專利名稱：：與二肽基肽酶有關的疾病狀態的診斷和預后的制作方法
技術領域：
：本發明一般地涉及疾病或病癥的診斷和預后。
背景技術：
：當前評價疾病風險或診斷疾病的方法通常依賴于耗費時間的診斷、排除法或通過侵入性手術或活組織檢查。甚至在獲得確定的診斷后，預后也一般是基于主觀因素。在某些疾病例如代謝性疾病中，通過客觀診斷進行的方法通常是麻煩的，耗費時間并且昂責。例如，診斷2型糖尿病的主要方法是空腹血糖測試，評價血漿中的血糖水平。該測試需要患者禁食8-14小時，通常需要數小時到數天的多個血液圖。此外，盡管空腹血糖測試可以用于診斷2型糖尿病的存在，但是該測試在提供疾病預后的能力方面非常有限。9在醫學領域，一直在探索侵入性較小、身體費力較小和更準確的方法來診斷和治療疾病或病癥。由于展開更深入了解這些生物學過程和與這些過程有關的生物化學，已經產生了一些理論，關于哪些成分可能鑒定為某些疾病或病癥的標志或指示。蛋白酶和肽酶作為一類物質，人們已經研究了它們在診斷中的應用，并將其作為治療患者的靶點。在一般
背景技術：
中，通常根據很多標準例如作用的位點、底物選擇和機制將蛋白酶/肽酶分類。例如，氨基肽酶優先作用于多肽的N-末端殘基，羧肽酶優先作用于C-末端，內肽酶作用于這兩個末端之間的位點。二肽基肽酶(DPPs)是從它們的特異性底物中特異性地分裂二肽單元，即兩個氨基酸單元的肽酶。有很多不同的DPPs，底物選擇通常是用緊挨切割位點的N-末端的氨基酸殘基來表達的。例如，DPP-I(IUBMB酶命名法EC.3.4.14.1)是一種溶酶體的半胱氨酸-型肽酶，釋放N-末端二肽，Xaa-Yaa-i-Zaa-，除了當Xaa是Arg或Lys,或Yaa或Zaa是Pro時。DPP-II(IUBMB酶命名法EC.3.4.14,2)是一種溶酶體的絲氨酸-型肽酶，釋放N-末端二肽Xaa-Yaa-l-，優選地當Yaa是Ala或Pro時。DPP-III(IUBMB酶命名法EC.3.4.14.4)是一種細胞溶質性肽酶，它對于肽具有廣泛活性，盡管在pH9.2下它對于Arg-Arg-Z具有高度選擇性，其中Z是任意的氨基酸。DPP-IV(IUBMB酶命名法EC.3.4.14.4)是一種膜結合的絲氨酸-型肽酶，從Xaa-Yaa-1-Zaa-中釋放N-末端二肽，優選地當Yaa是Pro時，條件是Zaa不是Pro也不是羥基脯氨酸。DPPs涉及范圍廣泛的生理學重要的活性，與神經系統、內分泌系統、免疫系統和消化系統的調節有關。已經以很多的細胞內和細胞外功能例如蛋白質降解和酶活化證明了DPP活性。至于上述的特定DPPs，已經廣泛研究了DPP-IV，以及它們伴隨的亞型以及同工酶或結構同系物，以及顯示DPP-IV-樣活性的那些蛋白質。顯示DPP-IV-樣活性的蛋白質稱作二肽基肽酶IV活性和10/或結構同系物，或"DASH"。DPP-IV是一種II型膜蛋白，有很多名字，包括但不限于，DPP4、DP4、DAP-IV、FAP^腺苷脫氨酶絡合蛋白2、腺苷脫氨酶結合蛋白(ADAbp)、二肽基氨基肽酶IV;Xaa-Pro-二肽基-氨基肽酶；Gly-Pro萘酰胺酶；后脯氨酸二肽基氨基肽酶IV;淋巴細胞抗原CD26;糖蛋白GP110;二肽基肽酶IV;甘氨酰脯氨酸氨基肽酶；甘氨酰脯氨酸氨基肽酶；X-脯氨酰二肽基氨基肽酶；pepX;白細胞抗原CD26;甘氨酰脯氨酰二肽基氨基肽酶；二肽基-肽水解酶；甘氨酰脯氨酰氨基肽酶；二肽基氨基肽酶IV;DPPIV/CD26;氨基酰基-脯氨酰二肽基氨基肽酶；T細胞觸發分子Tpl03;X-PDAP.(Burgess等人，U.S.專利7,169,926)。已經報道了4艮多的DASH蛋白，例如seprase、成纖維細胞活化蛋白oc、DPP6、DPP8、DPP9、attractin、N-乙酰化-ot-連接的-酸性二肽酶I、II和L，休眠細胞脯氨酸二肽酶、胸腺-特異性絲氨酸蛋白酶和DPPIV--P(Busek等人，Int.J.Biochem.CellBiol.36:408-421(2004))。DPP-IV組成性地在很多不同組織包括腸、肝、肺、腎和胎盤的上皮和內皮細胞上表達(Hartel等人，Histochemistry89(2):151-161(1988);Yaron和Naider，CriticalRev.Biochem.Mol.Biol.28(1):31-81(1993))。DPP-IV在循環的T-淋巴細胞上表達，并已顯示它與細胞表面抗原CD-26是同義的(Sedo等人，ArthritisRes.Ther.7:253-269(2005))。除了膜-結合形式，DPP-IV也以可溶形式存在，可以在體液例如血漿和關節液中發現DPP-IV活性(Sedo等人，ArthritisRes.Ther.7:253-269(2005);Gorrell，ClinicalSci.108:277-292(2005))。據信，DPP-IV在神經肽代謝、T細胞活化、細胞粘附、腎和腸中包含脯氨酸的肽的消化、HIV感染和細胞凋亡，和某些黑色素瘤細胞中致腫瘤性的調節中發揮重要作用(Mattem等人，Scand.J.Immunol.33:737(1991);Pethiyagoda等人，Clin.Exp.Metastasis18(5):391-400(2000))DPP-IV的天然底物包括數種趨化因子、細胞因子、神經肽、循環性激素和生物活性肽(Lambeir等人，J.Biol.Chem.276(32):29839-29845(2001))。人們已經提出了在肽激素的代謝和在氨基酸運輸中DPP-IV的關鍵調節作用(Hildebrandt等人，Clin.Sci.(Lond.)99(2):93-104(2000))。在促有絲分裂或抗原刺激下T細胞中DPP-IV表達增加，表明了其在免疫系統中的作用(Mattem等人，Scand.J.Immunol.33:737(1991))。T-淋巴細胞的其他各種功能例如產生細胞因子、IL-2介導的細胞增殖和B-細胞輔助細胞活性也已經顯示出依賴DPP-IV活性(Schon等人，Scand.J.Immunol.29:127(1989))。此外，在T-細胞活化和增殖期間，DPP-IV似乎具有共刺激功能(vonBonin等人，Immunol.Rev.161:43-53(1998))。DPP-IV也涉及其他的生物學過程，包括用于細胞外酶腺苷脫氨酶(ADA)定位的膜-錨定功能(Franco等人，Immunol.Rev.161:27-42(1998))以及通過與膠原和纖連蛋白結合參與到細胞基質粘附(Loster等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.217(1):3"-348(1995))。據信，DPP-IV還在內分泌調節和代謝生理學中發揮作用。例如，DPP-IV分裂了胰高血糖素樣肽-1(GLP-I)的氨基-末端His-Ala二肽，產生了GLP-I受體拮抗劑，因此，縮短了對GLP-1的生理學應答。DPP-IV也涉及葡萄糖代謝的控制，因為它的底物包括促胰島素激素GLP-I和抑胃肽(GIP),通過除去它們的兩個N-末端氨基酸將其滅活(Mannucci等人，Diabetologia48:1168-1172(2005))。除了正常的生理學功能外，已經研究了DPPs對于疾病狀態，包括癌癥、自身免疫性疾病、心血管疾病、代謝性疾病和傳染性疾病的作用。例如，有人已經提出，DPP-IV是肺-轉移型乳腺和前列腺癌細胞的粘附分子(Johnson等人，J.Cell.Biol.121:1423(1993))。在良性前列腺肥大的患者的組織勻漿和前列腺體中已經發現了較高的DPP-IV活性(Vanhoof等人，Eur.J.Clin.Chem.Clin.Biochem.30:333(1992))。在自身免疫性疾病例如牛皮褲、類風濕性關節炎(RA)和扁平苔蘚的患者的人皮膚成纖維細胞中已經發現了高水平的DPP-IV表達(Raynaud等人，J.Cell.Physiol.152:378(1992))。DPP-IV與很多的代謝性疾病例如肥胖和食欲調節有關。例如，被更廣泛地研究的與DPP-IV有關的代謝性疾病之一是2型糖尿病。Mannucci等人定義和描述了糖尿病中'漫性高血糖和DDP-IV的關系。這種研究確定了，在II型糖尿病中循環的DPP-IV活性與高血糖的程度直接相關。其他研究討論了DPP-IV和涉及調節血糖水平的激素級聯的各種激素之間的關系。這些研究表明，DPP-IV降解了對于胰島素分泌非常重要的激素。特別地，已經有人提出，DPP-IV降解了胰高血糖素樣1肽(GLP-I)，其會導致胰島素分泌降低，因此提高了血糖。根據這種現象，可以發展DPP-IV的抑制劑來治療II型糖尿病(Green等人，Diab.Vase.Dis.Res.3(3):159-165(2006))。顯然，DPP-IV對于CD4+T-細胞中HIV-I和HIV-2病毒的滲透和感染性是重要的(Wakselman等人，J.Dermatol.Sci.22:152-160(2000))。因此，一些人提示，抑制DPP-IV也可以抑制這種機制。近來，DPP研究的一些途徑已經聚焦于將改變DPP水平作為一種手段來發展處理和治療與DPP有關的疾病狀態和病癥。但是，迄今為止這項工作幾乎沒有產生任何處理和治療方法。發明簡述仍然探索了基于DPP及其對生物學過程作用的治療和診斷工具的發展。本文所述的本發明的一個實施方案涉及一種與DPP有關的疾病狀態或病癥的預后或診斷方法。具體地，測定特異性的DPP的可區分部分的一種或多種參數，該測定值與疾病狀態或病癥的存在、不存在或嚴重度有關。本文所述的本發明的另一個實施方案涉及一種與DPP有關的疾病狀態或病癥的預后或診斷方法。具體地，測定DPP亞型的可區分部分的一種或多種參數，該測定值與疾病狀態或病癥的存在、不存在或嚴重度有關。所述發明的另一個實施方案涉及一種II型糖尿病的診斷或預后方法。具體地，測定患者樣品中DPP-IV亞型的一個或多個可區分部分的至少一種參數，該測定值與II型糖尿病的存在、不存在或嚴重度有關。附圖簡述附圖1描述了各亞型的自由流動電泳分離的工作流程。附圖2A和B的圖，顯示了在天然IEF-FFE后豬的DPP-IV的活性試驗的結果。附圖2B顯示了可區分的豬的DPP-IV亞型的特異活性(U/ng酶)。附圖3是從豬的DPP-IV的天然FFE(pH3-10)分離的第27到47部分的銀-染色的丙烯酰胺凝膠。附圖4A和B顯示的是從IEF凝膠分離的受胰蛋白酶作用的蛋白帶的肽質量指紋圖鐠，大多是酸性的(4A)亞型，稍多是堿性(4B)亞型。PMF測定鑒定了所有的亞型都是DPP-IV。附圖5A和B顯示的是用MALDITOF/TOF確認的所選擇的DPP-IV峰。附圖6A和B顯示的是來自兩個健康受試者的人的血漿中FFE可區分的DPP-IV亞型的DPP-IV活性。附圖7顯示的是來自正常人受試者的FFE可區分的亞型的DPP-IV活性特性。附圖8顯示的是來自葡萄糖水平為538mg/dL的糖尿病人受試者的FFE可區分的亞型的DPP-IV活性特性。附圖9顯示的是由健康人受試者的FFE可區分的亞型去唾液酸化導致的DPP-IV特性移動的例子。活性用RFU/分鐘表示。黑柱代表處理過的樣品；線紋柱代表未處理的樣品。附圖IO顯示的是來自健康(空柱)和糖尿病(黑柱)患者的血漿的pi可區分的DPP-亞型，以及糖尿病患者(黑線)的去唾液酸化亞型之間DPP-IV活性的比較。虛線代表每個部分都可區分時的pH。附圖11是pHvs.健康和糖尿病患者的pi可區分的DPP-亞型的DPP-IV活性的點狀圖。S04、Sll、S07和S02是健康者的，剩余的是糖尿病患者的。附圖12是pH的圖，在該pH下，每個受試者的pl可區分的DPP-IV亞型達到了90%的DPP-IV活性。S04、Sll、S07和S02是健康者的，剩余的是糖尿病患者的。附圖13是pH的圖，在該pH下，每個受試者的pl可區分的DPP-IV亞型達到了60%的DPP-IV活性。S04、Sll、S07和S02是健康者的，剩余的是糖尿病患者的。附圖14的圖，描述了可以將可區分的DPP亞型的測定參數與疾病之間關聯的各種方法。實施本發明的最佳方式本文所述的方法為與二肽基肽酶(DPP)-有關的疾病狀態或病癥提供了風險評估、診斷或預后。特別地，所述方法涉及與特定DPP參數有關的疾病狀態或病癥的風險評估、診斷或預后的方法。根據所述方法的實施方案，測定可區分的DPP部分的參數。然后將測定值與所述疾病狀態或病癥的存在、不存在或嚴重度關聯。為達到本申請的目的，術語"蛋白酶"和"肽酶"可互換地使用，指催化肽酰胺鍵水解的酶。二肽基肽酶(DPPs)是從多肽中分裂出二肽的蛋白酶。本文使用的術語"特異性的DPP的可區分部分"涉及患者樣品中以某種方式已經互相區別、分離或隔離的特定DPP(例如，特定DPP族中的一種或多種亞型，例如DPP-I、DPP-II、DPP-III、DPP-IV等等)。在一個實施方案中，使特異性的DPP經受某種將特定DPP的至少一種亞型與DPP的至少一種其他亞型區別開的條件。每個可區分部分可以包含該特定DPP的一種或多種DPP亞型，一些部分可以不包含DPP亞型。在另一個實施方案中，使DPP(可以包含一族或一族以上的DPP)經受某種將DPP的至少一種亞型與該DPP的至少一種其他亞型區別開的條件。特別地，DPP亞型個體可以完全或僅部分區分成各部分并彼此區分。因此，一個可區分部分可包含一種或多種亞型，或者每個可區分部分可以僅包含一種亞型。同樣地，一個可區分部分可以包含一種亞型，而其他可區分部分包含一種以上的亞型。此外，一些可區分部分可以不包含DPP亞型，只要一個或多個其他部分包含一種或多種DPP亞型。該特異性的DPP可以是任何特異性的DPP或DASH族的一員，包括DPP-I、DPP-II、DPP-III或DPP-IV。在一個示例性的實施方案中，DPP是DPP-IV。不特別指定的DPP包括非特異性和特異性的DPP。本文使用的術語DPP的"亞型"是指某些物理方面不同，但是都具有共同的特征性催化活性、同源的一級結構/氨基酸序列或都來源于相同的基因位點的一種或多種DPP酶的多種形式中的任何一種。DPP亞型的催化活性不需要是在催化的程度或速率方面相同，僅僅具有共同的底物特性。同樣地，亞型的一級結構不需要相同，但是可以是酶的氨基酸序列的較小加成、刪除或突變的結果。亞型可以具有類似或相同的一級結構，可以具有相同的催化活性或不同的催化活性。所述亞型的一級結構可以顯著不同，同時保留相同的催化活性。亞型可以具有相同或不同的二級結構、三級結構和/或四級結構，但仍是彼此的亞型，只要它們保留相同或類似的一級機構和/或酶活性和/或來源于相同的基因位點。亞型可以來源于相同的基因位點，或來源于不同的基因位16點。它們可以是不同等位基因；多個基因位點；由相同的基因產生的信使RM的交替剪接的結果，或者是翻譯后修飾例如加入多糖、磷酸酯、巰基、唾液酸或其他基團的結果。當在本文中使用時，"亞型"也包括同工酶。本文使用的術語"同工酶，，(可替代地，同功酶)是亞型的一個類型，是指起源于一級結構/氨基酸序列的基因確定差異的酶的多種形式中的任意一種。具有相同的催化活性、基因位點或一級結構的任意類型的酶互為亞型。已知多種DPP亞型。例如，DPP-1由相同基因(EntrezGeneGeneID:1075)編碼的轉錄變異而存在至少兩種亞型。同樣，已經^l道了DPP-II(DiCarlantonio等人，GameteRes.15(2):161175(2005))、DPP-III(Mazzocco等人，FEBSJournal273(5):10561064(2006))和DPP-IV(Schmauser等人，Glycobiol.9(12):12951305(1999))的多種亞型。例如，斷裂后-脯氨酸二肽鍵的任意的酶都是一種DPP-IV亞型。本領域技術人員很容易即可知道DPP的很多亞型。不是所有亞型都已經在此鑒定出來了。僅用于說明但非限制性地，DPP-IV亞型包括但不限于DPP-IV;DPP-IV的各種唾液酸化形式；膜結合型DPP-IV;可溶性DPP-IV;和任何的二肽基肽酶IV活性和/或結構同系物(DASH)，例如seprase、成纖維細胞活化蛋白ct、DPP6、DPP8、DPP9、attractin、N-乙酰化-a-連接的-酸性二肽酶I、II和L，休眠細胞脯氨酸二肽酶、胸腺-特異性絲氨酸蛋白酶和DPPIV-3。可以測定的DPP參數包括量、濃度、活性、表達或者翻譯后修飾的量或類型。DPP的"量"包括DPP的存在、不存在或量。DPP的"活性"包括酶活性包括特異性活性的存在、不存在、量、程度或速率。DPP的"表達"包括DPP表達的存在、不存在、速率或量。DPP的"濃度"為在一個部分中存在的每個單位體積的DPP亞型的量。可以直接或間接測定DPP參數，可以是定性或定量的。可以用可以定性或定量測定DPP活性的任何測定方法來測定DPP活性。適合測定DPP活性的測定方法包括檢測DPP水解產物的存在或量對可檢測的標記底物的活性的測定。標記物可以是可直接或間接檢測的，可以是熒光的、化學發光的、色度的或放射性的。熒光標記物包括7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)和7-氨基_4-三氟甲基香豆素(AFC)。本領域技術人員將會理解，信號的檢測模式將取決于測定中使用的精確檢測系統。檢測系統可以檢測質量的改變，氨基酸序列或肽長度的改變、產色改變或熒光改變。在本領域所述的范圍廣泛的檢測方案中，該檢測方法可以使用次級檢測方案，包括產生可檢測改變的次級酶反應。例如，如果使用放射標記的檢測試劑，可以使用某種技術測定該信號，其中該技術能夠定量生物樣品中的信號或將生物樣品中的信號與參照樣品中的信號相比較，例如是閃爍計數、放射自顯影(典型地與掃描光密度測定法組合)等等。如果使用化學發光檢測系統，那么典型地使用光度計檢測信號。如果使用熒光檢測系統，可以用熒光分度計測定熒光。由檢測系統檢測信號的方法是本領域公知的。在一些實施方案中，DPP活性是通過檢測DPP對于可檢測標記底物作用而產生的水解產物的存在或量的測定來測定的。可以用檢測任何可檢測的標記底物的水解的測定來測定DPP-IV活性，其是由DPP-IV,即X-Y-R催化的，其中X是任意的氨基酸；Y是Pro(脯氨酸)、Ala(丙氨酸)或Arg(精氨酸)；和R是任何直接或間接可檢測的標記物。可以用定性或定量測定一種或多種DPP亞型的量的測定方法來測定DPP的量。適合測定DPP的量的測定方法包括但不限于，蛋白印跡分析、蛋白質分光光度法、放射性免疫測定、竟爭性結合測定和ELISA測定。在該方面，對于一種或多種DPP亞型具有特異性的抗體是特別有用的。可以用定性或定量測定一種或多種DPP亞型濃度的任何測定方法來測定DPP的濃度。適合測定DPP濃度的測定方法包括蛋白18印跡分析、蛋白質分光光度法、放射性免疫測定、竟爭性結合測定和ELISA測定。在該方面，對于一種或多種DPP亞型具有特異性的抗體是特別有用的。可以用定性或定量測定一種或多種DPP亞型表達的任何測定方法來測定DPP表達。適合測定DPP的表達的測定方法，一般檢測DPPmRNA或蛋白質，并包括RNA轉移分析和蛋白質印跡分析或其變形(例如，FarWestern分析、微陣列芯片)。可以用定性或定量測定一種或多種DPP亞型^^飾的任何測定方法來測定翻譯后修飾的類型或程度。適合測定翻譯后修飾的類型或程度的測定方法包括凝集素結合、蛋白印跡分析、蛋白質分光光度法、放射性免疫測定、竟爭性結合測定和ELISA測定。可以測定一種或一種以上的參數。例如，可以測定單個參數(例如，量、濃度、活性、表達、翻譯后修飾的量或類型)。可替代地，可以測定兩種或更多種參數，例如量和濃度，量和活性，量和表達，濃度和活性，濃度和表達，或者可以測定活性和表達。同樣，可以測定量、活性和表達；量、濃度和表達；或濃度，活性和表達。如果取兩個或更多個測定值，可以同時或連續測定它們。例如，可以同時測定量和活性。可替4戈地，可以在測定活性前或后測定量。如果取三個或更多個測定值，可以同時或連續測定它們。例如，可以在測定翻譯后修飾的類型和活性前測定量，其中同時測定翻譯后修飾的類型和活性，或者彼此同時或連續測定量、翻譯后修飾的類型和活性。同樣，如果取更多個測定值，可以彼此同時或連續測定它們，或者以各種可能的方法分組測定，以使得相對于每個其他組，同時或連續測定各個組。換句話說，可以以因素或分配方式將每個測定值分組，可以相對于所有的其他組同時或連續測定每個組。除了多個測定值，不管一種還是多種參數，可以不止一次，即重復地采用任何所給予的患者樣品的任何給定的測定值。此外，可以采用各部分的測定值的任意組合。例如，可以測定一個、一些或所有部分的一種參數。同樣，可以測定一個、一些或所有部分的一種以上的參數。可以測定一個或一些部分的一種參數，而測定其他或所有部分的另一種參數。例如，可以僅測定一個部分的量，同時可以測定所有部分的活性。例如，可以僅測定一個部分的活性，同時可以測定所有部分的量。當測定一種或多種DPP參數時，可以將患者樣品分成很多的等分部分，各個部分用于測定不同的DPP參數或進行重復的測定。另外地或可替代地，每個可區分的DPP部分可以分為很多的等分部分，用于測定不同的DPP參數或重復測定。重復測定對于本發明的方法并不是必要的，但是本發明的很多實施方案都使用了重復試驗，特別是重復兩次和重復三次的試驗。可替代地，可以使用能夠在單個測定中測定不同DPP參數的個體水平的測定方法測試患者樣品或其等分部分以在單個反應中確定多種DPP參數的水平，其中單個測定是例如排列型測定或使用多種檢測技術的測定(例如，使用用不同熒光染色標記物標記的檢測試劑的測定)。本文使用的術語"與DPP有關的疾病或病癥"涉及那些特征在于一種或多種特定的可測定的DPP參數不同的疾病或病癥。與DPP有關的疾病或病癥并不必然是由DPP的改變導致的，但是可以通過測定一種或多種DPP參數來診斷或監測。與DPP有關的疾病狀態和病癥包括，但不限于代謝性疾病、自身免疫性疾病、癌癥和病毒感染。本文使用的術語代謝性疾病是代謝障礙，包括后天和遺傳性疾病。在Harrison'sPrinciplesofInternalMedicine中描述了很多這樣的疾病。一般地，代謝性疾病分為三個主要的類型糖原積累病(即，影響糖代謝的那些疾病，例如II型糖尿病)，脂肪酸氧化性疾病(即，影響脂肪組分代謝的那些疾病，例如法布里病)和線粒體性疾病(即，影響線粒體的那些疾病，例如Leigh綜合征)。可以用本發明檢測的代謝性疾病狀態包括但不限于II型糖尿病、低血糖癥、高血糖癥、格雷夫斯病、柯興綜合征、尿黑酸尿癥、白化病、組氨酸血癥、高鳥氨酸血癥、威爾遜病、泰-薩克斯病、尼曼-皮克病、克臘比病、佩吉特病、楓糖尿癥或苯丙酮尿癥。在一個示例性的實施方案中，DPP是DPP-IV，該疾病是II型糖尿病。可以用本發明檢測的自身免疫性疾病包括但不限于類風濕性關節炎、扁平莒蘚、牛皮癬、葡萄膜炎、溶血性貧血、風濕熱、克羅恩病、格-巴二氏綜合征、牛皮癬、甲狀腺炎、格雷夫斯病、重癥肌無力、腎小球腎炎、自身免疫性肝炎或全身性紅斑狼瘡。在某些實施方案中，自身免疫性疾病是牛皮癬、類風濕性關節炎或扁平苔蘚，DPP是DPP-IV。可以用本發明檢測的癌癥包括但不限于原發和轉移性實體瘤和下列部位的癌癥乳腺；結腸；直腸；肺；口咽；喉咽；食管；胃；胰臟；肝；膽嚢；膽管；小腸；尿道包括腎、膀胱和尿路上皮；女性生殖道包括宮頸、子宮、卵巢，絨毛膜癌和妊娠性滋養層細胞病；男性生殖道包括前列腺、精嚢、睪丸和生殖細胞瘤；內分泌腺包括曱狀腺、腎上腺和腦垂體；皮膚包括血管瘤、黑素瘤、起源于骨或軟組織的肉瘤以及卡波西肉瘤；腦、神經、眼和腦膜的腫瘤包括星形細胞瘤、神經膠質瘤、惡性膠質瘤、視網膜母細胞瘤、神經瘤、成神經細胞瘤、神經梢瘤和腦膜瘤；起源于造血惡性病例如白血病的實體瘤，包括綠色瘤、漿細胞瘤、革樣霉菌病的斑塊腫瘤以及表皮T細胞淋巴瘤/白血病；淋巴瘤包括Hodgkin,s和非一Hodgkin,s。可以用本發明檢測的病毒感染包括但不限于由對于人和其他動物是致病性的病毒類導致的感染，例如腺病毒科、雙核糖核酸病毒科、布尼亞病毒科、日冕型病毒科、黃病毒科、皰疹病毒科、正粘病毒科、乳多空病毒科、微小病毒科、微小核糖核酸病毒科、呼腸孤病毒科、逆轉錄病毒科(例如，HIV)、彈狀病毒科或披膜病毒科。在某些實施方案中，DPP是DPP-IV，病毒性疾病是HIV。本文使用的術語"患者"是指任何需要進行與DPP有關的疾病狀態或病癥的診斷、預后、疾病進程監測或風險評估的活體，其中患者具有與DPP表達有關的生理學。這些患者包括但不限于，人、21高級靈長類動物、其他哺乳動物(例如，家養哺乳動物例如，貓、狗和馬，嚙齒類動物例如大鼠和小鼠，以及野生動物例如獅子、老虎和熊)、鳥類(例如，雞、鸚鵡)及其他動物。本文使用的術語"患者樣品"或"生物樣品"是指從可以期望包含目標酶的患者中取用或來自所述患者的任何樣品，包括細胞和無細胞樣品。患者樣品包括但不限于組織，例如肌肉、肝、肺、脾臟、脂肪、乳房和腫瘤組織；血液和血液制品，例如全血、血漿、血清和血細胞；以及其他生物液，例如尿、唾液、淚、粘液、羊水、腦脊液、關節液和精液。患者樣品也可以包含液體和/或組織的組合。樣品可以是通過任何臨床可接受的方法例如靜脈穿刺、腰推穿刺、羊膜穿刺和組織活檢從患者中獲得的。盡管可以直接使用從患者獲得的樣品，但是本發明的一個方面關注的是在區分DPP為各部分(例如，將可區分的DPP亞型區分成各個部分)或測定DPP參數前處理樣品。處理方法包括但不限于，勻化、稀釋、濃縮、聲處理、冷凍、與防腐劑或其它試劑混合，或其組合。此外，可以處理包含其中期望DPP是膜結合的細胞或其他組織的樣品，以從細胞膜中釋放DPP，這樣就允許將其用于本領域認可的用于從樣品中分離/隔離蛋白質/酶的任何方法。釋放膜結合的蛋白質的方法是本領域公知的，包括冷凍/融化、勻化、聲處理以及從膜中進行活性酶的化學或酶性釋放。在一些例子中，將患者樣品收集在容器中，該容器包含EDTA、蛋白酶抑制劑或者一些其他適合運輸、防腐和處理生物樣品的組分。當患者樣品由液體構成時，處理可以包括排除有核和/或無核細胞例如血樣中的紅細胞、白細胞和血小板(例如為了獲得血漿)的方式，或者也可以包括排除某些蛋白質例如從血中排除某些凝固級聯蛋白(例如，為了獲得血清)。例如，可以將血收集在含有肝素、檸檬酸鹽或蛋白酶抑制劑的容器中，或者在收集后與肝素、檸檬酸鹽或蛋白酶抑制劑接觸。其他處理可以包括濃縮或稀釋樣品，以，例如在區分或測定前將總蛋白質含量標準化。進行這些操作的方案是本領域公知的。在將所測定的DPP參數與疾病狀態或病癥進行關聯后，可以將結果傳達給操作者。結果包括疾病狀態或病癥的存在、不存在或嚴重度。"操作者"可以是醫生、護士、醫生助手、醫療技師、實驗室技術人員、或操作進行本發明的一個或多個步驟的機器或裝置的任何人，或接受診斷或預后信息的任何人，包括患者。例如，診斷或預后信息可以通過傳真、電話、文件傳遞或電子郵件自動傳達給患者或患者的代表。可以通過電話、文件傳遞、電子郵件或傳真使用傳遞結果的任何方法，包括但不限于，在介質例如電子屏、數碼屏或可印刷底物中顯示疾病狀態；產生可聽的信號例如蜂鳴聲、鈴聲、電產生的聲音或記錄的聲音。可以在測定任何DPP參數前或同時部分或完全將DPP亞型區分成各DPP部分。例如，假設在樣品中存在兩種以上類型的DPP亞型，可以將該亞型僅區分成兩個部分，一個部分包含一種以上類型的亞型(即，部分區分)；或可以將亞型區分成其中每個部分僅包含一種類型的亞型(即完全區分)的部分。同樣，可以將亞型部分區分為兩個或更多個部分，一個部分僅包含一種類型的亞型，另外的部分包含一種以上類型的亞型。可以通過任何方法包括物理分離或隔離或者其他鑒定或區別各個亞型的方法來區分DPP部分。例如，區分可以基于生化性質和動力學性質的差異，其中生化性質是例如電移動性或等電點(pi);熱穩定性；分子量；氨基酸序列，在一級結構不同的亞型的情況中；抗體親和力或親和性；翻譯后修飾的程度或類型；動力學性質是例如Kn或速率常數。可以使用對于不同DPP亞型具有特異性的抗體或凝集素來物理分離各DPP部分，或不經物理分離而區別各部分。例如，可以將對于不同DPP亞型具有特異性的抗體載有不同的可檢測標記物，無需物理分離即可區分各部分。可替代地，可以將抗體在栽體或柱使用，以將不同的DPP亞型物理分離成各個部分。分離方法包括等電聚焦，其基于PI分離；電泳法，在基質例如凝膠或過濾器或無凝膠，可以基于電荷和/或分子量區別；對亞型具有親和力的凝集素結合的程度或凝集素的種類；抗體結合；以及親和或大小區別色譜法。本文使用的術語"等電點"(PI)是分子不栽有凈電荷時的pH。PI也稱作等電點pH。因此，根據本申請的目的，術語"PI"和"等電點pH"可以互換使用。在一個示例性的實施方案中，該DPP部分是基于PI區分的，該特異性的DPP是DPP-IV。等電聚焦的方法包括自由流動電泳、等電聚焦電泳或色鐠聚焦或其他固相介導的，由隨通過固相的時間而pH改變的緩沖系統的流動而推進的分離。在等電聚焦電泳中，將感興趣的樣品注射或直接用于凝膠平板、過濾器或其他包含固定的pH梯度的其他介質中。pH梯度平行于電場的方向延伸，通過向一個方向的移動將樣品中的蛋白質彼此分開，在達到等于其PI的pH環境以前使其通過不同的pH環境。當蛋白質已經達到其PI時，它將會固定在基質物內。在這時，可以從基質物中獲得樣品，并用于進一步的測定，例如十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)(Zuo等人，AnalyticalBiochem.284:266-278(2000))，在平面片上進行的次級大小分離(Becker等人，J.Micromech.Microeng.8:2428(1998))，檢測酶活性的測定例如焚光比色法，或適合測定任意DPP參數的測定。自由流動電泳是一種不使用傳統電泳的固體基質例如丙烯酰胺凝膠，或在色鐠中使用的分離相的電泳法。作為代替，根據電荷和/或在連續層流中的電泳遷移率或在垂直于流動方向使用電場中的緩沖溶液來分離分析物。24進行自由流動電泳的機器的一個例子是BD自由流動電泳系統(BectonDickensonmodel#441117)。使用該系統時，將可區分的樣品收集在分離槽末端的96毛細管中，這允許進行連續分段分離以流入到收集分開中，其中流出物保持物理分離成多個部分。該方法適合通過至少三種分離原理來分離樣品等電聚焦(IEF)、分段電泳(ZE)和等速電泳(ITP)。當收集后，各部分可以通過在等電聚焦后使用的所述的任何測定，即SDS-PAGE、在平面片上的次級大小分離和酶活性測定來進一步測定。區分和測定并不限于任何特定的順序。可以在參數測定前或后進行區分，或者與測定同時進行。例如，可以用方法例如電泳將特異性的DPP物理分離成各部分，然后可以測定一些或所有部分的一種或多種參數。可替代地，當同時進行測定和區分時，可以通過下列方法將特異性的DPP區分成各部分，例如將患者樣品與對不同DPP亞型具有特異性的抗體接觸，將每個抗體與不同的可檢測標記物連接，可以測定可檢測標記物的信號。在另一個實施方案中，可以用雙重檢測系統來區分各部分或亞型。例如，可以將DPP亞型和與固相結合的抗體接觸，其中抗體與所有或大部分DPP亞型和對于較小部分的DPP亞型具有特異性的一種或多種抗體或凝集素結合。每個更特異性的抗體或凝集素都包含一種獨特的可檢測的標記物。該亞型可以與抗體或抗體和凝集素同時接觸，或者以任意順序接觸，例如，與結合抗體接觸，然后與更特異性的抗體/凝集素接觸，或者先與更特異性的抗體/凝集素接觸，然后與結合抗體接觸。DPP可以區分為兩個或更多個部分。部分的數目取決于所期望的區分程度和所使用的區分方法。對于DPP可以區分的部分的數目并沒有限制，但是例如，DPP可以區分成2或更多個部分，例如2，3,4，5，6，7，8，9，10，11，12，18,24，36，48，96,100，200，300，384,400，500或1536個部分。例如，在一些實施方案中，方便地將DPP亞型區分為例如96個部分，以在標準的96孔板中進行處理和參數測定。為了完全區分亞型，每個DPP部分應當不包含一種以上的DPP亞型，一些部分可以不包含DPP亞型。為了部分區分亞型，至少一個DPP部分應當包含一種以上的DPP亞型，而其他部分可以不包含DPP亞型、一種DPP亞型，或一種以上的DPP亞型。在本發明的某些實施方案中，可以在一個以上的時間點從個體獲得患者樣品。這種"系列"取樣非常適合在典型的醫學異常情況發生前確定疾病的早期發作，因此促進了早期的補救性治療策略，產生了更有效的疾病管理或者甚至避免了疾病。這種系列取樣也非常適合本發明涉及監測患者的疾病例如II型糖尿病進程的方面。這尤其可以用于評價任何患者所經受的與疾病有關的治療的有效性。系列取樣或重復取樣也可以用于確定發生該疾病或病癥的個體風險。可以以任何期望的時間線例如每小時、半日、每日、每周、每月、每季度(即，每三個月)、每半年、每年、每兩年或頻率更小來進行系列取樣。可以每次測定一個新樣品來進行測定水平和對照水平之間的比較，或者可以保留與水平相關的數據以用于頻率更小的測定。優選離體或在體外進行測定或區分。在一個實施方案中，離體進行測定和區分。本領域技術人員將會理解，本文所述的方法可以包括測定多種DPP或非-DPP參數(其可以是或可以不是與疾病有關的參數)中的任意一種來確定患者樣品的完整性和/或性質。例如，雌激素水平(一般在女性中更高)可以測定作為性別標記，或者其他的化學血液測定項目例如膽固醇水平。可以測定其他與疾病有關的非-DPP參數，以證實診斷或預后。在一些實施方案中，該非-DPP參數是血紅蛋白A1C水平，該疾病是糖尿病。血紅蛋白A1C水平低于全部血紅蛋白的7%表明沒有患糖尿病；水平高于全部血紅蛋白的7%表明存在糖尿病。可以在DPP參數前或后測定非-DPP參數，或者可以同時測定。為了將所測定的DPP參數與疾病狀態或病癥關聯，可以將所測定的DPP參數與參考值，即標準值或內對照值對比。與參考值相比，DPP參數分別或累加地升高、降低或移動，不管是陽性或陰性，都可以與疾病狀態相關聯。可替代地，該可區分的酶的一個部分的DPP參數可以與可區分的酶的另一個部分的參數相比較，或者它可以與兩個或更多個可區分部分的總測定值相比較。當然，所測定的參數應當與對應的參數相比較。例如，如果所測定的是DPP的量，那么該DPP的量的值應當與參照物或其他部分的DPP的量的值相比較。如果如果所測定的是DPP的表達，那么它應當與參照物或其他部分的DPP的表達相比較。在一些實施方案中，測定連續范圍的各部分的參數。例如，對于基于等電點分離的亞型，可以測定在鄰近pH或等電點分離的兩個或更多個部分的一種或多種參數。可以獲得連續范圍的各部分內的所測定參數(群)的特性。可替代地，可以基于測定非連續范圍的各部分來獲得所測定參數(群)的特性。該特性可以基于所有部分，或者它可以基于各部分的子集。可以在4艮多部分兩兩間和多者之間<坎出的以確定與疾病狀態的關聯的各種比較是很多的。分析所測定的參數的數據或將該數據與其他數據比較的技術是本領域技術人員公知的。因此，所有這些技術都不會在本文中詳細討論。分析數據以引申出所期望的結論(即，疾病狀態存在或不存在)的一種示例性的技術通過參考附圖14中的圖來進行說明。在附圖14中，y軸代表DPP參數[例如，活性、表達、量、濃度、翻譯后修飾的類型或量]。X軸代表區分的大小(例如，PI、pH或亞型類型)。關于該圖，突出顯示了三個區域，區域"a"、區域"b"和區域"c"。對于每個區域，可以測定一個范圍內的總測定值(例如，一個給定范圍的曲線下面積)，給出值"a"和"b"，總值"c"。可以測定的其他值包括范圍內的峰值，在一個范圍內達到峰值的點，在該范圍內任意點(例如在特定PI或pH下)的特異性活性，所測定的參數提高或降低時的點(例如，拐點)，與其他測定值相比所測定的參數隨x軸的改變，及其任意組合。可以根據通過測定連續范圍的各部分獲得的曲線去來計算該值，或者可以根據單個或多個部分的測定值來計算它們。為了將疾病狀態與一個測定值相關聯，我們可以比較范圍"a"的值和范圍"b"的值；范圍"a"的值和范圍"c"的值；范圍"b"的值和范圍"c"的值；范圍"a"的值和內對照值或標準值；范圍"b"的值和內對照值或標準值；和/或范圍"c"的值和內對照值或標準值。可替代地，可以得到與區分的給定大小有關的任意范圍或任意比例的定量測定值中的各個定量測定值，并與已知的參照值或這些測定值的范圍相比較，通過臨床試驗確定的參照范圍提供了確定疾病存在、不存在或嚴重度的標尺。定量測定也可以通過加入內或外標物，將其與可以用于將定量讀數標準化以預先確立參照范圍的區分大小(例如亞型區分)同時或按順序進行。本文使用的術語"標準值"是指從一部分人群獲得的一個值，一般是一個平均值、中位值或平均值。標準值可以是陽性標準值或陰性標準值，可以由年齡匹配的人群中獲得。年齡匹配的人群(可以獲得標準值)與受試個體年齡相當，但是年齡大概匹配的人群也是可接受的。年齡大概匹配的人群與受試個體的年齡的差別可以在1-20年內，包括約1,約5,約10，約15或約20年，或者可以是包括受試個體年齡的不同年齡的組。年齡大概匹配的人群可以提高2,3，4，5，6，7，8，9或10年(例如，用作62歲個體的標準值來源的"提高5年組"可以包括58-62歲的個體，59-63歲的個體，60-64歲的個體，61-65歲的個體或62-66歲的個體)。陽性標準值是從具有特定疾病狀態的人群獲得的某種值，例如平均值。陰性標準值是從不具有特定疾病狀態的人群獲得的某種值，例如平均值。本文使用的術語"內對照值"是指從其疾病狀態已知的單個患者或一組患者的一個或多個樣品獲得的值。內對照值可以是陽性對照值、陰性對照值或相同患者的對照值。例如，內對照值可以是來自具有特定疾病狀態的一個或多個患者的陽性對照值；或者它可以是來自具有特定疾病狀態的一個或多個患者的陰性對照值。最后，內對照值可以是從診斷的患者，來源于不同身體位點(即，血vs.肝)的樣品，在不同時間測定疾病進程而獲得的，或者是在測定前從不同進程的兩個或更多個樣品獲得的，或者是收集在相同類型或不同類型的分開的容器[例如，兩個EDTA血漿管或一個EDTA血漿管和一個血清管]中的值。內對照值可以與要診斷的患者的測定值并發或同時獲得，或者可以在其他某個時間獲得。測定值之間或測定值和參照值之間的比較結果用于診斷或用于疾病的診斷或預后，根據疾病的嚴重度將患者分層，或者在特定患者中監測疾病的進程。因此，如果比較表明測定值和暗示/指示疾病的參照值之間有差異(即，升高或降低)，那么就有助于或可以做出適當的診斷。相反，如果所測定的水平與參照水平的比較不能出現提示或指示疾病診斷的差異，那么就不能有助于或做出適當的診斷。當測定一種以上的與疾病有關的DPP參數但各種測定值不能一致提示或指示疾病的診斷時，使用"多數的"提示或指示(例如，當該方法使用4種與疾病有關的DPP參數時，其中三種提示/指示疾病)。這樣的結果可以認為是提示或指示個體疾病的診斷。可以以任何適合所討論的與糖尿病有關的DPP參數的測可以用定量或定性測定技術來進行"測定"，根據所使用的測定技術，比較測定值和參照值的方式可以不同。例如，當使用定性分析來測定DPP活性水平時，可以通過視覺比較熒光反應產物的完整性，或通過比較分光光度計的數據(例如，比較來源于測定裝置的數字數據或圖形數據，例如直方圖)來比較該水平。但是，期望的是，在本發明的方法29中使用的測定值最常見的是定量值(例如，濃度的定量測定值，例如每毫升樣品的DPP亞型毫微克數，或絕對量)。在另外的例子中，測定值是定性的。當定量測定時，可以通過檢查數字數據，以及通過檢查數據的圖(例如，檢查圖表例如直方圖或線圖)來進行比較。比較方法可以是手動的(例如，通過醫生的視覺檢查方法)，或者可以是自動的。例如，試驗裝置(例如測定化學發光信號的光度計)可以包括電路系統和能使其比較DPP參數的測定值和參照值的軟件。可替代地，可以使用單獨的裝置(例如，數字計算機)來比較測定值和參照值。用于比較的自動裝置可以包括儲存所測定的與疾病相關的DPP參數的參照值，或者它們可以比較測定值和來源于同時測定參照樣品而得到的參照值。在一些實施方案中，本發明的方法在所測定水平和參照水平之間使用"單一"和"二元"比較，例如，所測定水平和參照水平之間的比較確定了所測定水平是否高于還是低于參照水平。在一些實施方案中，值之間的任何差異都可以指示疾病。如本文所述，可以定量(絕對值)或定性(相對值)測定參數。用于給定評價的代表性的與疾病有關的DPP參數水平可以重疊或不重疊。如本文所述，對于一些實施方案，定性數據表示給定水平的疾病狀態(輕度、中度或重度)，在另外的實施方案中，定量數據表示給定水平的疾病狀態。在本發明的某些方面，進行比較以確定測定值和參照值之間的差異大小，例如比較測定值和參照值之間差異的"倍數"或百分比。比某些最小倍數差異低或高約2倍的倍數差異提示或指示，例如存在疾病。確定倍數差異，通過測定DPP的絕對量、濃度、活性或表達，并與參照物的絕對值相比較，或者測定倍數差異，通過確定參照值和樣品值的相對差異，其中這兩種值都不是絕對量、濃度、活性或表達的測定值，和/或這兩種值是同時測定的。可替代地，可以在試驗數據本身內來測定倍數差異，例如比較"a"和"c"的倍數差異，以及比較"b，，和"c"，或測定系統內可測定參數的任何其他比率。因此，提示或指示特定診斷的測定值和參照值之間的差異大小將取決于用于產生測定值和參照值的所測定的特定參數。如本文所述，將由通過pi分離的連續范圍的DPP-IV亞型獲得的DPP-IV活性特性和II型糖尿病的存在、不存在或嚴重度進行關聯。該關聯是用于II型糖尿病的診斷或預后方法，該方法包括測定患者樣品中可區分的DPP-IV部分的一種或多種DPP-IV參數，并將所測定所述DPP-IV參數與患者中II型糖尿病的存在、不存在或嚴重度關聯。在一些實施方案中，DPP-IV參數是DPP-IV活性。在一些實施方案中，DPP-IV部分是基于pi區分的。可以將DPP-IV參數與一組標準值或內對照值相比較。陰性組標準值或陰性內對照值的任意差異與糖尿病的存在或嚴重度有關。所測定DPP-IV參數和陰性參照值之間的差異程度越高，預后就越嚴重。同樣，陽性組標準值或陽性內對照值的任意差異與糖尿病的不存在有關。如上述討論，參數包括活性、量、表達或濃度。可以通過本文所述的任何特征或方法來區分各DPP-IV部分。在示例性的實施方案中，各DPP-IV部分是基于pi區分的。在一些實施方案中，通過自由流動電泳分離各DPP-IV部分。附圖10顯示的是一個健康者和一個糖尿病患者的血漿中pi可區分的各DPP-IV部分之間的DPP-IV活性特性的比較。本發明人已經表明，在糖尿病患者中，DPP-IV活性特性向較高pH移動。任意健康者在任一點或任何點的DPP-IV活性特性值的任意差異如所示，或者將在任一點或任何點群由內陰性對照物或組標準物獲得的值的任何差異可以與糖尿病相關聯。因此，DPP-IV活性特性由本文所示的任何陰性標準值或組陰性標準值向更高PH移動指示了糖尿病。同樣，DPP-IV活性特性由內陰性對照值向更高pH移動指示了II型糖尿病。活性特性的移動越顯著，疾病越嚴重。可以通過所討論的pi范圍內的最極端的亞型的測定值來表示與健康樣品或組"相反"的極端測定值有關的陽性標準值。確定31此陽性標準值，可以通過例如，用化學或酶方法處理患者樣品以完全除去所有的糖基化物，完全沒有任何糖基化物代表與典型的健康樣品所包含的亞型差距最大的可測定亞型條件。應當注意的是，該處理導致的極端亞型并不是實際上可能存在于實際的樣品中，但是仍然可以出于提供用于測定的可測定對照值的目的而用于確定pH最大可能的范圍。作為替代，該"極端"陽性亞型可以是外對照物，可以分開測定或在摻入到要分析的樣品中后測定。在一些實施方案中，這樣的陽性對照物也可以用于幫助將所得到的樣品測定值標準化。活性的"移動"是指在一個或多個DPP-IV部分中DPP-IV活性的任何差異。例如，在一個可區分部分中DPP-IV活性的測定值可以與參照值不同，或者在一些或所有部分中它可以都不同。DPP-IV活性水平的趨勢，例如在更高pH下活性更高，對于檢測II型糖尿病是特別有用的。當基于pi來區分DPP-IV時，糖尿病患者和健康者也顯示了DPP-IV活性特性的兩個主峰。糖尿病患者在約pH4.4和約pH4.8處顯示峰。這些峰中的每個都與pi可區分的亞型的總測定活性的約10%有關。健康患者在約pH3.9和約pH4.l處顯示峰。"峰"是指所有測定值中少數局部極限值中的一個。每個值都與可區分部分相關。峰值可以與一個可區分部分或一組可區分部分相關。因此，該值可以是單個可區分部分的不連續的值或者是一個范圍的可區分部分的不連續的值的總體。例如，該值作為可區分部分的函數的特性可以僅包含一個峰，或者它可以包含一個以上的峰。一般地，僅僅最高的第1,2，3,4或5個值可以認為是峰。任選地，例如，峰可以是優選多個鄰近值的特征或附近的相關值，其中所述值從一個高點改變成某一下落數量值。因此，在或約pH3.9和/或在或約pH4.1下pi可區分的DDP-IV亞型的DPP-IV活性的最大峰與糖尿病的不存在相關。同樣，在或約pH4.4和/或在或約pH4.8下pi可區分的DDP-IV亞型的DPP-IV活性的峰與糖尿病的存在相關。為連續范圍32的DPP-IV的總測定活性的至少約10%的峰對于糖尿病的存在是特別有用的。在或約pH4，4和/或pH4.8下的峰越高，診斷越嚴重。附圖11的圖顯示的健康者和糖尿病患者的pi可區分的亞型的累積DPP-IV活性特性。圖中的每個點代表總活性的累積百分比，其是連續范圍的可區分亞型的pH升高的函數。如前面所解釋，可以通過分離成分散的可區分部分來區分DPP亞型，其中每個部分與特定窄范圍的pH相關。附圖12顯示的是個體患者的pi可區分的DPP-IV部分的累積活性達到所測定范圍的總活性的90%時的pH，概括了從酸性開始到所測定的pH范圍的可區分的亞型部分的活性。在和約pH4.2以下，健康者的可區分亞型達到了90%DPP-IV活性。相反，在和約pH4.4以下，糖尿病患者的可區分亞型沒有達到90。/。DPP-IV活性。患病者的累積DPP-IV活性沒有達到總累積DPP-IV活性的90%,直至將可區分亞型置于甚至更高的pH下。因此，可以用樣品中pi可區分的DPP-IV部分的累積活性達到樣品總活性90%時的pH將DPP-IV活性-測定值與疾病相關聯。因此，如果與在和約pH4.4以下的pH范圍有關的等電點處在可區分的亞型中存在的連續范圍的所有測定部分的總DPP-IV活性的百分比不超過約90%,那么就檢測到了糖尿病的存在。如果與在和約pH4.4以上的pH范圍有關的等電點處在可區分的亞型中存在的連續范圍的所有測定部分的總DPP-IV活性的百分比是至少約10%，那么就檢測到了糖尿病的存在。達到90%活性時pH比pH4.4更高，則表明預后更嚴重。如果與在和約pH4.2以下的pH范圍有關的等電點處在可區分的亞型中存在的連續范圍的所有測定部分的總DPP-IV活性的百分比是至少約90%，那么就檢測到不存在糖尿病。如果與在和約pH4.2以上的pH范圍有關的等電點處在可區分的亞型中存在的連續范圍的所有測定部分的總DPP-IV活性的百分比不超過約10%，那么就檢測到不存在糖尿病。附圖13顯示的是個體患者的pi可區分的DPP-IV部分的累積活性達到總活性的60°/。時的pH，概括了從酸性開始到所測定的pH范圍的亞型的活性。在約pH3.9，健康者達到DPP-IV活性的60%。相反，糖尿病患者達不到DPP-IV活性的60%,直至約pH4.15及以上。患病者的累積DPP-IV活性沒有達到總累積DPP-IV活性的60%，直至將可區分亞型置于甚至更高的pH。因此，可以用樣品中pi可區分的DPP-IV部分的累積活性達到樣品總活性60%時的pH將DPP-IV活性-測定值與疾病相關聯。因此，如果與在和約pH4.15以下的pH范圍有關的等電點處在可區分的亞型中存在的連續范圍的所有測定部分的總DPP-IV活性的百分比不超過約60%,那么就檢測到了糖尿病的存在。如果與在和約pH4.15以上的pH范圍有關的等電點處在可區分的亞型中存在的連續范圍的所有測定部分的總DPP-IV活性的百分比是至少約40%，那么就檢測到了糖尿病的存在。達到60%活性時pH比pH4.15更高，則表明預后更嚴重。如果與在和約pH3.9以下的pH范圍有關的等電點處在可區分的亞型中存在的連續范圍的所有測定部分的總DPP-IV活性的百分比是至少約60°/。，那么就檢測到不存在糖尿病。如果與在和約pH3.9以上的pH范圍有關的等電點處在可區分的亞型中存在的連續范圍的所有測定部分的總DPP-IV活性的百分比不超過約40%,那么就檢測到不存在糖尿病。實施例1使用自由形式的電泳(FFE)(BDTM自由流動電泳系統)，基于電荷分離蛋白質，將DPP-IV的亞型分成各部分并表征。優選分離蛋白質亞型來檢驗特異性修飾對于活性的作用。活性測定表明特異性活性的提高與亞型pi的升高相關。這提示，翻譯后修飾在DPP-IV活性的調節中發揮作用。FFE可以促進進一步的關于酶修飾和疾病狀態關系的研究。如下使用BDTM自由流動電泳系統來進行FFE:將從Sigma獲得的豬DPP-IV(1-100mg)在pH適當的分離介質中稀釋(一般1:5)。然后將稀釋后的蛋白質負載到BeetonFFE室的最大的負極進樣口中，然后使用1200-1500V和20-25mA來分離，使用3-10的pH梯度，分離介質的流速是約60mL/小時。如下進行活性測定將45iu1的測定緩沖液(IOOmMTris-Cl[pH8.0];0.05%v/vDMSO)加入到5u1蛋白質樣品中，從Tinitial測定熒光的增加。將活性表達為在30^C下由底物Gly-Pro-AMC(250juM)的水解導致的相對焚光單位(RFU)/分鐘的增加。結果如附圖2A和2B所示進行蛋白質的胰蛋白酶消化，包括在PAGE(IEF)或SDS-PAGE后將可見的SyproRuby染色帶刪除，隨后根據試劑盒的介紹(Pierce/Sigma)來消化。如下進行基質-輔助激光解析/電離(MALDI)MS:提取"在凝膠中"消化的肽(如直接的)，并用ZipTip吸管端(Millipore)清潔。將消化的肽以1:1與基質(ot-氰基-4-羥基肉桂酸的60%乙腈的飽和溶液)混合，并在不銹鋼耙(BrukerDaltonics)上噴點。開始時的基質-輔助激光解析/電離飛行時間(TOF)肽質量指紋分析(PMF)用于在TOF/TOF鑒定特異性肽(都使用Mascot)后鑒定消化的蛋白質。結果如附圖4A和4B所示。實施例2在實施例2中描述的實驗是按照與實施例l相同的方案進行的，除了蛋白質樣品來源于健康者的人血漿。人血漿樣品(EDTA抗凝血劑)來自兩個個體，如實施例1所述將DPP-IV亞型分離成各個部分。如實施例1所述測定活性。檢查DPP-IV活性的模式，以觀察是否存在與豬的DPP-IV亞型類似的活性特性。結果存在于附圖6A和6B中。根據附圖6A和6B所報告的結果，可以觀察到，人血漿中DPP-IV活性的延伸類似于在豬的DPP-IV中所見。在較高pH值(最大約pH5.2)下觀察到了活性增強。需要進行精確的蛋白質(DPP-IV)定量來確定特異性活性。通過實施例1和2，證明了可以用FFE(IEF)來分離蛋白質亞型并能夠對所分離的亞型進行生化表征。豬的DPP-IV模型顯示了具有不同特異性活性的多種亞型(用MassSpec鑒定)。當在FFE后分析時，人DPP-IV(在血漿中分離)顯示了類似的趨勢。翻譯后修飾(PTMs)可以在調節DPP-IV的特異性活性中發揮作用。FFE可以促進DPP-IV個體亞型以及其他蛋白質的潛在PTMs的鑒定和推斷。如前所述測定DPP-IV。結果如附圖6A和6B所示，當與豬的DPP-IV實驗結果相比較時，該結果表明，當在FFE后如豬的DPP-IV測定類似地進行測定時，人DPP-IV顯示了類似的活性趨勢。總之，實施例1和2的結果表明，翻譯后修飾(PTMs)可以在調節DPP-IV的特異性活性中發揮作用，FFE可以促進DPP-IV個體亞型以及其他蛋白質的潛在PTMs的鑒定和推斷。實施例3在實施例3中描述的實驗是按照與實施例l相同的方案進行的，除了蛋白質樣品來源于人血漿，以及用3-7的pH梯度進行IEF。具體地，獲得2種肝素化處理的人血漿樣品，一種來源于2型糖尿病患者(血糖水平為538mg/dL)，一種來源于健康者。結果如附圖7和8所示，表明糖尿病樣品顯示了具有更高等電范圍的DPP-IV亞型特性。實施例4通過pi區分4名健康者和5名糖尿病患者的血漿。如下使用BectonTMFFE室進行FEE:將25jiL血漿(l:8稀釋)與25juL甘油、25yL0.08%HPMC、125yL分離緩沖液pH3-7混合。然后將稀釋的蛋白質負載到BectonFFE室的最大的負極進樣口中，然后使用3-10的pH梯度和天然條件，并使用1200-1500V和20-25mA，通過間隔等電聚焦(IIEF)-FFE分離。在IOC下進行IIEF-FFE，駐留時間共64分鐘。使用5分鐘間隔(5分鐘向前，然后5分鐘向后)下緩沖液流速為50mL/小時，共60分鐘。以6000jiL/小時進行點樣，共2分鐘，在點樣期間，介質流速為180mL/小時。在點樣后，使用電壓，將介質流速設置為5分鐘間隔(5分鐘向前，然后5分鐘向后)下為50mL/小時，共60分鐘。在間隔分離后，通過將緩沖液流速提高至300mL/小時，共2分鐘，停止，然后在2分鐘內收集到96孔中來收集樣品。如實施例1所示測定DPP-IV活性。結果如附圖10和11所示。在附圖10中，亮柱代表在每個pi下從一個健康者中獲得的值，黑柱代表在每個pi下從一個糖尿病患者獲得的平均值。在約pH3.9和約pH4.1，在健康者中觀察到兩個主要的峰。同樣地，在約pH4.4和約pH4.8，在糖尿病患者中觀察到兩個主要的峰。糖尿病血漿曲線向更高pH移動，或者向健康者的血漿曲線的右側移動。在本實施例中，第1組是健康的(S04,Sll,S07和S02)，第2組是i貪斷為糖尿病的L205-血糖=~139mg/dL;S09-血糖未知；SOS-血糖-~90mg/dL，用藥物控制患者的疾病；SOI-BG=~150mg/dL;和S139-BG-~350mg/dL。將健康者的血漿分成等分部分，一半用唾液酸苷酶去唾液酸化，剩下的一半作為對照品。在本實施例如上所述的條件下分離每個部分，通過酶測定來測定亞型特性。除去唾液酸導致特性從約pH4.0向約pH5.0移動。結果用附圖9中的直方圖表示。去唾液酸化也導致特異性活性增強了2到3倍，如表1所示。表1.特異性的DPP-IV活性(mU/mg)<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>顯然，過度的唾液酸化降低了DPP-IV的有效性(即特異性活性)。因此，具有不同疾病狀態的患者可以顯示不同的亞型特性的一個原因在于翻譯后修飾，例如唾液酸化。為了解釋多種樣品的實際pH梯度，將pH讀數vs.%局部活性(在該pH下)半積分。然后加上pH范圍內的活性百分比。如附圖11所示。實際上，這樣就允許視覺檢查在什么pH下達到了活性的某個"閾值"。健康者和糖尿病患者的數據如所示在附圖12中為60%，在附圖13中為90°/。。健康者的90%活性在pH4.2下都非常緊密地下降；而糖尿病患者在pH4.4以上都松散地下降，在更高pH下則疾病的嚴重性增加。健康者的601活性在約pH3.9下都緊密地下降；而糖尿病患者在pH4.5以上都松散地下降。盡管已經參考具體的實施方案對本發明進行了描述，但是應當理解的是，這些實施方案僅是對本發明的原理和應用的說明。因此，應當理解，可以對說明性的實施方案進行很多改變，可以設計出其他的排列而不脫離如附屬的權利要求所限定的本發明的精神和范圍。權利要求1.一種特征在于一種特定的二肽基肽酶(DPP)參數的疾病狀態或病癥的診斷或預后方法，包括測定患者樣品中特異性的DPP中一個或多個可區分部分的至少一種參數，和將所測定的所述DPP參數和所述疾病狀態的存在、不存在或嚴重度關聯。2.權利要求l的方法，其中每個部分包含一種或多種DPP亞型。3.權利要求2的方法，其中每個部分包含一種DPP亞型。4.權利要求l的方法，其中一個或多個部分不包含DPP亞型，并且其他部分包含一種或多種DPP亞型。5.權利要求l的方法，其中所述疾病狀態選自代謝性疾病狀態、癌癥、病毒感染和自身免疫性疾病.6.權利要求5的方法，其中所述疾病狀態是II型糖尿病。7.權利要求l的方法，其中所述參數選自量、濃度、活性、表達、翻譯后修飾的類型和翻譯后修飾的量。8.權利要求7的方法，其中所述參數是DPP活性，所述測定是通過檢測DPP對于直接或間接的可檢測底物活性而產生的水解產物的存在或量的測定而完成的。9.權利要求8的方法，其中所述特異性的DPP是DPP-IV，所述參數是DPP-IV活性。10.權利要求9的方法，其中所述底物是X-Y-R，其中X是任意的氨基酸，Y是脯氨酸、丙氨酸或精氨酸，R是任意的可檢測的標記物。11.權利要求l的方法，其中所述參數是用對一種或多種DPP亞型具有特異性的抗體或凝集素測定的。12.權利要求l的方法，其中測定一種以上的DPP參數。13.權利要求l的方法，其中所述患者樣品選自組織、血液、血漿、血清、唾液、眼淚、粘液、尿、羊水、關節液、精液、腦脊液及其組合。14.權利要求l的方法，進一步包括給操作者傳達疾病狀態的存在、不存在或嚴重度。15.權利要求14的方法，其中所述傳達包括在選自電子屏、數碼屏、可印刷底物和聽覺信號的介質中顯示疾病狀態。16.權利要求l的方法，進一步包括區分在患者樣品中存在的特定DPP的DPP部分。17.權利要求16的方法，其中所述區分是在所述測定前進行的。18.權利要求16的方法，其中所述區分是與所述測定同時進行的。19.權利要求l的方法，其中所述患者樣品是在所述測定前進行處理的。20.權利要求19的方法，其中所述處理選自勻化、稀釋、濃縮、冷凍及其組合。21.權利要求16的方法，其中所述區分是通過物理分離或隔離進行的。22.權利要求21的方法，其中所述區分是用無凝膠方式進行的。23.權利要求22的方法，其中所述無凝膠方式選自自由流動電泳和自由基質電泳。24.權利要求16的方法，其中所述DPP部分是基于DPP亞型的等電點區分的。25.權利要求16的方法，其中有至少兩個所述的DPP部分。26.權利要求l的方法，其中所述關聯包括比較所測定的參數和標準值的對應參數。27.權利要求l的方法，其中所述關聯包括比較所測定的參數和內對照值的對應參數。28.權利要求25的方法，其中測定所述至少兩個部分的所述參數。29.權利要求28的方法，其中所述關聯包括比較至少一個部分的參數和至少兩個部分的總測定的對應參數。30.權利要求29的方法，其中所述關聯包括比較至少一個部分的參數和所有部分的總測定的對應參數。31.權利要求28的方法，其中所述關聯包括比較至少一個部分的測定參數和至少一個其他部分的對應測定參數。32.權利要求28的方法，其中所述關聯包括比較兩個或更多個部分的總測定參數和標準值的對應總參數。33.權利要求28的方法，其中所述關聯包括比較兩個或更多個部分的總測定參數和內對照值的對應總參數。34.權利要求l的方法，其中所述特異性的DPP是DPP-IV。35.—種特征在于一種二肽基肽酶(DPP)參數的疾病狀態或病癥的診斷或預后方法，包括測定患者樣品中一種或多種可區分的DPP亞型的至少一種參數，和將所測定的所述DPP參數和所述疾病狀態存在、不存在或嚴重度的關聯。36.權利要求35的方法，其中所述疾病狀態選自代謝性疾病狀態、癌癥、病毒感染和自身免疫性疾病。37.權利要求35的方法，其中所述參數選自量、濃度、活性、表達、翻譯后修飾的類型和翻譯后修飾的量。38.權利要求35的方法，其中測定一種以上的DPP參數。39.權利要求35的方法，其中所述患者樣品選自組織、血液、血漿、血清、唾液、眼淚、粘液、尿、羊水、關節液、精液、腦脊液及其組合。40.權利要求35的方法，進一步包括給操作者傳達疾病狀態的存在、不存在或嚴重度。41.權利要求35的方法，進一步包括區分患者樣品中的DPP亞型。42.權利要求41的方法，其中所述區分是在所述測定前進行的。43.權利要求41的方法，其中所述區分是與所述測定同時進行的。44.權利要求41的方法，其中所述患者樣品是在所述測定前進行處理的。45.權利要求41的方法，其中所述區分是通過物理分離或隔離進行的。46.權利要求45的方法，其中所述DPP部分是基于DPP亞型的等電點區分的。47.權利要求35的方法，其中所述關聯包括比較所測定的參數和標準值的對應參數。48.權利要求35的方法，其中所述關聯包括比較所測定的參數和內對照值的對應參數。49.權利要求35的方法，其中所述關聯包括比較至少一種亞型的參數和兩種或更多種亞型的總測定的對應參數。50.權利要求49的方法，其中所述關聯包括比較至少一種亞型的參數和所有亞型的總測定的對應參數。51.權利要求35的方法，其中所述關聯包括比較至少一種亞型的所測定的參數和至少一種其他亞型的對應的總測定參數。52.權利要求35的方法，其中所述關聯包括比較兩種或更多種亞型的總測定參數和標準值的對應的總參數。53.權利要求35的方法，其中所述關聯包括比較兩種或更多種亞型的總測定參數和內對照值的對應的總參數。54.—種II型糖尿病的診斷或預后方法，包括測定患者樣品中DPP-IV亞型的一個或多個可區分部分的至少一種參數,和將所述的測定參數和II型糖尿病存在、不存在或嚴重度的關聯。55.權利要求54的方法，其中每個測定部分包含一種或多種DPP-IV亞型。56.權利要求54的方法，其中每個測定部分包含一種DPP-IV亞型。57.權利要求54的方法，其中一種或多種部分不包含DPP-IV亞型，其他部分包含一種或多種DPP-IV亞型。58.權利要求54的方法，其中所述參數選自量、濃度、活性、表達、翻譯后修飾的類型和翻譯后修飾的量。59.權利要求58的方法，其中所述參數是DPP-IV活性。60.權利要求59的方法，其中所述DPP-IV活性是通過檢測DPP-IV對于標記底物活性而產生的水解產物的存在或量的測定而完成的。61.權利要求60的方法，其中所述底物是X-Y-R，其中X是任意的氨基酸，Y是丙氨酸、脯氨酸或精氨酸，和R是任意的可檢測標記物。62.權利要求54的方法，其中所述參數是用對一種或多種DPP亞型具有特異性的抗體或凝集素測定的。63.權利要求54的方法，其中測定一種以上的DPP-IV參數。64.權利要求54的方法，其中所述患者樣品選自血液、血漿、血清及其組合。65.權利要求54的方法，進一步包括給操作者傳達II型糖尿病的存在、不存在或嚴重度。66.權利要求54的方法，進一步包括區分DPP-IV成各個部分。67.權利要求66的方法，其中所述區分是在所述測定前進行的。68.權利要求54的方法，其中所述DPP-IV亞型是根據等電點區分的。69.權利要求68的方法，其中所測定的參數是DPP-IV活性。70.權利要求69的方法，其中測定連續范圍的各部分的活性。71.權利要求70的方法，進一步包括獲得連續范圍的各部分的活性特性。72.權利要求71的方法，其中糖尿病的存在與選自下列的活性特性相關a.在與約pH4.4及以下的pH范圍有關的等電點上，可區分的亞型中存在的連續范圍的所有測定部分的總DPP-IV活性的百分比不超過約90%;b.在與約pH4.15及以下的pH范圍有關的等電點上，可區分的亞型中存在的連續范圍的所有測定部分的總DPP-IV活性的百分比不超過約60%;c，在與約pH4.4及以上的pH范圍有關的等電點上，在可區分的亞型中存在的連續范圍的所有測定部分的總DPP-IV活性的百分比是至少約10%;d.在與約pH4.15及以上的pH范圍有關的等電點上，在可區分的亞型中存在的連續范圍的所有測定部分的總DPP-IV活性的百分比是至少約40%;e.在約pH4.4處有DPP-IV活性特性的峰，其中所述峰與連續范圍的總測定活性的至少約10%有關；f.在約pH4.8處有DPP-IV活性特性的峰，其中所述峰與連續范圍的總測定活性的至少約10%有關；g.與內陰性對照物相比，DPP-IV的活性特性向更高pH移動；h.與陰性標準值相比，DPP-IV的活性特性向更高pH移動；和i.其組合。73.權利要求71的方法，其中糖尿病的不存在與選自下列的活性特性相關a.在與約pH4.2及以下的pH范圍有關的等電點上，可區分的亞型中存在的連續范圍的所有測定部分的總DPP-IV活性的百分比是至少約90%;b.在與約pH3.9及以下的pH范圍有關的等電點上，可區分的亞型中存在的連續范圍的所有測定部分的總DPP-IV活性的百分比是至少約60%;c.在與約pH4.2及以上的pH范圍有關的等電點上，在可區分的亞型中存在的連續范圍的所有測定部分的總DPP-IV活性的百分比不超過約10%;d.在與約pH3.9及以上的pH范圍有關的等電點上，在可區分的亞型中存在的連續范圍的所有測定部分的總DPP-IV活性的百分比不超過約40%;e.與內陽性對照物相比，DPP-IV的活性特性向更低pH移動；f.與陽性標準值相比，DPP-IV的活性特性向更低pH移動；和g.其組合。全文摘要提供了一種疾病狀態的診斷或預后的方法，包括測定患者樣品中可區分的二肽基二肽酶的參數，并將該參數和疾病相關聯。文檔編號G01N33/68GK101460851SQ200780016051公開日2009年6月17日申請日期2007年3月13日優先權日2006年3月13日發明者C·A·捷爾芬德,P·奧姆蘭申請人:貝克頓·迪金森公司