一種水生植物復合物、其多糖的提取方法及其多糖的新用途
【專利摘要】本發明公開了一種水生植物復合物，包括茭白、蓮藕、水芹、芡實、茨菇、荸薺、莼菜和菱八種水生植物；所述、蓮藕、水芹、芡實、茨菇、荸薺、莼菜和菱之間的重量比為2：2:1:2:2:2:1:2；2；其提取方法，包括以下步驟：（1）各原料進行高速粉碎，加入超純水收集濾液；（2）濾渣加入超純水繼續煎煮，與步驟（1）中收集的濾液合并；（3）將合并后溶液蒸發至溶液剩余10%～18%，冷卻至室溫；（4）加入乙醇，邊加邊攪拌；（5）將步驟（4）的溶液靜置沉淀，抽濾，棄去濾液，收集濾渣。濾渣再分別用乙醇和丙酮各洗滌一次，將剩余濾渣烘干；所述水生植物復合物多糖具備良好的抗腫瘤活性，毒副作用小，用于制備抗腫瘤藥物。
【專利說明】一種水生植物復合物、其多糖的提取方法及其多糖的新用途

【技術領域】
[0001]本發明涉及一種復合物、其多糖提取方法及其多糖新用途，尤其涉及一種水生植物復合物、其多糖的提取方法及其多糖用于制備抗腫瘤藥物的新用途，屬于天然藥物【技術領域】。

【背景技術】
[0002]“水八仙”是指茭白、蓮藕、水芹、芡實、慈菇、荸薺、莼菜、菱八種蔬菜，是我市傳統栽培的水生蔬菜品種，主要分布在我市的吳中區、吳江、常熟、太倉、張家港、昆山等地。由于種植歷史久遠，品種種類多、質量上乘、栽培精細。一度形成了鮮明地方特色，在國內外享有盛名，故美其名日“水八仙”。其中如蘇州黃慈菇，南蕩雞頭，大、中、小臘臺茭白，早花藕，紅皮荸薺，太湖莼菜等更是蘇州地方優良品種的佼佼者。
[0003]隨著人民生活水平逐步提高，高血壓、高血脂等“富貴病”的發病率逐年上升，從中醫學角度看，現代人已出現從以前的“陽虛”(營養不足)向“陰虛”(火氣過旺)轉移的趨勢，而水生蔬菜產品基本都是“涼性”食品，蓮子、芡實、慈菇等還含有較多的生物堿成分，長期食用有較好的“降火”功效。
[0004]腫瘤是機體在各種致癌因素作用下，局部組織的某一個細胞在基因水平上失去對其生長的正常調控，導致其克隆性異常增生而形成的異常病變。學界一般將腫瘤分為良性和惡性兩大類。我們常說的惡性腫瘤也就是癌癥。20世紀以來，現代醫學技術在治療癌癥方面取得了較為矚目的成績，癌癥死亡率逐步下降，但由于發病率持續走高，癌癥至今仍是威脅人類生命的最主要疾病之，其中在2008年全球新增癌癥患者玉約1270萬人，其中肺癌、乳腺癌、消化道腫瘤占據大比例。因癌癥共造成約760萬人死亡，其中肺癌、胃癌、肝癌、結直腸癌死亡人數為最高。癌癥死亡人數約占所有死亡人數的13%，這一數據使得癌癥已經超越心血管疾病成為全球死亡人數最多的疾病。
[0005]在中國，根據發布的《2012年中國腫瘤等級年報》顯示，2009年中國腫瘤發病為285.91/10萬。發病率無論男女，城市均高于農村。數據顯示，全國每年新發腫瘤病例估計約312萬例，平均每天新發現癌癥病例8550人，也就是說每分鐘就有6人被確診為惡性腫瘤。我國居民發病率最高的腫瘤為肺癌和消化道腫瘤。其中，男性患者主要是肺癌、胃癌和肝癌，女性患者主要是乳腺癌、肺癌和結直腸癌。根據衛生部《衛生統計年鑒》中的信息，2000年腫瘤已經開始成為城市居民第一死亡原因，而到2006年，農村居民的前五位疾病死亡率及死亡原因中，惡性腫瘤已經成為頭號殺手。
[0006]而腫瘤的發病率和死亡人數的持續走高，使得疾病研究領域開始朝向腫瘤，尤其是藥物開發領域。自從2007年，抗腫瘤藥物銷售額超過降血脂藥物，成為全球醫藥市場的領頭羊，2012年的銷售額超過了 700億美金。這使得各大藥企及研究單位爭先投入抗腫瘤藥物的研究與開發。在我國，根據中國醫院用藥市場可以看出抗腫瘤藥物的銷售規模一直穩步增長，2011年達到587億元。目前國際上抗腫瘤的治療藥物主要為傳統細胞毒類藥物和新型靶向藥物，二者雖然具備一定的優勢；然而細胞毒類藥物在治療時為患者帶來的毒副反應痛苦不容忽視，這使得患者在治療期間的生活質量嚴重下降，以至于有些患者產生消極治療心態；而新型的靶向藥物作用機制仍有很長的路要走，目前階段這類藥物仍不能作為一線治療藥物而被使用。
[0007]近年來，腫瘤已經成為威脅人類健康的第一大疾病，對于腫瘤的治療仍然以傳統的細胞毒類藥物為主，中藥具備毒副反應低的特點已被逐步重視。近年來，國家日益重視中藥現代化的投入，在傳統的重要煎熬等治療手段的背景下，結合現代分離提取工藝，獲得有效成分。藥用多糖的研究始于20世紀50年代末對微生物多糖抗癌效果的發現。科學家們從大量的藥理和臨床研究發現從天然產物中分離出來的多糖往往是一種免疫調節劑，它能激活免疫細胞而對正常細胞沒有毒副作用。多糖作為免疫治療藥物正越來越受到重視，這已成為新藥研究的熱點之一。
[0008]以往的研究大都以某種多糖的單一成分研究較多，而兩種以上多糖組成的復合多糖應用于動物體內，觀察其免疫功能和抑瘤作用的協同效應則研究甚少。大量研究認為多種多糖單用雖有一定抑瘤效果，但兩種免疫增強劑包括兩種多糖合用療效會更高，也就是說具有協同作用，其免疫增強及抗腫瘤作用會明顯提高。復合多糖的療效所以優于單味多糖，主要在于通過配伍發揮了藥物間的相輔相成作用，配伍后復方多糖可明顯提高療效。


【發明內容】

[0009]針對上述存在的技術問題，本發明的目的是:提出了一種水生植物復合物、其多糖的提取方法及其多糖用于制備抗腫瘤藥物的新用途。
[0010]本發明的技術解決方案是這樣實現的:一種水生植物復合物，包括茭白、蓮藕、水芹、芡實、茨菇、荸薺、莼菜和菱八種水生植物；所述、蓮藕、水芹、芡實、茨菇、荸薺、莼菜和菱之間的重量比為2:2:1:2:2:2:1:2。
[0011]一種水生植物復合物多糖的提取方法，包括以下步驟:
(I)將蓮藕、水芹、芡實、茨菇、荸薺、莼菜和菱原料各100g，使用藥用機械粉碎機進行高速粉碎，將原料粉碎到20?30目后，將粉碎后的粉末加入超純水4500mL?5300 mL進行高溫超聲處理30?40分鐘，收集濾液。
[0012](2)濾渣加入超純水4500mL?5300 mL繼續煎煮I?2小時后，與步驟(I)中收集的濾液合并。
[0013](3)將合并后溶液于80°C?90°C蒸發至溶液剩余10%?18%，轉移至燒杯，冷卻至室溫。
[0014](4)加入95%的乙醇，邊加邊攪拌，直至溶液中最終乙醇含量約為75%?82%。
[0015](5)將步驟(4)的溶液靜置沉淀22.5?25.5小時后，抽濾，棄去濾液，收集濾渣。濾渣再分別用乙醇和丙酮各洗滌一次，將剩余濾渣在58°C?72°C烘干，得到水生植物復合物多糖粉末。
[0016]一種水生植物復合物多糖用于制備抗腫瘤藥物的新用途，所述水生植物復合物多糖具備良好的抗腫瘤活性，毒副作用小，用于制備抗腫瘤藥物。
[0017]優選的，通過動物實驗得出:水生植物復合物多糖給藥組的KM小鼠在同一時間點體重與正常對照組無差異(P>0.05)。
[0018]優選的，通過動物實驗得出:水生植物復合物多糖給藥組的KM小鼠在解剖后的動物肝臟系數和脾臟系數與正常對照組無差異(P>0.05)。
[0019]優選的，通過動物實驗得出:水生植物復合物多糖給藥組的平均瘤重較模型組有顯著降低(P〈0.001);中藥復方多糖組合物給藥組的平均瘤重較阿霉素給藥組無差異(Ρ>0.05)。
[0020]由于上述技術方案的運用，本發明與現有技術相比具有下列優點:
本發明的水生植物復合物由茭白、蓮藕、水芹、芡實、茨菇、荸薺、莼菜和菱八種水生植物組成，提取其多糖，該水生植物復合物多糖具備良好的抗腫瘤活性，毒副作用小，可以用于制備抗腫瘤藥物，且該水生植物復合物多糖中的多種多糖具有協同作用，其免疫增強及抗腫瘤作用會明顯提高，制備出的藥物的療效也會更高。本發明的水生植物復合物多糖的提取方法，該提取方法的預處理方法在傳統的水浸沸煮的基礎上進行了優化，將原料進行高速粉碎得到粉末后，再結合高溫超聲處理，有助于藥材中的有效成分分離，大大提高提取效率。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]下面結合附圖對本發明技術方案作進一步說明:
附圖1為水生植物復合物多糖對正常小鼠體重的影響的實驗統計圖；
附圖2為水生植物復合物多糖對正常小鼠臟器系數的影響的實驗統計圖；
附圖3為水生植物復合物多糖對荷瘤小鼠體重的影響的實驗統計圖；
附圖4為水生植物復合物多糖抗腫瘤效果的實驗統計圖。

【具體實施方式】
[0022]下面結合說明書附圖和實施例對本發明作進一步說明。
[0023]1、水生植物復合物。
[0024]一種水生植物復合物，包括茭白、蓮藕、水芹、芡實、茨菇、荸薺、莼菜和菱八種水生植物；所述、蓮藕、水芹、芡實、茨菇、荸薺、莼菜和菱之間的重量比為2:2:1:2:2:2:1:2。
[0025]2、水生植物復合物多糖的提取方法
實施例1:一種水生植物復合物多糖的提取方法，包括以下步驟:
(I)將蓮藕、水芹、芡實、茨菇、荸薺、莼菜和菱原料各100g，使用藥用機械粉碎機進行高速粉碎，將原料粉碎到20目后，將粉碎后的粉末加入超純水4500mL進行高溫超聲處理30分鐘，收集濾液。
[0026](2)濾渣加入超純水4500 mL繼續煎煮I小時后，與步驟(I)中收集的濾液合并。
[0027](3)將合并后溶液于80°C蒸發至溶液剩余10%，轉移至燒杯，冷卻至室溫。
[0028](4)加入95%的乙醇，邊加邊攪拌，直至溶液中最終乙醇含量約為75%。
[0029](5)將步驟(4)的溶液靜置沉淀22.5小時后，抽濾，棄去濾液，收集濾渣。濾渣再分別用乙醇和丙酮各洗滌一次，將剩余濾渣在58°C烘干，得到水生植物復合物多糖粉末。
[0030]實施例2:—種水生植物復合物多糖的提取方法，包括以下步驟:
(I)將蓮藕、水芹、芡實、茨菇、荸薺、莼菜和菱原料各100g，使用藥用機械粉碎機進行高速粉碎，將原料粉碎到25目后，將粉碎后的粉末加入超純水4900 mL進行高溫超聲處理35分鐘，收集濾液。
[0031](2)濾渣加入超純水4900mL繼續煎煮1.5小時后，與步驟(I)中收集的濾液合并。
[0032](3)將合并后溶液于85°C蒸發至溶液剩余14%，轉移至燒杯，冷卻至室溫。
[0033](4)加入95%的乙醇，邊加邊攪拌，直至溶液中最終乙醇含量約為78.5%。
[0034](5)將步驟(4)的溶液靜置沉淀24小時后，抽濾，棄去濾液，收集濾渣。濾渣再分別用乙醇和丙酮各洗滌一次，將剩余濾渣在65°C烘干，得到水生植物復合物多糖粉末。
[0035]實施例3:—種水生植物復合物多糖的提取方法，包括以下步驟:
(I)將蓮藕、水芹、芡實、茨菇、荸薺、莼菜和菱原料各100g，使用藥用機械粉碎機進行高速粉碎，將原料粉碎到30目后，將粉碎后的粉末加入超純水5300 mL進行高溫超聲處理40分鐘，收集濾液。
[0036](2)濾渣加入超純水5300 mL繼續煎煮2小時后，與步驟(I)中收集的濾液合并。
[0037](3)將合并后溶液于90°C蒸發至溶液剩余18%，轉移至燒杯，冷卻至室溫。
[0038](4)加入95%的乙醇，邊加邊攪拌，直至溶液中最終乙醇含量約為75%?82%。
[0039](5)將步驟(4)的溶液靜置沉淀25.5小時后，抽濾，棄去濾液，收集濾渣。濾渣再分別用乙醇和丙酮各洗滌一次，將剩余濾渣在72°C烘干，得到水生植物復合物多糖粉末。
[0040]上述提取方法的實施例，預處理方法在傳統的水浸沸煮的基礎上進行了優化，將原料進行高速粉碎得到粉末后，再結合高溫超聲處理，有助于藥材中的有效成分分離，大大提聞提取效率。
[0041]3、水生植物復合物多糖含量的測定
首先進行5%苯酚的配制，方法為稱取12.5 g苯酚用超純水定容至250 mL。然后進行標準溶液的配制，方法為準確稱取100 mg葡萄糖，定容至100 mL，得到葡萄糖濃度為1000mg/L的儲備液。分別精密吸取儲備液0.10,0.20,0.40,0.60,0.80、1.00 mL于10 mL容量瓶中，得到濃度為 10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L、60 mg/L、80 mg/L、100 mg/L 的系列標準溶液。準備樣品，方法為準確稱取提取的多糖粉末10 mg，用超純水定容至100 mL，80°C水浴溶解。進行樣品含量測定，分別取系列標準溶液、樣品溶液及空白(以超純水作空白)I mL，于具塞比色管中，加入I mL 5%的苯酚，搖勻，垂直迅速加入3 mL濃硫酸，搖勻，沸水浴15分鐘。取出后迅速冷卻。在490 nm波長下進行測定。以吸光度A對濃度C回歸得方程:A=0.00794C + 0.01559,r = 0.99。測得提取粉末總糖含量為:51.6%。計算多糖得率，水生植物復合物多糖得率為7.2%。
[0042]4、水生植物復合物多糖的鑒定
借助紅外光譜和紫外光譜測定技術，對水生植物復合物多糖成分進行鑒定。紅外光譜鑒定借助Thermo NICOLET islO FTIR進行。方法為取干燥后的粉末約I mg與100 mg KBr固體粉末在瑪瑙研缽中研磨均勻，壓片后在400?4000cm-l區波數范圍內進行紅外光譜掃描。為了判斷三種多糖中核酸和蛋白質雜質的成分，利用紫外光譜進行多糖的鑒定，借助貝克曼DU800紫外分光光度計對多糖樣本進行檢測
5、水生植物復合物多糖對小鼠毒性試驗
選擇KM小鼠24只，基于體重隨機化區層分組(分組之日記做dayO )，分為2組:陰性對照組，以多糖(2g/kg)組成水生植物復合物多糖組；每組12只，雌、雄各半。采用單次口服給藥，給藥體積為20mL/kg，給藥后觀察7天。期間測體重及記錄臨床癥狀等指標，觀察結束后解剖動物，稱量肝臟重量和脾臟重量，計算肝臟系數和脾臟系數。
[0043]圖1中可以看出，水生植物復合物多糖給藥組動物在同一時間點體重與正常對照組無差異(P > 0.05)，說明水生植物復合物多糖各組分以2g/kg高劑量組合給藥對動物體重沒有影響，結合圖2進一步判斷，各給藥組在解剖后對動物肝臟系數和脾臟系數均無差異(P>0.05)，這充分說明了水生植物復合物多糖對小鼠無毒副作用。
[0044]6、水生植物復合物多糖的抗腫瘤作用
給藥劑量為水生植物復合物多糖500mg/kg。陽性對照藥物選擇阿霉素。
[0045]小鼠腫瘤模型利用肝癌H22接種獲得，首先從液氮中復蘇H22腹水瘤細胞，將0.5mL細胞注射至生長狀況良好的KM小鼠腹腔。I周后取腹水生長良好的小鼠，安樂死后抽取腹水，腹水無血方可用于接種實驗。選擇20只KM小鼠，雌雄各半，動物經體重隨機化區層分為2組后，將0.1mL腹水瘤源細胞接種至小鼠腋窩處皮下，并開始給藥，每日觀察荷瘤鼠生存狀況和瘤子大小情況。連續給藥7-10后動物進行安樂死，剝離腫瘤并稱重拍照，計算抑瘤率。計算公式IR%=1-T/C%，T為治療組平均瘤重，C為模型組平均瘤重。
[0046]圖3可以看出，阿霉素給藥組荷瘤動物體重在給藥后期出現體重下降的現象，說明阿霉素毒性作用較強，這是由于細胞毒類抗腫瘤藥物的嚴重毒性反應所致；而其他各組動物體重增長趨勢基本一致。圖4可以看出，與模型組比較，各給藥組平均瘤重均顯著低于模型組平均瘤重(P〈0.001)，與阿霉素組比較，水生植物復合物多糖組的平均瘤重與阿霉素組平均瘤重無顯著性差異(P > 0.05)，說明水生植物復合物多糖復方配伍抗腫瘤效果基本與阿霉素效果一致，抗腫瘤作用明顯。
[0047]本發明的水生植物復合物由茭白、蓮藕、水芹、芡實、茨菇、荸薺、莼菜和菱八種水生植物組成，提取其多糖，該水生植物復合物多糖具備良好的抗腫瘤活性，毒副作用小，可以用于制備抗腫瘤藥物，且該水生植物復合物多糖中的多種多糖具有協同作用，其免疫增強及抗腫瘤作用會明顯提高，制備出的藥物的療效也會更高。
[0048]上述實施例只為說明本發明的技術構思及特點，其目的在于讓熟悉此項技術的人士能夠了解本發明的內容并加以實施，并不能以此限制本發明的保護范圍，凡根據本發明精神實質所作的等效變化或修飾，都應涵蓋在本發明的保護范圍內。
【權利要求】
1.一種水生植物復合物，其特征在于:包括茭白、蓮藕、水芹、芡實、茨菇、荸薺、莼菜和菱八種水生植物；所述、蓮藕、水芹、芡實、茨菇、荸薺、莼菜和菱之間的重量比為2:2:1:2:2:2:1:2ο
2.—種水生植物復合物多糖的提取方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)將蓮藕、水芹、芡實、茨菇、荸薺、莼菜和菱原料各100g，使用藥用機械粉碎機進行高速粉碎，將原料粉碎到20?30目后，將粉碎后的粉末加入超純水4500mL?5300 mL進行高溫超聲處理30?40分鐘，收集濾液； (2)濾渣加入超純水4500mL?5300mL繼續煎煮I?2小時后，與步驟(I)中收集的濾液合并； (3)將合并后溶液于80°C?90°C蒸發至溶液剩余10%?18%，轉移至燒杯，冷卻至室溫； (4)加入95%的乙醇，邊加邊攪拌，直至溶液中最終乙醇含量約為75%?82%； (5)將步驟(4)的溶液靜置沉淀22.5?25.5小時后，抽濾，棄去濾液，收集濾渣；濾渣再分別用乙醇和丙酮各洗滌一次，將剩余濾渣在58°C?72°C烘干，得到水生植物復合物復方多糖粉末。
3.—種如權利要求1所述的水生植物復合物多糖用于制備抗腫瘤藥物的新用途，其特征在于:所述水生植物復合物多糖具備良好的抗腫瘤活性，毒副作用小，用于制備抗腫瘤藥物。
4.根據權利要求3所述的水生植物復合物多糖用于制備抗腫瘤藥物的新用途，其特征在于:通過動物實驗得出:水生植物復合物多糖給藥組的KM小鼠在同一時間點體重與正常對照組無差異(P>0.05)。
5.據權利要求3所述的水生植物復合物多糖用于制備抗腫瘤藥物的新用途，其特征在于:通過動物實驗得出:水生植物復合物多糖給藥組的KM小鼠在解剖后的動物肝臟系數和脾臟系數與正常對照組無差異(P>0.05)。
6.據權利要求3所述的水生植物復合物多糖用于制備抗腫瘤藥物的新用途，其特征在于:通過動物實驗得出:水生植物復合物多糖給藥組的平均瘤重較模型組有顯著降低(P〈0.001);中藥復方多糖組合物給藥組的平均瘤重較阿霉素給藥組無差異(P>0.05)。
【文檔編號】A61P35/00GK104367853SQ201410566614
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年10月22日 優先權日:2014年10月22日
【發明者】吳夢旦, 許穎, 朱瑋 申請人:蘇州市博力生物科技有限公司