專利名稱：：水解的蛋白質-多糖復合物的制作方法
技術領域：
：本發明涉及水解的蛋白質-多糖復合物，并更具體地涉及通過蛋白質和多糖之間的復合物形成然后通過水解獲得的那些水解的蛋白質-多糖復合物。得到的復合物具有良好的乳化和穩定化特性，并可以用于食品、美容產品或者藥物產品。本發明進一步涉及生產此類復合物的方法。
背景技術：
：蛋白質-多糖復合物穩定乳劑和泡沫劑的能力是本領域熟知的。例如，US3，944，680描述了這些復合物在存儲穩定的可攪拌乳劑中(storagestablewhippableemulsion)作為對單獨的球狀蛋白質的合適備選物。US6,197，319涉及這些復合物在美容組合物中作為避免當蛋白質或多糖單獨地使用時獲得的不穩定產物的方法的用途。歐洲專利號340035中描述了將微片段化的離子多糖/蛋白質復合物分散體作為脂肪替代物用于食物產品例如冰淇淋、沙拉醬、調味汁、涂食品的果醬和佐料。具有高乳化能力的乳化劑描述于WO2004/078334中。該乳化劑通過在pH2至pH5加熱下，酸性多糖和蛋白質或者水解蛋白質之間的復合物形成產生。此外，Pilosof，A.M.R.等在FoodHydrocolloids,19，2005，361-369中討論了泡沫劑中水解的向日葵蛋白質對與多糖相互作用的影響。蛋白質有限的水解似乎促進了其發泡特性并且也影響了蛋白質-多糖相互作用。W02004/028281公開了靜電結合的蛋白質-多糖復合物作為表面活性劑和穩定劑在任一類型的乳劑或者泡沫劑中的用途。發明目的因此，本發明的目的是進一步改進蛋白質-多糖復合物的乳化特性和穩定特性。發明概述該目的通過獨立權利要求解決。從屬權利要求進一步發展了本發明的中心思想。因此，在第一方面，本發明涉及通過用酶水解蛋白質-多糖復合物獲得的和/或可獲得的水解蛋白質-多糖復合物。根據權利要求1至5中任一項的復合物作為乳化劑和/或穩定劑在食物產品、美容產品或者藥物產品中的用途也構成本發明的一部分，食物產品優選地選自甜品、冷凍甜品、乳制品、寵物食品、烹飪制品、臨床營養制品；美容產品優選地選自乳膏、泡沫劑、摩絲、凝膠、洗發劑、乳劑；藥物產品優選地選自片劑、膠囊劑、糖漿劑。最后，本發明也涉及用于生產水解蛋白質-多糖復合物的方法，包括步驟a.將蛋白質溶液與多糖混合以誘導復合物的形成b.用酶水解形成的復合物，優選地在水解蛋白質-多糖復合物中達到至50%，更優選地2%至25%，甚至更優選地3.5%至20%的蛋白質水解程度，以獲得所述水解的蛋白質-多糖復合物。附圖本發明進一步通過附圖進行說明，其中-圖1顯示通過A)Enzeco真菌蛋白酶濃縮物；B)酸性蛋白酶II；OEnzeco菠蘿蛋白酶濃縮物在PH4.2的WPI(BiPRO)/阿拉伯樹膠水解復合物或者WPI水解產物在C18柱上的RP-HPLC譜。在所有樣品中，酶在RP-HPLC分析和去復合(de-complexation)前都進行了熱失活。-圖2顯示(a，b)不用酶；或者用(c，d)Enzeco真菌蛋白酶；(e，f)Enzeco菠蘿蛋白酶；和(g，h)酸性蛋白酶II水解()()·；()0.5Wt%或(__)LOwt^WPI或者WPI/阿拉伯樹膠復合物制備的乳劑隨時間測量的膏化層的高度(％)。-圖3是概括通過OPA方法測量的在pH4.2獲得的WPI和WPI/阿拉伯樹膠復合物水解O小時)的DH值的表。發明詳述本發明涉及水解的蛋白質-多糖復合物。在本發明的上下文中，術語“水解的蛋白質-多糖復合物”描述了蛋白質和多糖之間的復合物，其在完整蛋白質和多糖之間復合物形成后已經進行了水解。術語“復合物”意為蛋白質和多糖之間的任一形式的結合。此種結合可以包括疏水相互作用、范德華相互作用、靜電相互作用、氫鍵結合、共價相互作用或者偶極-偶極誘導的相互作用。本發明的復合物優選地是靜電結合的復合物。因此，蛋白質優選地具有與多糖的總靜電荷相反的總靜電荷。然而，本申請也涵蓋了通過蛋白質電荷修補(chargepatch)，即在蛋白質和多糖具有相似的靜電荷的情況下形成的靜電復合物。在本發明的上下文中，術語“水解”指在與多糖結合的情況下，蛋白質的水解。水解優選地使用酶實施。選擇酶以使其可以在蛋白質-多糖復合物中的蛋白質上作用。此種酶可以選自內切蛋白酶例如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、無花果蛋白酶，來自豬胰臟、牛胰臟、豬胃粘膜(porcinestomachmucosa)、豬胃粘膜(porcinegastricmucosa)、豬胃內層、枯草芽抱桿茵(Bacillussubtilis)、芽抱桿菌屬(Bacillusspp.)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、醬油曲霉(Aspergillussojae)、曲霉屬(Aspergillusspp.)、雪白*艮霉(Rhizopusniveus)、番木瓜、菠蘿、鳳梨科(Bromeliceae)、無花果屬物種的內切蛋白酶，來自米曲霉、醬油曲霉、曲霉屬、番木瓜的外切蛋白酶。優選地，該酶是內切蛋白酶。可以在本發明中使用的酶是從Novozymes例如在Alcalase,Neutrase,Protamex,Flavourzyme商標下購買的。用酶水解蛋白質-多糖復合物中蛋白質的程度已經顯示出要比當蛋白質游離的時候用相同的酶水解的程度低(參見圖幻。預計這種結果是因為多糖的存在稍微妨礙了蛋白質上剪切位點的接近。然而，在蛋白質-多糖復合物中得到的較低程度的水解對復合物作為穩定劑的性能沒有影響。事實上，已經發現，為了實現本發明的有利作用，至50%，優選地2%至25%，更優選地3.5%至20%的水解程度是合適的。在水解之前的蛋白質-多糖復合物的蛋白質優選地選自乳蛋白質、大豆蛋白質、卵蛋白質、肉蛋白質、魚蛋白質或者植物蛋白質的一種或多種。優選地，它是乳蛋白質例如乳清蛋白或者酪蛋白，更優選地牛乳蛋白質。甚至更優選地，它是牛乳清蛋白。本發明中使用的多糖可以是能與蛋白質分子間結合的任一多糖。因此，優選地是陰離子或者陽離子多糖。本發明的多糖可以選自樹膠、水膠體、微生物胞外多糖或者真菌胞外多糖。優選地選自阿拉伯樹膠、果膠、角叉菜膠、哺乳動物明膠例如豬明膠、魚明膠、阿拉伯半乳聚糖、黑麥阿拉伯木聚糖、小麥阿拉伯木聚糖、藻酸鹽、丙二醇藻酸酯、羧甲基纖維素、脫殼聚糖、黃原膠、瓊脂、來自乳酸茵的胞外多糖的一種或者多種。最優選地，多糖選自阿拉伯樹膠和/或殼聚糖。在本發明的復合物中，蛋白質的水解程度可以在1%至50%之間變化。優選地，其為2%至25%，更優選地為3.5%至20%。從復合物中的蛋白質水解得到的肽譜可以通過將蛋白質部分從多糖中去復合來測定。“去復合”意為蛋白質-多糖復合物的解離。去復合可以通過例如PH改變和多糖在乙腈中沉淀來實現。基于去復合，蛋白質譜可以例如通過C18RP-HPLC分析。這是本領域已知的用于肽譜表征的方法。發現該蛋白質譜與用相同的酶但是不存在與多糖形成復合物的情況下水解的蛋白質的蛋白質譜不同。這圖解于圖1(A、B和C)中，其顯示與以前并沒有與多糖結合的蛋白質比較，在以復合物形式與多糖結合的蛋白質中的相同位點沒有發生用三種不同的酶對蛋白質的水解。因此，可以發現，通過水解蛋白質-多糖復合物水解得到的復合物與由水解的蛋白質和多糖結合形成的復合物比較，結構是不同的。此外，顯示本發明的復合物與非水解的復合物、僅非水解的蛋白質或者水解的蛋白質比較，提供了隨時間增強的乳化穩定性。這圖解于圖2中，其顯示了已經通過真菌蛋白酶、菠蘿蛋白酶或者酸性蛋白酶水解的復合物隨時間的最佳膏化穩定性。通過用酸性蛋白酶水解復合物得到的水解的蛋白質-多糖復合物顯示出在膏化穩定性方面特別好的結果。在圖解于圖2的實例中，真菌蛋白酶和菠蘿蛋白酶是EnzymeDevelopment公司市售的。它們包含分別來自米曲霉的內切蛋白酶和來自鳳梨科的內切蛋白酶。酸性蛋白酶II是從Amano購買的，并包含來自雪白根霉的內切蛋白酶。因此，本發明的復合物可以用作為食品、美容產品或者藥物產品中的乳化劑和/或穩定劑。包含本發明復合物的食物產品優選地選自甜品、冷凍甜品、乳制品、寵物食品、烹飪制品、臨床營養制品等。具體而言，它們可以包括調味汁、湯類、蛋黃醬、沙拉醬、奶油、冰淇淋、巧克力、奶油凍、奶等。本發明的復合物可以用于美容產品例如乳膏、泡沫劑、摩絲、凝膠劑、洗發劑、乳劑等。可以添加本發明復合物的藥物產品包括片劑、膠囊劑、糖漿劑等。當用作為乳劑和/或穩定劑時，該復合物優選地以所述產品的0.Olwt%至IOwt%，優選地0.Iwt%，最優選地0.Iwt%-0.5wt%的量存在于所述產品中。實際上已經發現，乳化特性和穩定特性在低濃度下是最佳的。因此，本發明的產品提供了它們是高度有效的乳化劑和/或穩定劑的優點。本發明進一步涉及生產這些水解的蛋白質-多糖復合物的方法。方法中的第一步包括混合蛋白質溶液和多糖以誘導復合物的形成。在本發明方法中使用的蛋白質在與多糖混合前，優選地還沒有進行任何水解步驟。蛋白質可以選自乳蛋白質、大豆蛋白質、卵蛋白質、肉蛋白質、魚蛋白質或者植物蛋白質的一種或多種。優選地，它是乳蛋白質例如乳清蛋白或者酪蛋白，更優選地牛乳蛋白質。甚至更優選地，它是牛乳清蛋白。在本發明中使用的多糖可以是能與蛋白質分子間結合的任一多糖。因此，它優選地是陰離子或者陽離子多糖。本發明的多糖可以選自樹膠、水膠體、微生物或真菌外泌多糖。它優選地選自阿拉伯樹膠、果膠、角叉菜膠、哺乳動物明膠例如豬明膠、魚明膠、阿拉伯半乳聚糖、黑麥阿拉伯木聚糖、小麥阿拉伯木聚糖、藻酸鹽、丙二醇藻酸酯、羧甲基纖維素、殼聚糖、黃原膠、瓊脂、來自乳酸菌的外泌多糖的一種或者多種。多糖最優選地選自阿拉伯樹膠和/或殼聚糖。用于誘導復合物形成的條件，特別是用于誘導靜電結合的復合物形成的條件取決于所使用的蛋白質和多糖的來源。蛋白質和多糖可以以201至120的蛋白質多糖重量比混合。優選地，蛋白質和多糖以51至15，更優選地21至12的蛋白質多糖重量比混合。最優選地，蛋白質和多糖以21的蛋白質多糖重量比混合。溶液中多糖的量優選地為0.至10%，更優選地為0.4%至5%。在本發明中，已經發現，可以調整溶液的pH以誘導蛋白質與多糖的靜電結合。含有蛋白質和多糖的溶液的PH可以從3.0至8.0，優選地從3.0至7.0變化。在一個優選的實施方案中，PH可以從3.0至5.0變化。在另一個實施方案中，pH可以從6.0至7.0變化。例如，當乳清蛋白與陰離子多糖例如阿拉伯樹膠混合時，優選的pH是在3.0至5.0之間，更優選地是大約4.2。當乳清蛋白與陽離子多糖例如殼聚糖混合時，優選的pH是在6.0至7.0之間，更優選地是大約6.5。可以通過使用常規的酸例如鹽酸、磷酸、檸檬酸、乙酸、甲酸或者堿例如氫氧化鈉、氫氧化鉀進行PH調整。混合溶液達到誘導蛋白質和多糖之間的復合物形成所需的時間量。該時間可以從1秒至30秒變化。復合物形成可以是瞬時的。復合物形成可以通過技術人員已知的方法例如濁度測量、光散射測量或者電導測量證實。然后將完整的蛋白質-多糖復合物例如用酶水解。選擇酶以使其可以在蛋白質-多糖復合物中的蛋白質上作用。此種酶可以選自內切蛋白酶例如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、無花果蛋白酶，來自豬胰臟、來自牛胰臟、豬胃粘膜、牛胃粘膜、豬胃內層、枯草芽孢桿菌、芽孢桿菌屬、米曲霉、醬油曲霉、曲霉屬、雪白根霉、番木瓜、菠蘿、鳳梨科、無花果屬物種的內切蛋白酶，來自米曲霉、醬油曲霉、曲霉屬、番木瓜的外切蛋白酶。優選地，該酶是內切蛋白酶。可以在本發明中使用的酶是從Novozymes例如在Alcalase,Neutrase,Protamex,Flavourzyme商標下購買的。在溶液中，蛋白質與酶比率是15至11000，優選地110至1100，更優選地150。水解可以在30°C至70°C的溫度下進行。最佳的溫度取決于酶的選擇。優選地，進行水解作用的溫度是40V至50°C之間。水解可以進行10分鐘至3小時，優選地大約2小時。蛋白質-多糖復合物優選地水解至1%至50%，更優選地2%至25%，甚至更優選地3.5%至20%的水解程度。水解程度通過本領域技術人員已知的OPA(鄰苯二醛)方法測定用于隨后的蛋白質水解。得到的水解蛋白質-多糖復合物在添加了它的組合物中作為乳化劑和/或穩定劑具有高度有效的優點。此外，它包含了僅天然成分以至于它比由化學修飾或者合成產物組成的常規乳化劑更有吸引力。同時，就可能含有它們的產品來說，本發明的復合物是多用途的。例如，通過調整蛋白質和多糖的選擇，它們在寬PH范圍起著乳化劑和/或穩定劑的作用。例如，它們可以在具有大約2.5的pH的酸性產品例如蛋黃醬中以及在具有6.5以上的PH產品例如乳中使用。水解后，失活酶是有利的。酶失活可以通過熱處理、壓力處理或者添加對酶特異的抑制物完成。優選地，通過熱處理含有水解蛋白質-多糖復合物和酶的溶液來實施。熱處理優選地在80°C至100°C的溫度實施5-30分鐘。此外，可以將水解后，并任選地酶失活后的溶液進行超濾。這具有將本發明的復合物與由于水解步驟產生的游離肽分離的優點。在一個優選的實施方案中，然后將溶液通過本領域已知的任一方法例如噴霧干燥、冷凍干燥或者真空干燥來進行干燥。因此，本發明的復合物可以為溶液、凝膠或者干粉的形式。在另外的實施方案中，水解蛋白質-多糖復合物可以在存在另外的成分的情況下干燥。備選地，干燥的水解蛋白質-多糖復合物可以與其他干燥成分混合。得到的產物可以是例如包含本發明復合物的奶粉或者脫水湯粉。本發明通過以下非限制性實施例進行進一步的說明。實施例^MMι-7k解的阿白積撲$-將乳清蛋白分離物(WPI-來自DaviscoFoodshternational的BiPro)與阿拉伯樹膠(來自ColloidesNaturelsInternational的速溶樹膠)按21的蛋白質與多糖重量比、2wt%的總WPI濃度(基于蛋白質)混合，并且將PH調整至4.2。然后將Enzeco菠蘿蛋白酶酶濃縮物以150的蛋白質與酶的比率加入到溶液中。2小時后，水解度為3.7%，并熱處理(90°C，15分鐘)水解復合物以失活酶并且超濾以除去由蛋白酶產生的未結合的肽。將得到的水解蛋白質-多糖復合物冷凍干燥以產生粉末。^mm2-ykmm^mm-在本實施例中，分別將殼聚糖和乳清蛋白用作為多糖和蛋白質。殼聚糖252(去乙酰化度>90%,MahtaniChitosanPVT有限公司)獲自FranceChitine0乳清蛋白分離物從DaviscoFoodsInternational以BiPro商標獲得。在與蛋白質混合前將殼聚糖的水分散體在50°C調整至pH5.9。然后將蛋白質(在水溶液中)加入殼聚糖分散體中并用乙酸將PH調整至6.5。混合物中乳清蛋白質濃度為0.9wt%。混合物中殼聚糖濃度為0.45wt%。混合20分鐘后，加入0.018wt%濃度的來自枯草芽孢桿茵(COrOlase7089)的真菌蛋白酶。將混合物在50°C攪拌下保持2小時以獲得12%的水解程度。然后使用具有IOOkDa(0.09m2)的MWCO的Pr印/^caleSpiralWoundTFFIModulePZHK在50°C超濾混合物。入口壓力設置為0.75巴(泵的第6速)。首先將混合物濃縮至2X，然后通過添加1直徑體積(diavolume)(SOOmL)的去離子水開始滲濾。為了使滲余物中的酶變性，應用了90°C的熱處理15分鐘。然后將滯留物冷凍干燥以得到根據本發明的產物。實施例3檢測在實施例1中獲得的水解阿拉伯樹膠-乳清蛋白復合物在3種不同濃度(0.Iwt%、0·5wt%禾口Iwt%)下的乳化能力。使用向日葵油(MeritSelection商標)制備乳劑。將IOg油加入到90g的去離子水中。然后加入0.lwt%,0.5wt%和在實施例1中獲得的并在蒸餾水中重構的水解復合物。最后，加入0.02wt%NaN3作為防腐劑。在乳化前用Ultra-Turrax(Janke-Kunke1，GmBH)預先勻化混合物30秒。在室溫，使用Emulsifiex_C5勻化器(Avestin公司，加拿大)以兩種通道即400巴(6000psi)和80巴(IlOOpsi)實施乳化。結果顯示于圖2中。可以看到，與非水解復合物(圖2a)比較或者與僅水解的乳清蛋白(圖2c、e、g)比較，在觀天存儲期間，本發明復合物(圖2d、f、h)的膏化穩定性，即乳劑對經歷相分離的抗性更好。此外，結果顯示，低至0.的本發明水解復合物的濃度在穩定乳劑時特別有效。權利要求1.水解的蛋白質-多糖復合物，其可以通過酶水解蛋白質-多糖復合物獲得。2.根據權利要求1的復合物，其中所述蛋白質-多糖復合物是靜電結合的復合物。3.根據權利要求1或者2的復合物，其中所述蛋白質選自乳蛋白質、大豆蛋白質、卵蛋白質、肉蛋白質、魚蛋白質或者植物蛋白質的一種或多種，優選地選自乳蛋白質例如乳清蛋白或者酪蛋白，更優選地牛乳蛋白質，甚至更優選地牛乳清蛋白。4.根據前述權利要求任一項的復合物，其中所述多糖選自樹膠、水膠體、微生物或者真菌外泌多糖的一種或多種，優選地選自阿拉伯樹膠、果膠、角叉菜膠、哺乳動物明膠例如豬明膠、魚明膠、阿拉伯半乳聚糖、黑麥阿拉伯木聚糖、小麥阿拉伯木聚糖、藻酸鹽、丙二醇藻酸酯、羧甲基纖維素、殼聚糖、黃原膠、瓊脂、來自乳酸菌的外泌多糖的一種或者多種，最優選地選自阿拉伯樹膠和/或殼聚糖。5.根據前述權利要求任一項的復合物，其中水解的蛋白質-多糖復合物中蛋白質的水解程度是1%至50%，優選地2%至25%，更優選地3.5%至20%。6.根據權利要求1至5中任一項的復合物的用途，用作優選地選自甜品、冷凍甜品、乳制品、寵物食品、烹飪制品、臨床營養制品的食物產品；優選地選自乳膏、泡沫劑、摩絲、凝膠劑、洗發劑、乳劑的美容產品；或者優選地選自片劑、膠囊劑、糖漿劑的藥物產品中的乳化劑和/或穩定劑。7.根據權利要求6的用途，以所述產品的0.01襯％至10wt%，優選地0.1襯％至5wt%，更優選地0.Iwt%至0.5wt%的量。8.生產水解的蛋白質-多糖復合物的方法，所述方法包括a.將蛋白質溶液與多糖混合以誘導復合物的形成，b.用酶水解形成的復合物，優選地在水解蛋白質-多糖復合物中達到1%至50%，更優選地2%至25%，甚至更優選地3.5%至20%的蛋白質水解程度，以獲得所述水解的蛋白質-多糖復合物。9.根據權利要求8的方法，其中所述混合在誘導蛋白質和多糖之間的靜電復合物形成的PH下進行。10.根據權利要求8或者9的方法，其中所述溶液的PH是3.0至8.0，優選地3.0至7.0，更優選地3.0至5.0或者6.0至7.0。11.根據權利要求8至10的方法，其中蛋白質與多糖的重量比是201至120，優選地51至15，更優選地21至12，最優選地21。12.根據權利要求8至11中任一項的方法，其中所述酶選自內切蛋白酶例如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、無花果蛋白酶，來自豬胰臟、牛胰臟、豬胃粘膜、豬胃粘膜、豬胃內層、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、芽孢桿菌屬(Bacillusspp.)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、醬油曲霉(Aspergillussojae)、曲霉屬(Aspergillusspp.)、雪白根霉(lihizopusniveus)、番木瓜、菠蘿、鳳梨科、無花果屬物種的內切蛋白酶，來自米曲霉、醬油曲霉、曲霉屬、番木瓜的外切蛋白酶，優選地內切蛋白酶。13.根據權利要求8至12任一項的方法，其中所述酶在水解步驟后被失活，優選地通過熱處理、壓力處理或者添加酶特異的抑制物，更優選地通過在80°C至100°C的溫度下熱處理5-30分鐘進行失活。14.根據權利要求8至13任一項的方法，其中所述水解步驟之后是所獲得的混合物的超濾。15.根據權利要求8至14任一項的方法，其中所述水解步驟之后是干燥步驟。全文摘要本發明涉及水解的蛋白質-多糖復合物，并更具體地涉及通過蛋白質和多糖之間的復合物形成然后通過水解獲得的那些水解的蛋白質-多糖復合物。得到的復合物具有良好的乳化和穩定化特性，并可以用于食品、美容產品或者藥物產品。本發明進一步涉及生產此類復合物的方法。文檔編號B01F17/00GK102227170SQ200980147598公開日2011年10月26日申請日期2009年11月30日優先權日2008年12月4日發明者C·J·E·施密特,巴列斯特爾S·I·拉內維勒,S·特金,S·高蒂爾申請人:雀巢產品技術援助有限公司