用于產后子癇診斷的標志物及其檢測試劑的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種用于產后子癇診斷的標志物及其檢測試劑。
【背景技術】
[0002] 子癇是指孕婦妊娠晚期或臨產時或新產后，眩暈頭痛，突然昏不知人，兩目上視， 手足抽搐，全身強直、少頃即醒，醒后復發，甚至昏迷不醒的疾病，被稱為"子癇"，又稱"妊娠 癇征"。妊娠子癇是由先兆子癇癥狀和體征加劇發展而來的。子癇可發生于妊娠期、分娩期 或產后24小時內，被分別稱為產前子癇、產時子癇和產后子癇，是產科四大死亡原因之一。 一旦發生，母兒并發癥及死亡率明顯增加，故應特別重視，緊急處理。孕婦一旦發生子癇，兇 多吉少，死亡率極高。
[0003] 子癇已成為當今全球性的醫學社會問題之一，如何有效地實現早期預測和/或診 斷仍是非常棘手的問題。目前對于產后子癇的診斷還沒有有效的分子。這一方面是由于這 些疾病具有很明顯的復雜性和異質性，患者的病情輕重、病程急緩、發病早晚以及遺傳背景 等均會導致臨床表征的巨大差異；另一個重要因素是對疾病的發病機制和發生發展基礎的 認識還非常有限。隨著對這些疾病表征認識的不斷深入，加之現代生物學技術的飛速發展， 妊娠重大疾病的發病機制研宄也面臨著全新的機遇和挑戰。開展相關疾病機理的深入而系 統的研宄，將發現可用于疾病的預測、診斷、治療和預后的關鍵生物靶標分子，這是最大限 度地降低妊娠重大疾病造成的母兒危害、提高女性健康水平的重要途徑，也將為從生命早 期宮內發育的環節上防治糖尿病、高血壓等成年慢性疾病提供關鍵的科學依據。

【發明內容】

[0004] 針對上述現有技術存在的不足，本發明的目的是提供一種用于產后子癇診斷的標 志物一WNT4蛋白或WNT5A蛋白中的一種或兩種的組合。
[0005] 本發明還提供了一種以WNT4蛋白或WNT5A蛋白中的一種或兩種的組合為標志物 制備的用于產后子癇診斷的試劑。
[0006] 為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：
[0007] 本發明以正常妊娠婦女和產后子癇患者的蛻膜組織為材料進行研宄，通過免疫組 化檢測WNT4、WNT5A在蛻膜組織中的表達情況；通過Real-timePCR、Westernblot分別檢 測蛻膜組織中WNT4、WNT5A在mRNA和蛋白質水平的表達量，結果發現，與正常妊娠婦女組相 比，產后子癇患者的蛻膜組織中，WNT4、WNT5A在mRNA和蛋白質水平的表達量明顯降低，推 測這可能會導致蛻膜損傷，進而會引發產后子癇。因此，WNT4蛋白或WNT5A蛋白中的一種 或兩種的組合可以作為產后子癇預防和/或診斷的標志物。
[0008] 優選的，以WNT4蛋白和WNT5A蛋白的組合作為產后子癇預防和/或診斷的標志 物。
[0009] 一種用于產后子癇臨床診斷的試劑盒，包括抗WNT4抗體和抗WNT5A抗體中的一種 或兩種、HRPrabbitanti-goat抗體，以及抗0-actin抗體。
[0010] 采用該診斷試劑盒進行產后子癇臨床診斷的方法，在孕婦剖宮產分娩出胎盤后， 采集蛻膜組織，提取蛻膜組織中的全蛋白，進行凝膠電泳，根據蛋白Marker條帶和WNT4、 WNT5A及-actin分子量，切下含有目的蛋白的膠條，放到轉移緩沖液中，用以后續轉膜； 根據切下的待轉膜的膠條的大小，剪取適當大小的聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜），將PVDF膜 放入甲醇中，活化30s;將活化的膜放入三蒸水中清洗2分鐘；將膜放入轉移緩沖液中，和膠 條一起浸泡15分鐘進行滲透；滲透完畢后，打開轉膜夾，從正極到負極依次按照1層海綿、2 層濾紙、PVDF膜、膠條、2層濾紙、1層海綿的順序鋪到轉膜夾上；各層都鋪放整齊后，將轉膜 夾扣緊，放到轉膜槽中，倒入轉移緩沖液，注意緩沖液要沒過海綿；接通電源，設定為120mA 恒流，轉膜50分鐘，一定要注意確認電源的正負極，及蛋白是由膠向PVDF膜的方向轉移；封 閉：轉膜結束后，將PVDF膜取出，膜上會有清晰的蛋白Marker條帶，然后將膜放入5%的脫 脂奶粉中，在搖床上輕搖封閉1. 5小時；
[0011] 一抗孵育：將PVDF膜從封閉液中取出，分別放入所對應的一抗工作液中，用封口 機封好后，放入4°C冰箱孵育過夜；
[0012] 洗膜：第二天早上，將孵育的膜從冰箱拿出，室溫下平衡30分鐘，然后將PVDF膜放 入1XTBST中，輕搖清洗4次，每次15分鐘；
[0013] 二抗孵育：將PVDF膜分別放入所對應的二抗工作液中，室溫下在搖床上輕搖孵育 1小時，注意：13 -actin不需要二抗孵育；
[0014] 洗膜：二抗孵育結束后，用1XTBST輕搖清洗4次，每次15分鐘；
[0015]顯影：
[0016] (1)根據PVDF膜的大小，配制適量的ECL反應液（分為A液和B液），用移液槍分 別吸取等量的A液和B液混勻，約lOOulECL反應液/cm2膜，注意避光；
[0017] (2)用吸水紙吸干PVDF膜上的液體，然后將膜正面向上放到干凈的一次性PE手套 上，在膜上滴加配好的ECL反應液，保證反應液將膜完全覆蓋，避光反應約3分鐘左右，期間 可將膜正反顛倒，保證膜充分接觸反應液。
[0018] 圖像結果處理：
[0019] (1)將顯影得到的蛋白條帶圖像用Quantiscan軟件處理，得到條帶的灰度值，即 NetArea的讀數；
[0020] (2)記錄所有研宄對象WNT4、WNT5A及0 -actin條帶的灰度值，然后計算目的蛋 白與0-actin的灰度值比值。
[0021] 結果判定：
[0022] 以陰性蛻膜組織（正常健康妊娠女性的蛻膜組織）為對照，待檢測孕婦的蛻膜組 織的WNT4蛋白的相對表達量與陰性對照的比值小于0. 72，WNT5A蛋白的相對表達量與陰性 對照的比值小于0. 56,滿足上述兩個條件之一，即判定為陽性。
[0023] 本發明的有益效果：
[0024] 本發明通過檢測出WNT4、WNT5A在產后子癇患者蛻膜組織中的低表達，提供了一 種新的產后子癇臨床診斷的標志物一WNT4蛋白或WNT5A蛋白中的一種或兩種的組合，進一 步的，以該檢測標志物制備的檢測試劑，具有敏感性強、特異性高等優點，可廣泛用于臨床 類產后子癇初步調查和健康普查，為臨床診斷提供可靠依據。
【附圖說明】
[0025] 圖1為WNT4和WNT5A蛋白在兩組蛻膜中的表達分布情況，A、C和E為NP組蛻膜 組織切片，B、D和F為產后子癇組蛻膜組織切片，褐色顯示的是靶蛋白，標數字1的代表放 大倍數為200X，標數字2的代表放大倍數為400X，箭頭所指為蛻膜細胞；NP，正常妊娠組； NC，陰性對照；標尺=50ym;SPE，產后子癇組；
[0026] 圖2為WNT4和WNT5A蛋白表達水平實驗結果；
[0027] 圖3A為WNT4mRNA水平的表達實驗結果；B為WNT5AmRNA水平的表達實驗結果。
【具體實施方式】
[0028] 結合實施例對本發明作進一步的說明，應該說明的是，下述說明僅是為了解釋本 發明，并不對其內容進行限定。
[0029] 實施例1 :用于產后子癇臨床診斷標志物的發現與驗證
[0030] 1. 1研宄對象的選擇及分組
[0031] 本實施例的研宄對象均為2014年1月至2015年1月期間，在濟南市山東大學齊魯 醫院婦產科進行剖宮產手術終止妊娠的女性，共40例。其中包括產后子癇患者（SPE組）20 人，作為產后子癇組，該組平均年齡為29. 40±1. 111，平均孕周為36. 78±0. 625。正常健 康妊娠女性20人，作為正常妊娠組（NP組），該組平均年齡為28. 73±0. 639,平均孕周為 39. 10±0. 233。
[0032] 1. 2蛻膜組織標本的采集及處理
[0033] 1. 2. 1組織采集：在孕婦剖宮產分娩出胎盤后，用無菌紗布擦拭胎盤附著部位的 子宮壁，然后從紗布上取下擦拭下來的組織，用無菌濾紙反復吸凈組織上的血液，再放入無 菌小瓶中，作好標記，然后迅速放入小型液氮罐中以備帶回實驗室做進一步處理，整個操作 過程要迅速。
[0034]1. 2. 2組織處理：
[0035] 將組織帶回實驗室后，從液氮罐里取出組織，保持在冰凍狀態下做如下處理：
[0036](1)分出一塊約0. 5cmX0. 5cmX0. 5cm大小的組織塊放入包埋劑OCT中，然后放回 液氮罐保存，用于后續冰凍切片。
[0037] (2)迅速分出約80mg組織，放入lmlRIPA裂解液中，并放到-80°C冰箱保存，用于 后續提蛋白。
[0038] (3)迅速分出約40mg組織，放入lmlTRIzol中，并保存于-80°C冰箱，用于后續提 RNA〇
[0039] 1. 3WNT4及WNT5A在蛻膜組織中的表達分布研宄
[0040] 1. 3. 1試劑材料：
[0041] APES，DAB試劑盒，HRPgoatanti-rabbit，HRPrabbitanti-goat均購于北京中 杉金橋生物科技有限公司；包埋劑OCT購于美國SAKURAFinetek公司；BSA購于Promega 公司；TritonX-100購于Amresco公司；抗WNT4抗體，抗WNT5A抗體均購買于美國Santa CruzBiotechnology公司；NaCl，KCl，Na2HP04，KH2P0, 30%H202，甲醇，無水乙醇，丙酮，二甲 苯等均為國產分析純。
[0042]1. 3. 2溶液配制：
[0043] (1)配制 10XPBS:分別取NaCl40. 03g，KC1 1. 005g，Na2HP047. 7g，KH2P040 . 95g， 加入燒杯中，然后加入三蒸水約400ml，再調節pH到7. 4,最后用三蒸水定容至500ml即可。
[0044] (2)配制 3%TritonX-1