含有大豆蛋白質的水解物的組合物的制作方法
【專利摘要】本發明的目的在于提供一種具有促進細胞和膠原間的粘附的活性的新型物質。本發明涉及使用大豆蛋白質的水解物，調制用于促進細胞和膠原間的粘附的組合物。
【專利說明】含有大豆蛋白質的水解物的組合物
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種用于促進細胞和膠原間的粘附和/或用于促進膠原凝膠的收縮的組合物、以及與其相關的發明。
【背景技術】
[0002]在以人為代表的哺乳動物生物體的真皮內，成纖維細胞與細胞外基質中的膠原粘附是強化并穩定化膠原纖維束的格子狀立體結構，并保持肌膚的張力及彈性的原因之一。而且，已知由于老化等原因，如果成纖維細胞對膠原的粘附能力降低，會引起肌膚的張力及彈力的降低。而且已知如果未與膠原纖維粘附而獲得支架(足場)，成纖維細胞自身的動作(例如各種因子的產生等)也會變得遲鈍。而且認為，這些理由引起的真皮細胞功能的降低不僅停留于真皮現象，還會對從真皮向表皮的營養供給及增殖因子的移動等產生不良影響，結果還會影響表皮的細胞功能。根據以上理由，探索促進成纖維細胞和膠原間的粘附的成分。
[0003]另外，在皮膚組織中，存在于表皮和真皮的臨界線上的基底膜中含有IV型膠原及VII型膠原作為主要成分。而且，如果基底膜和表皮角質細胞間的粘附因紫外線或年齡增加等原因而逐漸減弱松緩，不僅會引起松弛(例如，毛孔的松弛)或皺紋，由于角質細胞無法良好獲得貼壁，會降低角質細胞的增殖能力，由此，新陳代謝變差，引起色斑(黑色素的沉積)或暗沉。而且，如果在這樣的基底膜和角質細胞之間產生松緩，從作為基底膜的起重要作用的真皮向表皮的營養供給或生長因子的移動變差，皮膚整體的健康狀態不良，可能還會導致表皮的變薄等。因此，促進基底膜中的膠原和表皮角質細胞的粘附，使基底膜和表皮角質細胞牢固地粘合，對預防/改善松弛或皺紋、新陳代謝不良以及伴隨這些不良的色斑或暗沉、進而表皮的變薄等尤為重要。根據該理由，需要對促進角質細胞和膠原間的粘附的成分進行探索。
[0004]而且，近年，作為一種老化現象，生物體內蛋白質的糖化受到關注。而且，也逐漸明確了在生物體內，通過膠原蛋白質糖化而產生的糖化膠原(也稱為AGE化膠原)難以與細胞粘附。
[0005]而且，至今，作為促進皮膚細胞和膠原間的粘附的材料，已知的是具有特定序列的妝(專利文獻I)等。
[0006]但是，需要開發更實用的具有促進細胞和膠原間的粘附的活性的材料。特別是需要開發來源于天然材料，能夠安全用于生物體且具有高活性的新型材料。
[0007]現有技術文獻
[0008]專利文獻
[0009]專利文獻:國際公開第03/008438號小冊子
【發明內容】

[0010]發明所要解決的課題[0011]本發明鑒于上述技術研制而成，其目的在于，提供一種實用的新型材料，其源自天然物，對生物體安全，且能夠高度發揮促進細胞和膠原間的粘附的活性。
[0012]用于解決課題的技術方案
[0013]本發明人等為了解決上述課題而潛心研究，其結果發現，大豆蛋白質的水解物可作為高度促進細胞和膠原間的粘附，具有促進膠原凝膠收縮的活性的、實用的新型材料使用，直至完成本發明。
[0014]即，本發明提供以下內容。
[0015][I]含有大豆蛋白質的水解物的、用于促進細胞和膠原間的粘附的組合物。
[0016][2]含有大豆蛋白質的水解物的、用于促進含有細胞的膠原凝膠的收縮的組合物。
[0017][3]如[I]或[2]的組合物，其中，所述水解物為通過對大豆蛋白質進行蛋白酶處理而獲得的分解物。
[0018][4]如[I]~[3]中任一種的組合物，其中，大豆蛋白質的水解物的平均分子量為300 ~50000。
[0019]本發明書包含作為本申請優先權的基礎的日本國專利申請號的說明書和/或附圖中所述的內容。[0020]發明效果
[0021]根據本發明，提供一種實用的新型材料，其能夠有效地促進細胞與膠原的粘附，具有較高的促進膠原凝膠收縮的活性。因此，根據本發明，提供一種新型材料，其能夠有效防止老化等引起的細胞(特別是成纖維細胞和/或角質細胞)和膠原間的粘附能力降低，強化成纖維細胞和細胞外基質的結合，增加兩者的拉伸強度，使真皮緊縮，改善皮膚的皺紋及松弛，恢復肌膚的張力及彈性，進而，強化表皮角質細胞和基底膜的粘附，不僅能夠預防/改善松弛或皺紋，還有助于預防/改善新陳代謝降低、色斑、暗沉、表皮的變薄。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1是通過GPC法獲得的、表示實施例1的大豆蛋白質水解物的分子量分布的色譜圖；
[0023]圖2是通過GPC法得到的、表示實施例2的大豆蛋白質水解物的分子量分布的色譜圖；
[0024]圖3是通過GPC法得到的、表示實施例3的大豆蛋白質水解物的分子量分布的色譜圖。
【具體實施方式】
[0025]以下，詳細地說明本發明。在本說明書的全文中，除特別說明外，應理解單數形式的表現也包含其多數形式的概念。另外，除特別說明外，本說明書中使用的用語應理解以在該領域中通常使用的意思所使用的。
[0026]本發明提供一種含有大豆蛋白質的水解物的、用于促進細胞和膠原間的粘附的組合物。
[0027]另外，本發明提供一種含有大豆蛋白質的水解物的、用于促進膠原凝膠的收縮的組合物。[0028]大豆(Glycine max)是一種高約60~70cm的豆科一年生草本植物。公知的是，其種子多作為毛豆等，或加工成豆腐、豆醬(味噌)、醬油等供食用。[0029]用于本發明的大豆蛋白質可以為來源于上述大豆植物的任意的蛋白質，優選的是，可以是來源于大豆植物的種子的任意的蛋白質。在此，來源于大豆植物的蛋白質、或來源于大豆植物的種子的蛋白質是指在大豆植物體或大豆植物的種子中含有的蛋白質，能夠以任意的方法提取、分離或提純的蛋白質。作為大豆植物體，可以舉出植物整體或葉、莖、根等各個器官。另外，還可使用由組織培養獲得的大豆植物的組織或大豆的培養細胞中所含的蛋白質。作為大豆蛋白質，沒有限定，例如可舉出，大豆球蛋白、伴大豆球蛋白(優選β伴大?球蛋白)等。
[0030]因此，在本發明中，雖也可使用大豆植物的種子其本身或該種子的碎片物或粉碎物等作為大豆蛋白質，但優選使用從大豆植物中的所有成分分離、提純而得的蛋白質成分，更優選使用從大豆植物的種子中的所有成分分離、提純而得的蛋白質成分。這樣分離、提純而得的大豆蛋白質只要其水解物具有促進細胞和膠原間的粘附的功能、和/或具有促進膠原凝膠收縮的功能，可包含有大豆植物或大豆植物的種子中所含的實質上全部種類的蛋白質，另外，也可含有一部分種類的蛋白質。
[0031 ] 大豆蛋白質從大豆植物體或大豆植物的種子的分離、提純可通過公知的蛋白質的分離、提純方法進行。
[0032]作為大豆蛋白質,也可適合使用市售品,例如,可容易地從日清cosmo-foods(株)、ADM FAR EAST (株)、昭和產業(株)、不二制油(株)、(株)光洋商會等制造商或供應商購得。大豆蛋白質可作為例如脫脂大豆粉末等購得。
[0033]此外，在本說明書中，大豆植物的種子不僅指通常稱為大豆種子的結構物整體，也包含例如，脫皮大豆種子、脫脂大豆種子(粉末)、由大豆種子整體得到的豆渣(豆腐渣)等。
[0034]水解大豆蛋白質的方法可以使用在該領域中公知的任意的方法，例如，可以舉出通過用蛋白酶處理而水解的方法、通過用酸或堿處理而水解的方法等，但不限于此。從容易地高效得到希望的分解物這一觀點考慮，可優選使用用蛋白酶處理大豆蛋白質的方法。
[0035]在通過用蛋白酶處理的方法獲得本發明的大豆蛋白質的水解物的情況下，作為在該方法中使用的蛋白酶，沒有特別限定，可使用源自動物、植物、微生物的蛋白酶。例如，可以舉出嗜熱菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、胱天蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胃蛋白酶、組織蛋白酶D、胰蛋白酶、糜蛋白酶、胰酶、枯草桿菌蛋白酶等。另外，也可使用市售的含有蛋白酶的酶制齊Li。作為酶制劑，可以舉出:Sumizyme FL-G、Sumizyme AP、Sumizyme-LP、Sumizyme-FP、Sumizyme-LPL (以上為新日本化學工業制)、蛋白酶A、蛋白酶N、蛋白酶S、Newlase F3G、Newlase A、木瓜蛋白酶 W-40、菠蘿蛋白酶 F、Protin SD-NY10、Protin SD-PClOF (以上為天野酶制)、PR0TEX7L、PR0TEX14L、Promod223LP、木瓜蛋白酶(以上為Genencor協和制)、Aroase AP-10、Aroase NP-10、Aroase NS、Aroase XA-10、蛋白酶 YP-SS、Panchdase NP-2、Panchdase P (以上為 Yakult 藥品工業制)、Papain F、TRYPSIN4.0T、C0R0LASE N、C0R0LASEL10、C0R0LASE7089、VERON LlO (以上為樋口商會制)、0rientase20A、OrientaselONL、0rientase90N> Orientase 0NS、Tetradze S、Nucleicin (以上為 HBI 制)、Molsin F (以上為 Kikkoman 食品制)、Brewers Clarex、Brewers 蛋白酶、Varidase AFP、Varidase FP60、Acceleration Enzyme NP50.000 (以上為DSM日本制)、Denapsin2P、食品用提純木瓜蛋白酶、Denatyme AP (以上為 Nagasechemtex 制)、Neutrase (以上為 Novozymes 制)、提純木瓜蛋白酶(以上為三菱化學食品制)、ENZYL0N NBS (以上為洛東化成工業制)等，但不限于此。優選為酸性蛋白酶和/或中性蛋白酶。用于本發明的蛋白酶可以僅使用一種，也可兩種以上組合使用。另外，在組合使用的情況下，可以同時組合使用兩種以上的酶進行水解，也可用兩種以上的酶中的某種酶水解后，進而用其它酶水解等依次使用不同的酶。蛋白酶可適合使用市售品。
[0036]用于用蛋白酶水解大豆蛋白質的情況下的反應條件沒有特別限定，可按照技術常識由本領域技術人員適當選擇。例如，在使用市售的蛋白酶的情況下，可以按照其使用說明書使用。作為具體例子，可以列舉出如下方式，按照大豆蛋白質濃度一般為0.1~30% (w/V),優選I~10% (w/v)程度的方式在水等溶劑中懸浮(懸獨)含有大豆蛋白質或大豆蛋白質的原料，在該懸浮液(懸獨液)中通常按照0.001~5% (w/v)、優選0.005~3% (w/v)、更優選0.01~1% (w/v)程度的方式添加蛋白酶,進行水解反應。通常可使用30~80°C、優選40~70°C、更優選50~60°C的反應溫度。另外，通常可使用2~30小時、優選3~24小時、更優選10~20小時的反應時間。作為反應液的pH，優選為使用的蛋白酶的最佳pH附近。
[0037]對于反應的停止方法也沒有特別限定，可使用公知的方法。作為該方法，例如可舉出加熱處理等。例如，通過將上述反應物在80~100°C程度的溫度下進行3~20分鐘、優選5~15分鐘的加熱處理，使反應物中所含的蛋白酶失活，可停止酶反應。具體而言，可舉出在85°C下15分鐘的加熱處理或在100°C下5分鐘的加熱處理等。
[0038]通過上述那樣的水解反應而得的水解物可根據需要通過本領域技術人員公知的任意方法進一步處理。例如，優選通過過濾等處理，除去該水解物中較大的固體顆粒。過濾條件等沒有特別限定，可 按照技術常識由本領域技術人員適當選擇。例如，在容易引起濾紙堵塞的情況下等，還可優選使用過濾助劑等。
[0039]另外，還可減壓濃縮上述水解物，接著，通過冷凍干燥，進行粉末化。另外，還可通過噴霧干燥等方法進行粉末化。對減壓濃縮及冷凍干燥、噴霧干燥等時使用的條件及機器種類沒有特別限定，按照技術常識，可由本領域技術人員適當選擇。這樣，粉末化后的水解物可直接使用，或溶解于水等溶劑使用。
[0040]在大豆蛋白質的水解物中含有分子量或氨基酸序列不同的多種多樣的肽。用于本發明的水解物可以是實質上全部含有通過水解大豆蛋白質產生的多種多樣的肽的狀態，或者，還可以是以是否具有促進細胞和膠原間的粘附的功能為指標，和/或以是否具有促進膠原凝膠收縮的功能為指標，用公知的方法進一步區分、提純該多種多樣的肽而得到的一部分(例如，去除(除 < )幾乎不影響上述促進粘附功能的肽和/或幾乎不影響上述促進收縮功能的肽等)。但為了簡便，在實質上全部含有水解大豆蛋白質而得的多種多樣的肽的狀態下直接使用。此外，是否具有促進成纖維細胞和膠原間的粘附功能例如可如后述的實施例5及7所示的方式進行確認。另外，是否具有促進角質細胞和膠原間的粘附功能例如可如后述實施例6所示的方式進行確認。而且，是否具有膠原凝膠收縮的功能例如可如后述實施例8所示的方式進行確認。
[0041]用于本發明的大豆蛋白質的水解物的平均分子量優選為300~50000。從提高對皮膚的滲透性，而得到更高效果的觀點考慮，該平均分子量更優選為500~30000，進一步優選為700~20000，進一步更優選為1000~10000，特別優選為2000~10000。還可以根
據分子量區分大豆蛋白質的水解物，回收上述分子量范圍內含有的水解物，將上述分子量范圍的肽區分作為本發明的大豆蛋白質的水解物使用。水解物的平均分子量可通過本領域技術人員公知的任意方法測定，例如，可通過下述實施例所述的凝膠滲透色譜(GPC)法容易地測定。在本說明書中，通過GPC法測定的平均分子量是指“峰值平均分子量”，“峰值平均分子量”是指與色譜圖的峰頂(最強強度的峰值)的洗脫時間對應的分子量。
[0042]另外，用于本發明的大豆蛋白質的水解物的分子量分布沒有特別限定，從能夠提高對皮膚的滲透性，得到更高效果的觀點考慮，優選為70000以下、更優選100~70000、進一步優選100~50000、特別優選100~30000。此外，水解物的分子量分布可通過本領域技術人員公知的任意的方法測定，例如，可由根據GPC法得到的洗脫曲線容易算出。
[0043]如后述實施例所示，大豆蛋白質的水解物能夠促進細胞和膠原間的粘附。優選細胞為皮膚細胞，更優選為成纖維細胞及/或角質細胞。現在已知在膠原中有I~XIX型等各種類型的膠原，也指其任一類型的膠原。另外，膠原也可為糖化而AGE化的膠原。本發明的大豆蛋白質的水解物主要促進皮膚的真皮中多含有的I型膠原(膠原類型I)和成纖維細胞間的粘附、或皮膚的基底膜中多含有的IV型膠原(膠原類型IV)和角質細胞間的粘附。另外，本發明的大豆蛋白質的水解物通常也可促進已知的難以與細胞粘附的AGE化膠原和細胞間的粘附。通過在生物體的真皮內，成纖維細胞與細胞外基質中的膠原粘附，膠原形成纖維束構造，由此，強化成纖維細胞和細胞外基質的結合，增加兩者的拉伸強度，使真皮緊縮，保持肌膚的張力及彈性。因此，使用大豆蛋白質的水解物可有助于改善上述成纖維細胞和膠原間的粘附能力降低引起的皮膚的皺紋或松弛，或者，用于恢復肌膚的張力或彈性。而且，由于通過表皮 角質細胞與基底膜的膠原粘附，并牢固地使表皮和基底膜附著，抑制松弛(例如，毛孔的松弛)或皺紋，還促進了角質細胞的增殖，因此，促進了新陳代謝，并隨之可期待改善色斑、暗沉。在此，新陳代謝是指，在皮膚中，在皮膚的基底層產生表皮的角質細胞后，形成角質層，最終脫落。通過新陳代謝，皮膚的細胞重新變為新的細胞。通過促進新陳代謝，縮短新陳代謝所需的時間。另外，通過促進表皮和基底膜的粘附，對表皮的營養供給或轉錄因子的移動等變得順利，可接近更健康的皮膚狀態(例如，不產生表皮變薄的狀態)。因此，使用大豆蛋白質的水解物有助于改善因角質細胞和膠原間的粘附能力降低引起的松弛或皺紋、新陳代謝降低、色斑、暗沉、表皮的變薄。促進細胞和膠原間的粘附的作用可通過如下方法進行測定，例如，在由膠原被覆的培養板中，使用包含上述水解物的培養基培養細胞(例如，皮膚成纖維細胞或皮膚角質細胞)后，清洗板，測量洗不掉而殘留于板上的膠原涂層上的細胞數，相對不添加大豆蛋白質的水解物的情況，在殘留于膠原涂層上的細胞數顯著較多時，可判斷促進了各細胞和膠原間的粘附。
[0044]另外，大豆蛋白質的水解物具有膠原凝膠收縮作用，能夠促進膠原凝膠的收縮。本發明的大豆蛋白質的水解物主要促進包含皮膚的真皮中多含有的I型膠原(膠原類型I)的凝膠的收縮。在此 ，膠原凝膠是指含有細胞(特別是成纖維細胞)的膠原凝膠。為了在更接近生物體內的環境下進行評價，例如通過使用包埋有成纖維細胞的固化的膠原凝膠，在含有上述水解物的培養基中培養，并在培養前后比較該膠原凝膠的直徑，能夠評價該水解物的膠原凝膠收縮作用，在與培養前相比，培養后的膠原凝膠的直徑顯著降低時，可判斷促進了膠原凝膠的收縮。在該評價方法中，包埋有成纖維細胞的膠原凝膠作為生物體的真皮的模型使用。能夠促進包含成纖維細胞的膠原凝膠的收縮的、本發明的大豆蛋白質的水解物在生物體的真皮結締組織中，能夠促進由成纖維細胞和膠原形成的膠原凝膠的收縮。
[0045]如為本領域技術人員則可理解，通過該種方法，能夠促進成纖維細胞和膠原間的粘附的水解物和/或能夠促進膠原凝膠的收縮的水解物具有如下效果，強化成纖維細胞和細胞外基質的結合，增加兩者的拉伸強度，使真皮緊縮，改善皮膚的皺紋或松弛，或者恢復肌膚的張力及彈性。
[0046]本發明的組合物為上述含有大豆蛋白質的水解物。由于該組合物含有具有上述特征的水解物，因此，可作為用于促進細胞和膠原間的粘附的細胞和膠原間的粘附的促進劑，或用于促進膠原凝膠的收縮的膠原凝膠收縮促進劑有益地使用。該組合物例如，可作為醫藥組合物、化妝品組合物、食品組合物或飼料組合物，進而作為用于闡明與細胞和膠原間的粘附性相關的生理狀態、或闡明與膠原凝膠收縮相關的狀態的研究試藥適當地使用。
[0047]作為醫藥組合物，例如，可以舉出以人為代表的哺乳動物中細胞和膠原間的粘附能力降低引起的疾患的預防劑和/或治療劑等。具體而言，本發明的醫藥組合物例如，可作為因年齡增加等產生的成纖維細胞或角質細胞和膠原間的粘附能力降低引起的皮膚的皺紋或松弛的預防劑和/或治療劑，對上述粘附能力降低引起的皮膚的張力或彈力性的降低的預防劑和/或治療劑，或肌膚的緊縮劑，上述粘附能力降低引起的皮膚的新陳代謝不良及與之相伴的色斑或暗沉的預防劑和/或治療劑，或者上述粘附能力降低引起的表皮變薄的預防劑和/或治療劑等使用。而且，由于本發明的醫藥組合物含有作為創傷治愈的模型系統也顯示公知的高膠原凝膠收縮評價較高的收縮效果的含有大豆蛋白質的水解物，因此，也可作為用于促進創傷治愈、或皮膚潰瘍及瘢痕瘤等的治療、或皮膚移植時移植片的定著的藥劑等有益地使用。
[0048]作為化妝品組合物，例如，還可作為用于以人為代表的哺乳動物中細胞和膠原間的粘附能力降低引起的狀態的預防和/或改善的化妝品使用。具體而言，本發明的化妝品組合物例如，可作為用于因年齡增加等產生的成纖維細胞或角質細胞和膠原間的粘附能力降低引起的皮膚的皺紋或松弛的預防和/或改善的化妝品，用于對上述粘附能力降低引起的皮膚的張力或彈力性的降低的預防`和/或改善的化妝品，或用于肌膚的緊縮的化妝品，用于上述粘附能力降低引起的皮膚的新陳代謝不良及與其相伴的色斑或暗沉的預防和/或改善的化妝品，或用于上述粘附能力降低引起的表皮變薄的預防和/或改善的化妝品等使用。而且，使用本發明的化妝品組合物有助于改善創傷治愈、皮膚潰瘍及瘢痕瘤等狀態、或促進皮膚移植后的移植片的定著。
[0049]作為食品組合物，例如還可作為用于以人為代表的哺乳動物中細胞和膠原間的粘附能力降低引起的狀態的預防和/或改善的食品使用。具體而言，本發明的食品組合物例如，可以作為，用于因年齡增加等產生的成纖維細胞或角質細胞和膠原間的粘附能力降低引起的皮膚的皺紋或松弛的預防和/或改善的食品，用于對上述粘附能力降低引起的皮膚的張力或彈力性的降低的預防和/或改善的食品，或用于肌膚的緊縮的食品，用于上述粘附能力降低引起的皮膚的新陳代謝不良及與之相伴的色斑或暗沉的預防和/或改善的食品，或用于上述粘附能力降低引起的表皮變薄的預防和/或改善的食品等使用。而且，使用本發明的食品組合物有助于改善創傷治愈、皮膚潰瘍及瘢痕瘤等狀態、或用于促進皮膚移植后的移植片的定著。[0050]本發明的食品組合物含有健康食品、特定保健用食品、營養功能食品、健康輔助食品等。這些組合物包含美容健康食品。特定保健用食品是指，在飲食生活中，以特定的保健目的進行攝取，通過對其的攝取，顯示了可期待該保健的目的效果的食品。在這些食品中，在特定的實施方式中，可作為顯示了用于上述用途的食品效果的食品而提供。即，可作為顯示如下效果的食品提供，用于美容、具有美肌作用、用于改善肌質、用于恢復皮膚的張力或彈性、用于皮膚的皺紋或松弛的預防或改善、用于緊縮肌膚、用于皮膚的新陳代謝不良及與之相伴的色斑或暗沉的預防或改善、用于表皮變薄的預防或改善、用于創傷治愈、用于皮膚潰瘍及瘢痕瘤等狀態的改善、或用于促進皮膚移植后的移植片的定著等。
[0051]作為飼料，例如，可以舉出牛、豬、雞、羊、馬等家畜、及狗、貓等寵物動物中細胞和膠原間的粘附能力降低引起的狀態的預防用和/或改善用的飼料、以及用于改善創傷治愈、皮膚潰瘍及瘢痕瘤等狀態的飼料等。
[0052]本組合物中的上述大豆蛋白質的水解物的含量因組合物的劑型等而不同，通常，從得到高的促進細胞和膠原間的粘附的效果的觀點、和/或得到高的促進膠原凝膠收縮的效果的觀點考慮，優選為0.00001~100重量％，更優選為0.0001~95重量％，進一步優選為0.001~90重量％，特別優選為0.01~80重量％。
[0053]本發明的組合物除上述大豆蛋白質的水解物之外，在實現本發明的目的的范圍內，可適當配合制劑領域或食品領域等領域中通常使用的載體、基質(基剤)、和/或添加劑等進行調制。
[0054]作為載體，例如，可使用一種或組合兩種以上使用糖類、纖維素類、水難溶性膠類、交聯乙烯基聚合物、脂質類等。
[0055]作為基質，例如 ，可使用一種或組合兩種以上使用水、油脂類、礦物油類、石蠟類、脂肪酸類、硅油類、留醇類、酯類、金屬皂類、醇等。
[0056]作為添加劑，例如，可使用一種或組合兩種以上使用表面活性劑、可溶成分、乳化劑、油分、穩定劑、增粘劑、防腐劑、結合劑、潤滑劑、分散劑、PH調節劑、保濕劑、紫外線吸收齊?、螯合劑、經皮吸收促進劑、抗氧化劑、崩解劑、增塑劑、緩沖劑、維生素類、氨基酸類、著色劑、香料等。
[0057]進而，為了對本發明的組合物根據需要附加其它實用的作用，可組合一種或兩種以上美白成分、消炎成分、抗菌成分、細胞活性成分、收斂成分(収斂成分)、抗氧化成分、痤瘡改善成分、膠原等促進生物體成分合成的成分、促進血液循環成分、保濕成分、防老化成分等各種成分進行配合。
[0058]本發明的組合物可以是內服劑(包含食品及飼料)或外用劑(包含化妝品)等任意的劑型。
[0059]作為內服劑(包含食品及飼料)，例如可以使用片劑、丸劑、顆粒劑、細粒劑、粉劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、干糖漿劑、液劑(包含營養劑、懸浮劑、糖漿劑)、凝膠劑、脂質劑、浸膏劑、酊劑、檸檬水劑、果凍劑等任意的形式。
[0060]另外，在作為食品的情況下，還可作為面包、面、家常菜、肉食加工食品(例如，火腿、香腸等)、水產加工食品、調料(例如，調味汁等)、乳制品、點心(例如，餅干、糖果、果凍、冰淇淋等)、湯、果汁等任意通常的食品中含有的食品形式提供。在形成該種形式的情況下，上述的水解物可根據作為目的的食品的性質等，通過本領域技術人員公知的方法適當配人
口 O
[0061 ] 作為外用劑,例如,可以以液狀、乳液狀、膏狀、化妝水狀、糊狀、摩絲狀、啫喱狀、片
狀(負載基材)、氣溶膠狀、噴霧狀等任意的形式使用。
[0062]作為化妝品，例如，可以化妝水、乳液、膏、油、潤膚膏等基礎化妝品，粉底霜、胭脂、口紅等化妝用化妝品，洗面奶、潔面膏、沐浴露等清潔用品，沐浴粉等任意形式使用。
[0063]作為飼料，由于可以任意形式使用，沒有特別限定。
[0064]本發明還提供一種促進細胞和膠原間的粘附的方法和/或促進膠原凝膠的收縮的方法，其特征在于使用上述大豆蛋白質的水解物。
[0065]在本發明的方法中，使用可獲得促進細胞和膠原間的粘附的效果的有效量以上和/或可獲得促進收縮膠原凝膠的效果的有效量以上的量的上述大豆蛋白質的水解物即可。
[0066]即，本發明的方法中上述大豆蛋白質的水解物的使用量通常在內服劑的情況下，每成人I人體重約50kg優選約0.001~1000Omg/日、更優選約I~1000mg/日、進一步優選約I~IOOmg/日。外用劑時該使用量通常為每成人I人體重約50kg優選約Ing~2g /日、更優選約0.01 μ g~2g /日、進一步優選約0.1 μ g~2g/日。
[0067]而且，在作為外用劑使用的情況下，上述大豆蛋白質的水解物對皮膚的使用量優選為約0.01ng~500 μ g/cm2、更優選為約0.1ng~50 μ g/cm2、進一步優選為約Ing~10 μ g/cm2。
[0068]本發明還提供上述大豆蛋白質的水解物用于制造促進細胞和膠原間的粘附的組合物的應用。
[0069]另外，本發明提供上述大豆蛋白質的水解物用于制造促進膠原凝膠的收縮的組合物的應用。
[0070]上述大豆蛋白質的水解物的使用量按照成為上述組合物中的含量的方式使用即可。
[0071]本發明包含如下方法，將含有大豆蛋白質的水解物的組合物給與以人為代表的哺乳動物，促進該以人為代表的哺乳動物中細胞和膠原間的粘附的方法，及將含有大豆蛋白質的水解物的組合物給與以人為代表的哺乳動物，促進該以人為代表的哺乳動物中包含細胞的膠原凝膠的收縮的方法。另外，本發明包含，用于促進細胞和膠原間的粘附的大豆蛋白質的水解物、及用于促進包含細胞的膠原凝膠的收縮的大豆蛋白質的水解物。而且，本發明包含大豆蛋白質的水解物用于制造促進細胞和膠原間的粘附的藥劑的應用、及大豆蛋白質的水解物用于制造促進包含細胞的膠原凝膠的收縮的藥劑的應用。
[0072]實施例
[0073]以下，基于實施例詳細地說明本發明，本發明不限于這些實施例。
[0074]實施例1:調制大豆蛋白質的水解物(I)
[0075]按照脫脂大豆粉末(商品名PR0PHAM974、ADM FAR EAST有限公司制)的濃度成為5%(w/v)的方式懸浮大豆蛋白質,在該懸浮液中，按照成為0.05% (w/v)的方式添加作為胃蛋白酶的一種的P印sibiol:10,000 (日本Biocon公司制)，在50°C下進行18小時分解反應。反應液的PH以該蛋白酶的最佳pH附近的pH3.5進行實施。
[0076]反應 結束后，通過將上述反應物在85°C下經15分鐘進行加熱處理，使該反應物中含有的酶失活，其后用ION氫氧化鈉中和。接著，在布氏漏斗上預涂硅藻土 (扶桑化學、RADIOLITE # 200)，進行抽吸過濾。接著，通過減壓濃縮濾液，冷凍干燥，以42.8%的產量獲得粉末化的大豆蛋白質水解物。
[0077]實施例2:調制大豆蛋白質的水解物(2)
[0078]按照脫脂大豆粉末(商品名PR0PHAM974、ADM FAR EAST有限公司制)的濃度成為5% (w/v)的方式懸浮大豆蛋白質,在該懸浮液中以成為0.05% (w/v)的方式添加胰蛋白酶，在50°C下進行18小時分解反應。反應液的pH以在該蛋白酶的最佳pH附近的pH7.5進行實施。
[0079]反應結束后，通過將上述反應物在85°C下經15分鐘進行加熱處理，使該反應物中含有的酶失活。接著，在布氏漏斗上預涂硅藻土 (扶桑化學、RADIOLITE # 200)，進行抽吸過濾。接著，通過減壓濃縮濾液，冷凍干燥，以33.8%的產量獲得粉末化的大豆蛋白質水解物。
[0080]實施例3:調制大豆蛋白質的水解物(3)
[0081]按照脫脂大豆粉末(商品名PR0PHAM974、ADM FAR EAST有限公司制)的濃度成為5% (w/v)的方式懸浮大豆蛋白質,在該懸浮液中按照成為5% (w/v)的方式添加胰蛋白酶，以該蛋白酶的最佳PH附近的pH7.5在50°C下反應18小時，接著，進而添加Sumizyme FL-G(新日本化學公司制)0.05% (w/v),以該蛋白酶的最佳pH附近的7.0在60°C下進行18小時分解反應。[0082]反應結束后，通過將上述反應物在85°C下經15分鐘進行加熱處理，使該反應物中含有的酶失活。接著，在布氏漏斗上預涂硅藻土 (扶桑化學、RADIOLITE # 200)，進行抽吸過濾。接著，通過減壓濃縮濾液，冷凍干燥，以43.9%的產量獲得粉末化的大豆蛋白質水解物。
[0083]實施例4:測定大豆蛋白質的水解物的分子量
[0084]通過凝膠滲透色譜(GPC)法測定實施例1~3中獲得的大豆蛋白質的水解物的平均分子量。
[0085]具體而言，將各實施例的大豆蛋白質水解物溶解在25mM Tris-HCl緩沖液(含有150mM NaCl、pH7.5),調制 2mg/mL 的試驗溶液。將 HPLC 色譜柱 Superdex peptide HR (1 Omm
1.D.X30cm,GE Healthcare日本公司制)在相同的緩沖液下平衡化，在該色譜柱中注入試驗溶液50 μ L0在色譜柱的流速為0.5mL/分、色譜柱溫度為室溫、肽的檢測為214nm下進行，從洗脫時間推測分子量分布及峰值平均分子量。此外，作為已知分子量的肽制劑，使用了細胞色素C (sigma公司制，分子量12327)、抑肽酶(Aprotinin) (Roche制，分子量6518)、六甘氨酸(sigma公司制,分子量360)、三甘氨酸(sigma公司制,分子量189)、及甘氨酸(和光純藥公司制，分子量75)。
[0086]該結果，可確認實施例1~3的大豆蛋白質水解物的平均分子量(峰值平均分子量)分別為2233 (實施例1)、9274 (實施例2)、及3407 (實施例3)。此外，圖1~3是表示各水解物的分子量分布的色譜圖。
[0087]實施例5:評價成纖維細胞對膠原涂層的粘附
[0088]使用上述實施例1~3中調制的各種大豆蛋白質水解物，關于促進成纖維細胞對膠原涂層的粘附的效果進行評價。
[0089]具體而言，首先，將來自人的正常皮膚的成纖維細胞(倉敷紡績:KF-4009)，在用I型膠原的膠原被覆的細胞培養板(96孔)上以2X IO4細胞/孔濃度接種。接著，將各大豆蛋白質水解物被稀釋成0.5mg/ml濃度的Dulbecco’ s Modified Eagle MediumCDMEM ;含有AB1%)逐一添加200 μ I到各孔中，在37°C、5% 二氧化碳及95%空氣的環境下培養4小時。另外，作為對照，準備了添加未添加大豆蛋白質水解物的D-MEM培養基200μ I的孔。在開始培養4小時后，用PBS沖洗各孔的上清液，使用細胞計數試劑盒-8試劑盒((有限公司)同仁化學研究所制)，測量各孔中與膠原涂層粘附，未洗掉而殘留的活細胞數。以測定結果為基礎，將對照中的活細胞數為100%，算出各實施例的添加了水解物的組的活細胞數(％)。將該結果示于下表。
[0090]表1
[0091]
【權利要求】
1.一種組合物，其中，所述組合物為含有大豆蛋白質的水解物的、用于促進細胞和膠原間的粘附的組合物。
2.一種組合物，其中，所述組合物為含有大豆蛋白質的水解物的、用于促進包含細胞的膠原凝膠的收縮的組合物。
3.如權利要求1或2所述的組合物，其中，所述水解物為通過對大豆蛋白質進行蛋白酶處理而獲得的分解物。
4.如權利要求1~3中任一項所述的組合物，其中，大豆蛋白質的水解物的平均分子量為 300 ~50 000。
【文檔編號】A61P17/00GK103747793SQ201280040545
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2012年9月11日 優先權日:2011年9月12日
【發明者】阿部正通, 熊澤益德, 松本康助 申請人:樂敦制藥株式會社