專利名稱：Sars冠狀病毒磷酸化核蛋白(n蛋白)克隆表達及其用途的制作方法
嚴重呼吸道綜合癥(Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS)是去年11月份在中國廣東首先報告，并在全球許多地區出現的一種傳染性很強的新傳染病。2003年4月16日，世界衛生組織宣布，冠狀病毒中的一個變種，即一種新型冠狀病毒是引起SARS的病原體，并建議命名為SARS冠狀病毒(SARS Coronavirus，SARS-CoV)。隨后，加拿大，美國和中國等國測定了SARS病原體冠狀病毒的全基因序列。病原體的確定以及病毒基因測序工作的完成，為SARS的預防、治療和診斷研究提供了理論基礎。
根據SARS冠狀病毒全基因組的生物信息學分析，發現該病毒編碼主要蛋白有(1)病毒復制酶1a，1b；(2)四種結構蛋白S(纖突糖蛋白)，M(膜糖蛋白)，N(核蛋白)，E(小囊膜蛋白)，以及(3)5-9種功能未知的ORF。目前，對SARS病毒編碼的蛋白質結構與功能的認識主要基于對已知的動物和人類冠狀病毒認識和生物信息學理論預測，對SARS病毒蛋白在病毒復制過程中的表達特性及其生物學功能尚不清楚。當前最緊要的另一任務是，盡快研制出SARS快速檢測技術，實現SARS的快速早期診斷，以便盡快實現SARS病人與其他呼吸道感染的鑒別診斷，盡早控制SARS的傳播。
本發明的目的是，根據已公開的SARS冠狀病毒基因序列，設計針對N蛋白基因的特異引物，通過RT-PCR擴增并克隆SARS病毒N蛋白基因，經原核系統表達獲得了SARS病毒主要結構蛋白N蛋白。表達的SARS冠狀病毒N蛋白可以作為抗原，應用于ELISA和蛋白質芯片等SARS病毒診斷檢測技術研究和開發，也可應用于SARS病毒藥物和疫苗研究，對SARS的防治藥物和疫苗以及診斷技術研究具有重要意義。
本發明的主要內容是1.SARS冠狀病毒N蛋白基因克隆、表達和純化根據已經報道的SARS冠狀病毒全基因組序列，設計了N蛋白的引物。以浙江病毒株RNA為模板反轉錄合成cDNA，然后以此cDNA為模板、設計的N蛋白引物和高保真的DNA聚合酶PCR擴增N蛋白基因。擴增得到了N蛋白全長基因，回收目的基因，經Nde I和EcoR I雙酶切并回收后和經同樣酶切的PET28a大腸桿菌表達載體連接。連接產物轉化大腸桿菌DH5α并涂布到加有卡那霉素的LB平板上，37℃溫箱培養12小時。待長出肉眼可見菌落后，挑取菌落進行菌落PCR，挑選陽性克隆并抽出質粒。所抽質粒一部分以T7引物進行測序，測序結果和國外報道的序列一至。另取部分質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)。待長出菌落后，挑取單菌落進行搖瓶誘導表達。當搖瓶中細菌長到OD600＝0.5時加入終濃度為10mM的IPTG，37℃誘導3小時。取少量菌液進行SDS-PAGE分析，結果發現N蛋白獲得了高表達。搖瓶獲得的菌液經離心收集菌體，菌體用PH8.5的磷酸鹽緩沖液充分懸浮，經超聲破碎，離心去沉淀和0.45μm濾膜抽慮后，上陽離子柱純化。所用系統為法瑪西亞公司的Biopilot中亞層析系統，所用柱子為法瑪西亞公司S柱。收集各蛋白組分后進行SDS-PAGE分析。把有目的蛋白組分的部分混合后把PH值調到7.4，用Ni2+親合柱純化。經兩步純化后，得到了純度超過90％的蛋白樣品。
2.SARS病毒N蛋白作為抗原的ELISA檢測技術建立基因重組表達的SARS冠狀病毒N蛋白為抗原包被微孔板、辣根過氧化物酶標記鼠抗人IgG，以間接酶聯法原理(ELISA)檢測重癥急性呼吸綜合癥病人血清或血漿樣本中抗體，對重癥急性呼吸綜合癥病人進行診斷。檢測結果發現，20份SARS康復期病人血清時OD450為0.43±0.05，20份正常人血清時OD450為0.115±0.04，P/N＝3.75，說明特異性好。


圖1為N蛋白表達載體構建示意圖。
圖2為SARS冠狀病毒N蛋白基因的PCR擴增。
圖3為SARS冠狀病毒N蛋白基因的重組表達載體的PCR篩選。
圖4為SARS冠狀病毒N蛋白的表達與純化。
實施例一、SARS冠狀病毒N蛋白基因克隆、表達和純化1.擴增引物的設計根據已知的冠狀病毒N蛋白(核衣殼蛋白)的基因序列設計了一對PCR擴增引物，為了便于以后的蛋白表達，在引物中分別引入了NdeI和EcoRI酶切位點。序列如下上游引物5’-GGCAATTGCATATGTCTGATAATGGACC-3’；下游引物5’-CCGAATTCTT AT GCCTG AGTTG AATC-3’。擴增SARA病毒全基因的28105-29373核苷酸位點的N蛋白基因，共1269bp。
2.病毒總RNA的提取采用TRIZOL(Invitrogen)試劑一步法提取病毒總RNA。簡述如下收集患者血清，加入TRIZOL試劑，每1ml TRIZOL試劑加入200μl氯仿，5min后4℃ 12000×g離心15min，收集水相，加入0.5ml異丙醇，10min后4℃12000×g離心10min，沉淀用75％的乙醇洗一次，空氣干燥后，加入無RNase的水，-70℃保存，即得。
3.反轉錄PCR按照試劑盒說明書(Reverse Transcription System，Promega公司)分兩步進行RT-PCR。RNA樣品于70℃ 10min后，42℃反應30min，然后加熱95℃ 5min以滅活AMV酶活性及防止AMV酶與cDNA結合，即得PCR模板，-20℃保存。在PCR擴增儀進行反應，PCR條件變性94℃ 30S，退火58℃ 40S，延伸72℃，60S，循環數35，最后延伸10min.PCR產物用1％瓊脂糖DNA電泳(見圖1)。
4.原核表達載體的構建采用寶生物公司的DNA fragment purification kit回收PCR產物，然后用NdeI和EcoRI分別雙酶切PCR產物和原核表達載體PET-28a，純化酶切產物后，在T4 DNA連接酶作用下進行定向連接。如圖2所示。
5.基因的鑒定連接產物轉化大腸桿菌DH5α(采用道普生物公司的感受態試劑盒)，涂布到加有卡那霉素的LB平板，37℃溫箱培養12小時。挑取菌落用PCR擴增鑒定，DNA電泳，結果正確。并進行DNA測序，測序引物為T7引物，DNA分析表明，序列與報道的完全一致。DNA及氨基酸序列如下所示。
DNA序列 ATG TCT GAT AAT GGA CCC CAA TCA AAC CAA CGT AGT GCC氨基酸序列M S D N G P Q SNQ R S ACCC CGC ATT ACA TTT GGT GGA CCC ACA GAT TCA ACT GAC AAT AACP R IT F G GP T D S T DN NCAG AAT GGA GGA CGC AAT GGG GCA AGG CCA AAA CAG CGC CGA CCCQ N G G R N GA R P K Q R R PCAA GGT TTA CCC AAT AAT ACT GCG TCT TGG TTC ACA GCT CTC ACTQ G L P N N TA S W F T AL TCAG CAT GGC AAG GAG GAA CTT AGA TTC CCT CGA GGC CAG GGC GTTQ H G K E E L R FP R G Q G VCCA ATC AAC ACC AAT AGT GGT CCA GAT GAC CAA ATT GGC TAC TACP I N T N S GP D D Q I G Y Y
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7.目的蛋白的純化(1)所用陽離子柱為安瑪西亞公司的S柱。陽離子柱先用A液(pH8.5的20mM磷酸鹽緩沖液)平衡到基線，然后將上述表達的蛋白樣品上柱，然后再用A液平衡到基線。洗脫時，在十個柱體積內，B液(pH8.5的20mM磷酸鹽緩沖液+1M NaCl)由0％升高到100％，收集蛋白峰，進行SDS-PAGE。純度較好的組分混合后，把pH值調到7.4，準備上親和柱。所用Ni2+親和柱為安瑪西亞公司的親和預裝柱。
(2)親和柱先用5個柱體積的0.2M的硫酸鎳平衡，然后用10個柱體積的A液(20mM PB，500mM NaCl，pH7.4)平衡柱子到基線。然后上樣，上樣后再用A液平衡到基線。然后洗脫，B液(20mM PB，500mM NaCl，500mM咪唑，pH7.4)在十個柱體積內從0％升高到100％，收集蛋白組分，進行SDS-PAGE。
二、SARS病毒N蛋白作為抗原的ELISA檢測技術建立由上述的基因重組表達SARS病毒N蛋白作為抗原包被微孔板、辣根過氧化物酶標記鼠抗人IgG，以間接酶聯法原理(ELISA)檢測SARS病人血清或血漿樣本中抗體，對重癥急性呼吸綜合癥病人進行診斷。
1.試劑盒組成本試劑盒包括下列主要成分(1)重組SARS病毒抗原包被酶聯板條 96人份(2)陽性對照血清 0.5ml/瓶 1瓶(3)陰性對照血清 0.5ml/瓶 1瓶(4)樣品稀釋液 12ml/瓶1瓶(5)酶結合物 12ml/瓶1瓶(6)顯色劑A6ml/瓶 1瓶(7)顯色劑B6ml/瓶 1瓶(8)終止劑 6ml/瓶 1瓶(9)洗滌液(20×濃縮) 50ml/瓶1瓶2.操作方法(1)取出試劑，15-30℃放置20分鐘；每孔加100μl樣品稀釋液，然后再加入10μl待測樣品；包被板均需留空白孔，陰、陽性對照雙孔。空白孔加入100μl樣品稀釋液。直接加入100μl陰、陽性對照血清各雙孔，混勻后37℃水浴震蕩30分鐘。
(2)用1∶20稀釋后的洗滌液洗板4次，最后一次拍干。
(3)每孔加100μl酶結合物37℃水浴20分鐘，剩余酶結合物4℃保存。
(4)洗板同2。
(5)先加入顯色劑A液50μl再加入顯色劑B液50μl，37℃水浴避光顯色10-15分鐘。
(6)每孔加50μl終止液。
3.結果判定(1)測定以酶聯儀450nm測定各孔OD值(減去空白對照計算)。陽性對照每孔OD＞1.0，陰性對照每孔OD＜0.06試劑盒有效，終止后10分鐘內測OD值。
(2)臨界值陰性對照平均OD值+0.05。若陰性對照OD值0.06時，按0.06計算；若＞0.06，按實際OD值計算。
4.注意事項(1)濃縮洗滌液使用前，用蒸餾水稀釋20倍使用。
(2)不同批號試劑不可混合使用。
(3)必須嚴格控制培育反應板的溫度和時間。
(4)記過判定以儀器為準，不能肉眼觀察。
(5)樣品中血脂、黃膽、血紅蛋白對本品檢測結果基本不影響。
(6)保存條件2-8℃保存，有效期暫定為12個月，在有效期內使用。
(7)試劑規格為96人份。
權利要求
1.本發明涉及SARS冠狀病毒磷酸化核蛋白(N蛋白)基因克隆及其表達產物，其特征在于，通過RT-PCR技術克隆SARS冠狀病毒N蛋白基因，并實現了表達，分離純化獲得SARS冠狀病毒N蛋白，并在研究開發SARS冠狀病毒檢測診斷技術中的應用。
2.根據權利要求1所述，SARS冠狀病毒N蛋白是在體外通過RT-PCR技術克隆SARS冠狀病毒N蛋白基因，經過Ni2+親合柱純化后獲得。
3.根據權利要求1所述，SARS冠狀病毒N蛋白在SARS病毒診斷檢測技術研究和開發中的用途。
4.權利要求1所述，SARS冠狀病毒N蛋白在SARS冠狀病毒防治藥物和疫苗研究與開發中的用途。
5.根據權利要求2所述，體外表達純化的SARS冠狀病毒N蛋白作為抗原在SARS ELISA和蛋白質芯片等免疫學為基礎的診斷檢測技術研究和開發中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種生物工程類產品及其用途。具體說是SARS冠狀病毒N蛋白基因克隆和體外表達以及在診斷和藥物疫苗等研究中的用途。根據已公開的SARS冠狀病毒基因序列，設計針對N蛋白基因的特異引物，通過RT－PCR擴增并克隆SARS病毒N蛋白基因，經原核系統表達獲得了SARS病毒主要結構蛋白N蛋白。表達的SARS冠狀病毒N蛋白可以作為抗原應用于ELISA和蛋白質芯片等SARS病毒診斷檢測技術研究和開發，也可應用于SARS病毒藥物和疫苗研究和開發。
文檔編號G01N33/569GK1552731SQ0313794
公開日2004年12月8日 申請日期2003年5月30日 優先權日2003年5月30日
發明者王升啟, 張士猛, 張敏麗, 陳蘇紅, 杜清友, 陳忠斌 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院放射醫學研究所, 中國人民解放軍軍事醫學科學院放射醫