專利名稱：新型蛋白多糖復合物的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物化學技術領域，具體涉及一種新型蛋白多糖復合物。
背景技術：
金屬硫蛋白(MT)化學名為金屬硫組氨酸三甲基內鹽，化學結構特殊，是一類富含半胱氨酸、廣泛存在于生物體內的低分子量、富含金屬及巰基的非酶蛋白。MT的分子量介于6000 7000Da之間，通常含有61個氨基酸，其中20個為半胱氨酸，可以與7個二價金屬離子結合形成兩個獨立的金屬簇。MT對金屬離子有特定的親和力，其對金屬的結合序列為Fe2+ < Co2+ < Zn2+ < Pb2+ < Cd2+ < Cu2+ Ag2+ < Bi2+ < Hg2+，是機體內唯一一種在金屬代謝中起明確作用的小分子蛋白質，結合重金屬是MT蛋白區別于其他蛋白質的重要特性。 MT在生物體內具有多種作用，包括解除重金屬的毒害，清除自由基，參與微量元素代謝，促進機體免疫功能以及抗輻射、抗衰老等。同時，MT能抑制脂質(如血脂)的過氧化反應，可降低血液粘度，改善血液循環，能達到防治心腦血管疾病的目的和穩定生物膜等多種生物學作用。因此，MT可應用于食品、化妝品和醫藥等領域。糖胺聚糖(GAGs)存在于動物細胞的表面和細胞外基質，是一種長鏈多糖，是由含已糖醛酸和己糖胺成分的重復二糖單元連接成的直鏈雜多糖。糖胺聚糖的通式為[己糖醛酸一己糖胺]η，η隨種類而異，一般在30 250之間。二糖單元中至少有1個單糖殘基帶有負電荷的羧基或硫酸基。在體內1條或多條糖胺聚糖和1個核心蛋白共價連接形成蛋白聚糖，但透明質酸除外。按單糖殘基、殘基間連鍵的類型以及硫酸基的數目和位置，糖胺聚糖可分為透明質酸，4-硫酸軟骨素，6-硫酸軟骨素，硫酸皮膚素，硫酸角質素，肝素，和硫酸乙酰肝素。GA(is通過結合受體蛋白介導重要的生物學機制，比如保護蛋白免受降解、抗凝血、維持或抑制細胞生長、黏附和抗黏附、生物過濾器、促進或抑制血管形成、誘導神經軸突生長，以及在正常發育和病理條件下結合、貯存及向靶細胞釋放生長因子和參與信號轉導等生物活性。

發明內容
本發明的目的在于提供一種新型蛋白多糖復合物，其功能特性和物理穩定性均優于獨立的金屬硫蛋白或糖胺聚糖。為達到上述目的，本發明采用如下技術方案新型蛋白多糖復合物，由質量百分比為的金屬硫蛋白和[100-M]%的糖胺聚糖組成，其中，0 <M< 100。進一步，所述金屬硫蛋白與糖胺聚糖的最佳質量比為4 5 1。作為優選，所述金屬硫蛋白通過動物體內組織獲取或由基因工程方法獲取。作為優選，所述糖胺聚糖通過動物組織提取。進一步，所述糖胺聚糖為透明質酸，或4-硫酸軟骨素，或6-硫酸軟骨素，或硫酸皮膚素，或硫酸角質素，或肝素，或硫酸乙酰肝素，或它們的混合物。
本發明所述的新型蛋白多糖復合物綜合了兩組分的功能特性，使其功能特性和理化穩定性比單獨的MT或GAGs都有改善，同時提高了 MT的某些生理活性例如熱穩定性。使 MT與GAGs在食品、化妝品、醫藥等領域應用更加廣泛。
具體實施例方式本發明所述的新型蛋白多糖復合物，是由質量百分比為的金屬硫蛋白和 [100-M]%的糖胺聚糖組成，其中，0<M< 100。所述的金屬硫蛋白優選通過動物體內組織獲取或由基因工程方法獲取。所述的糖胺聚糖優選通過動物組織提取；所述的糖胺聚糖包括透明質酸、4-硫酸軟骨素、6-硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸角質素、肝素和硫酸乙酰肝素，或它們的混合物。一、MT-GAGs最佳質量配比實驗1、MT 的制備。采用現有的提取方法從動物肝臟中提取出活性&1-MT，并制成凍干粉。2、GAGs 的制備。采用現有的提取方法從海洋貝類動物提取出的GAGs，并制成水溶液。3、新型蛋白多糖復合物即MT-GAGs的制備。取一特定濃度的GAk水溶液，按不同的質量比加入MT凍干粉，攪拌混勻，得 MT-GAGs復合物。4、MT_GA(is復合物的分離取不同質量比制備的MT-GAGs復合物，分別配成MT-GAGs溶液10ml，取Iml分別上柱分離(S印hadex G-751. 6*30，流速5ml/分)，214nm紫外監測，記錄儀顯示當MT-GAGs 質量比為1 0時有MT樣品吸收峰，質量比為1 1 4 1時在13 19份洗脫液有 MT-GAk樣品吸收峰，且隨MT量增大吸收峰值也增大，當比例增大到5 1時另外又出現 MT吸收峰，表示MT-GAGs配比達到飽和。5、MT-GAGs復合物經人工胃液作用后分離。取不同質量比MT-GAGs復合物適量，分別加人工胃液配制成1 X IO^mol/LMT-GAGs 溶液，37 °C溫育120min，煮沸3分鐘酶滅火，8000r/min離心5min，取上清液用6000透析膜透析12小時，將透析后溶液轉入IOml容量瓶中，加水至刻度，再取Iml上柱分離 (SephadexG-751. 6*30，流速5ml/分)，214nm紫外監測，記錄儀顯示當MT-GAGs質量比為 1 0時MT樣品無吸收峰，質量比為1 1 4 1時吸收峰與未經人工胃液處理樣品的吸收峰相同，在質量比>4 1時吸收峰沒有大改變，過量的MT在人工胃液中被降解。6、結論。MT與GAGs最佳質量比為4 5 1。二、MT-GAGs對鉛中毒小鼠的保護實驗1、鉛中毒蓄積模型取小鼠每天灌胃40mg/L的醋酸鉛溶液，按0. 01L/kg體重劑量灌胃，連續10天后， 測定血鉛確定已中毒后，隨機分為染毒低劑量給藥組(LD)、染毒中劑量給藥組(MD)、染毒高劑量給藥組(HD)、染毒對照組(Pb)和正常對照組(NC)，每組10只。2、樣品配制
取MT-GAGs 樣品分別配制成 0.01 %、0. 05% 和 0. 10% (mg/100ml)濃度樣品， 105°C，保溫30分鐘，灌胃用。3、動物處理LD、MD、HD 3 組每天灌胃不同濃度的 MT_GA(is (MT GAGs = 4. 3 1)樣品，Pb 禾口 NC組灌胃去離子水，按0. 01L/kg體重劑量灌胃，連續7天，置代謝籠內，收集7天的尿和糞便。7天后眼眶取血，并處死動物，觀察內臟變化，分離腎臟及股骨，測定尿、糞及血、腎、骨的
鉛含量。4、結果Pb組小鼠肉眼可見肝、腸明顯病變。其它各組小鼠內臟未見異常。染毒小鼠經用 MT-GAk灌胃后，3個濃度劑量組的小鼠的排泄鉛(尿鉛和糞鉛)均明顯高于未服MT-GAGs 的1 組染毒小鼠；血、腎、骨中的鉛含量明顯低于未服MT-GAGs的1 組小鼠；HD、MD組的腎鉛和HD組的骨鉛接近于正常NC組，說明MT-GAGs能明顯增加體內鉛的排泄，降低體內鉛的蓄積，對鉛中毒小鼠具有與MT相同的保護作用。與單純MT實驗結果相同。三、MT-GAGs對熱的穩定性實驗1、紅細胞懸液的制備取新鮮兔肝素抗凝血2ml，2500r/min離心5min，吸掉血漿與白細胞，紅細胞用10 倍PBS清洗后，2500r/min離心5min，棄掉上清液，重復清洗三次后，配成1 X IO8紅細胞/ml
懸液，備用。2、氯化汞濃度與溶血率的關系測定Hg2+(汞離子)濃度0 2X 10_4mol/L對兔血紅細胞溶血的影響。取以上配制的紅細胞懸液，吸取0. 1ml，分別加入7. 90ml不同濃度的HgCl2 (氯化汞)溶液(Hg2+濃度 0 2X l(T4mol/L)，輕搖后于37°C溫育30min，然后在3000r/min離心5min，取上清液測定 417nm下的吸光值，按下式計算溶血率Hp Hp = (A-A0)Z(Aoo-A0)式中Aq-不加HgCl2時上清液的吸光值A——加入一定HgCl2后對應的上清液吸光值A00——HgCl2濃度大到紅細胞完全溶血時對應的吸光值從下表中可見隨Hg2+濃度增加，Hp %增大，當Hg2+濃度> 37. 5 X 10_6mO 1 /L時，Hp % 有突躍，大于56. 3 X 10_6mol/L時，紅細胞全部溶血，試驗重復5次取平均值。
權利要求
1.新型蛋白多糖復合物，其特征在于，由質量百分比為的金屬硫蛋白和[100-M]% 的糖胺聚糖組成，其中，0 < M < 100。
2.根據權利要求1所述的新型蛋白多糖復合物，其特征在于，所述金屬硫蛋白與糖胺聚糖的質量比為4 5 1。
3.根據權利要求1所述的新型蛋白多糖復合物，其特征在于，所述金屬硫蛋白通過動物體內組織獲取或由基因工程方法獲取。
4.根據權利要求1或2所述的新型蛋白多糖復合物，其特征在于，所述糖胺聚糖通過動物組織提取。
5.根據權利要求1或2所述的新型蛋白多糖復合物，其特征在于，所述糖胺聚糖為透明質酸，或4-硫酸軟骨素，或6-硫酸軟骨素，或硫酸皮膚素，或硫酸角質素，或肝素，或硫酸乙酰肝素，或它們的混合物。
全文摘要
本發明屬于生物化學技術領域，公開了一種新型蛋白多糖復合物。所述新型蛋白多糖復合物由質量百分比為M％的金屬硫蛋白和[100-M]％的糖胺聚糖組成，其中，0＜M＜100。進一步，所述金屬硫蛋白與糖胺聚糖的最佳質量比為4～5∶1。本發明綜合了兩組分的功能特性，使其功能特性和理化穩定性比單獨的MT或GAGs都有改善，同時提高了MT的某些生理活性例如熱穩定性。使MT與GAGs在食品、化妝品、醫藥等領域應用更加廣泛。
文檔編號A61K31/728GK102188693SQ201110122299
公開日2011年9月21日 申請日期2011年5月12日 優先權日2011年5月12日
發明者吳怡, 李國躍 申請人:湛江市索奇生物技術有限公司