h，離心得沉淀，沉淀配成5%的水溶液，加入1/3體積的Sevage試劑，震蕩25min,離心，經真空冷凍干燥，得樣品I。
[0015]優選地所述的步驟2)為，將粗多糖樣品溶于純水中，過0.45 μ m膜，取濾液置于安瓿瓶中，加入4mol/L三氟乙酸，充隊后封管，110°C條件下反應2h，冷卻至室溫，減壓蒸干后向安瓿瓶中加入甲醇再次蒸干，重復操作3次，用純水復溶，過0.45 μπι膜，得樣品II備用。
[0016]優選地，所述的步驟3)為，取樣品II，置于5mL具塞試管中，加入0.3mol/L NaOH溶液，0.5mol/L PMP甲醇溶液，混勻后70°C水浴反應2h，反應結束后試管冷卻至室溫，用0.3mol/L HCl中和反應體系，加入氯仿充分震蕩，靜置，棄去下層有機相，重復3次，加水稀釋后過0.45 μ m濾膜后進行HPLC分析。
[0017]本發明的有益效果
[0018](I)本發明在處理樣品時米用石油釀先提取，米用液氣研磨，米用Sevage試劑進行后處理，用冷凍干燥處理樣品，有效的保持原材料的成分且提取效率高。
[0019](2)本發明在采用TFA強酸性處理后利用甲醇溶解蒸干，用PMP處理后各種單糖成分具有紫外吸收，得以檢測且以上試劑用量檢測時峰形較好，采用柱溫30°C，流動相為磷酸緩沖溶液(PH = 6.8)-乙腈(體積比為83: 17)，流速為lml/min，檢測波長為245nm，進樣量為20 μ L，對單糖達到了較好的分離結果，使最終檢測結果準確率高。
【附圖說明】
[0020]圖1不同多糖中不同單糖的出峰時間；
[0021]圖2，即，2A-2F不同時期‘碭山酥梨’和‘銹酥’果皮多糖中各單糖組分含量；
【具體實施方式】
[0022]實施例1
[0023]I儀器與樣品
[0024]1.1 儀器:安捷倫 1260 HPLC system (Agilent Technologies, USA)。色譜柱:ZORBAX SB-C18 column(4.6m*150mm*5μm, Agilent, USA)。
[0025]樣品:‘碭山酥梨’(綠皮梨)及其褐皮芽變‘銹酥’(褐皮梨)花后25d、50d、75d、100d、125d 和 150d 的果皮。
[0026]2方法與結果
[0027]2.1稱取不同時期梨皮2g，用6倍體積的石油醚70°C提取2h，過濾，收集濾渣，殘渣用10倍體積的去離子水進行熱提取3次，水浴溫度80°C，每次提取時間2h。提取液離心、合并3次上清液，置旋轉蒸發儀50°C減壓濃縮至初始體積的1/3，加入4倍濃縮液體積的無水乙醇，混勻，靜置24h，離心得沉淀。沉淀配成5%的水溶液，加入1/3的Sevage試劑(氯仿:正丁醇=4:1)震蕩25min，離心，經真空冷凍干燥