一種基于鈀三腳架構建的肌紅蛋白生物傳感器的制備方法及應用
【技術領域】
[0001]本發明一種基于鈀三腳架構建的肌紅蛋白生物傳感器的制備方法及應用。具體是采用具有良好電催化性能的鈀三腳架，制備一種檢測肌紅蛋白的電化學免疫傳感器，屬于新型功能材料與生物傳感檢測技術領域。
【背景技術】
[0002]心肌蛋白是一種氧結合蛋白，廣泛存在于骨骼肌、心肌、平滑肌，約占肌肉中所有蛋白的2%。心肌蛋白的分子量小且位于細胞質內，從病理生理學角度講，心臟標志物出現早晚與分子大小及在細胞中存在部位有關。標志物分子量越小，越容易透過細胞間隙至血液，細胞質內高濃度物質比核內或線粒體內物質及結構蛋白更早在血中出現。因此心肌蛋白在心肌損傷時，出現較早，到目前為止，肌紅蛋白是急性心梗發生后最早的可測心肌損傷標志物。
[0003]目前電化學免疫傳感器已經廣泛用于腫瘤標志物的檢測，因為電化學免疫傳感器具有靈敏度高、選擇性好、結構簡單、操作簡便、易于小型化、可連續、快速自動化檢測分析等一系列優點。其中，由于無標記電化學免疫傳感器可以直接用于檢測抗原抗體的識別過程并且避免了標記物帶來的干擾，得到了更加廣泛的關注。
[0004]本發明將鈀三腳架修飾到玻碳電極表面，構建無標記電化學免疫傳感器。一方面，鈀三腳架具有立體結構和良好的生物相容性，能夠有效地固定抗體；另一方面，鈀三腳架具有良好的電子轉移能力和電化學催化活性，能夠提高傳感器的靈敏度。該方法在檢測過程中產生了良好的電化學信號，可用于心肌蛋白的分析。該方法具有成本低、靈敏度高、特異性好、檢測快速等優點，而且制備過程較為簡單，為目前有效檢測心肌蛋白提供了新途徑。

【發明內容】

[0005]本發明的目的之一是基于鈀三腳架，構建了一種無電子媒介體、無標記的電化學免疫傳感器。
[0006]本發明的目的之二是將該無標記電化學傳感器應用于心肌蛋白的高靈敏、特異性檢測。
[0007]本發明的技術方案如下
1.一種基于鈀三腳架構建的肌紅蛋白生物傳感器的制備方法
(1)依次用1.0,0.3,0.05 Mm的氧化鋁粉末對玻碳電極進行拋光，分別在超純水和乙醇中超聲清洗，氮氣吹干；
(2)在電極表面滴加6μ L濃度為I ~ 2 mg/mL的鈀三腳架水溶液，干燥；
(3)繼續將6PL濃度為8 ~ 12 Pg/mL的肌紅蛋白檢測抗體溶液滴加到修飾電極表面，于4°C冰箱中孵化I h，清洗干凈；
(4)用3yL濃度為5 ~ 15 mg/mL的牛血清白蛋白溶液封閉非特異性活性位點，于4°C冰箱中孵化I h，清洗干凈；
(5)將6 μ L濃度為0.000003 ~ 3 ng/mL的一系列不同濃度的肌紅蛋白抗原用于和檢測抗體的特異性識別，室溫下孵化I h，清洗干凈，于4°C冰箱中儲存備用。
[0008]鈀三腳架的制備
制備方法，所述鈀三腳架的制備，其特征在于，包括以下步驟:
在50 ~ 100 mL超純水中溶解0.0355 g氯化鈀和0.876 g氯化鈉，得到濃度為2 ~ 4臟01/1的氯化鈀溶液，將0.0546 ~ 0.1092 g十六烷基三甲基溴化銨溶解在裝有9.475 ~18.95 mL超純水的試劑瓶中，隨后，向其中加入1.25 ~ 2.5 mL制備的氯化鈀溶液和25 ~50 μ L濃度為4 mmol/L乙酸銅，震蕩5 S，將該試劑瓶至于30°C的水浴中，然后加入250 ~500 μ L濃度為0.1 mol/L的抗壞血酸，繼續在水浴中靜置3 h，最后溶液變為深灰色，離心洗滌后，得到鈀三腳架。
[0009]肌紅蛋白抗原的檢測方法
(1)使用電化學工作站以三電極體系進行測試，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為輔助電極，所制備的免疫傳感器為工作電極，在10 mL的pH值為6.8的磷酸鹽緩沖溶液中進行測試；
(2)選擇計時電流法對肌紅蛋白抗原進行檢測，將輸入電壓設置為-0.4 V，取樣間隔設置為0.1 S，運行時間設置為400 S ；
(3)當背景電流趨于穩定后，每隔50s向磷酸鹽緩沖溶液中注入10 yL濃度為5mol/L的雙氧水溶液，然后記錄電流隨時間的變化，繪制工作曲線；
(4 )將待測樣品溶液代替肌紅蛋白抗原標準溶液進行檢測。
[0010]所述肌紅蛋白抗原是一種是心肌梗死的標志物。
[0011]本發明的有益成果
(I)本發明采用鈀三腳架通過形成鈀氮鍵化學鍵合至玻碳電極表面，增強了電子的傳遞效率，放大了電化學信號。
[0012](2)本發明采用的鈀三腳架具有立體結構，能夠有效固定大量的抗體，使傳感器的穩定性加強。
[0013](3)本發明采用的鈀三腳架較普通的鈀納米顆粒對雙氧水具有更強的電化學催化性能，提高了免疫傳感器的靈敏度，比通常的功能材料至少提高1~2個數量級，檢測限可達到 1.5 fg/mL0
[0014](4)本發明將制備的無標記電化學免疫傳感器用于心肌蛋白的檢測，檢測限低，線性范圍寬，可以實現簡單、快速、靈敏和特異性檢測。
【具體實施方式】
[0015]實施例1 一種基于鈀三腳架構建的肌紅蛋白生物傳感器的制備方法
(1)依次用1.0,0.3,0.05 Mm的氧化鋁粉末對玻碳電極進行拋光，分別在超純水和乙醇中超聲清洗，氮氣吹干；
(2)在電極表面滴加6μ L濃度為I mg/mL的鈀三腳架水溶液，干燥；
(3)繼續將6μ?濃度為8 Pg/mL的肌紅蛋白檢測抗體溶液滴加到修飾電極表面，于4°C冰箱中孵化I h，清洗干凈； (4)用3μ L濃度為5 mg/mL的牛血清白蛋白溶液封閉非特異性活性位點，于4°C冰箱中孵化I h，清洗干凈；
(5)將6μ L濃度為0.000003 ~ 3 ng/mL的一系列不同濃度的肌紅蛋白抗原用于和檢測抗體的特異性識別，室溫下孵化I h，清洗干凈，于4°C冰箱中儲存備用。
[0016]實施例2 —種基于鈀三腳架構建的肌紅蛋白生物傳感器的制備方法
(1)依次用1.0,0.3,0.05 Mm的氧化鋁粉末對玻碳電極進行拋光，分別在超純水和乙醇中超聲清洗，氮氣吹干；
(2)在電極表面滴加6μ L濃度為1.5 mg/mL的鈀三腳架水溶液，干燥；
(3)繼續將6μ?濃度為10 Pg/mL的肌紅蛋白檢測抗體溶液滴加到修飾電極表面，于4 °C冰箱中孵化I h，清洗干凈；
(4)用3UL濃度為10 mg/mL的牛血清白蛋白溶液封閉非特異性活性位點，于4°C冰箱中孵化I h，清洗干凈；
(5)將6μ L濃度為0.000003 ~ 3 ng/mL的一系列不同濃度的肌紅蛋白抗原用于和檢測抗體的特異性識別，室溫下孵化I h，清洗干凈，于4°C冰箱中儲存備用。
[0017]實施例3 —種基于鈀三腳架構建的肌紅蛋白生物傳感器的制備方法
(1)依次用1.0,0.3,0